[0001] 本发明涉及构建转蔗糖合酶基因水稻的方法，属于转蔗糖合酶水稻的分子生物学技术领域，具体涉及一种利用蔗糖合酶(OsSUS3)提高水稻稻瘟病抗性的方法。

[0002] 蔗糖合酶(sucrose synthase，EC 2.4.1.13，SUS)是一种糖基转移酶，催化可逆的反应： 一般认为，它在植物体内主要起到蔗糖分解的作用[1,2](Tsai et al.,1970；Su and Preiss,1978)。单子叶模式物种水稻的蔗糖合酶基因家族有6个同源基因，分别命名为OsSUS1-6。当植物遭受到胁迫时，蔗糖(植物体内的主要碳源)就会发生积累，这种现象是植物适应外界环境的一种反馈调节。已有的研究表明蔗糖合酶可通过调节细胞内可溶性糖和渗透压的方式参与抗逆过程。低氧、低温、干旱、高盐、伤害等都会诱导蔗糖合酶的表达上调[3,4](Klotz and Haagenson 2008；Barrero-Sicilia et al 2011)。以氧胁迫为例，玉米SUS双基因突变体(sus1/sh1)缺氧处理时其根尖致死，恢复供氧时不能恢复正常分裂，而野生型根尖恢复供氧后可继续生长[5](Ricard et al 1998)。同样，马铃薯的SUS突变体经过低氧胁迫又恢复供氧后，突变体植株恢复生长的能力减弱[6](Biemelt et al 1999)。缺氧逆境会诱导玉米根系中胼胝质的产生[7](Subbaiah and Sachs 2001)和小麦根系中和纤维素多糖的增加[8](Albrecht and Mustroph 2003)。Atsus1/Atsus4双突拟南芥在通风良好的条件下可正常生长，而在缺氧胁迫条件下生长受抑制[9](Bieniawska et al 2007)。反义抑制黄瓜CsSUS3降低了其抗氧胁迫能力[10](Wang et al 2014)。

[0003] 此外，蔗糖合酶为胼胝质合成提供了底物UDPG，胼胝质在病菌侵染的组织部位积累起到机械屏障作用，将病原体限制在某一个区域中来阻止其向植物组织内进一步扩散；而沉积在筛板孔和胞间连丝上的胼胝质可以调节物质运输的速率，减少细胞间信号和病菌等传播[11,12](Vatén et al 2011； and  2013)。但迄今为止，尚无
蔗糖合酶对提高植物稻瘟病抗性的报道。参考文献：

[0004] 1.Tsai CY,Salamini F,Nelson OE.Enzymes of carbohydrate metabolism in the developing endosperm of maize.Plant Physiol,1970,46:299-306.[0005] 2.Su JC,Preiss J.Purification and properties of sucrose synthase from maize kernels.Plant Physiol,1978,61:389-393.

[0006] 3.Klotz KL,Haagenson DM.Wounding,anoxia and cold induce sugarbeet sucrose synthase transcriptional changes that are unrelated to protein expression and activity.J Plant Physiol,2008,165:423-434.

[0007] 4.Barrero-Sicilia C,Hernando-Amado S,Gonzalez-Melendi P,Carbonero P.Structure,expression profile and subcellular localisation of four different sucrose synthase genes from barley.Planta,2011,234:391-403.

[0008] 5.Ricard B,VanToai T,Chourey P,Saglio P.Evidence for the critical role of sucrose synthase for anoxic tolerance of maize roots using a double mutant.Plant Physiol,1998,116:1323-1331.

[0009] 6.Biemelt S,Hajirezaei MR,Melzer M,Albrecht G,Sonnewald U.Sucrose synthase activity does not restrict glycolysis in roots of transgenic potato plants under hypoxic conditions.Planta,1999,210:41-49.

[0010] 7.Subbaiah CC,Sachs MM.Altered patterns of sucrose synthase phosphorylation and localization precede callose induction and root tip death in anoxic maize seedlings.Plant Physiol,2001,125:585-594.

[0011] 8.Albrecht G,Mustroph A.Localization of sucrose synthase in wheat roots:increased in situ activity of sucrose synthase correlates with cell wall thickening by cellulose deposition under hypoxia.Planta,2003,217:252-260.

[0012] 9.Bieniawska Z,Barratt DH,Garlick AP,Thole V,Kruger NJ,Martin C,Zrenner R,Smith AM.Analysis of  the sucrose synthase gene family  in Arabidopsis.Plant J,2007,49:810-828.

[0013] 10.Wang  HY,Sui XL,Guo  JJ,Wang  ZY,Cheng  JT,Ma  S,Li X,Zhang ZX.Antisense suppression of cucumber(Cucumis sativus L.)sucrose synthase 3(CsSUS3)reduces hypoxic stress tolerance.Plant Cell Environ,2014,37:795-810.[0014] 11.Vatén A,Dettmer J,Wu S,Stierhof YD,Miyashima S,Yadav SR et al.,Callose biosynthesis regulates symplastic trafficking during root development.Developmental cell,2011,21:1144-1155.

[0015] 12. B, I.Callose:the plant cell wall polysaccharide with multiple biological functions.Acta physiologiae plantarum,2013,35:635-
644.

[0016] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种利用蔗糖合酶提高水稻稻瘟病抗性的方法，即利用转基因技术对水稻进行遗传改良，提高稻瘟病抗性，为水稻抗稻瘟病育种做理论以及技术上的探索。

[0017] 本发明的目的是这样实现的：

[0018] 一、利用蔗糖合酶提高水稻稻瘟病抗性的方法(简称方法)

[0019] 本方法包括下列步骤：

[0020] ①从水稻中克隆OsSUS3基因cDNA

[0021] 水稻蔗糖合酶3(OsSUS3)基因编码区序列如SEQ ID NO：1，cDNA长度为2643bp；

[0022] ②构建OsSUS3基因在次生细胞壁合成时表达的载体，并转化水稻中花11，获得转基因植株：转OsSUS3基因水稻种子Sus3(Oryza sativa Sus3)，于2017年1月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：P201702；

[0023] ③将获得的转OsSUS3基因的水稻材料苗期进行稻瘟病抗性的测定。

[0024] 本发明具有下列优点和积极效果：

[0025] 1、OsSUS3只在茎秆叶片等次生细胞壁大量合成的器官中增强表达，在胚乳中表达不增加；

[0026] 2、增加OsSUS3基因在水稻中的表达量，使转基因水稻稻瘟病(苗期)病斑长度减少了17％，病斑数目减少了37％。附图说明

[0027] 图1是转OsSUS3基因水稻的稻瘟病抗性比较图片。

[0028] 左2株是对照；右2株是转OsSUS3水稻。

[0029] 图2是稻瘟病病斑数目测定数据比较图。

[0030] 图3是稻瘟病病斑长度测定数据比较图。

[0031] 图4是载体构建示意图。

[0032] 转Ossus3基因水稻种子Sus3(Oryza sativa Sus3)，于2017年1月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：P201702。
具体实施方式：

[0033] 一、实施例1：AtCESA8启动子和OsSUS3基因cDNA的克隆

[0034] 从拟南芥中克隆AtCESA8启动子全长，长度为949bp。从水稻中克隆OsSUS3基因cDNA，长度为2643bp，其中CDS为2451bp。PCR产物经过回收，酶切，连接载体。

[0035] ——以拟南芥的基因组DNA为模板，合成引物扩增AtCESA8启动子。

[0036] F1：CCCAAGCTTCAGAGGAAACTCAGATGTGATGA；

[0037] R1：ACGCGTCGACCTTCGAATTCCCCTGTTTGGAGA；

[0038] ——合成引物扩增OsSUS3cDNA

[0039] F2：ACGCGTCGACTTTCCTCCTCTTCTCCTTT；

[0040] R2：ACTGGCCCTGAAATCAAC

[0041] 二、实施例2：表达载体的构建

[0042] 1、拟南芥AtCESA8启动子超表达水稻的OsSUS3载体(pC1300T-AtCESA8-OsSUS3)的构建(见图3)：

[0043] ——将启动子和OsSUS3cDNA序列分别连接T载体后，酶切，转入表达载体pC1300T。

[0044] 三、实施例3：植物表达载体转化农杆菌

[0045] 1、农杆菌活化

[0046] 将保存的农杆菌(EHA105)在固体LB培养基上画线(加抗生素：Kan，如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性)，抗生素浓度为：50μg/mL，28℃培养1-2天，然后转移到新的加有抗生素的固体LB培养基上再培养2天；

[0047] 2、农杆菌感受态细胞的制备

[0048] 将100μL接种于1mLLB液体培养基中，150rpm 28℃振荡培养过夜；

[0049] 吸取1mL菌液接种到100mL液体培养基中培养至OD600＝0.5；

[0050] 将菌液置冰上30min，使培养物冷却到0℃；

[0051] 4℃，5000rpm离心30s，弃去上清液；

[0052] 沉淀用60mL 0.1M CaCl2悬浮，冰浴30min；

[0053] 5000rpm离心30s，弃去上清液；

[0054] 每管用100μL含15％甘油的20mMCaCl2悬浮，用于转化；

[0055] 制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200μL分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转-80℃保存，使用时从-80℃取出，置冰上融化后使用；

[0056] 3、DNA直接转化农杆菌

[0057] 200μL农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg(5-10uL)，之后冰浴30min；

[0058] 放入液氮中7-8min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；

[0059] 取出离心管，冰上放置2min，加入0.8mLLB，28℃，150rpm振荡培养3～4hr；

[0060] 取出菌液于Kan抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养，2天左右菌落可见；

[0061] 4、重组农杆菌鉴定

[0062] 挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；

[0063] 小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶(50μg/mL-1，贮藏浓度为50mg/mL或10mg/mL)；

[0064] 质粒酶切或PCR鉴定。

[0065] 四、实施例4：水稻成熟胚愈伤组织的诱导、分化、生根及移栽方法[0066] 1、愈伤诱导

[0067] 将成熟的水稻种子去壳，先用无菌水冲洗3遍，然后用70％的乙醇处理1分钟，不时摇动；

[0068] 无菌水冲洗3遍，每次30秒，不时摇动；

[0069] 0.1％升汞溶液消毒12分钟(或2.5％NaClO消毒30min)，不时摇动；

[0070] 无菌水冲洗5遍以上，每次30秒，不时摇动；

[0071] 将种子放在灭菌滤纸上吸干水分，然后放在诱导培养基上；

[0072] 28℃，暗培养4周；

[0073] 2、愈伤继代

[0074] 挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤(即散落到培养基上的愈伤，不要选从种子上发出来的愈伤)，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度28℃；

[0075] 3、预培养

[0076] 挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4-14天，温度28℃；

[0077] 4、愈伤与农杆菌共培养

[0078] 1)农杆菌培养

[0079] 在带有对应抗性选择的LB培养基上预培养农杆菌两天，温度28℃；

[0080] 将农杆菌转移至装有悬浮培养基的带塞试管或离心管里，重悬农杆菌，调节农杆菌的悬浮液至OD600为0.8-1.0；

[0081] 2)农杆菌侵染

[0082] 将预培养的愈伤转移至灭菌好的三角瓶内；

[0083] 将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

[0084] 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吹干(30min-1h)；

[0085] 然后放置在已铺有一层滤纸的共培养基上培养3天，温度19-20℃。

[0086] 5)选择培养

[0087] 将共培养的愈伤转移至灭菌好的三角瓶内；

[0088] 灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

[0089] 浸泡在含400ppm羧苄青霉素的灭菌水中30分钟；

[0090] 转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干(1h以上)；

[0091] 转移愈伤至选择培养基上选择培养2次，每次2周。(第一次羧苄青霉素筛选浓度为400ppm，第二次为250ppm)；

[0092] 6)分化培养

[0093] 将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天(可省略)；

[0094] 转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃；

[0095] 7)生根培养

[0096] 剪掉分化时产生的根(留1-2mm)；

[0097] 然后将其转移至生根培养基中光照下培养2周，温度26℃；

[0098] 8)移栽

[0099] 待苗高10-12cm，根系发生较好，打开瓶盖，洗掉根上的残留培养基(注意不要伤根)，移栽花盆中。在最初的几天，蒙上保鲜膜，保持水分湿润。

[0100] 五、实施例5：转基因阳性苗的鉴定

[0101] 1、基因插入鉴定

[0102] 检测引物：潮霉素通用引物和基因特异性引物；

[0103] 2、表达鉴定

[0104] 基因特异引物。

[0105] 六、实施例6：水稻稻瘟病抗性的测定

[0106] 稻瘟菌(菌株R01-1)分生孢子用燕麦培养基放在温度28℃，12h光照/12h黑暗的光照培养箱培养10天，然后收集分生孢子，无菌水重新悬浮孢子，用血小板计数器将孢子浓度调到105个/mL，对照用不含孢子的灭菌的蒸馏水，接种前加入0.02％的吐温溶液进行喷雾接种。

[0107] 取生长约3周处于三叶一心期水稻幼苗进行叶片喷雾接种试验。喷雾接种结束后，用黑色塑料袋将每盆水稻单独密封放入光照培养箱，湿度80％，28℃，暗培养。24h后12h光照/12h黑暗光照培养，用透明保鲜膜将材料封好以便保湿，接种5天后取水稻叶片进行拍照，统计病斑数目和长度。

[0108] 序列表

[0109] <110>华中农业大学

[0110] <120>利用蔗糖合酶提高水稻稻瘟病抗性的方法

[0111] <140>

[0112] <141>

[0113] <160>5

[0114] <210>1

[0115] <211>2643

[0116] <212>OsSUS3基因的cDNA(包含CDS2451bp)

[0117] <400>

[0118] TTTCCTCCTCTTCTCCTTTAGTGCAAGGCTTGAGGATCCATCTAGAAGATAGCAATGGGGGAAACTACT[0119] GGAGAACGTGCCCTGACCCGTCTCCACAGCATGAGGGAGCGCATCGGCGATTCCCTCTCCGCGCACACC[0120] AATGAGCTTGTGGCTGTCTTCTCAAGGCTTGTGAACCAAGGAAAGGGAATGCTACAGCCCCACCAGATC[0121] ATTGCTGAGTACAACGCCGCAATCCCTGAGGGCGAGCGTGAGAAGCTGAAGGACTCTGCCTTAGAGGAT[0122] GTCCTGAGGGGAGCACAGGAGGCGATTGTCATCCCTCCATGGATTGCCCTTGCCATTCGCCCAAGGCCT[0123] GGTGTCTGGGAGTATCTGAGGATCAATGTAAGCCAGCTTGGTGTTGAGGAGCTGAGTGTCCCTGAATAC[0124] TTGCAGTTCAAGGAGCAGCTTGTGGATGGAAGCACCCAGAACAACTTTGTGCTTGAGCTGGACTTTGAG[0125] CCATTCAATGCCTCCTTCCCTCGCCCATCGTTGTCGAAGTCTATTGGCAATGGGGTGCAGTTCTTGAAC[0126] AGGCACCTGTCGTCAAAGCTGTTCCATGACAAAGAGAGCATGTACCCCCTGCTCAACTTTCTTCGTGCG[0127] CACAACTACAAAGGGATGACCATGATGTTGAACGACAGGATTCGCAGTCTCGATGCTCTCCAAGGTGCA[0128] TTGAGGAAGGCAGAAAAACATCTTGCAGGCATTACAGCTGACACCCCATATTCAGAGTTCCATCACAGG[0129] TTCCAAGAGCTTGGTTTGGAGAAGGGTTGGGGTGACTGCGCTCAGCGAGTGCGTGAGACTATTCACCTT[0130] CTCTTGGACCTTCTTGAGGCCCCTGAGCCGTCCGCCTTGGAGAAGTTCCTTGGAACAATCCCAATGGTG[0131] TTCAATGTTGTTATCCTCTCCCCGCATGGTTACTTTGCACAGGCTAATGTCTTGGGGTACCCTGATACC[0132] GGTGGGCAGGTTGTCTACATTTTGGATCAAGTCCGTGCTATGGAGAATGAGATGCTGCTGAGGATCAAG[0133] CAACAAGGTCTAAACATCACACCAAGGATTCTCATTGTGACCAGGTTGCTACCTGATGCGCATGGCACC[0134] ACATGTGGCCAGCGCCTTGAGAAGGTCCTAGGCACTGAGCACACTCATATCCTGCGTGTGCCATTCCGA[0135] ACAGAAAATGGGACTGTTCGCAAATGGATCTCGCGTTTTGAAGTCTGGCCTTACCTGGAAACTTACACC[0136] GATGATGTGGCACACGAGATTTCTGGAGAGCTGCAGGCCACCCCTGACCTGATCATTGGGAACTACAGT[0137] GATGGCAACCTTGTTGCATGTTTGCTGGCACACAAGTTGGGTGTCACTCATTGTACAATCGCCCATGCA[0138] CTTGAGAAAACCAAGTACCCCAACTCCGACCTTTACTGGAAGAAGTTTGAGGATCACTATCACTTCTCC[0139] TGCCAGTTCACAGCTGACCTGATTGCAATGAACCATGCTGACTTCATCATCACAAGTACCTTCCAGGAG[0140] ATTGCTGGAAACAAGGAAACTGTGGGGCAGTATGAGTCTCACATGGCATTCACAATGCCTGGCCTTTAT[0141] CGTGTTGTCCATGGTATCGATGTCTTTGACCCCAAGTTCAACATCGTCTCTCCTGGTGCTGACATGTCC[0142] ATCTACTTCCCATTCACCGAATCACAGAAGAGGCTCACCTCTCTCCATTTAGAGATAGAGGAGCTACTC[0143] TTCAGTGATGTTGAAAACACTGAGCACAAGTTTGTTCTGAAGGACAAGAAGAAGCCAATCATCTTCTCG[0144] ATGGCTAGGCTAGACCATGTCAAGAATTTGACTGGTCTGGTTGAGTTGTATGGTCGGAACCCTCGCCTG[0145] CAAGAGCTAGTAAACCTTGTGGTTGTCTGTGGTGACCATGGCAAGGAATCCAAGGACAAAGAAGAGCAG[0146] GCTGAGTTCAAGAAGATGTTTAATCTGATCGAGCAGTACAATTTGAATGGCCACATCCGCTGGATCTCC[0147] GCTCAGATGAACCGTGTCCGCAATGGTGAGCTCTACCGCTACATCTGCGACATGAGGGGAGCCTTTGTG[0148] CAGCCCGCTCTCTATGAGGCCTTTGGGCTAACTGTGATTGAGGCCATGACCTGTGGTCTTCCAACATTT[0149] GCAACTGCCTATGGTGGTCCAGCCGAGATCATCGTGCACGGCGTGTCTGGCTACCACATTGATCCTTAC[0150] CAGAACGACAAGGCCTCGGCGCTGCTCGTGGAGTTCTTTGAGAAGTGTCAGGAAGACCCAAACCACTGG[0151] ATCAAGATCTCGCAGGGTGGACTTCAGCGCATCGAGGAGAAGTACACATGGAAGCTCTACTCTGAGAGG[0152] CTGATGACTCTCTCCGGTGTCTACGGTTTCTGGAAGTATGTCACCAACCTCGACAGGCGTGAGACACGC[0153] CGCTACCTGGAGATGCTGTACGCCCTCAAGTACCGCAAGATGGCTACCACCGTTCCATTGGCCATTGAG[0154] GGAGAGGCCTCCACCAAATGATCTGGCCTTACCCGGTGAAAAGAATGGGCAATGGGTGCTCCATTGTTG[0155] CAGTGCTGATCCAGGGGTGAAGAAAAACAGAAATCGAGGAACGAATGCATCCATTTAGTTTCTAAGGGT[0156] TTAGTTGATTTCAGGGCCAGT；

[0157] <210>2

[0158] <211>AtCESA8启动子的正向引物

[0159] <212>32

[0160] <400>CCCAAGCTTCAGAGGAAACTCAGATGTGATGA；

[0161] <210>3

[0162] <211>AtCESA8启动子的反向引物

[0163] <212>33

[0164] <400>ACGCGTCGACCTTCGAATTCCCCTGTTTGGAGA；

[0165] <210>4

[0166] <211>OsSUS3cDNA的正向引物

[0167] <212>29

[0168] <400>ACGCGTCGACTTTCCTCCTCTTCTCCTTT；

[0169] <210>5

[0170] <211>OsSUS3cDNA的反向引物

[0171] <212>18

[0172] <400>ACTGGCCCTGAAATCAAC。