超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺 |
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| 申请号 | CN201610134989.4 | 申请日 | 2016-03-10 | 公开(公告)号 | CN107177573A | 公开(公告)日 | 2017-09-19 |
| 申请人 | 如皋市永兴肠衣有限公司; | 发明人 | 费苹; 陈银芳; 费正明; 陈明全; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及基因工程领域重组蛋白的一种 超临界 流体 色谱分离纯化肠激酶工艺，其步骤为：（1）在 牛 肠激酶催化亚基的基因EKL上构建突变体EKLM，突变体EKLM的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；（2）替换掉突变体EKLM中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的基因序列EKLMO，EKLMO的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。利用本发明所述制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，可以有效保持牛肠激酶催化亚基的活性，具有很高的蛋白得率，而且本发明所述的方法生产工艺简单，产品 质量 稳定。提纯后的蛋白可以用于 生物 工程 或药物生产等多个目的，具有显著的应用价值。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺，其特征在于：工艺步骤为 ： |
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| 说明书全文 | 超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺技术领域背景技术[0002] 肠激酶（Enterokinase，简写为 EK）是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二 聚体丝氨酸蛋白酶。其天然蛋白分子量为150kDa，由一条115kDa 的重链和一条35kDa 的轻 链组成，在 pH 值 4.5-9.5 和温度 4-45OC 之间均可以特异性的水解蛋白底物。肠激酶识别 底物蛋白的序列为DDDDK，它可以在赖氨酸残基的C 端进行切割。这样的酶切优势使其成为 了融合蛋白表达体系中理想的工具酶。天然提取的肠激酶很容易混有其它种类蛋白酶，限 制了其在基因工程中的广泛应用。因此利用基因工程重组制备肠激酶逐渐成为大家选择的 方向。 [0003] 肠激酶由一条重链和一条轻链组成，重链又称结构亚基，轻链又称催化亚基，二者 通过分子间二硫键结合。结构亚基负责将肠激酶定位到小肠的刷状缘膜上，催化亚基行使 催化活性，将胰蛋白酶原激活成为胰蛋白酶。为了高效获得制备肠激酶催化亚基蛋白，有必 要开发基因工程重组肠激酶催化亚基。 发明内容[0004] 本发明为了解决然提取的肠激酶很容易混有其它种类蛋白酶，限制了其在基因工 程中的广泛应用，提供了一种超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺。 [0005] 本发明是通过以下技术方案实现的 ：一种超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺，其特征在于：其步骤为 ： ⑴在牛肠激酶催化亚基的基因 EKL 上构建突变体 EKLM，突变体 EKLM 的核苷酸序列； ⑵替换掉突变体 EKLM 中存在的大肠杆菌不利表达的密码子从而获得优化的基因序列，EKLMO，EKLMO 的核苷酸序列。 ⑶在 EKLMO 的 5` 末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列，在 EKLMO 的 3` 末端加入标 签序列，得到完整的表达基因片段。 ⑷将上述表达基因片段克隆进入载体，构建得到高效表达载体，将其转入大肠杆菌 BL21，用 IPTG 诱导重组基因的表达 。 ⑸收集菌体，提纯目的蛋白；所述 步骤⑶中标签序列为四个连续的组氨酸标签序列 HIS4；；所述步骤⑸中提纯目的蛋白采用的是包涵体变复性方法；所述包涵体变复性方法的步骤为： ①按照每 10g 菌体加入 30ml 比例加入到溶液 A 中重悬，破碎细胞，高速离心获得包涵体；所述溶液 A 为 50mM Tris，pH 7.0 。 ②利用溶液 B 清洗包涵体两次 ；溶液 B 为 50mM Tris，pH 7.0，500mM NaCl，20mM EDTA， 2% Triton X-100 。 ③向包涵体中加入20 倍包涵体质量的溶液C，溶解24h ；溶液C 为7.5M 盐酸胍，pH 9.0， 50mM Tris，100mM 巯基乙醇 。 [0006] ④溶解 24h 后将溶液 pH 调整至 3.5，采用溶液 D 进行透析 ；透析完成后，高速离心去 掉沉淀，上清逐渐滴加到 10 倍上清体积的复性溶液 E 中；所述溶液 D 为 7.5M 盐酸胍，50mM Tris，pH 4.0 ；所述复性溶液 E 为 0.7M 精氨酸，pH 8.6，2mM 还原性谷胱甘肽，1mM EDTA 。 [0007] ⑤复性 72h 后，采用溶液 F 对添加有上清的复性溶液 E 进行透析，透析完成后，高速离 心去掉沉淀，获得目的蛋白溶液；溶液 F 为 20mM Tris，PH7.6，20mM NaCl，1mM CaCl2；通过 包涵体变复性提纯获得目的蛋白溶液后采用镍离子亲和柱快速纯化目的蛋白。 [0008] 本发明具有生产工艺简单，产品质量稳 定，且提纯后的蛋白可以用于生物工程或药物生产等多个目的，具有显著的应用价值。 具体实施方式[0009] 制备重组牛肠激酶催化亚基蛋白的方法，其步骤为 ： ⑴为了提高重组蛋白的活性和稳定性，基于牛肠激酶的晶体结构，以牛肠激酶催化亚基的基因 EKL 为模板，设计突变体蛋白 EKLM，突变位点包括 C112S，S121P 和 Y175R。突变后 的 EKLM 的全长核苷酸序列。 [0010] ⑵为了提高蛋白产量，替换掉突变体 EKLM 中存在的大肠杆菌不利表达的密码子 从而获得优化的基因序列 EKLMO，EKLMO 的核苷酸序列。 [0011] ⑶为了后续提纯方便，在 EKLMO 的 5` 末端加入牛肠激酶自身的酶切位点序列。 [0012] DDDDK，在EKLMO 的3` 末端加入四个连续的组氨酸标签序列HIS4，得到完整的表达基因片段DDDDK-EKLMO-HIS4。 [0013] ⑷设计引物 P1 和 P2 如下所示 ：P1 ： GGGAATTCCATATGGGTCCGATCGATGACGACGACAAGATCGTGGGCGGTAGCGACAG P2 ： CCGCTCGAGTTAATGATGATGATGGTGCAGGAAGCTCTGTATCCACTCG 引物稀释成50pmol/μl, 然后进行PCR 步骤。琼脂糖凝胶电泳检测DDDDK-EKLMO-HIS4条带位于 750bp 左右，胶回收目的基因，用Nde I 和Xho I 将基因酶切成粘性末端，同样处理 pET-26b 载体，加入 T4 DNA 连接酶，4℃连接 12 小时，转化大肠杆菌 DH5α。用硫酸卡那霉素 -LB 平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，利用酶切和PCR 的方法鉴定正确，然后核苷酸序序列分析含有正确的基因序列阅读框架，构建成功pET-26b- DDDDK-EKLMO-HIS4 载体。将 EKLMO 的表达载体转化 BL21 菌，常规扩增培养，加入 0.5mM IPTG 进行诱导，37 度诱导 4 小时，此时表达出的蛋白为 DDDDK-EKLMO-HIS4 蛋白，即可以收集菌体。 [0014] ⑸收集菌体，提纯目的蛋白 ：①按照每 10g 菌体加入 30ml 比例加入到溶液 A 中重悬，破碎细胞，高速离心获得包涵 体；所述溶液 A 为 50mM Tris，pH 7.0 。 [0015] ②利用溶液 B 清洗包涵体两次 ；溶液 B 为 50mM Tris，pH 7.0，500mM NaCl，20mM EDTA， 2% Triton X-100 。 [0016] ③向包涵体中加入20 倍包涵体质量的溶液C，溶解24h ；溶液C 为7.5M 盐酸胍，pH 9.0， 50mM Tris，100mM 巯基乙醇。 [0017] ④溶解 24h 后将溶液 pH 调整至 3.5，采用溶液 D 进行透析 ；透析完成后，高速离心去 掉沉淀，上清逐渐滴加到 10 倍上清体积的复性溶液 E 中；所述溶液 D 为 7.5M 盐酸胍，50mM Tris，pH 4.0 ；所述复性溶液 E 为 0.7M 精氨酸，pH 8.6，2mM 还原性谷胱甘肽，1mM EDTA 。 [0018] ⑤复性 72h 后，采用溶液 F 对添加有上清的复性溶液 E 进行透析，透析完成后，高速离 心去掉沉淀，获得目的蛋白溶液；溶液 F 为 20mM Tris，PH7.6，20mM NaCl，1mM CaCl2。包涵 体变复性处理过程中发生了自酶切反应获得目的蛋白 EKLMO-HIS4。 [0019] ⑹通过包涵体变复性提纯获得目的蛋白溶液后采用镍离子亲和柱快速纯化目的 蛋白，利用 SDS-PAGE 鉴定分析纯度和活性。 |
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