甘油和乙酸转化提高的发酵方法

申请号 CN201580069126.7 申请日 2015-12-17 公开(公告)号 CN107109441A 公开(公告)日 2017-08-29
申请人 帝斯曼知识产权资产管理有限公司; 发明人 汉斯·马里纳斯·查尔斯·约翰内斯·德·布鲁因; 威廉默斯·特奥多鲁斯·安东尼厄斯·马里亚·德·拉特; 保罗·克拉森;
摘要 本 发明 涉及生产 发酵 产物的方法,所述方法包括在反应器中利用能够转化糖、甘油和乙酸的细胞发酵 碳 源,其中所述碳源包括糖和乙酸,所述方法包括以下步骤:a)用所述细胞接种任选稀释的碳源;b)任选地,以分批模式发酵所述反应器;c)向所述反应器中逐渐加入包含甘油和任选的糖的碳源;d)充足的发酵时间之后,从所述反应器中分离发酵产物;e)任选地,将步骤d)的分离后剩余的级分保留为废液;和f)任选地,在步骤a)中使用所述废液稀释所述碳源。
权利要求

1.生产发酵产物的方法,所述方法包括在反应器中利用能够转化糖、甘油和乙酸的细胞发酵源,其中所述碳源包括糖和乙酸,所述方法包括以下步骤:
a)用所述细胞接种任选稀释的碳源;
b)任选地,以分批模式发酵所述反应器;
c)向所述反应器中逐渐加入包含甘油和任选的糖的碳源;
d)充足的发酵时间之后,从所述反应器中分离发酵产物;
e)任选地,将步骤d)的分离后剩余的级分保留为废液;和
f)任选地,在步骤a)中使用所述废液稀释所述碳源。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述碳源包括木质纤维解物。
3.根据权利要求2所述的方法,其中加入的甘油的量使得所述反应器中甘油的摩尔浓度为所述反应器中乙酸的摩尔浓度的大约两倍或1.8-2.2倍。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其中所述加入的甘油来源于基于淀粉或糖的乙醇生产设备或生物柴油设备。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中当反应器中的葡萄糖浓度为2g/l或更低时,开始加入甘油。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中将步骤f)的分离后剩余的级分保留为废液;并在步骤b)中使用所述废液。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述细胞能够消耗所述木质纤维素水解物中的木糖,优选地基本所有木糖。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述细胞是经遗传修饰的酵母细胞,其包含:
a)编码异源NAD+依赖型乙酰化乙脱氢酶(E.C.1.2.1.10)的一个或多个核苷酸序列;
b)编码同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的一个或多个核苷酸序列;
c)编码异源甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)的一个或多个核苷酸序列;和d)编码同源或异源二羟基丙激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的一个或多个核苷酸序列。
9.根据权利要求1-8所述的方法,其中所述酵母细胞具有编码甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或编码甘油3-磷酸脱氢酶基因的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其中所述细胞表达外源甘油同向转运体。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,其中在所述方法期间,不需要向所述反应器中的混合物中加入
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述酵母能够代谢有机酸,优选地代谢乙酸。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其中通过添加充足的木质纤维素水解物,使处于分批补料模式的分批补料反应器中的混合物的pH保持基本恒定。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述分批补料反应器中的乙酸浓度为30g/l或更低。
15.根据权利要求14所述的方法,其中进料到所述分批补料反应器中的木质纤维素水解物的速率为0.01h-1–0.10h-1。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法,其中处于分批补料模式的所述反应器中的pH为pH 4至pH 7、pH 4至pH 5或pH 4至pH 4.5。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法,其中所述方法是厌或缺氧的分批补料发酵方法,其中所述反应器中发酵液的pH高于进料的pH。
18.根据权利要求8-17中任一项所述的方法,其中所述酵母能够厌氧发酵至少一种C6糖和至少一种C5糖。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法得到的发酵产物。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述发酵产物是乙醇。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法,其中向所述发酵方法中加入增殖方法。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法,其中所述一种或多种方法是连续的。
23.根据权利要求22所述的方法,其是偶联的连续的增殖和发酵方法。

说明书全文

甘油和乙酸转化提高的发酵方法

发明领域

[0001] 本发明涉及发酵方法。具体而言,本发明涉及利用乙酸转化提高的转化甘油和乙酸的酵母细胞的发酵方法。本发明还涉及其中所述酵母细胞生成发酵产物如乙醇的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 第二代生物乙醇由例如解成游离单体糖(如己糖和戊糖)以发酵成乙醇的植物生物质的木质纤维素级分生产。除生物质预处理和水解期间的糖释放外,还形成一些有毒副产物。例如,糠和HMF就是这些产物中的两种。它们形成的量取决于几个预处理参数,如温度、压和预处理时间。木质纤维素水解物也含有大量的乙酸,乙酸是微生物如酵母发酵能力的强抑制物。
[0004] 甘油是糖发酵成乙醇期间的主要副产物,其主要由于重化反应消耗在厌氧条件下的生物合成期间形成的过量NADH而形成(van Dijken和Scheffers,1986)。因此,在工业发酵期间,酵母细胞消耗的约5%至10%的糖被转为甘油。降低这种多元醇的量被认为是增加乙醇产量的有前景的途径。这可以通过调节分批补料过程中的进料速率,或通过选择生成更少甘油的菌株而实现。
[0005] 然而,在文献中,已经报道几种不同的方法,它们可以帮助减少乙酸对水解物中糖发酵的抑制作用,以及(例如通过酵母的遗传工程)通过缺失甘油生成中涉及的基因来(部分)解决氧化还原平衡问题。
[0006] Sonderegger等(2004)公开了在发酵木糖的Saccharomyces cerevisiae菌株中磷酸转乙酰酶和乙醛脱氢酶的异源表达。结合天然磷酸酶,Sonderegger等由此生成了功能磷酸酮酶途径,其能够净重氧化NADH,所述NADH由该特定菌株中用于木糖利用的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的异源表达所产生。
[0007] Guadalupe等(2010)描述了一种Saccharomyces cerevisiae菌株,其中通过破坏内源性NAD依赖型甘油3-磷酸脱氢酶基因(GPD1和GPD2)而消除副产物甘油的生成。编码乙酰化NAD依赖型乙醛脱氢酶的E.colimhpF基因的表达通过为培养基补充乙酸恢复了gpd1gpd2双缺失菌株厌氧生长的能力。
[0008] Yu等(2010)构建了经代谢工程化以通过甘油脱氢酶(由GCY1编码)、二羟基丙酮激酶(DAK1)和甘油摄取蛋白(GUP1)的同时过表达来提高由甘油生成乙醇的Saccharomyces cerevisiae菌株。在同一团队的后来报告中(Yu等,2012),描述到分别编码醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的ADH1和PDC1的额外过表达引起在发酵条件下的生长速率和甘油消耗增加,导致最终乙醇产量略有增加。
[0009] Lee和Dasilva(2006)公开了经工程化以通过引入Escherichia coli mgs和gldA基因的表达等由甘油生成1,2-丙二醇的酵母Saccharomyces cerevisiae。
[0010] Guadelupe等(2010)(并且还在专利申请WO 2011/010923中)描述的技术提供了用于在生物质糖发酵和前述乙酸发酵成例如乙醇期间降低水解物的乙酸含量的方法。
[0011] 通过引入额外的NADH生成途径,例如通过另外(过)表达甘油消耗途径,进一步增强转化乙酸的能力是有潜在可能性的。在表达厌氧乙酸转化途径的酵母菌株(例如Medina等,2009所描述)中引入前述GUP1-、GCY1-和DAK1-基因(Yu等,2010)后,乙酸转化应增加以维持氧化还原平衡,导致水解物的去毒进一步增加且乙醇产量更高。然而Yu等的解决方案不起作用,因为酵母甘油脱氢酶(由GCY1编码)使用NADP+作为辅因子,由于辅因子再生不足而导致辅因子不平衡。替代性甘油脱氢酶(来自于E.coli的gldA)结合乙酸还原途径一起被测试,并且的确提高了在厌氧生长(发酵)条件下乙酸的转化(专利申请WO2013/081456)。
[0012] 已知方法的一个缺点是:对于转化甘油/HAc的酵母菌株而言,具有高毒性(例如,含有2g/l乙酸或更多)的某些木质纤维素水解物的已知分批发酵是不可行的。我们在本文中发现并在实施例中描述了这一点。
[0013] 发明概述
[0014] 因此,本发明的一个目标是提供发酵具有高毒性的木质纤维素水解物的可行方法。本发明的另一个目标是提供具有有效的甘油和HAc转化的方法。另一个目标是提供一种方法,其中菌株具有提高的糖转化率和改善的细胞生长。
[0015] 根据本发明实现了这些目标中的一个或多个,其提供了生产发酵产物的方法,所述方法包括在反应器中利用能够转化糖、甘油和乙酸的细胞发酵源,其中所述碳源包括糖和乙酸,所述方法包括以下步骤:
[0016] a)用所述细胞接种任选稀释的碳源;
[0017] b)任选地,以分批模式发酵所述反应器;
[0018] c)向所述反应器中逐渐加入包含甘油和任选的糖的碳源;
[0019] d)充足的发酵时间之后,从所述反应器中分离发酵产物;
[0020] e)任选地,将步骤d)的分离后剩余的级分保留为废液(spent broth);和
[0021] f)任选地,在步骤a)中使用所述废液稀释所述碳源。
[0022] 如实施例中所示,所述目标得以实现。附图简介
[0023] 图1YD01248在合成培养基上的发酵性能;糖转化和EtOH产生(A)、甘油转化和HAc转化、生物质(B);
[0024] 图2YD01248在甘油浓度递增的合成培养基上的发酵性能;
[0025] 图3YD01248在补充有不同浓度甘油的(NREL)预处理的玉米秆水解物上的发酵性能;
[0026] 图4在补充有不同浓度甘油的(NREL)预处理的玉米秆水解物的发酵中,YD01248的酵母生物质生长(由OD700计算)(A);以及单位生物质葡萄糖转化率(B)和木糖转化率(C);图4B和图4C的图注与图4A的图注相同。
[0027] 图5A在补充有不同浓度甘油的(NREL)预处理的玉米秆水解物的发酵中,在葡萄糖耗尽时(50小时),YD01248的酵母生物质生长(由OD700计算);图5A、5C和5E的图注与图5B的图注相同。
[0028] 图5B-E在补充有不同浓度甘油的(NREL)预处理的玉米秆水解物的发酵中,在葡萄糖耗尽时(50小时),YD01248的酵母生物质生长(由OD700计算)(A)、葡萄糖转化曲线(B)、木糖转化曲线(C)、HAc转化曲线(D)和甘油转化曲线(E);
[0029] 图6YD01397(A、C)和YD01437(B、D)在合成培养基上的发酵性能;糖转化和EtOH产生(A、B)、甘油转化和HAc转化、生物质(由OD700计算)(C、D);图6B的图注与图6A的图注相同;图6D的图注与图6C的图注相同。
[0030] 图7在发酵合成培养基的过程中,菌株YD01397和YD01437的单位生物质甘油转化;
[0031] 图8在补充有甘油的(NREL)预处理的玉米秆水解物上分批发酵YD01437;糖转化和EtOH产生(A)、甘油转化和HAc转化、生物质(由OD700计算)(B);
[0032] 图9在补充有甘油的(NREL)预处理的玉米秆水解物上分批补料发酵YD01437;糖转化和EtOH产生(A)、甘油转化和HAc转化、生物质(由OD700计算)(B);
[0033] 图10在降低的pH下,在补充有甘油的(NREL)预处理的玉米秆水解物上分批补料发酵YD01437;t=0-36小时,在pH 5.5下进料;t=36-75小时,在pH 4.3下进料。糖转化和EtOH产生(A)、甘油转化和HAc转化、发酵液pH和生物质(由OD700计算)(B)。
[0034] 图11图11(A、C)菌株YD01437在(NREL)预处理的玉米秆水解物上的有氧pH受调节的分批补料增殖,随后进行补充有甘油的相同水解物的pH受调节的分批补料发酵(B、D)。糖转化和EtOH产生(A)、甘油转化和HAc转化、发酵液pH和生物质(由OD700计算)(B)。
[0035] 图12实施例6的发酵系统和pH受调节的连续酵母增殖的示意图。
[0036] 图13在补充有甘油的(NREL)预处理的玉米秆水解物上分批补料发酵YD01437;起始体积中没有回收的发酵液(A、D);起始体积中有30ml回收的发酵液(B、E);起始体积中有90ml(C、F)回收的发酵液。在图13A、图13B、图13C中使用以下符号:EtOH 和木糖和葡萄糖 的糖转化,发酵罐体积(......);在图13D、图13E、图13F中使用以下符号:甘油 HAc pH 生物质(由OD600计算) 发酵罐体积(......)。
[0037] 发明详述
[0038] 在本说明书和所附权利要求的通篇,词语“包括”、“包含”和“含有”应被解释为包含性的。换言之,在语境允许的情况下,这些词语意图传达的意思是:可以包括其它没有明确列举的要素或整体。本文中不使用数量词修饰时指的是一个/种或多于一个/种(即一个/种或至少一个/种)语法对象。例如,“要素”可意味着一个/种要素或多于一个/种要素。
[0039] 因此,本发明涉及生产发酵产物的方法,所述方法包括在反应器中利用能够转化糖、甘油和乙酸的细胞发酵碳源,其中所述碳源包括糖和乙酸,所述方法包括以下步骤:
[0040] a)用所述细胞接种任选稀释的碳源;
[0041] b)任选地,以分批模式发酵所述反应器;
[0042] c)向所述反应器中逐渐加入包含甘油和任选的糖的碳源;
[0043] d)充足的发酵时间之后,从所述反应器中分离发酵产物;
[0044] e)任选地,将步骤d)的分离后剩余的级分保留为废液;和
[0045] f)任选地,在步骤a)中使用所述废液稀释所述碳源。
[0046] 如实施例中所示,利用本发明的方法,实现了发酵具有高毒性的木质纤维素水解物的可行方法。此外,实现了具有有效的甘油和HAc转化的方法。此外,在所述方法中,菌株具有提高的糖转化率和改善的细胞生长。此外,来自根据本发明的发酵方法的发酵液的一个独特特征是:其具有显著降低的HAc含量(与未发酵的水解物或现有技术产物相比)。这允许(部分或全部)发酵液或蒸馏的发酵液(釜馏物)再循环进入随后的增殖和发酵循环的分批相(batch phase),而不引入抑制浓度的HAc。在一种实施方式中,例如,在预处理之前和/或之后,使用釜馏物的液体级分作为稀释水。在一种实施方式中,当使用耐蒸馏的热稳定酶时,这允许木质纤维素材料水解中所用酶的再循环。
[0047] 在此更详细地描述了本发明方法的实施方式:
[0048] 步骤a)可包括用碳源填充反应器。这可以通过任何常规方式进行。可部分或完全填充反应器。可以计量填充。在该阶段,可以例如通过加热或冷却改变温度。碳源可以是水性液体、水性浆体。水性液体可包含细胞能够利用的任何碳源,例如己糖或戊糖,例如葡萄糖、木糖和/或阿拉伯糖。在一种实施方式中,碳源是木质纤维素水解物。此外,在步骤a)的一种实施方式中,可任选地用包含2g/l或更少乙酸的液体稀释碳源。由于碳源对细胞可能有毒性,所以在该步骤中,如果反应器的内容物对微生物毒性太大,则可以对其进行稀释。可以通过任何常规方式,通过添加稀释剂例如(工艺)水进行稀释。可以计量稀释。
[0049] 虽然可以通过常规方式进行该工艺步骤,但这些步骤的一些参数可以与特定的已知常规方法中的参数不同,如下文更详细描述的那样。
[0050] 在步骤a)中,可以使用任何合适的碳源。在一种实施方式中,在步骤a)中,碳源可以是稀释的木质纤维素水解物,更具体的是在水中稀释两倍或更多倍的木质纤维素水解物。
[0051] 在步骤a)中,向反应器中加入细胞。通过已知的方式(例如以细胞群体的形式)向反应器内容物中加入细胞(接种)。细胞群体可以以干细胞(作为乳膏)的形式加入或悬浮于水中。
[0052] 向反应器中加入碳源、稀释碳源和接种这些步骤也可以以任何其它方式进行:将碳源、稀释剂和初始细胞合在一起,加入例如碳源中,并且可以在不同于反应器中的另一个容器中合并碳源和稀释剂,以供稍后在反应器中使用。
[0053] b)任选地,以分批模式在反应器中发酵初始细胞群体。在该任选步骤中,在一定条件下,以已知方式发酵初始细胞群体,从而使碳源用于使细胞生长并/或用于产生发酵产物。
[0054] c)向反应器中逐渐加入包含甘油和任选的糖的碳源;
[0055] 在该步骤中,向反应器中逐渐加入包含甘油和任选的糖的碳源。
[0056] 本发明允许在乙醇发酵中使用第一代乙醇设备釜馏物作为甘油来源。因此,在一种实施方式中,向发酵培养基中加入第一代釜馏物。
[0057] 可以使用的釜馏物的干物质含量范围是常见的,例如,10-60wt%或20-40wt%。甘油浓度通常可以为15g/l-200g/l,例如80-120g/l或约100g/l。
[0058] 在本发明的一个实施方式中,在乙醇发酵中使用源自基于酯交换反应的生物柴油方法的甘油作为甘油来源。
[0059] 在一种实施方式中,在葡萄糖基本耗尽之后(例如当葡萄糖浓度为2g/l或更低时)或在葡萄糖耗尽之后,加入甘油。
[0060] 在一种实施方式中,加入的甘油的量使得反应器中甘油的摩尔浓度为反应器中乙酸的摩尔浓度的约两倍。例如,反应器中甘油的摩尔浓度可以是反应器中乙酸的摩尔浓度的1.8-2.2倍。在一种实施方式中,加入的甘油来源自基于淀粉或基于蔗糖的乙醇生产设备。
[0061] 在一种实施方式中,所添加的甘油来源自基于酯交换反应的生物柴油生产设备。
[0062] 在一种实施方式中,当反应器中的葡萄糖浓度为2g/l或更低时,开始加入甘油。
[0063] 向水解物或水解物进料中加入甘油来源以使甘油浓度在一定范围内,例如对于17%ds pCS而言<8g/l(参见对比实验C),对于%ds较高的水解物而言可以更高。在一种实施方式中,浓度使得甘油的mol数=HAc的mol数*2。例如甘油的mol数=HAc的mol数*1.8-
2.2的范围也是合适的。糖可任选地与甘油一起加入。糖可以是任何糖,例如葡萄糖、木糖和/或阿拉伯糖,单独地或作为任何底物(例如木质纤维素水解物和/或木质纤维素水解物的级分)的一部分。
[0064] 在一种实施方式中,通过添加充足的木质纤维素水解物,使处于分批补料模式的分批补料反应器中的混合物的pH保持基本恒定。在一种实施方式中,分批补料反应器中乙酸的浓度为30g/l或更低。在一种实施方式中,进料到分批补料反应器中的木质纤维素水解物的速率为0.10h-1或更低。在一种实施方式中,进料到分批补料反应器中的木质纤维素水解物的速率为0.01h-1–0.10h-1。在一种实施方式中,处于分批补料模式的反应器中的pH为pH 4至pH 7、优选地pH 4至pH 5。在一种实施方式中,酵母能够厌氧发酵至少一种C6糖和至少一种C5糖。
[0065] d)充足的发酵时间之后,从所述反应器中分离发酵产物。充足的发酵时间是形成期望量的发酵产物时的时间。这尤其取决于所用微生物、微生物的接种物(pitch)和碳源。例如,合适的发酵时间可以为例如约72小时、约60小时、约48小时或约24小时。
[0066] e)任选地,将步骤d)的分离后剩余的级分保留为废液;和
[0067] 可以利用已知的技术(例如分离和贮存技术)进行该步骤。
[0068] f)任选地,在步骤a)中使用所述废液稀释所述碳源。
[0069] (与未发酵的水解物相比)具有显著降低的HAc含量是废液(即,来自使用HAc转化菌株与如本文所述的进料策略的组合的发酵方法的发酵培养液)的一个独特特征。这允许(部分)废液或蒸馏的发酵液(釜馏物)再循环进入随后的增殖和发酵循环的分批相,而不引入抑制浓度的HAc。
[0070] 如果这种废液还含有残留的甘油,则使其在随后的发酵循环中所应用的级分中再循环,以降低水解物所需的甘油补充,从而改善转化过程的经济性。
[0071] 因此,本发明包括使具有降低的HAc含量并含有残留甘油的发酵液的一部分再循环进入随后的增殖或发酵循环的分批相。
[0072] 本发明还涉及根据上文所述方法获得的发酵产物。在一种实施方式中,发酵产物是乙醇。在一种实施方式中,向发酵方法中加入增殖方法。在一种实施方式中,一种或多种方法是连续的。
[0073] 木质纤维素水解物
[0074] 本文中的木质纤维素水解物是任何水解的木质纤维素。本文中的木质纤维素是生物质。它在本文中包括半纤维素和生物质的半纤维素部分。木质纤维素还包括生物质的木质纤维素级分。合适的木质纤维素材料可见以下列表:果园底料,树丛,磨坊废弃物,城市木材废弃物,市政废弃物,伐木废弃物,森林疏伐废弃物,短期轮种木本作物,工业废弃物,小麦秸,燕麦秸,水稻秸,大麦秸,黑麦秸,亚麻秸,大豆壳,稻壳,水稻秸,玉米谷蛋白饲料,燕麦壳,甘蔗,玉米秆,玉米杆,玉米芯,玉米壳,柳枝稷,芒草,高粱,芸苔茎,大豆茎,牧场草,磨擦禾,狐尾草;甜菜浆,柑橘果实浆,种子壳,纤维素动物粪便,草坪修剪废弃物,花,海藻,树木,软木材,硬木材,白杨,松树,灌木丛,草,小麦,小麦秸,甘蔗渣,玉米,玉米壳,玉米棒,玉米粒,来自玉米粒的纤维,来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物,市政固体废弃物,废纸,庭院废弃物,草本材料,农业残余物,林业残余物,市政固体废弃物,废纸,纸浆,造纸厂残余物,树枝,灌木,甘蔗,玉米,玉米壳,能源作物,森林,水果,鲜花,谷物,草,草本作物,树叶,树皮,针叶,原木,根,树苗,灌木丛,柳枝稷,树木,蔬菜,水果皮,藤蔓,甜菜浆,小麦麸皮,燕麦壳,硬木材或软木材,由农业加工产生的有机废弃物材料,林业木材废弃物或其中任意两种或更多的组合。
[0075] 木质纤维素水解物可以是酸性的。在一种实施方式中,木质纤维素水解物包含有机酸。可存在于木质纤维素水解物中的有机酸的实例有乙酸和甲酸。在一种实施方式中,有机酸是乙酸。酸性木质纤维素水解物是来自其中使用酸的预处理的常见产物,其导致形成乙酸。
[0076] 细胞
[0077] 本发明中使用的细胞能够转化糖、甘油和乙酸。
[0078] 在一种实施方式中,所述细胞能够由乙酸和甘油产生发酵产物(例如,乙醇),同时还具有发酵己糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等)以及戊糖(如木糖和阿拉伯糖)的能力。
[0079] 在一种实施方式中,所述细胞是酵母细胞。合适酵母细胞的实例是经遗传修饰的酵母细胞,其包含:
[0080] a)编码异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)的一个或多个核苷酸序列;
[0081] b)编码同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的一个或多个核苷酸序列;
[0082] c)编码异源甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)的一个或多个核苷酸序列;和
[0083] d)编码同源或异源二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的一个或多个核苷酸序列。
[0084] 在一种实施方式中,所述细胞具有编码甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或编码甘油3-磷酸脱氢酶基因的一个或多个内源核苷酸序列的缺失或破坏。例如欧洲专利申请EP13182222.3中描述了这种细胞,其内容被并入本文。
[0085] 在一种实施方式中,酵母细胞具有编码甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或编码甘油3-磷酸脱氢酶基因的一个或多个内源核苷酸序列的缺失或破坏。在一种实施方式中,在所述方法期间,不需要向反应器中的混合物中添加
[0086] 在一种实施方式中,酵母能够代谢有机酸,优选代谢乙酸。在一种实施方式中,细胞具有编码甘油转运体的一个或多个核苷酸序列。欧洲专利申请EP13182225.6中描述了这种细胞,其内容被并入本文,例如来自Zygosaccharomyces rouxii(ZYRO0E01210p)的甘油转运体。
[0087] 在一个实施方式中,细胞能够发酵C5和/或C6糖,例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖或半乳糖。在本发明的一种实施方式中,经转化的宿主细胞包含以下之一种或多种:xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因,以允许经转化的宿主细胞发酵木糖;以及araA、araB和araD基因的一个或多个或者2-10个拷贝,其中这些基因可以整合到细胞基因组中,以允许细胞发酵阿拉伯糖;醛糖还原酶(GRE3)基因的缺失;PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1的过表达,以允许提高细胞中通过戊糖磷酸通路的通量。
[0088] 在一个实施方案中,经转化的宿主细胞是工业细胞,更优选地是工业酵母。工业细胞和工业酵母细胞可如下定义。工业方法中(酵母)细胞的生存环境与实验室中显著不同。工业酵母细胞必须能够在所述方法期间可能变化的多种环境条件下表现良好。此类改变包括养分来源、pH、乙醇浓度、温度、氧浓度等等的改变,它们一起对Saccharomyces cerevisiae的细胞生长和乙醇生产具有潜在的影响。在不利的工业条件下,环境耐受菌株会允许强健的生长和生产。对使用工业酵母菌株的应用(例如烘焙工业、酿造工业、造酒和乙醇工业)中可能发生的环境条件中的这些改变而言,工业酵母菌株通常更加强健。在一种实施方式中,以工业宿主细胞为基础构建工业经转化的宿主细胞,其中所述构建如下文所述进行。工业酵母(S.cerevisiae)的实例是Ethanol (Fermentis)、 (DSM)
和 (Lallemand)。
[0089] 在一种实施方式中,经转化的宿主细胞是抑制物耐受的。抑制物耐受是对抑制性化合物的抗性。
[0090] 乙酸
[0091] 乙酸在本文中被理解为包括等效的乙酸酯(盐)。乙酸(即,乙酸/乙酸酯(盐))以及甲酸/甲酸酯(盐)形成水解的木质纤维素材料的一部分,其可以用作本发明的碳源。木质纤维素水解物含有大量乙酸,其是微生物(例如酵母)的发酵能力的有效抑制物。因此,在根据本发明的方法中,避免了乙酸对细胞的抑制。所述方法可以根据以下实施方式进行。
[0092] 在厌氧或缺氧的分批补料发酵方法中,反应器中发酵液的pH高于进料的pH(对于分批补料而言)。在一种实施方式中,乙酸的进料低于细胞的乙酸转化率。
[0093] 在一种实施方式中,进行分批补料发酵方法时发酵培养基中乙酸的浓度为3-15g/l HAc。在一种实施方式中,反应器中发酵液的pH值≤5且≥3.5,例如pH为4-4.5。
[0094] 在一种实施方式中,保持分批补料发酵方法中的底物浓度(C6和C5糖、甘油和HAc)低,例如10g/l或更低、7g/l或更低、5g/l或更低或2g/l或更低。
[0095] 分批补料方法
[0096] 分批补料方法可以是发酵方法,即产生发酵产物的方法;或增殖方法,其中细胞是产物。在一种其实施方式中,所述方法是组合的连续增殖&发酵方法。
[0097] 在一种实施方式中,增殖方法是需氧的限碳且/或pH受调节的分批补料增殖。HAc转化是这种方法中的限速步骤。
[0098] 分批补料的优点包括:
[0099] 在发酵期间,乙酸(HAc)以及其它底物(C6和C5糖、甘油)的浓度均保持较低,从而消除/降低了它们各自的生长抑制效应(去偶联、渗透等)。与分批发酵或传统的限糖分批补料发酵相比,这导致:
[0100] ·能够进行下述水解物发酵,其中HAc对酵母生长和存活的影响严重至它们导致生物催化剂的活性不足以完成底物转化。
[0101] ·降低抑制物含量不太严重的水解物对酵母接种物的要求。
[0102] ·通过以下方式降低发酵中细菌污染物的险和实际的糖损失:
[0103] ■使得能够在低于常用于木质纤维素水解物发酵的pH 5-5.5的pH值下发酵含HAc的木质纤维素水解物。现在甚至可以在低于HAc的pKa的pH下进行发酵;
[0104] ■与限糖或非限糖的分批补料发酵相比,整个发酵过程中的EtOH浓度更高;与分批发酵相比,EtOH浓度甚至更高;
[0105] ■这些效应还能降低/消除对添加抗生素的要求。
[0106] ■该方法导致酶促水解后和发酵前对滴定剂的要求更低,成本节省了0.01-0.02$/gal产生的EtOH(相较于在发酵前用调节pH的17%dm玉米秆水解物)。
[0107] 通过以下实施例来阐释本发明,不应将其解释为限制本发明的范围。实施例
[0108] 材料和方法
[0109] 培养基
[0110] 在含有10g/l酵母提取物、20g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖和15g/l琼脂(YPhD)的固体培养基上,并在含有200mg/l组氨酸且用6N KOH设定为pH 6.0的液体矿质培养基(Luttik等人,2000)中预培养菌株。
[0111] 使用合成矿质培养基(Luttik等人2000)或(NREL)预处理的玉米秆水解物进行发酵实验。每当在组氨酸营养缺陷型的特定发酵实验中应用菌株时,便用该氨基酸补充发酵培养基至终浓度为200mg/l。实验说明中分别列出了糖、乙酸和甘油的初始pH和浓度。
[0112] 对于预处理的玉米秆水解物的发酵而言,使用2个不同批次。二者源自分别从NREL获得的稀酸预处理的玉米秆,并且在使用2M氨将预处理材料的pH(从约1-2)调节至pH 4.5之后,使用DSM的专利酶混合物进行酶促水解。表1中给出了这些水解物的组成。
[0113] 表1.NREL稀酸预处理的、酶促水解的玉米秆水解物的组成
[0114]化合物 批次1 批次2
糖单体: (g/l) (g/l)
葡萄糖 63,0a 64,5b
木糖 40,9a 33,6b
阿拉伯糖 4,8a 4,1b
甘露糖 1,1a  
半乳糖 2,5a  
果糖 0,1a  
抑制物和副产物: (g/l) (g/l)
乙酸b 5,1 5,1
乳酸b ND ND
b
甲酸 0,3 0,2
甘油b ND 0,4
乙醇b ND ND
羟甲基糠醛(HMF)b 0,2 0,4
b
糠醛 1,0 0,7
其它分析:    
pH 4,2 4,3
干物质(%(m/m)) 17,3 19,5
密度 1,06g/ml 1,05g/ml
[0115] a通过HPAEC分析测定,b通过HPLC-H分析测定,
[0116] ND=未检出,无或存在可忽略的量。
[0117] 通过离心(30分钟,4520x g)然后在发酵前过滤(106μm)上清液来除去水解物中的悬浮固体。这是为了允许通过OD测量监测酵母生长,并简化实验室规模的分批补料发酵中水解物的进料。
[0118] 除非另有说明,加入氨(25%(w/v))以将pH调节至5.5并充当氮源。为了防止水解物中存在的任何细菌污染物的增长,加入新霉素和青霉素G至终浓度分别为50μg/ml和100μg/ml。向每种水解物中加入约250μl/l酮消泡剂(Dow Corning 1520)以防发泡。
[0119] 加入如上所述的大批量供应的2种工业副产物流之一作为甘油来源;为“糖浆”或“粗甘油”。
[0120] 糖浆(有时也被称为“可溶物”)是从传统的(第一代)玉米淀粉-朝向-乙醇设备获得的釜馏物的浓缩液体级分(通过蒸发)。“粗甘油”是从基于酯交换反应的生物柴油生产设备获得的。表2中给出了这些甘油来源的组成。
[0121] 表2.工业甘油来源“糖浆”和“粗甘油”的组成
[0122]化合物 糖浆 粗甘油
糖单体: (g/l) (g/l)
葡萄糖 a b
木糖 a b
阿拉伯糖 a b
抑制物和副产物: (g/l) (g/l)
乙酸b 1,9  
乳酸b 20,9  
甲酸b ND  
甘油b 106,9  
乙醇b ND  
羟甲基糠醛(HMF)b ND  
糠醛b ND  
其它分析:    
pH    
干物质 %  
密度 g/ml g/ml
[0123] a通过HPAEC分析测定,b通过HPLC-H分析测定,
[0124] ND=未检出,无或存在可忽略的量。
[0125] 菌株
[0126] 实验中使用的菌株为YD01248、YD01397和YD01437,其随后如下所述源自RN1001、RN1041和RN1069。
[0127] 菌株RN1001是菌株RN1041的亲本菌株,即在HIS3基因缺失之前。
[0128] WO 2012/067510中已经描述了RN1041。该菌株具有以下基因型:MAT a、ura3-52、leu2-112、his3::loxP、gre3::loxP、loxP-pTPI1::TAL1、loxPpTPI1::RKI1、loxP-pTPI1-TKL1、loxP-pTPI1-RPE1、δ::pADH1-XKS1-tCYC1-LEU2、δ::URA3-pTPI1-xylA-tCYC1。MAT a=接合型a,分别在URA3、LEU2和HIS3基因中的ura3-52、leu2-112、HIS3::loxP突变。ura3-52突变由Piromyces xylA过表达构建体上的URA3基因补充;leu2-112突变由XKS1过表达构建体上的LEU2基因补充。HIS3基因的缺失产生组氨酸营养缺陷型。出于这个原因,RN1041需要培养基中的组氨酸才能生长。
[0129] gre3::loxP是编码醛糖还原酶的GRE3基因缺失。去除标记后loxP位点留在基因组中。
[0130] loxP-pTPI1指在本文描述的实验中,通过用TPI1基因的启动子置换天然启动子,来过表达非氧化磷酸戊糖途径的基因。去除标记后TPI1组成型强启动子上游的loxP位点留在基因组中(Kuyper等,FEMS Yeast Research 5(2005)925-934)。
[0131] δ::意为在Ty1反转座子的长末端重复序列上重组后,构建体的染色体整合。
[0132] 菌株RN1069源自RN1041:通过基因置换破坏了GPD1和GPD2基因。WO2013/081456中也详细描述了菌株RN1069的构建。菌株RN1069的基因型为:MAT a、ura3-52、leu2-112、his3::loxP、gre3::loxP、loxP-pTPI1::TAL1、loxP-pTPI1::RKI1、loxP-pTPI1-TKL1、loxP-pTPI1-RPE1、δ::pADH1-XKS1-tCYC1-LEU2、δ::URA3-25pTPI1-xylA-tCYC1gpd1::hphMX、gpd2::natMX。由于未知的原因,该菌株已丢失了其natMX-标记,即不再耐诺尔丝菌素。这允许在随后的转化实验中使用该标记。但也可以使用另一种标记来代替。
[0133] WO2015028583中已描述了菌株YD01248,参见例如实施例2和3。
[0134] 表3:在菌株YD01248中表达的、编码期望的酶活性的甘油/乙酸基因。
[0135]基因 来源生物体 酶活性
acdH Lactobacillus plantarum 乙醛脱氢酶
ACS2 Saccharomyces cerevisiae 乙酰辅酶A连接酶
gldA Escherichia coli 甘油脱氢酶
DAK1 Saccharomyces cerevisiae 二羟基丙酮激酶
[0136] 通过移除选择标记物并引入来自Zygosaccharomyces rouxii的推定甘油转运体从菌株YD01248得到菌株YD01437,菌株YD01437详细描述于WO2015028583中,特别是实施例6和7中,菌株T5。
[0137] 预培养物制备
[0138] 将接种环量的冷冻(甘油)贮存培养物在YPhD(参见“培养基”)上划线,并在30℃下孵育3天。将获得的酵母生物质从琼脂平板转移到含有200ml矿质培养基(Luttik等,2000)的500ml摇瓶中,所述矿质培养基含有200mg/l组氨酸并且已经用6N KOH设定为pH 6.0。将培养物在振荡培养箱(200RPM)中在32℃孵育过夜(17-20小时)。通过离心(3分钟,13500x g)收获细胞,并用50ml冷(4℃)无菌脱矿质水洗涤。将细胞沉淀悬浮在1/3原始培养体积的冷(4℃)无菌脱矿质水中。使用先前确定的特定菌株的(干)酵母生物质和OD700之间的线性相关性,由悬浮液的OD700计算发酵接种体积。
[0139] 分批发酵条件
[0140] 除非另有说明,每个发酵试验使用500ml烧瓶中体积为400ml的发酵培养基(80%填充),将其从预培养细胞的悬浮液接种至(干)酵母生物质浓度为约0.5g/l。当在发酵中使用组氨酸营养缺陷型菌株时,向水解物培养基中加入组氨酸至终浓度为200mg/l。
[0141] 使用乙醇发酵监测仪(AFM)(Applikon Biotechnology,Schiedam,荷兰)进行分批发酵试验,将温度控制在32℃,并在250RPM下搅拌。发酵期间不控制发酵液的pH。通过AFM在线测量CO2产生,其与乙醇(EtOH)形成和生物质形成的总和相关,并在发酵过程中定期取样,以测定酵母生长、底物利用和产物形成。
[0142] 分批补料发酵条件
[0143] 类似于分批发酵实验进行分批补料发酵。在终体积为400-800ml时,使用生物活性监测仪(BAM)(Halotec,Veenendaal,荷兰);其基本上是AFM仪器的前身,其中将发酵烧瓶用常规磁力搅拌器搅拌并使用水浴在32℃下孵育。使用配备有HPLH 20VS或HPLH 200VS头(CAT,Staufen,德国)的可编程HPLH泵定量加入进料。
[0144] 使用Minifors发酵罐(Infors-HT,Basel,瑞士)进行终体积为800-2000ml的分批补料发酵,以及其中监测pH的所有其它实验。
[0145] 样品分析
[0146] 使用配备有保护柱(Bio-Rad H筒)和Aminex HPX-87H柱(300x7.8mm;Bio-Rad,Hercules,USA)的带有柱温箱CTO-10A-vp和自动注射器SIL-10AD-vp的Shimadzu(’s-Hertogenbosch,荷兰)定量发酵液样品中的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乙醇、乙酸和甘油。在80℃下利用5mM H2SO4以0.6ml*min-1进行洗脱。使用示差折光检测器RID-10A(Shimadzu,’s-Hertogenbosch,荷兰)监测洗脱液。
[0147] 请注意,当使用这种分离柱时,木糖、果糖、甘露糖和半乳糖具有相似的保留时间。因此,标有“使用HPLC-H分析”的木糖的报告数量包括所有这些糖单体。从表1可以看出,所用水解物的木糖含量比这些其它糖单体的木糖含量高得多,因此这些其它糖单体对报告的木糖数量只有很小的影响。
[0148] 如上所述,通过高效阴离子交换色谱法(HPAEC)分别分析单糖浓度(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖)。在配备有Dionex CarboPac PA-1柱(4mm ID x 250mm)连同Dionex  CarboPac  PA保护柱(4mm  x 50mm)和ED50-检测器(Dionex)的Dionex(Sunnyvale,USA)ICS3000系统上进行HPAEC。用水进行23分钟等度洗脱(20℃,1ml*min-1)。
每次洗脱后,进行洗涤步骤(2分钟,0.15M NaOH;3分钟,0.15M NaOH+1M NaAc;1分钟,0.15M NaOH)和平衡步骤(1分钟,水)。
[0149] 通过在分光光度计(Perkin-Elmer Lambda 2)中测量700nm处样品的OD来估计发酵培养液样品中的酵母生物质浓度,根据发酵培养基的OD进行校正,并使用先前确定的(菌株和仪器-特异性)线性相关因子来计算(干)酵母生物质。必要时,将培养液样品稀释至该线性范围(通常介于0-1OD单位之间)。
[0150] 对比实验A
[0151] 菌株YD01248的发酵特征
[0152] 使用菌株YD01248在含有约20g/l葡萄糖、20g/l木糖、2g/l乙酸和5g/l甘油的合成培养基上发酵。利用6M KOH将培养基的初始pH调节至4.5。将发酵培养基接种至OD 600为约0.9(相当于约0.15g/l(干)酵母生物质)。图1中给出了结果。YD01248在合成培养基上的发酵性能;糖转化和EtOH产生(A)、甘油转化和HAc转化、生物质(B)。
[0153] 从图1可以推断出:在葡萄糖发酵期间,直到稍晚于24小时,没有发生显著的甘油转化。只有在葡萄糖水平降至低于约5g/l之后,甘油转化才开始。
[0154] 在发酵的前24小时,乙酸水平略有下降(从2.2g/l到1.6g/l)。在该阶段期间,需要发生乙酸转化,以平衡氧化还原当量(将细胞生长过程中产生的NADH再氧化为NAD+)。然而,24小时后,当甘油转化加速时,乙酸转化的速率也加快。在24小时和72小时之间,由于甘油转化和一定程度的酵母生长(直至48小时),更多乙酸被转化。
[0155] 然而,虽然培养基中存在理论上充足的甘油以向细胞提供足够的NADH,旨在将所有HAc转化为EtOH,但是当甘油转化和HAc转化由于木糖耗尽而停止时,发酵培养基中残留0.8g/l HAc。
[0156] 为了改善甘油进入细胞从而提高其转化度,在对比实验B所述的实验中提高外部提供的甘油的浓度。
[0157] 对比实验B
[0158] YD01248在不同甘油浓度的合成培养基中的发酵特征
[0159] 使用菌株YD01248在含有约20g/l葡萄糖、20g/l木糖、2g/l乙酸的合成培养基上发酵。分别以0g/l、5g/l、10g/l、15g/l、20g/l和30g/l向培养基中加入甘油。利用6M KOH将培养基的初始pH调节至4.5。将发酵培养基接种至OD 600为约0.9(相当于约0.15g/l(干)酵母生物质)。结果示于图2。图2显示:将发酵培养基中的甘油浓度从5g/l提高到30g/l会导致更高程度的甘油(2D)转化和HAc(2C)转化。然而,这些提高的甘油浓度会负面影响葡萄糖(2A),并且更大程度地负面影响木糖转化(2B)。
[0160] 对比实验C
[0161] YD01248在不同甘油浓度的木质纤维素水解物上的发酵特征
[0162] 以0.5g/l(干)酵母生物质的量,使用菌株YD01248在预处理的玉米秆水解物(NREL批次1,参见表1)上发酵。分别以0g/l(参照物)、2g/l、4g/l、6g/l、8g/l和15g/l向发酵培养基中加入甘油。利用6M KOH将培养基的初始pH调节至5.5。
[0163] 结果示于图3和图4。图3显示:木质纤维素水解物中的甘油(3D)转化和HAc(3C)转化比合成培养基上的甘油转化和HAc转化(参见对照实验B)低得多。尽管以高达6g/l的浓度添加甘油仅有限地负面影响糖转化,但是在8g/l和更高的浓度下,其抑制效果看起来急剧增加(3A、B),这是允许完全转化水解物中存在的HAc所必需的。从图4可以看出,提高发酵液中的甘油浓度不仅会负面影响酵母的生长速率(A)并从而负面影响发酵中存在的生物催化剂的总量,而且会负面影响单位生物质的葡萄糖消耗率(B)和木糖消耗率(C),这两种效应都有助于次佳的糖转化(率)。
[0164] 这些结果表明:当使用比得上YD01248的甘油转化和HAc转化菌株发酵补充有甘油的木质纤维素水解物时,待用于发酵培养基中的最佳甘油浓度是增加的甘油/HAc-转化与(C5)糖转化程度之间的权衡。
[0165] 由于在葡萄糖浓度变低之前不使用甘油,所以改善这种权衡的一种方法是:在转化开始之前(处于低葡萄糖浓度),不向发酵提供甘油。从而避免了甘油对酵母的葡萄糖转化和生长率的负面影响,而不损害甘油转化。为了验证这一假设,进行对比实验D中描述的实验。
[0166] 对比实验D
[0167] 在葡萄糖发酵结束时加入甘油进行木质纤维素水解物的分批发酵
[0168] 以0.5g/l(干)酵母生物质的量,使用菌株YD01248在预处理的玉米秆水解物(NREL批次1,参见表1)上发酵。利用6M KOH将培养基的初始pH调节至5.5。
[0169] 由于甘油仅在葡萄糖降至低于约5g/l之后才转化(先前的对比实验C),所以在葡萄糖几乎耗尽(50小时)时加入甘油至浓度分别为0g/l(参照物)、2g/l、4g/l、6g/l、8g/l和15g/l,以防止在葡萄糖发酵阶段抑制酵母生长。
[0170] 图5显示:在葡萄糖(几乎)耗尽并且大部分生长已发生(5A)时向发酵培养液中加入甘油,避免了抑制酵母生物质形成。应用该策略时,可以应用在对比实验C中证明强烈抑制糖转化的甘油浓度(≥8g/l),以改善甘油(5D)转化和HAc(5E)转化,而不会很大程度地损害糖转化,这相较于在发酵开始时添加甘油,导致更有效的乙醇生产。发酵120小时之后,实现了最高的甘油转化和HAc转化,分别提高了1.0g/l(1.4g/l到2.4)和0.4g/l(1.2g/l到1.6g/l)。
[0171] 应用该方法时,甘油转化和HAc转化的最佳甘油浓度≥15g/l。然而,添加甘油至其浓度高于完全转化给定水解物中存在的HAc理论所需浓度(对于含5.1g/l HAc的这种特定的NREL预处理的玉米秆水解物:15.6g/l甘油,化学计量转化率为2摩尔甘油酶/1摩尔HAc(忽略由厌氧酵母生长产生的NADH所实现的HAc转化))从经济度来看是次佳的,因为其将不可避免地留下相对大量的未转化甘油。
[0172] 这个问题的更好解决方案是:通过使得能够进行葡萄糖-甘油共转化,将甘油/HAc转化期从仅在木糖发酵阶段期间扩展到发酵的整个持续时间,以改善甘油(和伴随的HAc)转化。在甘油和HAc-转化酵母菌株(描述于专利申请WO2015028583中)中表达来自Z.rouxii的甘油-质子同向转运体(symporter)能够实现这个方案,并且还会提高酵母对甘油的亲和力,从而可以在发酵液中留下较少残余甘油(对比实验E)。
[0173] 对比实验E
[0174] 使用含有外源甘油同向转运体的菌株分批发酵含有甘油的合成培养基
[0175] 使用菌株YD01397(描述于专利申请WO2015028583中,特别是实施例6和7中,菌株T3)和YD01437(表达来自Z.rouxii的甘油-质子同向转运体,描述于WO2015028583中,特别是实施例6和7中,菌株T5)发酵含约20g/l葡萄糖、20g/l木糖、2g/l乙酸和10g/l甘油的合成培养基,菌株YD01397和YD01437的浓度为约0.125g/l(干)酵母生物质。利用6M KOH将培养基的初始pH调节至4.5。将发酵培养基接种至OD 600为约0.9。
[0176] 图6显示:YD01397中的甘油摄取仅在葡萄糖几乎耗尽(约23小时)之后方才开始,而菌株YD01437在20g/l葡萄糖时明显共转化葡萄糖和甘油。YD01437中的甘油转化率(图7)也显著提高。
[0177] 然而,这种提高水平的甘油输入和/或转化严重抑制了糖转化率和生物质生长。
[0178] 图7在发酵合成培养基的过程中,菌株YD01397和YD01437的单位生物质甘油转化。
[0179] 对比实验F
[0180] 使用表达外源甘油同向转运体的菌株分批发酵补充有甘油的木质纤维素水解物[0181] 对酵母菌株YD01437进行预培养、收获、洗涤并重悬至(干)生物质浓度为50g/l。将含有(900ml)预处理的玉米秆水解物(NREL批次2,参见表1)(补充有12.2g/l甘油并利用6M KOH调节至pH 5.5)的(1000ml)发酵罐接种至基于最终发酵体积为1.0g/l(干)酵母生物质。在32℃下进行厌氧发酵,并以150rpm搅拌。
[0182] 图8显示:菌株YD01437明显共消耗葡萄糖(A)、甘油和HAc(B)。然而,HAc、甘油与水解物混合物中存在的其它化合物的抑制效果的组合导致发酵中的糖转化和酵母生长非常缓慢和低效。通过应用分批补料发酵能够降低这些抑制效果,如实施例1所示。
[0183] 实施例1
[0184] 使用表达外源甘油同向转运体的菌株分批补料发酵补充有甘油的木质纤维素水解物
[0185] 对酵母菌株YD01437进行预培养、收获、洗涤并重悬至生物质浓度为50g/l(干),然后加入到空的(1000ml)发酵罐中至基于最终发酵体积为1.0g/l(干)酵母生物质。随后利用补充有12.2g/l甘油并利用6M KOH调节至pH 5.5的900ml预处理的玉米秆水解物(NREL批次2,参见表1)以恒定的进料速率向发酵罐进料93.75小时。在32℃下进行厌氧发酵,并以
150rpm搅拌。
[0186] 图9所示的获得的发酵数据显示:从进入发酵至少6小时(第一次取样)开始,酵母能够以近似于将其进料到发酵罐的速率转化葡萄糖、木糖、HAc和甘油,从而导致这些底物在发酵过程中保持相对较低,这与对照实验F的分批发酵相反。由于这些低浓度,这些化合物的抑制效应(如对比实验F中所示)显著降低,从而抵消了它们对糖的不利影响,进而导致了发酵120小时之后明显改善的底物转化水平和增加的EtOH含量。
[0187] ·优点:在发酵期间,HAc以及其它底物的浓度(C6和C5糖、甘油)均相对较低,从而降低了它们各自的生长抑制效应(去偶联、渗透等)。与分批发酵或传统的限糖分批补料发酵相比,这导致:
[0188] ·使得能够进行这样的水解物发酵,其中HAc对酵母生长和存活的影响严重至它们导致生物催化剂的活性不足以完成底物转化。
[0189] ·降低抑制物含量不太严重的水解物对酵母接种物的要求。
[0190] 实施例2
[0191] 在降低的pH下分批补料发酵补充有甘油的木质纤维素水解物
[0192] 在实施例1中所述的实验中,与对比实验F的分批发酵相比,HAc、糖和甘油的浓度剧烈降低。为了保持这些化合物对酵母的抑制效应尽可能的低,理想地,在发酵的整个持续时间内,这些浓度接近于0g/l。
[0193] 相较于实施例1(其中2.1g/l HAc保持未转化)中的实验,为了改善HAc转化率,通过加入在酶促水解后未进行pH调节的水解物/甘油混合物来维持发酵培养液的pH较低。因此,可用于转化为EtOH的发酵培养液中未解离的HAc级分增加,并且总残留HAc随后降低。
[0194] 对酵母菌株YD01437进行预培养、收获、洗涤并重悬至生物质浓度为50g/l(干),然后加入到3个空的(1000ml)发酵罐中至基于最终发酵体积为1.0g/l(干)酵母生物质。最初利用补充有12.2g/l甘油并利用6MKOH调节至pH 5.5的预处理的玉米秆水解物(NREL批次2,参见表1)以0.20ml/min的恒定速率(1.31%最终体积/小时,相当于总进料时间为75小时)向发酵罐进料。在32℃下进行缺氧发酵,并以150rpm搅拌。
[0195] 图10显示:从36小时开始添加未经pH调节的进料导致培养液的pH降低(B),但发酵仍然与仅进料pH5.5的水解物/甘油混合物的发酵几乎相同地进行(实施例1,图9)。
[0196] ·优点:通过以下方式降低发酵中归因于细菌污染物的糖损失:
[0197] ·使得能够在低于木质纤维素水解物发酵惯用的pH 5-5.5的pH值下发酵含HAc的木质纤维素水解物。在培养液中的HAc浓度非常低时,甚至可以在低于HAc的pKa的pH下进行发酵,这在传统的(第一代)糖/淀粉-朝向-EtOH设备中是常见的,因为它有利于酵母菌超过细菌生长。
[0198] ·与限糖或非限糖的分批补料发酵相比,整个发酵过程中的EtOH浓度更高;与分批发酵相比,EtOH浓度甚至更高。
[0199] 这些效应还降低/消除了对添加抗生素的要求。
[0200] 实施例3
[0201] 分批补料发酵补充有工业甘油来源的木质纤维素水解物
[0202] 重复实施例1的实验,并通过添加工业副产物流向水解物补充甘油;一种利用(第一代)淀粉-朝向-EtOH的“糖浆”,另一种利用基于酯交换反应的生物柴油“粗甘油”(参见表2的组成)。
[0203] “糖浆”或“可溶物”是从传统的(第1代)玉米淀粉-朝向-乙醇设备(通过蒸发)获得的釜馏物的浓缩液体级分(见表2)。将甘油来源混合到水解物进料中,以使得获得的混合进料中甘油与HAc的摩尔比为2:1。由于这引起水解物的轻微稀释,因此还在表2的最右栏中示出所得混合进料的分析。结果如图11(A-D)所示;甘油来源:1G糖浆(A、C)和源自生物柴油的甘油(B、D)。
[0204] 在发酵转化中引入的另外的糖和HAc在发酵结束时转变为略微提高的EtOH滴度。
[0205] 优点:
[0206] ·釜馏物可在与第一代乙醇设备位于同一位置的生物炼制厂现场直接获得。
[0207] ·釜馏物含有来自C6发酵的(大部分裂解的)酵母的营养物,其在木质纤维素水解物发酵中有益于酵母生长。这些营养物还包括氮,取决于水解物的初始N含量和预期的N源(例如氨)的价格,这会导致节省高达0.03$/gal添加到水解物的N-源。
[0208] ·釜馏物含有来自C6发酵的残留糖,这会提高木质纤维素水解物发酵的可能最终EtOH滴定度。
[0209] ·釜馏物往往含有在C6发酵中产生的HAc,其也可能在木质纤维素水解物的发酵中被转化为EtOH。
[0210] “粗甘油”是从基于酯交换反应的生物柴油生产获得的(见表2)。将其混合到水解物进料中,以使得获得的混合进料中甘油与HAc的摩尔比为2:1。
[0211] ·优点:
[0212] ·粗甘油可以以生物柴油生产的主要副产物的形式大批量获得,其是由植物或动物脂肪和油的酯交换反应生成的。由于杂质(例如甲醇、盐和脂肪酸)的存在,粗甘油的价值相对较低,因此对于本应用而言是经济上有吸引力的甘油来源。
[0213] ·粗甘油会变得越来越容易在与第一代EtOH设备位于同一位置的生物炼制厂(其中由提取的玉米油生产生物柴油)现场作为副产物获得。在这种方法中,使用现场产生的EtOH而非甲醇进行酯交换反应;当在本文所述的发酵方法中应用甘油副产物时,粗甘油中的任何残留EtOH都会被回收。
[0214] ·由于本文所述方法中设想的甘油-水解物共混比中的稀释(4-8倍),浓度相当高的杂质例如盐(K2SO4或NaCl,高达7%w/v)将不是大问题,在由于经济原因而需要利用未稀释或稀释度低的粗甘油的方法中,所述浓度相当高的杂质会抑制微生物转化。
[0215] 当使用粗甘油作为甘油来源时,由于杂质(盐)的引入,发酵速率略微降低。
[0216] 实施例4
[0217] 以pH受调节的进料曲线分批补料增殖和发酵含有甘油的木质纤维素水解物[0218] 为了保持糖、HAc和甘油对酵母的抑制效应尽可能的低,理想地,在发酵的整个持续时间内,这些化合物的浓度为(接近于)0g/l。虽然在木质纤维素水解物中,糖通常以比HAc(和补充的甘油)更高的浓度存在,但是当应用旨在保持所有(抑制酵母的)底物水平低+的进料策略时,甘油和HAc利用是限速的,这是因为甘油和HAc的转化率(通过NAD-NADH辅因子利用而偶联)远低于水解物中存在的糖的转化率。理想地,定量进料与发酵液中的剩余的HAc直接偶联。
[0219] 如在实施例2中所观察到的那样,发酵培养液的pH值指示HAc的残留浓度。因此,通过使用(酸性)水解物进料进行pH调节,可以使残留的HAc偶联的进料自动化,这类似于专利申请WO2014072232-A1中所述的pH受调节的需氧分批补料酵母增殖。加上这种方法的实用性,pH是(乙醇)发酵过程中已经普遍(在线)测量的参数,因此在大规模应用时不需要大的硬件改造投资。
[0220] 通过根据WO2014072232A1进行菌株YD01437的需氧pH受控制的分批补料酵母增殖来开始实验。不调节进料的pH(酶促水解后,从pH 4.3开始)。通过定量加入木质纤维素水解物进料持续72小时,将增殖培养液的pH控制在4.5。此时停止发酵罐通气,之后从发酵罐中移出一部分增殖培养液,在发酵罐中留500ml培养液(相当于发酵罐最小工作体积),其含有23.4g/l(干)酵母生物质。
[0221] 转变为缺氧条件之后,通过定量加入木质纤维素水解物和甘油的混合物,其中甘油与HAc的摩尔比为2:1,将发酵液的pH控制在4.5。还不调节进料的pH值(从pH 4.3开始)。结果如图12所示。在图12中,(A、C)是菌株YD01437在(NREL)预处理的玉米秆水解物上的需氧pH受调节的分批补料增殖,(B、D)是补充有甘油的相同水解物的pH受调节的分批补料发酵。糖转化和EtOH产生(A)、甘油转化和HAc转化、培养液pH和生物质(由OD700计算)(B)。
[0222] 实施例5
[0223] 利用甘油再循环分批补料发酵木质纤维素水解物
[0224] 当向体积相对较小的培养液进料水解物/甘油混合物时,可以通过下述方法来防止发酵早期HAc、甘油和糖的峰浓度:增加分批相体积,从而有效降低进料开始时相对较高的稀释率。可以通过两种方式实现分批相体积的增加:
[0225] 通过以较低的最终酵母生物质浓度进行增殖过程,因此在发酵中使用较大体积的增殖培养液。然而,从经济角度来看,这是不期望的,因为会需要相应较大的增殖罐(propagator),从而导致资本支出(CAPEX)增加。
[0226] 稀释增殖培养液。这通常在木质纤维素水解物的工业发酵中通过向发酵罐中加入生产用水(process water)进行。然而,这也是不期望的,因为会将额外的水引入系统,从而增加总发酵体积(需要较大的发酵罐和增加的资本支出)、降低最终的EtOH滴度(蒸馏中较低的(能量)效率),进而导致运营支出(OPEX)增加。此外,需要在蒸馏的下游处理稀释水(蒸发/厌氧消化池),从而导致生产成本进一步提高(资本支出&运营支出)。
[0227] 来自使用HAc-转化菌株与如本文所述的进料策略组合的发酵方法的发酵液的独特特征之一是:其具有显著降低的HAc含量(与未发酵的水解物相比)。这允许(部分)发酵的培养液或蒸馏的发酵培养液(釜馏物)再循环进入随后的增殖和发酵循环的分批相,而不引入抑制浓度的HAc。
[0228] 如果这种发酵的培养液还含有残留的甘油,则使其在随后的发酵循环中所应用的级分中再循环,以降低水解物所需的甘油补充,从而改善转化过程的经济性。
[0229] 如下开始实验:根据WO2014072232A1在预处理的玉米秆水解物批次3(表1)上进行菌株YD01437的pH受控制的需氧分批补料酵母增殖,其中固定稀释率为0.06hr-1。调节进料的pH(酶促水解后,从4.3到5.5)。50小时(此时已加入了约800ml水解物进料)之后,从发酵罐中收获增殖培养液。此时,增殖培养液含有34g DCW/l酵母生物质,而所有可发酵C源(葡萄糖、木糖、HAc和甘油)的浓度均>1g/l。
[0230] 将等份的30ml发酵液(含有1.0g DCW酵母生物质)转移到分别含有0ml、30ml和90ml再循环发酵培养液的(1000ml)发酵罐中(含有0.4g/l葡萄糖、0.5g/l木糖、1.7g/l HAc和2.8g/l甘油作为可发酵C源,以及47.5g/l EtOH,pH为7.7)。由于这种培养液在从发酵罐中收获之后已被过滤(0.2μm孔径),因此使得能够(在4℃下)贮存而不发生腐败,并且使得能够通过随后发酵中的OD测量来进行生物质监测,这种培养液不含来自先前发酵的酵母活性。随后以恒定的进料速率经94小时向发酵罐中加入总量为745ml的预处理的玉米秆水解物(NREL批次3,参见表1),其补充有14.3g/l甘油并用6M KOH调节至pH 5.5。在32℃进行厌氧发酵,以150rpm搅拌培养液。
[0231] 结果示于图13中。图13显示:通过添加再循环发酵液将分批体积增加至2倍,没有产生不利影响(A、D相对于B、E)。即使以4倍增加分批体积,稀释酵母生物质的效果也是有限的,导致糖转化率略有降低。在通过转化为EtOH而使乙酸浓度降低更具挑战性的发酵中(例如毒性更高的水解物),存在过量进料的风险。当向培养液中加入的HAc比酵母能够转化的HAc多时,残留的HAc导致在发酵培养液中的高浓度,这是由于发酵罐中只有很小的液体体积,因此这种残留的HAc未被大幅稀释。培养液中高浓度的HAc随后抑制其通过酵母转化为EtOH,这可导致发酵卡滞或至少缓慢。通过在进料之前向发酵罐中加入来自先前发酵的脱毒培养液,加入发酵罐的未直接转化的任何HAc被更强烈地稀释,从而有效地阻抑过量进料的抑制作用,并允许培养液中HAc的转化继续进行并且当稀释因子逐渐变得越来越小时,可能在发酵稍后的时候赶上。
[0232] 实施例6
[0233] 偶联的连续增殖和发酵系统
[0234] 图12)示出了该实验的示意图。通过向2个发酵罐(图12:1-2)中填充1/5其终体积的(NREL预处理的玉米秆,批次2)水解物(见表1)和4/5体积的水来开始实验。用营养物补充发酵罐1中的培养基,用釜馏物补充发酵罐2中的培养基(见表2),以使得两个发酵罐中甘油与HAc的摩尔比为2:1)。
[0235] 将发酵罐1接种至新预培养的菌株YD01437的浓度为约0.02g/l,并以1vvm通气(图12:3)。通过搅拌器级联系统(150-500RPM)将溶解氧气控制在20%(图12:4)。酵母利用来自稀释的水解物的可用碳源进行生长和维持。HAc的连续转化导致培养液pH升高(图12:5)。随后通过向发酵罐中定量加入(酸性)水解物(图12:6)来将pH维持在4.5,这有效地导致pH受调节的进料,其使平均稀释率稳定在约0.09hr-1。虽然向发酵罐中加入了额外的水解物,但培养液中HAc的浓度保持在接近0g/l,从而允许酵母有效生长。水解物中酵母生物质的浓度逐渐提高至约46g/l(干)。发酵罐1中的最高水平指示物(图12:8)会触发一个泵,该泵提供从发酵罐1到发酵罐2的连续的增殖培养液流(图12:2)。
[0236] 在发酵罐1中(厌氧)增殖的酵母在发酵罐2中转化葡萄糖、木糖、甘油和HAc。
[0237] 发酵罐2中的最高水平指示物(图12:9)会触发一个泵,该泵提供离开发酵罐2的连续的发酵培养液流(图12:10)。在工业环境中,将这种流进料至蒸馏系统,任选地通过缓冲罐进行。
[0238] 来自发酵罐1的新增殖酵母的连续流入(图12:8)提高了发酵罐2中的酵母浓度,使得达到了一定程度的甘油和HAc转化,其将培养液的pH提高至触发2种单独的进料(水解物(图12:11)和釜馏物(图12:12))到发酵罐2的设定点水平。设定这些进料之间的比例,使得合并的进料流入(水解物+釜馏物)中甘油与HAc的摩尔比为2:1。
[0239] 在这种组合的连续增殖和发酵系统中,在发酵部分中酵母的量与发酵停留时间之间自动建立平衡。通过改变发酵罐1的工作体积可手动调节酵母生物质的通量;(通过调节水平传感器的高度(图12:7));较小的增殖体积会降低酵母产量。
[0240] 可以通过改变发酵罐2的pH控制设置来手动调节HAc转化度;降低这种设置会减少必须转化以触发(酸性)进料的HAc部分。
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