一种大鼠肝S9的诱导及制备方法 |
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| 申请号 | CN201510907047.0 | 申请日 | 2015-12-07 | 公开(公告)号 | CN106834206A | 公开(公告)日 | 2017-06-13 |
| 申请人 | 江苏齐氏生物科技有限公司; | 发明人 | 田瑞; 张亚洲; 蒋敏; 齐来俊; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种大鼠肝S9的诱导及制备方法，包括步骤(a)挑选大鼠，按照大鼠的体重，用不同的方式和剂量 腹腔 注射两种诱导剂以确定最佳诱导方法；(b)处死大鼠，在无菌条件下，除去肝中残血，取出肝脏；(c)在无菌条件下，按一定的肝湿重比加入预冷的储存缓冲液中，充分剪碎，在 冰 浴中匀浆；(d)将匀浆好的组织液低速离心，收集上清和沉淀，并将上清高速离心收集上清，即首次获得肝S9；(e)将收集的沉淀，按一定的比重加入预冷的储存缓冲液，在无菌和冰浴条件下充分 研磨 并在不同条件下超声 破碎 细胞，将其在高速离心收集上清，即再次获得肝S9；(f)BCA法和CO还原法检测不同条件下肝S9蛋白以及酶含量；本发明提供的大鼠肝S9制备的方法不仅能够提高肝S9的产量并且显著提高了P450酶含量。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种大鼠肝S9的诱导及制备方法，其特征在于：(a)挑选大鼠，按照大鼠的体重，用不同的方式和剂量腹腔注射两种诱导剂以确定最佳诱导方法；(b)处死大鼠，在无菌条件下，除去肝中残血，取出肝脏；(c)在无菌条件下，按一定的肝湿重比加入预冷的储存缓冲液中，充分剪碎，在冰浴中匀浆；(d)将匀浆好的组织液低速离心，收集上清和沉淀，并将上清高速离心收集上清，即首次获得大鼠肝S9；(e)将收集的沉淀，按一定的比重加入预冷的储存缓冲液，在无菌和冰浴条件下充分研磨并在不同条件下超声破碎细胞，将其在高速离心收集上清，即再次获得大鼠肝S9；(f)BCA法和CO还原法检测不同条件下大鼠肝S9蛋白以及酶含量。 |
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| 说明书全文 | 一种大鼠肝S9的诱导及制备方法技术领域[0001] 本发明属于蛋白酶学领域，具体涉及一大鼠肝S9的诱导及制备方法。 背景技术[0002] 大鼠肝细胞S9是大鼠肝实质细胞匀浆液的去线粒体上清液，包含了大量的CYPs等药物代谢酶，其在药物体外代谢的研究中具有快速简便、灵敏、经济且可进行高通量筛选的特点，因此常用作体外研究药物代谢和药物相互作用的工具。同时许多致癌剂的生物转化是依靠细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的，所以大鼠肝S9是许多体外研究致癌剂生物转化的活化系统。传统的大鼠肝S9诱导剂为多氯联苯，其诱导效果比单独用苯巴比妥钠或β-奈黄酮要好，但其是致癌剂，一种严重的环境污染物，现许多国家已禁止生产。现研究表明联合诱导法可以达到多氯联苯诱导的效果，本发明通过优化苯巴比妥和β-奈黄酮联合诱导法以及大鼠肝S9制备方法可以获得高产量的大鼠肝S9以及较高的P450酶含量。 发明内容[0003] 本发明的目的是建立一种可以获得高产量的大鼠肝S9以及较高的P450酶含量的大鼠肝S9制备方法。 [0004] 为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法制备大鼠肝S9： [0005] 大鼠肝S9的诱导及制备方法的步骤包括：(a)挑选大鼠，按照大鼠的体重，用不同的方式和剂量腹腔注射两种诱导剂以确定最佳诱导方法；(b)处死大鼠， 在无菌条件下，除去肝中残血，取出肝脏；(c)在无菌条件下，按一定的肝湿重比加入预冷的储存缓冲液中，充分剪碎，在冰浴中匀浆；(d)将匀浆好的组织液低速离心，收集上清和沉淀，并将上清高速离心收集上清，即首次获得的大鼠肝S9；(e)将收集的沉淀，按一定的比重加入预冷的储存缓冲液，在无菌和冰浴条件下充分研磨并在不同条件下超声破碎细胞，将其在高速离心收集上清，即再次获得肝S9；(f)BCA法和CO还原法检测不同条件下大鼠肝S9蛋白以及酶含量。 [0006] 可选的大鼠为SD雄性大鼠，体重为230±20g； [0007] 可选的诱导剂为苯巴比妥钠和β-奈黄酮； [0008] 可选的诱导方法为第1d大鼠腹腔注射剂量为30mg/kg的苯巴比妥钠和剂量为40mg/kg的β-萘黄酮，第2d注射剂量为80mg/kg的β-萘黄酮，第3d注射剂量为60mg/kg的苯巴比妥钠，第4d注射剂量为80mg/kg的β-萘黄酮，第5d注射苯巴比妥钠60mg/kg； [0009] 可选的除去肝中残血的方法是将事先冰浴的肝素液经肝门静脉灌洗除去残血： [0010] 可选的加入预冷的储存缓冲液的量是肝湿重的3倍(V/m)； [0011] 可选的储存缓冲液为0.15M KCl(pH 7.4)； [0012] 可选的低速离心匀浆液，其离心速度为1500rpm/min，时间5min； [0013] 可选的肝S9高速离心，其离心速度为9000g，时间20min； [0014] 可选的加入预冷的储存缓冲液的量是沉淀重量的2倍(V/m)； [0015] 可选的超声条件分别为34w/50w/65w超声功率下，超声10s，间隔5s的条件下，超声20次； [0017] 图1：三种诱导方法所产生大鼠肝S9的P450酶含量； [0018] 图2：不同超声破碎条件下产生的总蛋白含量； [0019] 图3：不同超声破碎条件下产生的P450酶含量。 具体实施方式[0020] 为了使本发明的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。 [0021] a.实验前准备好一盆-80℃的冰，将需要的肝脏灌洗缓冲液和储存缓冲液提前30min放置在冰上，同时在冰上放置几个称重的50mL离心管。 [0022] b.挑选SD大鼠，雄性，230±20g；诱导方法1：大鼠腹腔注射苯巴比妥钠，每天1次，第一天剂量为30mg/kg，余下3d每天剂量为60mg/kg；第3、4天腹腔注射β-萘黄酮：每天1次，剂量为80mg/kg；诱导方法2：第1d大鼠腹腔注射剂量为30mg/kg的苯巴比妥钠和剂量为40mg/kg的β-萘黄酮，第2d注射为60mg/kg的苯巴比妥钠和剂量为80mg/kg的β-萘黄酮；第3d不注射诱导剂，第4d注射剂量为80mg/kg的β-萘黄酮和剂量为60mg/kg的苯巴比妥钠；诱导方法3：第1d大鼠腹腔注射剂量为30mg/kg的苯巴比妥钠和剂量为40mg/kg的β-萘黄酮，第2d注射剂量为80mg/kg的β-萘黄酮，第3d注射剂量为60mg/kg的苯巴比妥钠，第4d注射剂量为 80mg/kg的β-萘黄酮，第5d注射苯巴比妥钠60mg/kg；大鼠注射诱导剂时正常饮食，在最后一次给药后，大鼠禁食，可以正常饮水，24h后麻醉处死。 [0023] c.在无菌条件下剖腹，将事先冰浴的肝素液(10mM PBS，0.15M KCl，20％肝素(1000U/mL)，pH 7.4)经肝门静脉灌洗除去残血，洗至土黄色。 [0024] d.快速剪下肝脏，立即放到用冰浴冷却的PBS缓冲液(0.15M KCl，pH 7.4)进一步洗去多余血污。 [0025] e.将清洗干净的肝脏放置冰上预冷的无菌离心管中，称重，将其按3ml/g湿重的比例加入预冷的储存缓冲液中，充分剪碎，在冰浴中匀浆。 [0026] f.将匀浆好的组织液，倒入预冷的50mL的离心管中，1500r，5min离心，收集上清和沉淀。 [0027] g.上清于冷冻高速离心机中9000×g离心15min，取其上清液即为首次获得的大鼠肝S9，取样测蛋白含量及P450酶含量。 [0028] h.将诱导方法3诱导条件下的沉淀按其重量1∶2的量加入储存缓冲液，充分混匀，平均分成3等份，在无菌条件下，分别在34w/50w/65w超声功率下，超声10s，间隔5s的条件下，超声20次。 [0029] i.超声后，液体于冷冻高速离心机中9000×g离心15min，取其上清液即为再次获得的大鼠肝S9，取样测蛋白含量及P450酶含量。 [0030] j.将BCA法测各组样中蛋白含量，并对收集的样品定量。 [0031] k.在样品中蛋白浓度一定的条件下，通过CO还原法检测分组中酶含量，具体步骤为：1)将待测样蛋白浓度稀释为5mg/mL，取0.2ml加入到5.4mL的PBS中，然后加入10％的连二硫酸钠0.5ml，立刻混匀；2)开启紫外分光光度器，选取波长424、450、490nm，用PBS作为Blank，取3ml的反应液作为对照组，读取OD值，另外3ml反应液中充CO 30s，然后立即检测OD值；3)计算公式ΔOD(450-490)×103/(91×稀释后蛋白浓度(mg/ml))结果发现：诱导方法3产生的肝S9，其P450酶含量最高，达到579pmol/mg； 在50W的超声功率下，所产生的总P450酶含量最高，其蛋白含量为53mg/mL，P450酶含量为554pmol/mg。说明沉淀再次研磨并超声破碎后收集的肝S9与首次获得的肝S9性质相差不大，将两次获得的肝S9合并后作为肝S9库，大大提高了大鼠肝S9的产量。 |
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