[0001] 本发明属于免疫学领域，具体涉及一种日本血吸虫无机焦磷酸酶(SjPPase)重组抗原蛋白在日本血吸虫病的疗效考核中的应用。

[0002] 日本血吸虫病是由于人或哺乳动物感染日本血吸虫引起的一种人畜共患的寄生虫病，主要分布在中国南部地区、菲律宾和印度尼西亚。尽管在中国已经有超过50年的血吸虫病防治史，但是日本血吸虫病仍然是目前中国重要的公共卫生问题之一，主要在我国7省110县市区流行，仍然有79万患者，受威胁人口6500万。

[0003] 日本血吸虫童虫到成虫的发育阶段在哺乳动物宿主体内完成，该过程中童虫生长较快、发育为成虫的历时较短。而后，其长期的寄生给宿主带来一系列的病理反应。因此，日本血吸虫童虫的发育不仅是血吸虫完善自己的过程，而且是宿主发生病理性变化的推动性因素。无机焦磷酸酶(PPase，inorganic pyrophosphatase)是一种与日本血吸虫童虫发育相关的蛋白质类催化剂，可以催化一分子无机焦磷酸盐(PPi，inoraganic pyrophosphate)水解生成两分子无机磷酸盐(Pi，inorganic phosphate)。与无催化剂的情况相比，PPase可使PPi的水解速率提高至原来的1010倍。PPi是许多生物大分子(如DNA、RNA、蛋白质等)合成过程中的副产物，PPi的快速水解反应为这些生物大分子合成反应的正向进行形成一个热力学的推动力，加速了生物大分子的合成，进而推动日本血吸虫童虫的发育。

[0004] 血吸虫感染宿主后，机体受抗原刺激所产生的抗体在宿主体液内会维持较长的时间，即使感染者得到有效治疗(体内虫体已经死亡)，其体内抗体水平仍维持较高水平，故不能确定其是否需要继续治疗。因而寻找某些治疗后消失较快的抗体即“短程抗体”，成为血吸虫病疗效考核的研究热点之一。现有的免疫诊断抗原无法有效区分现症感染和既往感染，故常导致已治愈患者的反复用药，这不但加重用药者的精神负担，也可能降低血吸虫对药物的敏感性。因此，发现和寻找那些具有高敏感性，同时能检测出区分现症感染和既往感染的可用于日本血吸虫病疗效考核的抗原靶点非常重要。

[0005] 本发明所要解决的技术问题在于，提供一种日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白，其对日本血吸虫病具有阳性检出率高、特异性强的特点，可用于日本血吸虫病的疗效考核。

[0006] 本发明所要解决的另一技术问题在于，提供一种以SjPPase重组抗原蛋白为基础建立的日本血吸虫病免疫诊断方法。

[0007] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

[0008] 本发明提供一种日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白，其具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。该重组抗原蛋白可催化无机焦磷酸盐(PPi)水解生成磷酸盐，分子量为Mr 36 000。

[0009] 本发明提供一种检测日本血吸虫病的检测产品，该检测产品包括具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白。本发明的的日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白可以用于制备成检测日本血吸虫病的各种检测产品，包括检测试纸、检测试剂或检测试剂盒等。

[0010] 所述SjPPase重组抗原蛋白的应用，用于诊断日本血吸虫病。

[0011] 所述SjPPase重组抗原蛋白的应用，用于日本血吸虫病的疗效考核。

[0012] 本发明的有益效果：本发明包括日本血吸虫无机焦磷酸酶SjPPase重组抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，是可以催化无机焦磷酸盐(PPi)水解生成磷酸盐的蛋白。本发明首次提出将SjPPase重组蛋白应用于日本血吸虫病诊断，其对日本血吸虫病患者血清的敏感性为88.8％(71/80),阳性检出率高，诊断特异性为97.5％(39/40)，特异性强。不仅可以用于诊断日本血吸虫病，而且可以进行疗效考核，具有广阔的市场空间和较好的社会、经济效益。

[0013] 下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0014] 实施例1日本血吸虫SjPPase重组抗原蛋白用于日本血吸虫病的诊断和疗效考核价值的评价

[0015] 1材料

[0016] 1.1日本血吸虫病患者吡喹酮治疗前、治疗后3个月、治疗后6个月的血清样本，从四川省日本血吸虫病流行区采集；正常人血清采自苏州市

[0017] 1.2羊抗人全分子IgG，来自于SIGMA公司。

[0018] 2方法

[0019] 2.1重组抗原SjPPase检测吡喹酮治疗前日本血吸虫病患者及正常人血清的检测结果

[0020] 1)用包被液稀释抗原至最终浓度为4ng/μl，100μl/孔，37℃孵育2h，用PBS-T洗涤3次，每次3min；

[0021] 2)用1％BSA(PBS稀释)，100μl/孔，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，每次3min；

[0022] 3)将一抗(日本血吸虫病患者吡喹酮治疗前及正常人血清)用PBS-T稀释(1:100)，100μl/孔，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，每次3min；

[0023] 将二抗(羊抗人全分子IgG)用PBS-T稀释(1:10000)，100μl/孔，37℃孵育1h，用PBS-T洗涤3次，每次3min；

[0024] 4)加TMB底物显色液，100μl/孔，常温3min左右，加2M H2SO4终止液，100μl/孔；

[0025] 5)将96孔板放入酶标仪中读数，光波波长为450nm。待检测OD值大于阴性对照2倍者为阳性，当阴性对照OD值低于0.05时按0.05计算。

[0026] 2.2重组抗原SjPPase对吡喹酮治疗后3个月、6个月日本血吸虫病患者血清的检测结果ELISA检测方法同2.1，一抗为日本血吸虫病患者吡喹酮治疗后3个月、6个月血清。

[0027] 3数据统计分析

[0028] 使用Excel电子表格处理软件对实验数据进行整理和统计分析。

[0029] 4结果

[0030] 4.1重组抗原SjPPase检测吡喹酮治疗前日本血吸虫病患者及正常人血清的检测结果

[0031] 用重组抗原SjPPase分别对受日本血吸虫感染的病人血清和正常人血清进行ELISA的IgG检测，以检测OD值大于阴性对照2倍为阳性判断值，其敏感性为88.8％(表1)，特异性为97.5％(表2)。

[0032] 表1重组抗原SjPPase检测吡喹酮治疗前日本血吸虫病患者血清中IgG的结果[0033]检测方法 阳性数 阴性数 阳性检出率
SjPPase-ELISA 71 9 88.8％

[0034] 表2重组抗原SjPPase检测正常人血清中IgG的结果

[0035]检测方法 检测例数 阳性数 阳性率
SjPPase-ELISA 40 1 2.5％

[0036] 4.2重组抗原SjPPase对吡喹酮治疗后3个月、6个月日本血吸虫病患者血清的检测结果

[0037] 重组抗原SjPPase对吡喹酮治疗后37例日本血吸虫病患者血清的检测结果如表3所示，其治疗后3个月、6个月的阴转率分别为24.3％和43.2％。

[0038] 表3重组抗原SjPPase检测吡喹酮治疗后3个月、6个月日本血吸虫病患者血清疗效考核结果

[0039]

[0040] 5讨论

[0041] 血吸虫病仍然是一种世界范围内流行的主要寄生虫病，虽然我国已经在日本血吸虫病的防治工作中取得了卓越成就，但是目前仍缺乏能对血吸虫病进行疗效考核的方法。

[0042] 基因工程技术为发展检测人血清抗体的重组抗原制备与检测方法提供了方便，基于ELISA免疫检测方法具有较高的实用性，且已广泛应用于日本血吸虫病辅助诊断和血清流行病学监测。本发明基于日本血吸虫SjPPase重组抗原对吡喹酮治疗前、治疗后3个月、6个月以及正常人血清进行ELISA检测，结果表明SjPPase重组抗原对日本血吸虫病患者血清的敏感性为88.8％(71/80),诊断特异性为97.5％(39/40)，其阳性检出率高、特异性强。吡喹酮治疗后3个月、6个月的日本血吸虫病患者血清阴转率分别为24.3％(9/37)和43.2％(16/37)。不仅可以用于诊断日本血吸虫病，而且可以进行疗效考核，具有广阔的市场空间和较好的社会、经济效益。

[0043] 综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。