一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株及其构建方法和应用 |
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| 申请号 | CN201611244066.0 | 申请日 | 2016-12-29 | 公开(公告)号 | CN106834198A | 公开(公告)日 | 2017-06-13 |
| 申请人 | 中国海洋大学; | 发明人 | 臧晓南; 肖东芳; 张学成; 徐涤; 吴非; 张冉; 冯小亭; 衣俊杰; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株及其构建方法和应用，本发明克隆了节旋藻的亚 铁 血红素 氧 化酶 hoxⅠ基因及藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因pcyA，将两者连接进pET24a(+)表达载体中，构建出重组表达质粒pET24a‑hoxⅠ(314)‑pcyA(314)，并将其转化入E.coli BL21(DE3)表达菌株，得到重组表达菌株H(314)P(314)，从而实现大肠杆菌异源表达藻蓝胆素的所有元件都来自节旋藻。经大肠杆菌异源表达的藻蓝胆素可进一步与异源表达出的藻蓝蛋白的α与β亚基结合，从而催化有 荧光 活性的藻蓝蛋白的 生物 合成。从节旋藻中提取的藻蓝蛋白可作为一种天然色素应用于食品、 化妆品 等领域。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)，其特征在于：其分类命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.12909。 |
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| 说明书全文 | 一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株及其构建方法和应用技术领域背景技术[0002] 藻胆蛋白主要存在于红藻、蓝藻、隐藻及少数甲藻中，由脱辅基蛋白和色基组成，是色素蛋白复合体，能捕获高等植物不能利用的蓝绿光。同时藻胆蛋白具有多种功效，可作为荧光探针，食品添加剂，保健品和药品等。根据藻胆蛋白吸收光谱性质的差异，可将其分为四大类即藻红蛋白、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白。具有光学活性的藻胆蛋白主要是由脱辅基藻胆蛋白和藻胆素共价结合而成。藻胆蛋白具有荧光活性，是因为含有色素—藻胆色素，因此藻胆色素的合成是形成有光学活性藻胆蛋白非常重要的代谢途径。 [0003] 藻胆色素的合成是以氨基乙酰丙酸作为前体物质开始的。氨基乙酰丙酸在胆色素原合酶(Porphobilinogen synthase)的作用下合成胆色素原，再利用胆色素原脱氨酶(Hydroxymethyl-bilanesynthase)、尿卟啉原III合酶(Uroporphyrinogen III synthase,UPS)、尿卟啉原III脱羧酶(Uroporphyrinogen III decarboxylase,UDC)、粪卟啉原III氧化酶(Coproporphyrinogen III oxidase,aerobic,COXae)、原卟啉原IX氧化酶(Protoporphyrinogen IX oxidase,aerobic,POXae)数步反应生成原卟啉IX。原卟啉IX在铁离子螯合酶等酶的作用下生成血红素。血红素氧化酶(heme oxygenase)将血红素氧化，氧化发生在IXa位点使共轭环断裂，生成胆绿素IXa，胆绿素IXa在不同的还原酶作用下产生不同类型的藻胆色素。 [0004] 目前，对于具荧光活性的藻蓝蛋白的异源表达的研究多集中于集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)，鱼腥藻(Anabaena sp.strain PCC7120)中。而重要经济蓝藻-钝顶节旋藻的相关基因还没有被克隆，其在合成有荧光活性藻蓝蛋白中的作用还缺乏研究。节旋藻(Arthrospira)营养丰富，富含维生素，微量元素，人体必需的8种氨基酸，蛋白含量高达60-70％。是目前公认的唯一一种人体可安全食用并具有药用价值的经济藻类。其中含有的藻蓝蛋白可作为一种天然色素应用于食品、化妆品等领域。 发明内容[0005] 本发明提供了一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株及其构建方法和应用。通过本发明的技术方案，获得的重组表达菌株H(314)P(314)BAEF具有较高的重组藻蓝蛋白表达量。 [0006] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现： [0007] 本发明提供了一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)，其分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.12909。 [0009] 进一步的：所述hoxⅠ基因来源于节旋藻Arthrospira platensis FACHB314。 [0010] 进一步的：所述菌株H(314)P(314)含有如序列表SEQ ID No：3序列所示的pcyA基因。 [0011] 进一步的：所述pcyA基因来源于节旋藻Arthrospira platensis FACHB314。 [0012] 进一步的：所述菌株H(314)P(314)经IPTG诱导表达呈现蓝绿色，在580-590nm激发波长下，在635-645nm处发射荧光。 [0013] 本发明还提供了所述的表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)的构建方法，所述构建方法包括以下步骤： [0014] (1)克隆节旋藻Arthrospira platensis FACHB314的hoxⅠ基因和pcyA基因，并将其连入克隆载体pMD19-T中，分别获得质粒pMD19T-hoxⅠ(314)和pMD19T-pcyA(314)； [0015] (2)将所述质粒pMD19T-hoxⅠ(314)用BamHI和SacI进行双酶切，所述质粒pMD19T-pcyA(314)用SacⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收目的片段hoxⅠ(314)基因和pcyA(314)基因，并将二者连接入pET24a(+)表达载体中，构建出重组表达质粒pET24a-hoxⅠ(314)-pcyA(314)； [0016] (3)将所述质粒pET24a-hoxⅠ(314)-pcyA(314)转化入E.coli BL21(DE3)表达菌株，得到重组基因工程菌株H(314)P(314)。 [0017] 本发明还提供了所述的表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)在用于制备藻蓝胆素中的应用。 [0018] 进一步的：将含藻蓝蛋白α与β亚基基因及色基裂合酶cpcE与cpcF基因的质粒载体pACYCDuet-uBAEF转化入所述重组基因工程菌株H(314)P(314)，获得重组表达菌株H(314)P(314)BAEF。 [0019] 进一步的：所述重组表达菌株H(314)P(314)BAEF的重组藻蓝蛋白表达量达1.08mg/ml以上，获得的此重组藻蓝蛋白在580nm激发波长下，在640nm处发射出藻蓝蛋白的特征荧光峰，且单位质量重组藻蓝蛋白发射出的荧光强度达140000。 [0020] 本发明的优点和技术效果是：本发明首次克隆了节旋藻Arthrospira platensis FACHB314的亚铁血红素氧化酶hoxI基因及藻蓝素铁氧还蛋白还原酶基因pcyA，将两者连接进pET24a(+)表达载体中，构建出重组表达质粒pET24a-hoxI(314)-pcyA(314)(hoxI基因与pcyA基因均来自Arthrospira platensis FACHB314)，并将其转化入E.coli BL21(DE3)表达菌株，以得到重组表达菌株H(314)P(314)。从而实现大肠杆菌异源表达藻蓝胆素的所有元件都来自节旋藻Arthrospira platensis FACHB314。经大肠杆菌异源表达的藻蓝胆素可进一步与异源表达出的藻蓝蛋白的α与β亚基结合，从而催化有荧光活性的藻蓝蛋白的生物合成。所述重组表达菌株H(314)P(314)BAEF的重组藻蓝蛋白表达量达1.08mg/ml以上，表达出的藻蓝胆素活性非常高。获得的此重组藻蓝蛋白在580nm激发波长下，在640nm处发射出藻蓝蛋白的特征荧光峰，且单位质量重组藻蓝蛋白发射出的荧光强度达140000。 [0021] 而且，节旋藻(Arthrospira)是人体可安全食用并具有药用价值的经济藻类，从节旋藻中提取的藻蓝蛋白可作为一种天然色素应用于食品、药品、化妆品等领域，具有广泛的市场应用前景。附图说明 [0022] 图1为重组体系的菌液PCR检测；其中M1为Trans 2K；M2为Trans 15K；1、2、3、4、5泳道分别对应重组体系H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)。 [0023] 图2为重组菌株藻蓝胆素的表达，其中1，2，3，4，5，6分别对应未转化菌株E.coli BL21、重组菌株H(314)、重组菌株P(314)、重组菌株H(314)P(314)、重组菌株H(6803)P(314)和重组菌株H(314)P(6803)。 [0024] 图3为重组菌株的SDS-PAGE电泳，其中0为未转化菌株E.coli BL21；M为广谱彩虹预染蛋白Marker；泳道1、2、3、4、5分别为重组菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)和H(314)P(6803)。 [0025] 图4为重组菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)及空白菌株BL21的荧光发射光谱。 [0026] 图5为重组菌株藻蓝蛋白的表达，其中，1为未转化菌株E.coli BL21；2，3，4，5，6分别为H(314)BAEF，P(314)BAEF，H(314)P(314)BAEF，H(6803)P(314)BAEF和H(314)P(6803)BAEF。 [0027] 图6为重组菌株的SDS-PAGE电泳及重组蛋白的色素锌电泳；其中图6a中，0为未转化菌株E.coli BL21；泳道1，2，3，4，5，6分别为重组菌株H(314)BAEF，P(314)BAEF，H(314)P(314)BAEF，H(6803)P(314)BAEF，H(314)P(6803)BAEF和藻蓝蛋白标准品； [0028] 图6b中，1为H(314)P(314)；2为pACYCDuet-uBAEF(BL21)；3，4，5，6分别为重组表达菌株H(314)P(314)BAEF，H(6803)P(314)BAEF，H(314)P(6803)BAEF和藻蓝蛋白标准品。 [0029] 图7为重组菌株的Western-Blotting检测，其中0为未转化菌株E.coli BL21；泳道1，2，3，4，5，6分别为重组菌株H(314)BAEF，P(314)BAEF，H(314)P(314)BAEF，H(6803)P(314)BAEF，H(314)P(6803)BAEF和藻蓝蛋白标准品。 [0030] 图8为重组菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF及BL21的荧光发射光谱。 具体实施方式[0031] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。 [0032] 实施例1：节旋藻Arthrospira platensis FACHB314中hoxI基因及pcyA基因的克隆 [0033] 1、节旋藻Arthrospira platensis FACHB314中hoxI基因的克隆 [0034] 节旋藻Arthrospira platensis FACHB314属于保健品，具有食品和药品方面的应用价值，购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FACHB)，也可以选用市售的节旋藻。 [0035] 设计引物hoxI-1和hoxI-2，并在引物hoxI-1和hoxI-2上分别引入BamHI和SacI位点(下划线为酶切位点)。引物序列分别为： [0036] hoxI-1 5'-GGATCCATGAGTGTTAACCTAGCCACCCA-3'； [0037] hoxI-2 5'-GAGCTCTTAGTTCACCGAGTCAGTAGCG-3'。 [0038] 以节旋藻Arthrospira platensis FACHB314基因组序列为模板进行PCR反应，PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃保温10min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测割胶回收后，克隆到pMD19-T载体并将其转化克隆菌株E.coli DH5α，用含Amp的平板筛选，经菌液PCR和测序鉴定得到阳性克隆质粒pMD19T-hoxI(314)。 [0039] 连接体系如下： [0040] [0041] 经测序分析，所述节旋藻Arthrospira platensis FACHB314中hoxI基因(如序列表SEQ ID No：1序列所示)可编码242个氨基酸残基，编码产生的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：2所示。 [0042] 2.节旋藻Arthrospira platensis FACHB314中pcyA基因的克隆 [0043] 根据节旋藻PCC8005pcyA基因序列(GenBank号：FO818640.1)设计引物，在引物pcyA-1和pcyA-2上分别引入SacI和SalI位点(下划线为酶切位点)。引物序列分别为： [0044] pcyA-1：5'-GAGCTCTGAAATAATTGGGCCGACGCTT-3'； [0045] pcyA-2：5'-GTCGACTCAGTCTTCAGGAGTATCAAATAAAAC-3'。 [0046] 以节旋藻Arthrospira platensis FACHB314基因组序列为模板进行PCR反应，PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，采用梯度扩增设置三个梯度55℃，52℃，48℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃保温10min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测割胶回收后，连接到pMD19-T载体并将其转化克隆菌株E.coli DH5α，用含Amp的平板筛选，经菌液PCR和测序鉴定得到阳性克隆质粒pMD19T-pcyA(314)。 [0047] 连接体系如下： [0048] [0049] [0050] 经测序分析，所述Arthrospira platensis FACHB314中pcyA基因(如序列表SEQ ID No：3序列所示)可编码247个氨基酸残基，编码产生的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：4所示。 [0051] 实施例2：重组表达菌株H(314)P(314)的建立 [0052] 将得到的阳性克隆质粒所述pMD19T-hox I(314)和pMD19T-pcyA(314)分别用BamHI和SacI及SacI和SalI进行双酶切，经割胶回收目的片段得到hoxI(314)基因及pcyA(314)基因，并将二者连接入pET24a(+)空载体中，连接时先用hoxI(314)基因的酶切位点BamHI和SacI对pET24a(+)空载体进行酶切，从而将hoxI(314)基因先连接进去得到pET24a-hoxI(314)。再用pcyA(314)基因的酶切位点SacI和SalI对pET24a-hoxI(314)进行酶切，从而将pcyA(314)基因也连接入表达载体中，获得重组表达质粒pET24a-hoxI(314)-pcyA(314)。 [0053] 将该质粒转入E.coli DH5α中，并用含Kan抗性的平板进行筛选，经菌液PCR和测序鉴定得到阳性菌株。在获得的阳性菌株中将pET24a-hoxI(314)-pcyA(314)质粒提出，并转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，用含Kan平板筛选，并经菌液PCR检测鉴定得到阳性表达菌株H(314)P(314)，最后进行测序验证。 [0054] 为检验单独的hoxI(314)基因及单独的pcyA(314)基因在藻蓝胆素合成中的作用及不同藻种中合成藻蓝胆素相关基因在大肠杆菌内异源表达的表达情况，本发明同时构建了表达质粒pET24a-hoxI(314)，pET24a-pcyA(314)，pET24a-hoxI(314)-pcyA(6803)(hoxI来自Arthrospira platensis FACHB314，pcyA来自Synechocystis sp.PCC6803)，pET24a-hoxI(6803)-pcyA(314)(hoxI来自Synechocystis sp.PCC6803，pcyA来自Arthrospira platensis FACHB314)并将其一起转化入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组表达菌株H(314)、P(314)、H(314)P(6803)和H(6803)P(314)并将其与H(314)P(314)一起进行菌液PCR的鉴定。菌液PCR鉴定结果如图1所示。 [0055] 图1结果显示：1，2泳道显示条带大小为700-1000bp左右，与hoxI(314)，pcyA(314)基因大小基本一致，证明重组体系H(314)与P(314)构建成功。3，4，5泳道显示条带大小为1500bp左右，与连接后的hoxI-pcyA基因片段大小一致，证明重组体系H(314)P(314)，H(6803)P(314)，H(314)P(6803)重组体系构建成功。 [0056] 将获得的重组表达菌株H(314)P(314)进行菌种保藏，保藏单位的名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。大肠埃希氏菌Escherichia coli的保藏日期：2016年8月26日；保藏编号：CGMCC No.12909。 [0057] pMD19T-hoxI(314)的酶切体系如下： [0058] [0059] pMD19T-pcyA(314)的酶切体系如下： [0060] [0061] pET24a-hoxI(314)连接体系如下： [0062] [0063] 以此先得到质粒pET24a-hoxI(314)，在针对此质粒使用pcyA基因的酶切位点对其进行酶切，从而将pcyA基因连入该表达载体中。 [0064] pET24a-hoxI(314)的酶切体系如下： [0065] [0066] pET24a-hoxI(314)-pcyA(314)的连接体系如下： [0067] [0068] 实施例3：重组表达菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)的诱导表达及SDS-PAGE [0069] 1、重组菌株的诱导表达： [0070] (1)将构建的5个重组表达菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)分别接种到LB液体培养基中(含有抗生素Kan)；同时接种没有表达载体的空白对照E.coli BL21(DE3)，培养基中不含抗生素，在37℃下过夜培养12-14h； [0071] (2)分别将以上5个重组表达菌株的过夜培养物按1:100的比例接种在100ml(含Kan)LB液体培养基中；空白的大肠杆菌BL21(DE3)的过夜培养物按1:100的比例接种于100ml不含抗生素的LB培养基中，37℃培养2-3个小时至OD600≈0.6； [0072] (3)37℃下，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至工作浓度为1mmol/L； [0073] (4)37℃诱导2小时后，用分光光度计分别测量三种菌体的OD600值，以保证离心后收集的菌量相同； [0074] (5)5个重组体系中各取2ml IPTG诱导后的菌体离心，用400ulPBS悬浮菌体沉淀并加入100ul上样缓冲液，开水煮5min用以变性重组体系中的蛋白，将处理好的蛋白样品置于4℃，以用于蛋白电泳检测。 [0075] 其他剩余的诱导后的菌体4000rpm/min离心20min，弃上清，收集沉淀如图2所示，用0.9％的NaCl溶液洗涤菌体沉淀2次。 [0076] 从图2收集到的菌体沉淀可初步判断与阴性对照BL21相比重组菌株H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)均已诱导表达出了藻蓝胆素，只是颜色深浅不同，H(314)P(314)>H(6803)P(314)>H(314)P(6803)。菌株H(314)P(314)和H(6803)P(314)呈现出天然藻蓝蛋白的蓝色，而菌株H(314)P(6803)的颜色偏绿，表明节旋藻314的铁氧还蛋白还原酶(PcyA)在重组菌株中具有更好的催化活性，重组表达的藻蓝胆素更接近于天然藻蓝胆素。其中菌株H(314)P(314)的颜色最深，进一步表明节旋藻314的亚铁血红素氧化酶(HoxI)在重组菌株中具有更好的催化活性或者来自相同物种节旋藻的HoxI和PcyA间存在协调作用，从而具有更强的合成藻蓝蛋白的活性。只含hoxI基因的重组菌株，经离心所得的绿色沉淀应为胆绿素。只含pcyA基因的重组菌株，因大肠杆菌中无胆绿素，故无法进一步形成藻蓝胆素，故菌体颜色与空菌株E.coli BL21类似。 [0077] 2、重组菌株的SDS-PAGE： [0078] 样品的处理：即以上5个重组菌株在诱导表达过程中第5步中的处理方法。 [0079] 安装装置：将玻璃板和电泳槽用蒸馏水冲净，晾干并将玻璃板固定于制胶器上。 [0080] 聚丙烯酰胺凝胶的配置：按照下表1配置聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为15％。 [0081] 表1聚丙烯酰胺凝胶的配置 [0082] [0083] 分离胶注入胶板中(给浓缩胶预留1cm位置)，用1000ul的移液枪迅速的将浓缩胶加到胶板里，插上梳子，凝胶15分钟。 [0084] 上样：在电泳槽中加入适量Tris-Gly电泳缓冲液，缓慢拔掉梳子，将蛋白样品加入上样孔中，每个样品上样量为20ul，Marker上样量为5～8ul； [0088] 脱色：将染色后的凝胶放入脱色液中震荡脱色，直到背景透明，条带清晰为止。 [0089] 重组菌株的SDS-PAGE结果如图3所示。图3中箭头所示蛋白条带依次为：1：HoxI；2：PcyA；3：HoxI(314)-PcyA(314)；4：HoxI(6803)-PcyA(314)；5：HoxI(314)-PcyA(6803))。重组菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)与阴性对照BL21相比，在29KD出现清晰可见且不同于BL21的条带，该条带为HoxI和PcyA，经网上在线预测，PcyA分子量大小为28.1KD，HoxI分子量为27.7KD，因此该条带应为合成藻蓝胆素所需的酶HoxI和PcyA。 [0090] 实施例4：重组表达菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)的荧光检测 [0091] 将以上洗涤过的菌体沉淀重悬于0.01mol/L的PBS中并进行超声破碎(超声5s，停止2.5s，共6min)。离心后取上清进行荧光检测，扫描速度1200nm/min，狭缝宽度5.0nm，电压为950V，用580nm波长激发得到荧光发射光谱(如图4)。重组菌株H(314)即胆绿素的荧光发射峰在637nm左右；重组菌株P(314)的荧光发射光谱与BL21类似，主要是与体系内无法形成胆绿素进而无法形成藻蓝胆素有关；菌株H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)形成色素主要为藻蓝胆素，同时可观察到菌株H(314)P(314)与H(6803)P(314)相较体系H(314)P(6803)中藻蓝胆素的荧光发射峰更加接近天然藻蓝胆素的荧光发射峰640nm，由此可表明在形成藻蓝胆素的过程中，来源于Arthrospira platensis FACHB314的PcyA要优于Synechocystis sp.PCC6803的PcyA。 [0092] 实施例5：藻蓝胆素在合成有荧光活性藻蓝蛋白中的应用 [0093] 1、重组表达菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的获得 [0094] 将质粒载体pACYCDuet-uBAEF(含藻蓝蛋白α与β亚基基因及色基裂合酶cpcE与cpcF基因)分别转化入重组菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)，用含Kan与Cm的双抗平板筛选，并经菌液PCR和测序检测鉴定得到重组表达菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF。 [0095] 2、重组表达菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的诱导表达 [0096] 诱导表达过程与实施例3中重组表达菌株H(314)、P(314)、H(314)P(314)、H(6803)P(314)、H(314)P(6803)的诱导过程相同。所得的菌体沉淀如图5所示。从图5中可以判断：与空白对照BL21相比，菌株H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF中的具荧光活性的藻蓝蛋白均已表达，颜色与单独只有藻蓝胆素表达时不同，且各体系颜色深浅不同，H(314)P(314)BAEF>H(6803)P(314)BAEF>H(314)P(6803)BAEF。由此可进一步断定hoxI和pcyA基因均来源于Arthrospira platensis FACHB314的重组体系在大肠杆菌中合成和组装具有荧光活性的藻蓝蛋白的协调性较来源于Synechocystis sp.PCC6803的要强。菌株H(6803)P(314)BAEF相较于菌株H(314)P(6803)BAEF沉淀颜色更接近于天然藻蓝蛋白的蓝色，由此表明在形成有荧光活性藻蓝蛋白过程中，PcyA的作用很重要，而且节旋藻FACHB314的PcyA在形成有荧光活性的藻蓝蛋白中的活性比集胞藻PCC6803的活性强。。 [0097] 菌株H(314)与菌株P(314)中因只含单独的hoxI和pcyA基因，故确认体系中并未生成具有荧光活性的藻蓝蛋白，菌株H(314)中表现出的绿色仍为胆绿素的颜色。 [0098] 3、重组表达菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的SDS-PAGE电泳，和Western-blotting检测 [0099] SDS-PAGE电泳与实施例3中重组菌株的SDS-PAGE过程相同。所得SDS-PAGE电泳图谱如图6a所示，图6a中箭头所示条带均为各体系表达出的藻蓝蛋白。 [0100] SDS-PAGE结束后，用Launch sensiAnsys.exe软件对SDS-PAGE凝胶结果进行分析，测定藻蓝蛋白在表达的总蛋白中所占百分比。重组菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的目标蛋白表达量分析如表2所示。 [0101] 表2重组菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的目标蛋白表达量分析 [0102] [0103] 重组表达菌株的Western-blotting检测： [0104] 转膜：采用半干式电转仪(120V，25min)； [0105] 丽春红染色：染色时间不宜太长，染后迅速用蒸馏水冲洗； [0107] 洗膜：封闭完成后倒掉封闭液，用0.02MPBS洗膜5分钟，两次； [0108] 一抗反应：使用兔抗藻蓝蛋白多克隆抗体作为一抗，将其用抗体稀释液稀释200倍，37℃震荡孵育2h。反应结束后，倒掉反应液，使用0.02MPBS洗膜5分钟，两次； [0109] 二抗反应：采用羊抗兔IgG-HRP(H L)作为二抗，用抗体稀释液稀释2000倍，37℃震荡孵育1h。反应结束后，倒掉反应液，使用0.02MPBS洗膜5分钟，四次； [0110] DAB显色反应：将配置的DAB显色液均匀的淋于硝酸纤维素膜上，避光显色，约五分钟后，用蒸馏水将膜冲洗干净。 [0111] 所得Western-blotting检测结果如图7所示。图7中箭头所示条带均为各体系表达出的藻蓝蛋白。 [0112] 从电泳结果可知重组体系H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF与阴性对照BL21相比，在18KD出现清晰可见且不同于BL21的条带，最后一个泳道出现的条带为藻蓝蛋白标准品，且Western-Blotting检测结果显示在18KD附近呈现出颜色加深的条带，且条带位置与最后一列藻蓝蛋白标准品位置大体一致。据文献报道，藻蓝蛋白αβ通常以聚合体存在，分子量在36KD。在SDS-PAGE中，藻蓝蛋白的αβ亚基会分开，单独的一个亚基大小约为18KD。由此判断重组菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF中均已表达出藻蓝蛋白。 [0113] 4、重组表达菌株H(314)P(314)、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的色素蛋白锌电泳 [0114] 电泳过程与SDS-PAGE电泳过程相同。电泳结束后将聚丙烯酰胺凝胶置于0.02M的ZnSO4溶液中震荡浸泡10分钟，浸泡结束后将胶置于紫外灯下观察。结果如图6b所示，图中3，4泳道箭头所示条带为由重组表达菌株表达出的藻蓝蛋白与藻蓝胆素结合后在锌染后于紫外下观察获得的条带。箭头6为天然的具荧光活性的藻蓝蛋白在锌染后于紫外下观察获得的条带。 [0115] 由图6b可知单独的藻蓝胆素由于分子量太小，不能被聚丙烯酰胺凝胶截留从而无法停留在胶上，故经ZnSO4染色后，在紫外下无荧光条带产生(泳道1)。泳道2是只表达藻蓝蛋白的重组表达菌株，因没有藻蓝胆素产生，单独的藻蓝蛋白未与藻蓝胆素结合，故经ZnSO4染色后，在紫外光下也无荧光条带产生。藻蓝蛋白标准品为从节旋藻中提取出的天然藻蓝蛋白，其脱辅基藻蓝蛋白上结合着藻蓝胆素，故经ZnSO4染色后，在紫外下有荧光条带产生。而重组表达菌株H(314)P(314)BAEF，H(6803)P(314)BAEF表达出的藻蓝蛋白，经ZnSO4染色后，在紫外下有荧光条带产生，且荧光条带产生位置与藻蓝蛋白标准品的条带位置相同，并与经SDS-PAGE电泳后的藻蓝蛋白的条带位置相同，大小为18KD左右。表明这两个重组菌株中均可表达出藻蓝蛋白和藻蓝胆素，而且表达出的藻蓝胆素与藻蓝蛋白能够结合在一起。重组菌株H(314)P(6803)BAEF表达出的蛋白经ZnSO4染色后紫外下并未显示出明显条带，是由于该重组菌株内藻蓝胆素的表达量过低，或者藻蓝胆素的结构不正确，进而无法与藻蓝蛋白结合产生光学活性。 [0116] 5、重组表达菌株H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF的荧光检测 [0117] 超声破碎过程及荧光检测过程与实施例4中的检测过程相同。将超声破碎后的菌体离心取上清后用580nm波长进行荧光检测并根据表2中藻蓝蛋白的表达量计算单位质量藻蓝蛋白的荧光强度，所得荧光光谱如图8所示。因图8中重组菌株H(314)P(314)BAEF和H(6803)P(314)BAEF的荧光强度太强，导致无法在同一个图中显示出其他体系的荧光发射光谱，故单独对重组体系H(314)BAEF、P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF和BL21作图。 [0118] 由图8可知重组体系H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF、H(314)P(6803)BAEF在天然藻蓝蛋白的特征发射峰640nm处有特征荧光发射峰，且体系H(314)P(314)BAEF、H(6803)P(314)BAEF单位质量藻蓝蛋白发射出的荧光强度更高，约为140000和120000，远远高于其他重组体系，表明重组体系H(314)P(314)BAEF与H(6803)P(314)BAEF均已表达出了具有荧光活性的藻蓝蛋白，且PcyA在形成具有荧光活性的藻蓝蛋白的过程中具有重要作用，来源于节旋藻Arthrospira platensis FACHB314中的PcyA的活性远高于来源于Synechocystis sp.PCC6803的PcyA。重组菌株H(314)P(314)BAEF具有最高的荧光强度，表明hoxI和pcyA基因均来源于Arthrospira platensisFACHB314的重组体系在大肠杆菌中合成和组装具有荧光活性的藻蓝蛋白的效率更高，重组藻蓝蛋白的光学活性更强。 [0119] 体系H(314)中的荧光发射峰出现大幅度红移，偏离天然藻蓝蛋白特征荧光峰，因为体系H(314)中仅含有hoxI基因，因而只能形成胆绿素，胆绿素无法与脱辅基藻蓝蛋白正常结合，从而无法指导具有天然构象的藻蓝蛋白的正确合成。也进一步证实了天然藻蓝蛋白所具有的特征荧光活性主要是由于藻蓝胆素与脱辅基藻蓝蛋白的正确结合形成的。 [0120] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。 |
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