用于生物合成化合物的方法、试剂和细胞 |
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| 申请号 | CN201580043006.X | 申请日 | 2015-06-16 | 公开(公告)号 | CN106795530A | 公开(公告)日 | 2017-05-31 |
| 申请人 | 英威达技术有限责任公司; | 发明人 | A.L.博特斯; A.V.E.康拉迪; | ||||
| 摘要 | 本文件描述了使用 脂肪酸 O‑甲基转移酶，硫酯酶，CoA转移酶，CoA连接酶中的一种或多种从前体，诸如2‑ 酮 戊二酸 ，乙酰CoA，或琥珀酰‑CoA产生2(E)‑庚烯二酰基‑CoA甲酯的 生物 化学途径，以及表达一种或多种此类酶的重组宿主。可以使用反式‑2‑烯酰基‑CoA还原酶，和甲酯酶将2(E)‑庚烯二酰基‑CoA甲酯酶促转化为庚二酰‑CoA。可以将庚二酰‑CoA酶促转化为庚二酸，7‑ 氨 基庚酸，7‑羟基庚酸，七亚甲基二胺，或1,7‑庚二醇。 | ||||||
| 权利要求 | 1.在重组宿主中遮蔽(shielding)用末端羧基官能化的碳链脂肪族主链的方法，所述方法包括： |
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| 说明书全文 | 用于生物合成化合物的方法、试剂和细胞[0001] 对相关申请的交叉引用 [0002] 本申请要求均于2014年06月16日提交的美国申请号62/012,674和62/012,735的优先权，其公开内容通过提述以其整体并入本文。发明领域 [0003] 本发明涉及在重组宿主中使用具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽遮蔽用末端羧基官能化的碳链脂肪族主链的方法。本发明还涉及在宿主中使用如下一种或多种生物合成庚烯二酰基-CoA甲酯的方法：(i)具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽(ii)具有硫酯酶活性或CoA-转移酶活性的多肽，或(iii)具有CoA连接酶活性的多肽，以及涉及表达一种或多种此类酶的重组宿主细胞。另外，本发明还涉及使用具有反式-烯酰基-CoA还原酶活性的多肽和/或具有庚二酰-[acp]甲酯酯酶活性的多肽将庚-2-烯二酰基-CoA甲酯酶促转化为庚二酰-CoA的方法，以及将庚二酰-CoA酶促转化为庚二酸，7-氨基庚酸，七亚甲基二胺，7-羟基庚酸，和1,7-庚二醇(以下称为“C7构件块”)中一种或多种，以及产生这种C7构件块的重组宿主。 [0004] 发明背景 [0005] 尼龙是聚酰胺，其有时通过二胺与二羧酸的缩合聚合而合成。同样，尼龙可以通过内酰胺的缩合聚合制备。普遍存在的尼龙是尼龙6,6，其通过六亚甲基二胺(HMD)与己二酸的反应制备。尼龙6通过己内酰胺的开环聚合制备(Anton&Baird,Polyamides Fibers,Encyclopedia of Polymer Science andTechnology,2001)。 [0006] 尼龙7和尼龙7,7代表与尼龙6和尼龙6,6相比具有增值特性的新型聚酰胺。尼龙7通过7-氨基庚酸的聚合制备，而尼龙7,7通过庚二酸和七亚甲基二胺的缩合聚合制备。不存在经济可行的石油化学路线用于产生尼龙7和尼龙7,7的单体。 [0007] 鉴于没有经济可行的石油化学单体原料，生物技术提供了通过生物催化的替代方法。生物催化是使用生物催化剂(如酶)来进行有机化合物的生物化学转化。 [0008] 生物来源的原料和石油化学原料都是用于生物催化过程的可行的原料。 [0009] 因此，针对这种背景，显然需要产生庚二酸，7-氨基庚酸，七亚甲基二胺，7-羟基庚酸和1,7-庚二醇(下文称为“C7构件块”)的方法，其中所述方法是基于生物催化剂的。 [0010] 然而，没有野生型原核生物或真核生物天然地过量产生或分泌C7构件块(building block)到细胞外环境。然而，已报道庚二酸的代谢。 [0011] 二羧酸庚二酸作为碳源被许多细菌和酵母经由β-氧化有效地转化为中心代谢物。辅酶A(CoA)活化的庚二酸到CoA活化的3-氧代庚二酸的β-氧化促进了进一步分解代谢，其通过例如与芳族底物降解相关的途径进行。已经全面地表征了通过几种细菌的3-氧代庚二酰-CoA到乙酰-CoA和戊二酰-CoA的分解代谢(Harwood and Parales,Annual Review of Microbiology,1996,50,553–590)。 [0012] 最优性原理(optimality principle)叙述，微生物调节其生物化学网络以支持最大生物量生长。超出在宿主生物体中表达异源途径的需要，将碳流(carbon flux)引向充当碳源而不是作为生物质生长成分的C7构件块违背了最优性原理。例如，与天然产生者的产生性能相比，将梭菌属(Clostridium)物种的1-丁醇途径转移到其它产生菌株中通常下降一个数量级(Shen et al.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9),2905–2915)。 [0013] 七碳脂肪族主链前体的有效合成是在C7脂肪族主链上形成末端官能团(如羧基，胺或羟基)之前合成C7构件块的关键考虑。 [0014] 发明概述 [0015] 本文件至少部分基于这样的发现，即可以构建经由庚-2-烯二酰基-CoA(也称为2-庚烯二酰基-CoA)甲酯的生物化学途径用于产生七碳链脂肪族主链前体如庚二酰-CoA，其中可以形成一种或两种官能团(即羧基、胺或羟基)，导致合成庚二酸，7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，七亚甲基二胺，和1,7-庚二醇(以下称为“C7构件块”)的一种或多种。庚二酸和庚二酸盐/酯，7-羟基庚酸和7-羟基庚酸盐/酯，和7-氨基庚酸和7-氨基庚酸盐/酯在本文中可互换使用，指任何其中性或离子化形式的化合物，包括其任何盐形式。本领域技术人员应当理解，具体形式将取决于pH。本文描述的这些途径，代谢工程和培养策略依赖于使用例如脂肪酸O-甲基转移酶从2(E)-庚烯二酸产生2(E)-庚烯二酸甲酯和使用例如CoA连接酶从2(E)-庚烯二酸甲酯产生2(E)-庚烯二酰基-CoA甲酯。可以使用例如反式-2-烯酰基-CoA还原酶和庚二酰-[acp]甲酯酯酶从2(E)-庚烯二酰基-CoA甲酯产生庚二酰基-CoA。可以从例如2-酮戊二酸，乙酰-CoA或琥珀酸半醛产生2(E)-庚烯二酸，如分别示于图1，2和3。 [0016] 在面对最优性原则下，令人惊奇地，已经发现可以组合适当的非天然途径、原料、宿主微生物、对宿主生物化学网络的弱化策略和培养策略以有效地产生一种或多种C7构件块。 [0017] 在一些实施方案中，可以使用以下酶来酶促形成末端羧基：硫酯酶，醛脱氢酶，7-氧代庚酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，可逆的CoA-连接酶(如可逆的琥珀酰-CoA-连接酶)，或CoA-转移酶(如戊烯二酸CoA-转移酶)。参见图4。 [0018] 在一些实施方案中，可以使用ω-转氨酶或脱乙酰酶来酶促形成末端胺基。参见图5和6。 [0019] 在一些实施方案中，可以使用4-羟基丁酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，6-羟基己酸脱氢酶或醇脱氢酶来酶促形成末端羟基。参见图7和8。 [0020] 两个末端官能团可以相同(例如，胺或羟基)或可以不同(例如末端胺和末端羧基；或末端羟基和末端羧基)。 [0021] 任何方法可以在重组宿主中通过发酵进行。宿主可以经受在厌氧，微需氧或混合氧/反硝化培养条件下的培养策略。宿主可以在营养限制的条件下培养。可以使用陶瓷膜保留所述宿主以在发酵期间维持高细胞密度。最终的电子受体可以是氧的替代物，例如硝酸盐。 [0022] 在任何方法中，可以通过在选择性环境中连续培养来改善宿主对高浓度C7构件块的耐受性。 [0023] 补料到发酵的主要碳源可以源自生物或非生物给料，在一些实施方案中，生物给料可以是，包括或源自单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的酒糟可溶物(condensed distillers'solubles)或城市废物。 [0024] 在一些实施方案中，所述非生物给料是或者源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐/酯(benzoate)、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)或碱洗液废物流(non-volatile residue(NVR)or a causticwash waste stream from cyclohexane oxidation processes)，或对苯二甲酸/间苯二甲酸混合物废物流。 [0025] 本文件特征在于包括至少一种编码以下的外源核酸的重组宿主：(i)脂肪酸O-甲基转移酶；和(ii)硫酯酶或CoA-转移酶，所述宿主产生2(E)-庚烯二酸甲酯。宿主可以进一步包含外源CoA连接酶，所述宿主进一步生成2(E)-庚烯二酰基-CoA甲酯。在一些实施方案中，所述宿主还可包括外源反式-2-烯酰基-CoA还原酶和/或外源庚二酰-[acp]甲酯酯酶，并产生庚二酰-CoA。 [0026] 本文件特征还在于包括至少一种编码以下的外源核酸的重组宿主：(i)脂肪酸O-甲基转移酶；和(ii)CoA连接酶，所述宿主产生2(E)-庚烯二酰基-CoA甲酯。此类宿主还可以包括外源硫酯酶或CoA-转移酶。在一些实施方案中，所述宿主还可包括外源反式-2-烯酰基-CoA还原酶和/或外源庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶，并产生庚二酰-CoA。 [0027] 产生庚二酰-CoA的重组宿主还可以包括至少一种编码以下一种或多种的外源核酸：硫酯酶，醛脱氢酶，7-氧代庚酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，CoA-转移酶，可逆的CoA-连接酶(如可逆的琥珀酰-CoA-连接酶)，乙酰化醛脱氢酶或羧酸还原酶，所述宿主产生庚二酸或庚二酸半醛。在任何表达羧酸还原酶的重组宿主中，还可以表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶以增强羧酸还原酶的活性。 [0028] 产生庚二酸半醛的重组宿主还可以包括至少一种编码ω-转氨酶的外源核酸，并进一步产生7-氨基庚酸。 [0029] 产生庚二酸半醛的重组宿主还可以包括至少一种编码4-羟基丁酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶或6-羟基己酸脱氢酶的外源核酸，所述宿主进一步产生7-羟基庚酸。 [0030] 产生庚二酸半醛，7-氨基庚酸或7-羟基庚酸的重组宿主还可以包括羧酸还原酶，ω-转氨酶，脱乙酰酶，N-乙酰转移酶或醇脱氢酶，所述宿主进一步产生七亚甲基二胺。 [0031] 产生7-羟基庚酸的重组宿主还可以包括至少一种编码羧酸还原酶或醇脱氢酶的外源核酸，宿主进一步产生1,7-庚二醇。 [0032] 重组宿主可以是原核生物，例如，来自埃希氏菌属如大肠杆菌；来自梭菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或者克鲁佛梭菌；来自棒状杆菌属如谷氨酸棒状杆菌；来自贪铜菌属如钩虫贪铜菌或者耐金属贪铜菌；来自假单胞菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌；来自食酸代尔夫特菌；来自芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌；来自乳杆菌属如德氏乳杆菌；来自乳球菌属如乳酸乳球菌或来自红球菌属如马红球菌。 [0033] 重组宿主可以真核生物，例如来自曲霉属如黑曲霉；来自酵母属，如酿酒酵母；来自毕赤氏酵属如巴斯德毕赤酵母；来自耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵母；来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母；来自德巴利酵母属如汉逊德巴利酵母；来自Arxula属如Arxula adenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属如乳酸克鲁维酵母菌的真核生物。 [0034] 本文所述的任何重组宿主还可以包括一种或多种以下弱化的酶：聚羟基链烷酸合酶，乙酰CoA硫酯酶，乙酰CoA特异性β-酮硫解酶，形成乙酸的磷酸转乙酰酶，乙酸激酶，乳酸脱氢酶，menaquinol-延胡索酸氧化还原酶，形成乙醇的醇脱氢酶，丙糖磷酸异构酶，丙酮酸脱羧酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，消散NADPH不平衡的转氢酶，消散NADPH不平衡的谷氨酸脱氢酶，利用NADH/NADPH的谷氨酸脱氢酶，庚二酰-CoA脱氢酶；接受C7构件块和中心前体作为底物的酰基-CoA脱氢酶；戊二酰-CoA脱氢酶；或庚二酰-CoA合成酶。 [0035] 本文所述的任何重组宿主还可以过表达一种或多种编码以下的基因：乙酰CoA合成酶，6-磷酸葡糖酸脱氢酶；转酮酶；吡啶(puridine)核苷酸转氢酶；甲酸脱氢酶；甘油醛-3P-脱氢酶；苹果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；果糖1,6二磷酸酶；L-丙氨酸脱氢酶；PEP羧化酶，丙酮酸羧化酶，PEP羧激酶，PEP合酶，用于产生平衡的对NADPH特异的L-谷氨酸脱氢酶； 甲醇脱氢酶，甲醛脱氢酶，赖氨酸转运蛋白；二羧酸转运蛋白；S-腺苷甲硫氨酸合成酶，3-磷酸甘油酸脱氢酶，3-磷酸丝氨酸氨基转移酶，磷酸丝氨酸磷酸酶，和/或多药物转运蛋白。 [0036] 本文描述的途径的反应可在以下一种或多种细胞(例如宿主细胞)株中进行，所述细胞株：(a)天然表达一种或多种相关酶，(b)经遗传工程化改造以表达一种或多种相关酶，或(c)天然表达一种或多种相关酶并且经遗传工程化改造以表达一种或多种相关酶。或者，可从任何上述类型的宿主细胞中提取相关酶，并以纯化或半纯化形式使用。提取的酶可以任选地固定到固体基质，如合适的反应容器的底部和/或壁。此外，此类提取物包括可作为相关酶的来源的裂解物(例如细胞裂解物)。在文件提供的方法中，所有步骤可以在细胞(例如宿主细胞)中进行，所有步骤可以使用提取的酶进行，或者一些步骤可以在细胞中进行，而其它步骤可以使用提取的酶。 [0037] 本文所述的许多酶催化可逆反应，并且感兴趣的反应可与所述反应相反。示于图1至8中的示意性途径显示了每种中间体的感兴趣的反应。 [0038] 在一个方面，该文件的特征在于产生生物衍生的七碳化合物的方法。用于产生生物衍生的七碳化合物的方法可以包括在一定条件下培养或生长如本文所述的重组宿主达足够的时间段以产生生物衍生的七碳化合物，其中，任选地，所述生物衍生的七碳化合物选自由以下组成的组：庚二酸，7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，七亚甲基二胺，1,7-庚二醇及其组合。 [0039] 一方面，本文特征在于包含如本文所述的生物衍生的七碳化合物和除所述生物衍生的七碳化合物之外的化合物的组合物，其中所述生物衍生的七碳化合物选自由庚二酸，7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，七亚甲基二胺，1,7-庚二醇及其组合所组成的组。例如，所述生物衍生的七碳化合物是宿主细胞或生物体的细胞部分。 [0040] 本文特征还在于基于生物的(biobased)聚合物，其包含生物衍生的庚二酸，7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，七亚甲基二胺，1,7-庚二醇及其组合。 [0041] 本文特征还在于基于生物的树脂，其包含生物衍生的庚二酸，7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，七亚甲基二胺，1,7-庚二醇及其组合，以及通过模制基于生物的树脂获得的模制产品(molded product)。 [0042] 另一方面，本文的特征在于产生基于生物的聚合物的方法，包括在聚合物产生反应中使生物衍生的庚二酸，7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，七亚甲基二胺，或1,7-庚二醇与其自身或另一化合物发生化学反应。 [0043] 另一方面，本文的特征在于产生基于生物的树脂的方法，包括在聚合物产生反应中使生物衍生的庚二酸，7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，七亚甲基二胺，或1,7-庚二醇与其自身或另一化合物发生化学反应。 [0044] 本文还描述的是包含具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽的生物化学网络，其中具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽将2(E)庚烯二酸酶促转化为2(E)庚烯二酸甲酯。生物化学网络还可以包括具有CoA连接酶活性的多肽，其中所述具有CoA连接酶活性的多肽将2(E)庚烯二酸甲酯酶促转化为2(E)庚烯二酰-CoA甲酯。生物化学网络还可以包括具有反式-2-烯酰基-CoA还原酶活性的多肽，其中所述具有反式-2-烯酰基-CoA还原酶活性的多肽将2(E)庚烯二酰-CoA甲酯酶促转化为庚二酰-CoA甲酯。生物化学网络还可以包括具有庚二酰-[acp]甲酯酯酶活性的多肽，其中所述具有庚二酰-[acp]甲酯酯酶活性的多肽将庚二酰-CoA甲酯酶促转化为庚二酰-CoA。 [0045] 生物化学网络还可以包括一种或多种具有以下活性的多肽：硫酯酶活性，可逆的CoA连接酶活性，戊烯二酸CoA-转移酶活性，ω-转氨酶活性，6-羟基己酸脱氢酶活性，5-羟基戊酸脱氢酶活性，4-羟基丁酸脱氢酶活性，醇脱氢酶活性，羧酸还原酶活性，或醇脱氢酶活性，其中一种或多种具有硫酯酶活性，可逆的CoA-连接酶活性，戊烯二酸CoA-转移酶活性，ω-转氨酶活性，6-羟基己酸脱氢酶活性，5-羟基戊酸脱氢酶活性，4-羟基丁酸脱氢酶活性，醇脱氢酶活性，羧酸还原酶活性，或醇脱氢酶活性的多肽将庚二酰-CoA酶促转化为选自由庚二酸，7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，七亚甲基二胺，和1,7-庚二醇组成的组的产物。 [0046] 本文还描述的是使用一种或多种具有以下活性的多肽获得2(E)-庚烯二酸甲酯，2-庚烯二酰基-CoA甲酯，庚二酸，7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，七亚甲基二胺，和1,7-庚二醇的手段：硫酯酶，可逆的CoA连接酶，戊烯二酸CoA-转移酶，ω-转氨酶，6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，4-羟基丁酸脱氢酶，醇脱氢酶，羧酸还原酶或醇脱氢酶活性。 [0047] 在另一方面，本文件特征在于组合物，其包含一种或多种具有脂肪酸O-甲基转移酶，硫酯酶，可逆的CoA-连接酶，戊烯二酸CoA-转移酶，ω-转氨酶，6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，4-羟基丁酸脱氢酶，醇脱氢酶，羧酸还原酶，或醇脱氢酶活性的多肽，以及以下至少一种：2(E)-庚烯二酸甲酯，2(E)-庚烯二酰基-CoA甲酯，庚二酸，7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，七亚甲基二胺，和1,7-庚二醇。所述组合物可以是细胞的。 [0048] 本领域技术人员理解，当存在于亲本化合物中的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子，碱土金属离子或铝离子替代；或与有机碱配位时，含有羧酸基团的化合物(包括但不限于有机一元酸，羟基酸，氨基酸和二羧酸)得以形成或被转化成其离子盐形式。可接受的有机碱包括但不限于乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠等。将本发明的盐分离为盐或通过经由添加酸或用酸性离子交换树脂处理将pH降至pKa以下而转化成游离酸。 [0049] 本领域技术人员理解，含有胺基团的化合物(包括但不限于有机胺，氨基酸和二胺)得以形成或被转化为它们的离子盐形式，例如通过向胺中加入酸性质子形成铵盐，与无机酸如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等形成；或与有机酸形成，包括但不限于乙酸，丙酸，己酸，环戊烷丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，苹果酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙二磺酸，2-羟基乙磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)，3-苯基丙酸，三甲基乙酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，谷氨酸，羟基萘甲酸，水杨酸，硬脂酸，粘康酸等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠等。本发明的盐以盐的形式分离或通过经由添加碱或用碱性离子交换树脂处理将pH至高于pKb转化成游离胺。 [0050] 本领域技术人员理解，含有胺基团和羧酸基团两者的化合物(包括但不限于氨基酸)通过以下形成或转化成它们的离子盐形式：通过1)与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸包括但不限于盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸包括但不限于乙酸，丙酸，己酸，环戊烷丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，苹果酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，1,2-乙二磺酸，2-羟基乙磺酸，苯磺酸，2-萘磺酸，4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸，4,4'-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-羧酸)，3-苯基丙酸，三甲基乙酸酸，叔丁基乙酸，月桂基硫酸，葡糖酸，谷氨酸，羟基萘甲酸，水杨酸，硬脂酸，粘康酸等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠等，或2)当存在于亲本化合物中的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子，碱土金属离子或铝离子置换时； 或与有机碱配位。可接受的有机碱包括但不限于乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，氨丁三醇，N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括但不限于氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠等。本发明的盐可以作为盐分离或通过经由添加酸或用酸性离子交换树脂处理将pH降至pKa以下而转化为游离酸。 [0051] 除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。尽管与本文中所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于实施本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文中提及的所有出版物，专利申请，专利和其它参考文献，包括具有登录号的GenBank和NCBI提交物通过引用整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料，该方法和实施例仅仅是说明性的，而不是限制性的。 [0052] 在下面的附图和描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征，目的和优点将从说明书和附图以及权利要求书中显而易见。根据专利法中的标准实践，权利要求书中的词语“包括”可以被“基本上由...组成”或由“由...组成”替代。 [0053] 附图简述 [0054] 图1是从2-酮戊二酸或乙酰CoA，经由庚-2-烯二酰基-CoA甲酯导致庚二酰-CoA的示例性生物化学途径的示意图。 [0055] 图2是从2-酮戊二酸经由庚-2-烯二酰基-CoA甲酯导致庚二酰-CoA的示例性生物化学途径的示意图。 [0056] 图3是从琥珀酰-CoA或2-酮戊二酸经由庚-2-烯二酰基-CoA甲酯导致庚二酰-CoA的示例性生物化学途径的示意图。 [0057] 图4是使用庚二酰-CoA作为中心前体导致庚二酸的示例性生物化学途径的示意图。 [0058] 图5是使用庚二酰-CoA或庚二酸作为中心前体导致7-氨基庚酸的示例性生物化学途径的示意图。 [0059] 图6是使用7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，或庚二酸半醛作为中心前体导致七亚甲基二胺的示例性生物化学途径的示意图。 [0060] 图7是使用庚二酸，庚二酰-CoA或庚二酸半醛作为中心前体导致7-羟基庚酸的示例性生物化学途径的示意图。 [0061] 图8是使用7-羟基庚酸作为中心前体导致1,7-庚二醇的示例性生物化学途径的示意图。 [0062] 图9包含以下酶的氨基酸序列：海分枝杆菌脂肪酸O-甲基转移酶(GenBank登录号ACC41782.1；SEQ ID NO:1)，耻垢分枝杆菌MC2菌株脂肪酸O-甲基转移酶(GenBank登录号ABK73223.1；SEQ ID NO:2)，恶臭假单胞菌脂肪酸O-甲基转移酶(GenBank登录号CAA39234.1；SEQ ID NO:3)，短乳杆菌酰基-[acp]硫酯酶(GenBank登录号ABJ63754.1，SEQ ID NO:4)，植物乳杆菌酰基-[acp]硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1，SEQ ID NO:5)，大肠杆菌庚二酰-[acp]甲酯酯酶(参见GenBank登录号AAC76437.1，SEQ ID NO:6)，海分枝杆菌羧酸还原酶(参见GenBank登录号ACC40567.1，SEQ ID NO:7)，耻垢分枝杆菌羧酸还原酶(参见GenBank登录号ABK71854.1，SEQ ID NO:8)，Segniliparus rugosus羧酸还原酶(参见GenBank登录号EFV11917.1，SEQ ID NO:9)，耻垢分枝杆菌羧酸还原酶(参见GenBank登录号ABK75684.1，SEQ ID NO:10)，马赛分枝杆菌羧酸还原酶(参见GenBank登录号EIV11143.1，SEQ ID NO:11)，Segniliparus rotundus羧酸还原酶(参见GenBank登录号ADG98140.1，SEQ ID NO:12)，紫色色杆菌ω-转氨酶(参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:13)，铜绿假单胞菌ω-转氨酶(参见GenBank登录号AAG08191.1，SEQ ID NO:14)，丁香假单胞菌ω-转氨酶(参见GenBank登录号AAY39893.1，SEQ ID NO:15)，球形红杆菌ω-转氨酶(参见GenBank登录号ABA81135.1，SEQ ID NO:16)，大肠杆菌ω-转氨酶(参见GenBank登录号AAA57874.1，SEQID NO:17)，河流弧菌(Vibrio Fluvialis)ω-转氨酶(参见GenBank登录号AEA39183.1，SEQ ID NO:18)，枯草芽孢杆菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见GenBank登录号CAA44858.1，SEQ ID NO:19)，诺卡氏菌属物种NRRL 5646磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见GenBank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:20)，由tesB编码的大肠杆菌硫酯酶(参见GenBank登录号AAA24665.1，SEQ ID NO:21)，大肠杆菌长链脂肪酸-CoA连接酶(GenBank登录号CAA50321.1，SEQ ID NO:22)，钩虫贪铜菌长链脂肪酸-CoA连接酶(GenBank登录号CAJ95550.1，SEQ ID NO:23)，发酵氨基酸球菌戊烯二酸CoA-转移酶(参见例如分别为GenBank登录号CAA57199.1(GctA)和CAA57200.1(GctB)，SEQID NO:24和25)，齿垢密螺旋体烯酰CoA还原酶(参见例如GenBank登录号AAS11092.1，SEQ ID NO:26)，细小裸藻(Euglena gracilis)烯酰CoA还原酶(参见例如GenBank登录号AAW66853.1，SEQ ID NO:27)， Pseudomonas reinekei MT1β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录号ACZ63623.1，SEQ ID NO: 28)，恶臭假单胞菌β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录号AAA85138.1，SEQ ID NO:29)，Burkholderia xenovoransβ-酮硫解酶(参见例如GenBank登录号ABE33819.1，SEQ ID NO: 30)，节杆菌属(Arthrobacter)物种β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录号ABK03524.1，SEQ ID NO:31)，Burkholderia xenovoransβ-酮硫解酶(参见例如GenBank登录号ABE36495.1，SEQ ID NO:32)，Geobacillus kaustophilusβ-酮硫解酶(参见例如GenBank登录号 BAD75605.1，SEQ ID NO:33)，Gordonia bronchialisβ-酮硫解酶(参见例如GenBank登录ACY20886.1，SEQ ID NO:34)，弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录KFB98168.1，SEQ ID NO:35)，伯克氏菌属物种(Burkholderia sp.)β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录ADG18081.1，SEQ ID NO:36)，印度拜耶林克氏菌 (Beijerinckia indica)β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录ACB95386.1，SEQ ID NO:37)，Arthrobacter arilaitensisβ-酮硫解酶(参见例如GenBank登录CBT74677.1，SEQ ID NO: 38)，钩虫贪铜菌β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录AAC38322.1，SEQ ID NO:39)，和大肠杆菌β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录AAC74479.1，SEQ ID NO:40)。 [0063] 图10是20分钟后释放的CoA的在412nm处相对吸光度的柱状图，其是相对于空载体对照，将庚二酰-CoA转化为庚二酸的硫酯酶活性的量度。 [0064] 图11是总结了20分钟后在340nm处吸光度变化的柱状图，其是相对于仅对照(无底物)的NADPH消耗和羧酸还原酶活性的量度。 [0065] 图12是20分钟后在340nm处吸光度变化的柱状图，其是相对于空载体对照的NADPH消耗和将庚二酸转化为庚二酸半醛的羧酸还原酶活性的量度。 [0066] 图13是20分钟后在340nm处吸光度变化的柱状图，其是相对于空载体对照的NADPH消耗和将7-羟基庚酸转化为7-羟基庚醛的羧酸还原酶活性的量度。 [0067] 图14是20分钟后在340nm处吸光度变化的柱状图，其是相对于空载体对照的NADPH消耗和将N7-乙酰基-7-氨基庚酸转化为N7-乙酰基-7-氨基庚醛的羧酸还原酶活性的量度。 [0068] 图15是20分钟后在340nm处吸光度变化的柱状图，其是相对于空载体对照的NADPH消耗和将庚二酸半醛转化为庚二醛的羧酸还原酶活性的量度。 [0069] 图16是总结了4小时后丙酮酸至L-丙氨酸的转化百分比(mol/mol)的柱状图，其作为仅酶的对照(无底物)的ω-转氨酶活性的量度。 [0070] 图17是4小时后丙酮酸至L-丙氨酸的转化百分比(mol/mol)的柱状图，其作为相对于空载体对照的将7-氨基庚酸转化为庚二酸半醛的ω-转氨酶活性的量度。 [0071] 图18是4小时后L-丙氨酸至丙酮酸的转化百分比(mol/mol)的柱状图，其作为相对于空载体对照的将庚二酸半醛转化为7-氨基庚酸的ω-转氨酶活性的量度。 [0072] 图19是4小时后丙酮酸至L-丙氨酸的转化百分比(mol/mol)的柱状图，其作为相对于空载体对照的将七亚甲基二胺转化为7-氨基庚醛的ω-转氨酶活性的量度。 [0073] 图20是4小时后丙酮酸至L-丙氨酸的转化百分比(mol/mol)的柱状图，其作为相对于空载体对照的将N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷转化为N7-乙酰基-7-氨基庚醛的ω-转氨酶活性的量度。 [0074] 图21是4小时后丙酮酸至L-丙氨酸的转化百分比(mol/mol)的柱状图，其作为相对于空载体对照的将7-氨基庚醇转化为7-氧代庚醇的ω-转氨酶活性的量度。 [0075] 图22是1小时后，通过庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶将庚二酰-CoA甲酯转化为庚二酰-CoA的表。 [0076] 图23是3小时后通过β-酮酯酶将戊二酰-CoA和乙酰CoA转化为3-酮庚二酰-CoA的表。 [0077] 发明详述 [0078] 本文件提供了酶、非天然途径、培养策略、原料、宿主微生物和对宿主生物化学网络的弱化(attenuation)，其从中心代谢物产生七碳链脂肪族主链，可在该七碳脂肪族主链中形成一个或两个末端官能团，导致合成庚二酸，7-氨基庚酸，七亚甲基二胺，7-羟基庚酸，或1,7-庚二醇(本文称为“C7构件块”)。如本文所用，术语“中心前体”用于表示导致C7构件块的合成的本文所示的任何代谢途径中的任何代谢物。术语“中心代谢物”在本文中用于表示在所有微生物中产生以支持生长的代谢物。 [0079] 本文所述的宿主微生物可以包括能够被操作，使得可以产生一种或多种C7构件块的内源途径。在内源途径中，宿主微生物天然表达催化途径中的反应的所有酶。包含工程化途径的宿主微生物不天然表达催化途径中的反应的所有酶，但已经被工程化改造，从而在宿主中表达途径中所有的酶。 [0080] 如本文中提及核酸(或蛋白质)和宿主使用的，术语“外源”指不像其在自然界中被发现一样存在于特定类型细胞中(并且不能从特定类型细胞获得)的核酸或由所述核酸编码的蛋白质。如此，非天然存在的核酸一旦在宿主中即视为对于宿主而言外源的。重要的是注意非天然存在的核酸可含有在自然界中发现的核酸序列的核酸亚序列或片段，只要该核酸作为整体不存在于自然界中。例如，表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，如此一旦导入宿主中对于宿主细胞而言是外源的，因为该核酸分子作为整体(基因组DNA加载体DNA)不存在于自然界中。如此，作为整体不存在于自然界中的任何载体、自主复制的质粒或病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、或疱疹病毒)视为非天然存在的核酸。由此得出结论通过PCR或限制内切性核酸酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA也视为非天然存在的核酸，因为它们作为未见于自然界的分开的分子存在。由此还得出结论任何以未见于自然界中的排布含有启动子序列和多肽编码序列(例如cDNA或基因组DNA)的任何核酸也是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是对于特定宿主微生物而言外源的。例如，从酵母x的细胞分离的完整染色体一旦将该染色体导入酵母y的细胞中就酵母y细胞而言是外源核酸。 [0081] 比较而言，如本文中提及核酸(例如基因)(或蛋白质)和宿主使用的，术语“内源的”指就像其在自然界中被发现一样的确存在于特定宿主中(并且可以从特定宿主获得)的核酸(或蛋白质)。此外，“内源表达”核酸(或蛋白质)的细胞就像其在自然界中被发现时相同特定类型的宿主那样表达所述核酸(或蛋白质)。此外，“内源生成”核酸、蛋白质、或其它化合物的宿主就像其在自然界中被发现时相同特定类型的宿主那样生成所述核酸、蛋白质、或化合物。 [0082] 例如，根据宿主和宿主产生的化合物，重组宿主可以表达具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的外源多肽。 [0083] 例如，根据宿主和由宿主产生的化合物，除了具有(i)脂肪酸O-甲基转移酶活性，(ii)硫酯酶活性或CoA转移酶活性，和(iii)CoA连接酶活性的多肽外，还可以在宿主中表达一种或多种以下多肽：庚二酰-[acp]甲酯酯酶，(高)n柠檬酸合酶，(高)n柠檬酸脱水酶，(高)乌头酸水合酶，异(高)n柠檬酸脱氢酶，脱羧酶如吲哚丙酮酸脱羧酶，β-酮硫解酶，乙酰羧化酶，乙酰乙酰CoA合酶，3-羟基丁酰CoA脱氢酶，烯酰CoA水合酶，戊二酰CoA脱氢酶，烯酰CoA还原酶，反式-2-烯酰CoA还原酶，戊烯二酰基-CoA脱羧酶，β-酮酰基-[acp]合酶，3-羟基丁酰-CoA脱氢酶，2-羟基戊二酸脱氢酶，2-羟基戊二酰-CoA脱水酶，戊二酸半醛脱氢酶，4-羟基-2-氧代庚二酸醛缩酶，2-氧代-庚-3-烯-1,7-二酸水合酶，2-烯酸还原酶，2-羟基戊二酸脱氢酶，2-羟基戊二酰-CoA脱水酶，硫酯酶，醛脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，7-氧代庚酸脱氢酶，可逆的CoA-连接酶(例如可逆的琥珀酰-CoA-连接酶)，CoA-转移酶(例如戊烯二酸CoA-转移酶)，乙酰化醛脱氢酶，羧酸还原酶，4-羟基丁酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，6-羟基己酸脱氢酶，ω-转氨酶，N-乙酰转移酶，醇脱氢酶，或脱乙酰酶。在表达羧酸还原酶的重组宿主中，也可以表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，因为它增强羧酸还原酶的活性。 [0084] 例如，重组宿主可以包括至少一种编码以下的外源核酸：(i)脂肪酸O-甲基转移酶，(ii)硫酯酶或CoA-转移酶，和/或(iii)CoA连接酶。在一些实施方案中，重组宿主包括编码以下的外源核酸：(i)脂肪酸O-甲基转移酶和(ii)硫酯酶或CoA-转移酶，其中所述宿主产生2(E)-庚烯二酸甲酯。在一些实施方案中，重组宿主包括编码脂肪酸O-甲基转移酶和CoA连接酶的外源核酸，其中所述宿主产生庚-2-烯二酰基-CoA甲酯(hept-2-enedioyl CoA methyl ester)。在一些实施方案中，重组宿主包括编码以下的外源核酸：(i)脂肪酸O-甲基转移酶，(ii)硫酯酶，和(iii)CoA连接酶，并产生庚-2-烯二酰基CoA甲酯。此类宿主还可以包括外源反式-2-烯酰CoA还原酶和外源庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶，并进一步产生庚二酰-CoA。 [0085] 在一些实施方案中，宿主可以包括一种或多种用于从2-酮戊二酸产生戊二酰-CoA的外源酶：(a)高柠檬酸合酶，(b)高柠檬酸脱水酶，(c)高乌头酸水合酶(homoaconitate hydratase)，(d)异高柠檬酸脱氢酶，(e)脱羧酶如吲哚丙酮酸脱羧酶，(f)戊二酸半醛脱氢酶，和(g)戊二酸:CoA连接酶或CoA-转移酶。 [0086] 在一些实施方案中，宿主可以包括一种或多种用于从乙酰CoA产生戊二酰CoA的外源酶：(a)β-酮硫解酶或乙酰基-羧化酶与乙酰乙酰-CoA合酶的组合，(b)3-羟基丁酰-CoA脱氢酶，(c)烯酰CoA水合酶，和(d)戊二酰-CoA脱氢酶与烯酰CoA还原酶的组合或(e)戊烯二酰基-CoA脱羧酶。 [0087] 在一些实施方案中，宿主可以包括一种或多种用于从戊二酰CoA产生2-庚烯二酰-CoA的外源酶：β-酮酰基-[acp]合酶或β-酮硫解酶，3-羟基酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶。 [0088] 在一些实施方案中，如图2所示，宿主可以包括一种或多种用于通过2-氧代-庚二酸将2-氧代-戊二酸转化为庚-2-烯二酰基-CoA的外源酶：高柠檬酸合酶，高柠檬酸脱水酶，高乌头酸脱水酶，异高柠檬酸脱氢酶，2-羟基戊二酸脱氢酶，戊烯二酸CoA-转移酶，和2-羟基戊二酰CoA脱水酶。 [0089] 在一些实施方案中，如图3所示，宿主可以包括一种或多种下列外源酶，用于通过2-氧代-庚二酸将琥珀酸半醛转化为庚-2-烯二酰基-CoA：戊二酸半醛脱氢酶，4-羟基-2-氧代庚二酸醛缩酶，2-氧代-庚-3-烯-1,7-二酸水合酶，2-烯酸还原酶，2-羟基戊二酸脱氢酶，戊烯二酸CoA-转移酶，和2-羟基戊二酰-CoA脱水酶。 [0090] 此类重组宿主还可以包括至少一种编码以下一种或多种的外源核酸：硫酯酶，醛脱氢酶，7-氧代庚酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，CoA-转移酶，可逆的CoA-连接酶，乙酰化醛脱氢酶，或羧酸还原酶，并产生庚二酸或庚二酸半醛。例如，产生庚二酰CoA的重组宿主还可以包括硫酯酶，可逆的CoA-连接酶(例如可逆的琥珀酰-CoA连接酶)或CoA转移酶(例如戊烯二酸CoA转移酶)并产生庚二酸。例如，产生庚二酰CoA的重组宿主还可以包括乙酰化醛脱氢酶并产生庚二酸半醛。例如，产生庚二酸的重组宿主还可以包括羧酸还原酶并产生庚二酸半醛。 [0091] 产生庚二酸或庚二酸半醛的重组宿主还可以包括至少一种编码ω-转氨酶的外源核酸并产生7-氨基庚酸。在一些实施方案中，产生庚二酸的重组宿主包括羧酸还原酶和ω-转氨酶以产生7-氨基庚酸。 [0092] 产生庚二酸或庚二酸半醛的重组宿主还可以包括编码6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶或4-羟基丁酸脱氢酶的至少一种外源核酸，并产生7-羟基庚酸。在一些实施方案中，产生庚二酰-CoA的重组宿主包括乙酰化醛脱氢酶和6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶或4-羟基丁酸脱氢酶以产生7-羟基庚酸。在一些实施方案中，产生庚二酸的重组宿主包括羧酸还原酶和6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶或4-羟基丁酸脱氢酶以产生7-羟基庚酸。 [0093] 产生7-氨基庚酸，7-羟基庚酸或庚二酸半醛的重组宿主还可包括至少一种编码ω-转氨酶，脱乙酰酶，N-乙酰转移酶或醇脱氢酶的外源核酸，并产生七亚甲基二胺。例如，产生7-羟基庚酸的重组宿主可以包括羧酸还原酶与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂、ω-转氨酶和醇脱氢酶。 [0094] 产生7-羟基庚酸的重组宿主还可以包括以下一种或多种：羧酸还原酶与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂和醇脱氢酶，并产生1,7-庚二醇。 [0095] 在工程化途径中，酶可以来自单一来源，即来自一个物种或属，或可来自多个来源，即不同的物种或属。已经从各种生物体鉴定了编码本文所述酶的核酸，并且可容易地在公众可获得的数据库，如GenBank或EMBL中获得。 [0096] 本文描述的可用于产生一种或多种C7构件块的任何酶可与相应的野生型酶的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。应当理解，可以基于成熟酶(例如，除去任何信号序列)或基于未成熟酶(例如，包括任何信号序列)确定序列同一性。还应当理解，起始甲硫氨酸残基可以存在于或可以不存在于本文所述的任何酶序列上。 [0097] 例如，本文所述的具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽可以与海分枝杆菌(参见GenBank登录号ACC41782.1，SEQ ID NO:1)，耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK73223.1，SEQ ID NO:2)，或恶臭假单胞菌(参见GenBank登录号CAA39234.1，SEQ ID NO: 3)甲基转移酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。参见图9。 [0098] 例如，本文所述的具有硫酯酶活性的多肽可以与短乳杆菌(GenBank登录号ABJ63754.1，SEQ ID NO:4)或植物乳杆菌(GenBank登录号CCC78182.1，SEQ ID NO:5)酰基-[acp]硫酯酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。参见图9。 [0099] 例如，本文所述的具有庚二酰-[acp]甲酯酯酶活性的多肽可以与大肠杆菌庚二酰-[acp]甲酯酯酶(参见GenBank登录号AAC76437.1，SEQ ID NO:6)的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)。参见图9。 [0100] 例如，本文所述的具有羧酸还原酶活性的多肽可以与海分支杆菌(参见GenBank登录号ACC40567.1，SEQ ID NO:7)，耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK71854.1，SEQ ID NO:8)，Segniliparus rugosus(参见GenBank登录号EFV11917.1，SEQ ID NO:9)，耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK75684.1，SEQ ID NO:10)，马赛分枝杆菌(参见GenBank登录号EIV11143.1，SEQ ID NO:11)，或Segniliparus rugosus(参见GenBank登录号ADG98140.1，SEQ ID NO:12)羧酸还原酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。参见图9。 [0101] 例如，具本文所述的有ω-转氨酶活性的多肽可以与紫色色杆菌(参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:13)，铜绿假单胞菌(参见GenBank登录号AAG08191.1，SEQ ID NO:14)，丁香假单胞菌(参见GenBank登录号AAY39893.1，SEQ ID NO:15)，球形红杆菌(see GenBank登录号ABA81135.1，SEQ ID NO:16)，大肠杆菌(参见GenBank登录号AAA57874.1，SEQ ID NO:17)，或河流弧菌(参见GenBank登录号AEA39183.1，SEQ ID NO:18)ω-转氨酶的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。这些ω-转氨酶中的一些是二胺ω-转氨酶。 [0102] 例如，本文所述的具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的多肽可以与枯草芽孢杆菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见GenBank登录号CAA44858.1，SEQ ID NO:19)或诺卡氏菌属物种NRRL 5646磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(参见GenBank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:20)的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。参见图9。 [0103] 例如，本文所述的具有硫酯酶活性的多肽可以与由tesB编码的大肠杆菌硫酯酶的氨基酸序列(参见GenBank登录号AAA24665.1，SEQ ID NO:21)具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。参见图9。 [0104] 例如，本文所述的具有长链脂肪酸-CoA连接酶活性的多肽可以与大肠杆菌长链脂肪酸-CoA连接酶(参见GenBank登录号CAA50321.1，SEQ ID NO:22)，或钩虫贪铜菌长链脂肪酸-CoA连接酶(参见GenBank登录号CAJ95550.1，SEQ ID NO:23)的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％)。 [0105] 例如，本文所述的具有戊烯二酸CoA-转移酶活性的多肽可以与发酵氨基酸球菌戊烯二酸CoA-转移酶(参见例如分别为GenBank登录号CAA57199.1(GctA)和CAA57200.1(GctB)，SEQ ID NO:24和25)的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。 [0106] 例如，本文所述的具有烯酰-CoA还原酶活性的多肽可以与齿垢密螺旋体烯酰-CoA还原酶的氨基酸序列(参见例如GenBank登录号AAS11092.1，SEQ ID NO:26)或与细小裸藻烯酰-CoA还原酶的氨基酸序列(参见例如GenBank登录号AAW66853.1，SEQ ID NO:27)具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。 [0107] 例如，本文所述的具有烯酰CoA还原酶活性的多肽可以与Pseudomonas reinekei MT1的β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录号ACZ63623.1，SEQ ID NO:28)，恶臭假单胞菌β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录号AAA85138.1，SEQ ID NO:29)，Burkholderia xenovoransβ-酮硫解酶(参见例如GenBank登录号ABE33819.1，SEQ ID NO:30)，节杆菌属物种β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录号ABK03524.1，SEQ ID NO:31)，Burkholderia xenovoransβ-酮硫解酶(参见例如GenBank登录号ABE36495.1，SEQ ID NO:32)， Geobacillus kaustophilusβ-酮硫解酶(参见例如GenBank登录号BAD75605.1，SEQ ID NO: 33)，Gordonia bronchialisβ-酮硫解酶(参见例如GenBank登录ACY20886.1，SEQ ID NO: 34)，弗氏柠檬酸杆菌β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录KFB98168.1，SEQ ID NO:35)，伯克氏菌属β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录ADG18081.1，SEQ ID NO:36)，印度拜耶林克氏菌β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录ACB95386.1，SEQ ID NO:37)，Arthrobacter arilaitensisβ-酮硫解酶(参见例如GenBank登录CBT74677.1，SEQ ID NO:38)，钩虫贪铜菌β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录AAC38322.1，SEQ ID NO:39)，和大肠杆菌β-酮硫解酶(参见例如GenBank登录AAC74479.1，SEQ ID NO:40)的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性(同源性)(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％)。 [0108] 可以如下测定两种氨基酸序列间的百分比同一性(同源性)。首先，使用来自含有BLASTP第2.0.14版的单机版BLASTZ的BLAST 2Sequences(Bl2seq)程序比对氨基酸序列。此单机版BLASTZ可以获自Fish&Richardson的网站(例如www.fr.com/blast/)或美国政府国立生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)。解释如何使用Bl2seq程序的用法说明可以参见伴随BLASTZ的自述文件。Bl2seq使用BLASTP算法实施两种氨基酸序列之间的比较。为了比较两种氨基酸序列，如下设置Bl2seq的选项：-i设置为含有要比较的第一氨基酸序列的文件(例如C:\seq1.txt)；-j设置为含有要比较的第二氨基酸序列的文件(例如C:\seq2.txt)；-p设置为blastp；-o设置为任何期望的文件名称(例如C:\output.txt)；并且所有其它选项保持为其缺省设置。例如，可以使用以下命令来产生含有两种氨基酸序列间的比较的输出文件：C:\Bl2seq–ic:\seq1.txt–j c:\seq2.txt–p blastp–o c:\output.txt。如果两种比较序列共享同源性(同一性)，那么指定的输出文件会呈现那些同源性区作为比对序列。如果两种比较序列不共享同源性(同一性)，那么指定的输出文件不会呈现比对序列。可以对核酸序列遵循相似的规程，只是使用blastn。 [0109] 一旦比对，通过计算相同氨基酸残基在这两种序列中呈现的位置的数目确定匹配数目。通过用匹配数目除以全长多肽氨基酸序列的长度，接着将所得的数值乘以100来确定百分比同一性(同源性)。注意到百分比同一性(同源性)值被四舍五入到最近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13、和78.14被向下四舍五入到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18、和78.19被向上四舍五入到78.2。还注意到长度值会总是整数。 [0110] 应当领会，许多核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是本领域中公知的；即对于许多氨基酸，存在有超过一种充当氨基酸密码子的核苷酸三联体。例如，可以修饰给定酶的编码序列中的密码子，从而获得特定物种(例如细菌或真菌)中的最佳表达，这使用适合于所述物种的密码子偏爱表进行。 [0111] 也可以在本文件的方法中使用本文中描述的任何酶的功能性片段。如本文中使用的，术语“功能性片段”指与相应的成熟、全长、野生型蛋白质的活性具有至少25％(例如至少30％；40％；50％；60％；70％；75％；80％；85％；90％；95％；98％；99％；100％；或甚至大于100％)的蛋白质的肽片段。功能性片段一般但不总是可以由蛋白质的连续区构成，其中该区具有功能性活性。功能片段通常但不总是由蛋白质的连续区域组成，其中该区域具有功能活性。功能片段比相应的成熟蛋白要短，但通常至少25个(例如至少:30；40；50；60；70；80，90；100；120；150；200；250；300；450；500；800；或更多个)氨基酸长。 [0112] 此文件还提供了(i)本文件的方法中使用的酶的功能性变体和(ii)上文描述的功能性片段的功能性变体。相对于相应的野生型序列，酶和功能性片段的功能性变体可以含有添加、缺失、或取代。具有取代的酶一般会具有不超过50(例如不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、或50)处氨基酸取代(例如保守取代)。这适用于本文中描述的任何酶和功能性片段。保守取代是用一种氨基酸取代具有相似特征的另一种。保守取代包括下列组内的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸、和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸、和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。用上文提及的极性、碱性或酸性组的一种成员被相同组的另一种成员的任何取代可以视为保守取代。比较而言，非保守取代是用一种氨基酸取代具有不同特征的另一种。 [0113] 缺失变体可以缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个氨基酸的区段(具有两种或更多种氨基酸)或非连续的单一氨基酸。添加(添加变体)包括融合蛋白，其含有：(a)本文中描述的任何酶或其片段；和(b)内部或末端(C或N)无关或异源氨基酸序列。在此类融合蛋白的背景中，术语“异源氨基酸序列”指与(a)不同的氨基酸序列。异源序列可以是例如用于纯化重组蛋白的序列(例如FLAG、多组氨酸(例如六组氨酸)、凝集素(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源序列也可以是可用作可检测标志物的蛋白质，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、或氯霉素乙酰基转移酶(CAT)。在一些实施方案中，融合蛋白含有来自另一种蛋白质的信号序列。在某些宿主细胞(例如酵母宿主细胞)中，可以经由使用异源信号序列提高靶蛋白的表达和/或分泌。在一些实施方案中，融合蛋白可以含有可用于例如引发免疫应答以生成抗体的载体(例如KLH)或ER或高尔基体保留信号。异源序列可以是不同长度的，并且在一些情况中可以是比与异源序列附接的全长靶蛋白质更长的序列。 [0114] 工程化宿主可天然表达本文所述途径的酶的无一(none)或一些(例如，一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种，或六种或多种)。因此，工程化宿主内的途径可以包括所有外源性酶，或者可以包括内源性和外源性酶两者。工程化宿主的内源基因也可以被破坏以防止不期望的代谢物的形成或防止通过作用于该中间体的其它酶导致途径中的中间体的损失。工程化宿主可以称为重组宿主或重组宿主细胞。如本文所述，重组宿主可以包括编码如下的一种或多种的核酸：甲基转移酶，酯酶，合酶，脱水酶，水合酶，脱氢酶，硫酯酶，可逆的CoA-连接酶，CoA-转移酶，还原酶，脱乙酰酶，N-乙酰转移酶或ω-转氨酶，如下面更详细地描述。 [0115] 此外，可以使用本文所述的分离的酶，使用来自宿主微生物的裂解物(例如，细胞裂解物)作为酶的来源，或使用多种来自不同宿主微生物的裂解物作为酶的来源，体外进行一种或多种C7构件块的产生。 [0116] 生物合成方法 [0117] 本文件提供了在重组宿主中遮蔽(shielding)用末端羧基官能化的碳链脂肪族主链的方法。所述方法可以包括在所述宿主中使用具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽，将n-羧基-2-烯酸酶促转化为n-羧基-2-烯酸甲酯，其中n+1反映了碳链脂肪族主链的长度。例如，n-羧基-2-烯酸可以是长度为4至18个，4至16个，4至14个，4至12个，4至10个，5至10个，5至9个，或5至8个碳，如2(E)-庚烯二酸，并可以被酶促转化为相应的甲酯，如2(E)-庚烯二酸甲酯。具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽可以被归类于EC 2.1.1.15下。在一些实施方案中，具有脂肪酸O-甲基转移酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3所列的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。 [0118] 在一些实施方案中，所述方法还包含将2(E)-庚烯二酸甲酯酶促转化为庚二酰-CoA。例如所述方法还可以包括将庚二酰-CoA酶促转化为选自以由下组成的组的产物：庚二酸，7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，七亚甲基二胺，和1,7-庚二醇，例如使用一种或多种具有硫酯酶活性，可逆的CoA-连接酶活性，戊烯二酸CoA-转移酶活性，ω-转氨酶活性，6-羟基己酸脱氢酶活性，5-羟基戊酸脱氢酶活性，4-羟基丁酸脱氢酶活性，醇脱氢酶活性，羧酸还原酶活性，或醇脱氢酶活性的多肽进行。 [0119] 本文件还提供了在重组宿主中产生2(E)-庚烯二酰-CoA甲酯的方法。所述方法可以包括在重组宿主中使用具有脂肪酸O-甲基转移酶活性活性的多肽将2(E)-庚烯二酸酶促转化为2(E)-庚烯二酸甲酯。具有脂肪酸O-甲基转移酶活性活性的多肽可以被归类于EC 2.1.1.15下。在一些实施方案中，具有脂肪酸O-甲基转移酶活性活性的多肽与SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3所列的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。所述方法还可以包括将2(E)-庚烯二酰-CoA甲酯酶促转化为庚二酰-CoA甲酯。 [0120] 在一些实施方案中，从2(E)-庚烯二酰-CoA酶促产生2(E)-庚烯二酸。例如具有硫酯酶或CoA-转移酶活性的多肽可以将2(E)-庚烯二酰-CoA酶促转化为2(E)-庚烯二酸。在一些实施方案中，具有硫酯酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所列的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。在一些实施方案中，具有CoA-转移酶活性的多肽可以与SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所列的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性 [0121] 在一些实施方案中，使用归类于EC 6.2.1.-(例如EC 6.2.1.2或EC 6.2.1.3)下的具有CoA连接酶活性的多肽将2(E)-庚烯二酸甲酯酶促转化为2(E)-庚烯二酰-CoA甲酯。 [0122] 在一些实施方案中，所述方法还包括将2(E)-庚烯二酰-CoA甲酯酶促转化为庚二酰-CoA甲酯。在一些实施方案中，具有反式-2-烯酰基-CoA还原酶活性的多肽将2(E)-庚烯二酰-CoA甲酯酶促转化为庚二酰-CoA甲酯。 [0123] 在一些实施方案中，所述方法还包括将庚二酰-CoA甲酯酶促转化为庚二酰-CoA。在一些实施方案中，具有庚二酰-[acp]甲酯酯酶活性的多肽与SEQ ID NO:6所列的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。 [0124] 在一些实施方案中，所述方法还包括将庚二酰-CoA酶促转化为由以下组成的组的产物：庚二酸，7-氨基庚酸，7-羟基庚酸，七亚甲基二胺，和1,7-庚二醇。在一些实施方案中，所述方法使用具有硫酯酶，可逆的CoA-连接酶或戊烯二酸CoA转移酶活性的多肽将庚二酰-CoA酶促转化为庚二酸。 [0125] 在一些实施方案中，所述方法还包括使用具有羧酸还原酶活性的多肽将庚二酸酶促转化为庚二酸半醛。在一些实施方案中，具有羧酸还原酶活性的多肽与SEQ ID NO:7到12所列的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。 [0126] 在一些实施方案中，所述方法还包括使用具有乙酰化醛脱氢酶活性的多肽将庚二酰-CoA酶促转化为庚二酸半醛。在一些实施方案中，所述方法还包括使用具有以下活性的多肽将庚二酸半醛酶促转化为庚二酸：5-氧代戊酸脱氢酶活性，6-氧代己酸脱氢酶活性，7-氧代庚酸脱氢酶活性，或醛脱氢酶活性。 [0127] 在一些实施方案中，所述方法还包括使用具有ω-转氨酶活性的多肽将庚二酸半醛酶促转化为7-氨基庚酸。在一些实施方案中，具有ω-转氨酶活性的多肽与SEQ ID NO:13至18所列的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。 [0128] 在一些实施方案中，所述方法还包括使用具有ω-转氨酶活性的多肽将庚二酸半醛酶促转化为七亚甲基二胺。 [0129] 在一些实施方案中，所述方法还包括使用具有以下活性的多肽将庚二酸半醛酶促转化为7-羟基庚酸：6-羟基己酸脱氢酶活性，5-羟基戊酸脱氢酶活性，4-羟基丁酸脱氢酶活性，或醇脱氢酶活性。 [0130] 在一些实施方案中，所述方法还包括使用具有羧酸还原酶或醇脱氢酶活性的多肽将7-羟基庚酸酶促转化为1,7-庚二醇。 [0131] 在一些实施方案中，方法的一个或多个步骤通过发酵实施。在一些实施方案中，宿主经受在需氧，厌氧，微需氧或混合氧/反硝化的培养条件下的培养策略。在一些实施方案中，在磷酸盐，氧，和/或氮限制的条件下培养宿主。在一些实施方案中，使用陶瓷膜保留宿主来维持发酵期间的高细胞密度 [0132] 在一些实施方案中，补料到发酵的主要碳源源自生物或非生物给料。在一些实施方案中，生物给料是或源自单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸、甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的酒糟可溶物(condensed distillers'solubles)或城市废物。在一些实施方案中，非生物给料是或源自天然气、合成气(syngas)、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐/酯、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)碱洗液(caustic wash)废物流，或对苯二甲酸/间苯二甲酸混合物废物流。 [0133] 在一些实施方案中，宿主包含一种或多种具有弱化的以下活性的多肽：聚羟基链烷酸合酶活性，乙酰CoA硫酯酶活性，乙酰CoA特异性β-酮硫解酶活性，形成乙酸的磷酸转乙酰酶活性，乙酸激酶活性，乳酸脱氢酶活性，menaquinol-延胡索酸氧化还原酶活性，产生异丁醇的2-酮酸脱羧酶活性，形成乙醇的醇脱氢酶活性，丙糖磷酸异构酶活性，丙酮酸脱羧酶活性，葡萄糖-6-磷酸异构酶活性，消散NADPH不平衡的转氢酶活性，消散NADPH不平衡的谷氨酸脱氢酶活性，利用NADH/NADPH的谷氨酸脱氢酶活性，庚二酰-CoA脱氢酶活性；接受C7构件块和中心前体作为底物的酰基-CoA脱氢酶活性；戊二酰-CoA脱氢酶活性；或庚二酰-CoA合成酶活性。 [0134] 在一些实施方案中，宿主过表达一种或多种基因，其编码具有以下活性的多肽：乙酰CoA合成酶活性；6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性；转酮酶活性；吡啶(puridine)核苷酸转氢酶活性；甲酸脱氢酶活性；甘油醛-3P-脱氢酶活性；苹果酸酶活性；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性；果糖1,6二磷酸酶活性；L-丙氨酸脱氢酶活性；PEP羧化酶活性，丙酮酸羧化酶活性；PEP羧激酶活性；PEP合酶活性；用于产生辅因子不平衡的对NADPH特异的L-谷氨酸脱氢酶活性；甲醇脱氢酶活性，甲醛脱氢酶活性，赖氨酸转运蛋白活性；二羧酸转运蛋白活性；S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性；3-磷酸甘油酸脱氢酶活性；3-磷酸丝氨酸转氨酶活性；磷酸丝氨酸磷酸酶活性；或多药物转运蛋白活性。 [0135] 在一些实施方案中，所述宿主是原核生物，例如，大肠杆菌，杨氏梭菌，自产乙醇梭菌，克鲁佛梭菌，谷氨酸棒状杆菌，钩虫贪铜菌，耐金属贪铜菌，荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌，食油假单胞菌，食酸代尔夫特菌，枯草芽胞杆菌，德氏乳杆菌，乳酸乳球菌，和红球菌。 [0136] 在一些实施方案中，所述宿主是真核生物，例如，黑曲霉，酿酒酵母，巴斯德毕赤酵母，解脂耶罗维亚酵母，东方伊萨酵母，汉逊德巴利酵母，Arxula adenoinivorans，和乳酸克鲁维酵母菌。 [0137] 将2(E)-庚烯二酰基-CoA转化为2(E)-庚烯二酰基-CoA甲酯的酶 [0138] 如描绘于图1至3中，可以使用脂肪酸O-甲基转移酶(如例如归类于EC 2.1.1.15下的脂肪酸O-甲基转移酶)从2(E)-庚烯二酸形成2(E)-庚烯二酰基-CoA甲酯。例如，所述脂肪酸O-甲基转移酶可以获得自海分枝杆M(GenBank登录号ACC41782.1.SEQ ID NO:1)；耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK73223.1，SEQ ID NO:2)，或恶臭假单胞菌(参见GenBank登录号CAA39234.1，SEQ ID NO:3)。 [0139] 例如，可以使用例如归类于EC 6.2.1.-下的CoA连接酶，将2(E)-庚烯二酸甲酯转化为2(E)-庚烯二酰基-CoA甲酯。在一些实施方案中，可以使用归类于EC 6.2.1.2下的丁酸-CoA连接酶或归类于EC 6.2.1.3下的长链脂肪酸-CoA连接酶(如来自大肠杆菌(GenBank登录号CAA50321.1，SEQ ID NO:22)或钩虫贪铜菌的长链脂肪酸-CoA连接酶(GenBank登录号CAJ95550.1，SEQ ID NO:23))，将2(E)-庚烯二酸甲酯转化为2(E)-庚烯二酰基-CoA甲酯。参见图1至3。 [0140] 在一些实施方案中，可以使用例如归类于EC 3.1.2.-下的硫酯酶(如来自短乳杆菌的酰基-[acp]硫酯酶(GenBank登录号ABJ63754.1，SEQ ID NO:4)或来自植物乳杆菌的酰基-[acp]硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1，SEQ ID NO:5))，从2(E)-庚烯二酰基-CoA(也称为2,3-脱氢庚二酰-CoA)形成2(E)-庚烯二酸。此类酰基-[acp]硫酯酶具有C6–C8链长度特异性(参见，例如Jing等，2011，BMC Biochemistry，12(44))。参见，例如图1。 [0141] 在一些实施方案中，可以使用例如CoA-转移酶(如戊烯二酸CoA-转移酶)从2(E)-庚烯二酰基-CoA形成2(E)-庚烯二酸，所述CoA-转移酶例如归类于EC 2.8.3.12下，如来自发酵氨基酸球菌的GctAB的基因产物(分别为GenBank登录号CAA57199.1(GctA)和CAA57200.1(GctB)，SEQ ID NO:24和25)。参见，例如Buckel等，1981，Eur.J.Biochem.，118: 315-321。参见，例如图2和3。 [0142] 从戊二酰-CoA产生2(E)-庚烯二酰基-CoA的酶 [0143] 如描绘于图1中，可以从中心代谢物2-酮戊二酸或乙酰CoA经由以下碳链延伸来形成戊二酰-CoA，所述碳链延伸(i)与通过α-氨基己二酸的赖氨酸生物合成相关或(ii)与Synthrophus aciditrophicus中的环己烷羧酸生物合成相关。可以使用(i)β-酮酰基-[acp]合酶或β-酮硫解酶，(ii)3-羟基丁酰-CoA脱氢酶，和(iii)烯酰CoA水合酶将戊二酰-CoA转化为2(E)-庚烯二酰基-CoA。 [0144] 例如，可以通过与经由α-氨基己二酸的赖氨酸生物合成有关的C1碳链延伸来形成戊二酰-CoA，其包含使用(i)高柠檬酸合酶，(ii)高柠檬酸脱水酶和高乌头酸水合酶，(iii)异高柠檬酸脱氢酶，(iv)脱羧酶，如吲哚丙酮酸脱羧酶，(vi)戊二酸半醛脱氢酶和(v)戊二酸:CoA连接酶。参见例如图1。 [0145] 例如，可以通过与在Synthrophus aciditrophicus中的环己烷羧酸生物合成相关的CoA-依赖的碳链延伸来形成戊二酰-CoA，其包括使用(i)β-酮硫解酶或乙酰基-羧化酶与乙酰乙酰CoA合酶的组合，(ii)3-羟基丁酰-CoA脱氢酶，(iii)烯酰CoA水合酶，和(iv)戊二酰-CoA脱氢酶与烯酰CoA还原酶或反式-2-烯酰CoA还原酶的组合或(v)戊烯二酰基-CoA脱羧酶。参见例如图1。 [0146] 在一些实施方案中，(高)n柠檬酸合酶例如可以被归类于EC 2.3.3.14或EC 2.3.3.13下，如来自詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的aksA的基因产物(参见GenBank登录号AAB98494.1)。 [0147] 在一些实施方案中，(高)n柠檬酸脱氢酶和(高)n乌头酸盐水合酶的组合可以被归类于例如EC 4.2.1.-(如EC 4.2.1.114，EC 4.2.1.36或EC 4.2.1.33)下，如来自詹氏甲烷球菌的aksD的基因产物(参见GenBank登录号AAB99007.1)或来自詹氏甲烷球菌的aksE的基因产物(参见GenBank登录号AAB99277.1)。aksD和aksE的基因产物是归类于EC 4.2.1.114下的酶的亚基。LeuC和LeuD的基因产物是归类于EC 4.2.1.33下的酶的亚基。 [0148] 在一些实施例中，异(高)n柠檬酸脱氢酶例如可以被归类于EC 1.1.1.-(如EC 1.1.1.85，EC 1.1.1.87或EC 1.1.1.286)下，如来自詹氏甲烷球菌的aksF的基因产物(参见GenBank登录号ACA28837.1)，来自酿酒酵母的LYS12的基因产物(参见GenBank登录号CAA86700.1)或来自嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)的hicdh(参见GenBank登录号BAB88861.1)。 [0149] 在一些实施方案中，可以通过归类于例如EC 4.1.1.43，EC 4.1.1.72，或EC 4.1.1.74下的脱羧酶，如来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的吲哚-3-丙酮酸脱羧酶(参见，例如GenBank登录号CAC48239.1)对2-氧代-己二酸脱羧。来自鼠伤寒沙门氏菌的吲哚-3-丙酮酸脱羧酶的突变体变体被成功地工程化改造以选择地接受较长链长度的底物。提供于GenBank登录号CAC48239.1中的序列的L544A突变允许比对C5 2-酮酸高567倍的对C7 2-酮酸的选择性(参见Xiong等，2012，Scientific Reports，2:311)。2-酮戊二酸脱氢酶复合物已证实对2-酮戊二酸和2-氧代己二酸的活性(Bunik等，2000， Eur.J.Biochem.，267，3583–3591)。 [0150] 还可以通过2-酮戊二酸脱氢酶复合物对2-氧代己二酸来脱羧，所述2-酮戊二酸脱氢酶复合物由与归类于例如EC 1.2.4.2，EC 1.8.1.4，和EC 2.3.1.61下的酶同源的酶构成。2-酮戊二酸脱氢酶复合物含有多拷贝的例如归类于EC 1.2.4.2下的2-酮戊二酸脱氢酶，所述2-酮戊二酸脱氢酶结合到例如归类于EC 2.3.1.61下的二氢脂酰赖氨酸-残基琥珀酰转移酶(dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferases)的核心，其还结合多拷贝的例如归类于EC 1.8.1.4下的二氢脂酰基脱氢酶(dihydrolipoyl dehydrogenase)。 [0151] 在一些实施方案中，5-氧代戊酸脱氢酶(如戊二酸半醛脱氢酶)可被归类于，例如EC 1.2.1.-(如EC 1.2.1.20，EC 1.2.1.16或EC 1.2.1.79)下，如CpnE的基因产物(参见，例如Iwaki等，2002，Appl.Environ.Microbiol.，68(11):5671–5684)。 [0152] 在一些实施方案中，戊二酸CoA连接酶例如可以被归类于EC 6.2.1.6下。 [0153] 在一些实施方案中，β-酮硫解酶可以被归类于EC 2.3.1.-(例如EC 2.3.1.9，EC 2.3.1.16，或EC 2.3.174)下。例如，β-酮硫解酶可以被归类于EC 2.3.1.9下，如atoB或phaA的基因产物。由atoB或phaA编码的β-酮硫解酶接受乙酰CoA作为底物，形成乙酰乙酰CoA(参见Haywood等，1988，同上；Slater等，1998，同上)。由paaJ(参见例如GenBank登录号AAC74479.1)，catF和pcaF编码的β-酮硫解酶可以归类于例如EC 2.3.1.174下。由paaJ编码的β-酮硫解酶将乙酰CoA和琥珀酰-CoA缩合成3-氧代己二酰-CoA(参见例如，Fuchs等， 2011，Nature Reviews Microbiology，9，803–816； 等，2002，J.Bacteriol.，184(1)， 216–223)。Synthrophus aciditrophicus中paaJ的同源物催化乙酰CoA和戊二酰CoA缩合成 3-氧代庚二酰-CoA，如GenBank登录号ABC78517.1或GenBank登录号ABC78881.1。或者，在Synthrophus aciditrophicus中的paaJ的β-酮酰基-[acp]同源物催化乙酰基-CoA和戊二酰基-CoA缩合成3-氧代庚二酰-CoA。 [0154] 乙酰CoA羧化酶可以被归类于EC 6.4.1.2下，且乙酰乙酰CoA合酶可以被归类于EC 2.3.1.194下。通过乙酰CoA羧化酶将乙酰CoA转化为丙二酰CoA已显示增加脂肪酸合成的速率(Davis等，J.Biol.Chem.，2000，275(37)，28593-28598)。已经证明，乙酰乙酰CoA合酶可以用作在与聚羟基丁酸合成相关的碳链延伸中的phaA的基因产物的不可逆替代物 (Matsumoto等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，2011，75(2)，364–366)。 [0155] 在一些实施方案中，3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶(也可以称为3-羟基酰基-CoA脱氢酶)可被归类于EC 1.1.1 .157下，如hbd的基因产物(参见，例如Shen等，Appl.Environ.Microbiol.，2011，77(9)，2905–2915；Budde等，J.Bacteriol.，2010，192(20)，5319–5328)或paaH的基因产物(Teufel等，2010，Proc.Natl.Acad.Sci.107(32)， 14390–14395)。 [0156] 在一些实施方案中，烯酰CoA水合酶可以被归类于EC 4.2.1.17下，如crt的基因产物(参见，例如Shen等，2011，同上；Fukui等，J.Bacteriol.，1998，180(3)，667–673)或paaF的基因产物(参见，例如Fuchs等，2011，同上)。Synthrophus aciditrophicus中的paaF的同源物包括GenBank登录号ABC77794.1的烯酰CoA水合酶或GenBank登录号ABC78950.1的烯酰CoA水合酶。 [0157] 在一些实施方案中，依赖于Na+膜泵的可逆戊烯二酰基-CoA脱羧酶例如可以被归类于例如EC 4.1.1.70下(参见Mouttaki等，Appl.Environ.Microbiol.，2007，73(3)，930-938)。所述EC 4.1.1.70酶活性与Synthrophus aciditrophicus中的以下的亚基相关，即Genbank登录号(1)ABC77900.1，(2)ABC76114.1和(3)ABC77898.1。 [0158] 在一些实施方案中，烯酰基-[acp]还原酶可以被归类于EC 1.3.1.-(例如EC1.3.1.9)下，如获自Synthrophus aciditrophicus的烯酰基-[acp]还原酶或来自枯草芽孢杆菌的FabI的基因产物(Genbank登录号:CAB13029.2)(参见，例如Heath等，2000，J.Biol.Chem.，275(51)，40128-33)。在Synthrophus aciditrophicus中涉及脂肪酸合成的烯酰基-[acp]还原酶可能接受辅酶A活化的二羧酸(Mouttaki等，2007，同上)。 [0159] 在一些实施方案中，反式-2-烯酰基-CoA还原酶例如可被归类于EC 1.3.1.44下，如ter的基因产物(GenBank登录号AAW66853.1)(Hoffmeister等，2005，J.Biol.Chem.，280(6)，4329-4338；Shen等，2011，同上)，或tdter的基因产物(GenBank登录号AAS11092.1)(Bond-Watts等，Biochemistry，2012，51，6827-6837)。 [0160] β-酮酰基-[acp]合酶例如可被归类于EC 2.3.1.41，EC 2.3.1.179，或EC 2.3.1.180下。在Synthrophus aciditrophicus中涉及脂肪酸合成的β-酮硫解酶和β-酮酰基-[acp]合酶可能接受CoA活化的二羧酸(Mouttaki等，Appl.Environ.Microbiol.，2007， 73(3)，930-938)。 [0161] 从2-氧代-庚二酸产生2(E)-庚烯二酰基-CoA的酶 [0162] 如图2中描绘，可以通过两轮与经由α-氨基己二酸的赖氨酸生物合成相关的碳链延伸，从中心代谢物2-酮戊二酸形成2-氧代-庚二酸，其中每轮延伸包含使用(i)高柠檬酸合酶，(ii)高柠檬酸脱水酶和高乌头酸水合酶，和(iii)异高柠檬酸脱氢酶。高柠檬酸合酶，高柠檬酸脱水酶，高乌头酸水合酶，和异高柠檬酸脱氢酶如上所述。还可以使用4-羟基-2-氧代庚二酸醛缩酶(hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolase)，2-氧代-庚-3-烯-1,7二酸水合酶，和2-烯酸还原酶从琥珀酸半醛形成2-氧代-庚二酸，如图3中显示的。 [0163] 可以使用(i)2-羟基戊二酸脱氢酶或(ii)乳酸脱氢酶，(ii)CoA-转移酶如戊烯二酸CoA转移酶，和(iii)2-羟基戊二酰-CoA脱水酶或2-羟基异己酰基-CoA脱水酶将2-氧代-庚二酸转化为2(E)-庚烯二酰基-CoA。参见图2和3。 [0164] 2-羟基戊二酸脱氢酶例如可以被归类于1.1.1.-(337)下，如HgdH或ldhA的基因产物。参见Djurdjevic等，2011，Appl.Environ.Microbiol.，77(1)，320–322和Kim等，2005，FEBS Journal，272，550-561。 [0165] CoA转移酶，如戊烯二酸CoA转移酶例如可以被归类于EC 2.8.3.12下，且可以获得自发酵氨基酸球菌(参见例如SEQ ID NO:24和25)。参见，例如Buckel等，1981，Eur.J.Biochem.，118:315–321。 [0166] 2-羟基戊二酰-CoA脱水酶例如可以被归类于EC 4.2.1.-下，如HgdAB的基因产物(Genbank登录号AAD31677.1和AAD31675.1)，与活化子(activator)HgdC的基因产物(GenBank登录号CAA42196.1)组合。HgdAB基因产物含有亚基A和B。参见，Djurdjevic等， 2011，同上。2-羟基异己酰基-CoA脱水酶例如可以被归类于EC 4.2.1.-下，如hadBC(Genbank登录号AAV40819.1和AAV40820.1)或hadI(GenBank登录号AAV40818.1)的基因产物。 [0167] 4-羟基-2-氧代庚二酸醛缩酶(4-hydroxy-2-oxoheptanedioate aldolase)例如可以被归类于EC 4.1.2.52下，例如HpaI的基因产物。参见GenBank登录号CAA87759.1。 [0168] 2-氧代-庚-3-烯-1,7-二酸水合酶例如可以被归类于EC 4.2.1.-下，例如HpaH的基因产物。参见GenBank登录号AAB91474.1。 [0169] 在一些实施方案中，2-烯酸还原酶可以被归类于EC 1.3.1.-(如EC 1.3.1.31或EC 1.6.99.1)下，如来源于枯草芽孢杆菌(GenBank登录号BAA12619.1)，恶臭假单胞菌 (GenBank登录号AAN66878.1)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)(GenBank登录号AAA98815.1)，干酪乳杆菌(GenBank登录号AGP69310.1)，Saccharomyces pastorianus(GenBank登录号CAA37666.1)，Thermoanaerobacter pseudethanolicus(GenBank登录号ABY93685.1)，或阴沟肠杆菌(GenBank登录号AAB38683.1)(Gao等，2012，Enzyme Microb.Technol.，51(1)，26-34)。 [0170] 在C7构件块的生物合成中促进引入末端官能基团的酶 [0171] 在一些实施方案中，羧酸还原酶促进末端醛基的产生，用于随后通过ω-转氨酶转化为胺基或通过醇脱氢酶转化为羟基。羧酸还原酶例如可获得自海分枝杆菌(GenBank登录号ACC40567.1，SEQ ID NO:7)，耻垢分枝杆菌(GenBank登录号ABK71854.1，SEQ ID NO:8)，Segniliparus rugosus(GenBank登录号EFV11917.1，SEQ ID NO:9)，耻垢分枝杆菌(GenBank登录号ABK75684.1，SEQ ID NO:10)，马赛分枝杆菌(GenBank登录号EIV11143.1，SEQ ID NO:11)，或Segniliparus rotundus(GenBank登录号ADG98140.1，SEQ ID NO:12)。 参见例如图4至8。 [0172] 由car的基因产物编码的羧酸还原酶和增强剂npt具有较宽的底物特异性，包括末端双官能的C4和C5羧酸(Venkitasubramanian等，Enzyme and Microbial Technology，2008，42，130-137)。 [0173] 在C7构件块的生物合成中产生末端羧基的酶 [0174] 如描绘于图4中，可以使用硫酯酶，醛脱氢酶，7-氧代庚酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，CoA-转移酶或可逆的CoA-连接酶酶促形成末端羧基。 [0175] 在一些实施方案中，通过庚二酰-[acp]甲酯酯酶酶促形成导致C7构件块合成的第一末端羧基，所述庚二酰-[acp]甲酯酯酶例如归类于EC 3.1.1.85下，如bioH的基因产物(GenBank登录号AAC76437.1，SEQ ID NO:6)。参见图1和2。 [0176] 在一些实施方案中，通过硫酯酶酶促形成导致C7构件块合成的第二末端羧基，所述硫酯酶被归类于EC 3.1.2.-下，如YciA，tesB(GenBank登录号AAA24665.1，SEQ ID NO:21)，Acot13或源自短乳杆菌(GenBank登录号ABJ63754.1，SEQ ID NO:4)或源自植物乳杆菌(GenBank登录号CCC78182.1，SEQ ID NO:5)的基因产物(参见例如Cantu等，Protein Science，2010，19，1281–1295；Zhuang等，Biochemistry，2008，47(9)，2789-2796；Naggert等，J.Biol.Chem.，1991，266(17)，11044-11050；或Jing等，2011，BMC Biochemistry，12(44))。 [0177] 在一些实施方案中，导致庚二酸的合成的第二末端羧基由例如归类于EC 1.2.1.3的醛脱氢酶酶促形成(参见例如，Guerrillot和Vandecasteele，Eur.J.Biochem.，1977，81，185–192)。 [0178] 在一些实施方案中，导致庚二酸的合成的第二末端羧基由归类于EC 1.2.1.-(如EC 1.2.1.16，EC 1.2.1.20，EC 1.2.1.79，EC 1.2.1.3或EC 1.2.1.63)下的脱氢酶，如5-氧代戊酸脱氢酶(例如来自丛毛单胞菌属物种(Comamonas sp.)的CpnE的基因产物)，6-氧代己酸脱氢酶(例如来自不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)的ChnE的基因产物)或7-氧代庚酸脱氢酶(例如来自Sphingomonas macrogolitabida的ThnG的基因产物)。参见例如Iwaki等，Appl.Environ.Microbiol.，1999，65(11)，5158–5162；Iwaki等，Appl.Environ.Microbiol.，2002，68(11)，5671-5684；或López-Sánchez等， Appl.Environ.Microbiol.，2010，76(1)，110-118。例如，6-氧代己酸脱氢酶可以被归类于EC 1.2.1.63下。例如，7-氧代庚酸脱氢酶可以被归类于EC 1.2.1.-下。 [0179] 在一些实施方案中，导致庚二酸的合成的第二末端羧基由CoA-转移酶酶促形成，所述CoA-转移酶例如归类于EC 2.8.3.12下，如来自发酵氨基酸球菌。参见例如Buckel等，1981，Eur.J.Biochem.，118:315-321。 [0180] 在一些实施方案中，导致庚二酸的合成的第二末端羧基由可逆的CoA-连接酶酶促形成，所述可逆的CoA-连接酶酶如例如归类于EC 6.2.1.5下，如来自Thermococcus kodakaraensis。参见例如Shikata等，2007，J.Biol.Chem.，282(37):26963-26970。 [0181] 在C7构件块的生物合成中产生末端胺基的酶 [0182] 如描绘与图5和图6中，可以使用ω-转氨酶或脱乙酰酶酶促形成末端胺基。 [0183] 在一些实施方案中，导致7-氨基庚酸合成的第一或第二末端胺基由ω-转氨酶酶促形成，所述ω-转氨酶例如归类于EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下，如获得自紫色色杆菌(GenBank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:13)，铜绿假单胞菌(GenBank登录号AAG08191.1，SEQ ID NO:14)，丁香假单胞菌(GenBank登录号AAY39893.1，SEQ ID NO:15)，球形红杆菌(GenBank登录号ABA81135.1，SEQ ID NO:16)，大肠杆菌(GenBank登录号AAA57874.1，SEQ ID NO:17)，河流弧菌(GenBank登录号AEA39183.1，SEQ ID NO:18)，灰色链霉菌(Streptomyces griseus)，或Clostridium viride。例如，归类于例如EC 2.6.1.29或EC 2.6.1.82下的ω-转氨酶可以是二胺ω-转氨酶。 [0184] 来自紫色色杆菌的可逆的ω-转氨酶(GenBank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:13)已经证明接受6-氨基己酸作为氨基供体的类似的活性，从而在己二酸半醛中形成第一末端氨基(Kaulmann等，Enzyme and Microbial Technology，2007，41，628-637)。 [0185] 来自灰色链霉菌的可逆的4-氨基丁酸:2-酮戊二酸转氨酶已经证明对于6-氨基己酸到己二酸半醛的转化的类似的活性(Yonaha等，Eur.J.Biochem.，1985，146:101-106)。 [0186] 来自Clostridium viride的可逆的5-氨基戊酸转氨酶已经证明对于6-氨基己酸到己二酸半醛的转化的类似的活性(Barker等，J.Biol.Chem.，1987，262(19)，8994-9003)。 [0187] 在一些实施方案中，导致7-氨基庚酸或七亚甲基二胺的合成的末端氨基通过二胺ω-转氨酶酶促形成。例如可以通过二胺ω-转氨酶酶促形成第二末端氨基，所述二胺ω-转氨酶例如归类于EC 2.6.1.29下或例如归类于EC 2.6.1.82下，如来自大肠杆菌的YgjG的基因产物(GenBank登录号AAA57874.1，SEQ ID NO:17)。 [0188] ygjG的基因产物接受宽范围的二胺碳链长度底物，如腐胺，尸胺和亚精胺(参见例如，Samsonova等，BMC Microbiology，2003，3:2)。 [0189] 来自大肠杆菌菌株B的二胺ω-转氨酶已经证明针对1,7二氨基庚烷的活性(Kim，The Journal of Chemistry，1964，239(3)，783–786)。 [0190] 在一些实施方案中，导致七亚甲基二胺合成的第二末端氨基由脱乙酰酶酶促形成，所述脱乙酰酶如例如归类于EC 3.5.1.17下的酰基-赖氨酸脱酰酶或如例如归类于如EC 3.5.1.62下的乙酰腐胺脱乙酰酶。来自藤黄微球菌(Micrococcus luteus)K11的乙酰腐胺脱乙酰酶接受宽范围的碳链长度底物，如乙酰腐胺，乙酰尸胺和N8-乙酰亚精胺(参见例如Suzuk等，1986，BBA–General Subjects，882(1):140-142)。 [0191] 在C7构件块的生物合成中产生末端羟基的酶 [0192] 如描绘与图7和8，可以使用6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，4-羟基丁酸脱氢酶或醇脱氢酶，酶促形成末端羟基。 [0193] 例如导致7-羟基庚酸的末端羟基可以由脱氢酶酶促形成，所述脱氢酶例如归类于EC 1.1.1.-下，如6-羟基己酸脱氢酶(例如归类于EC 1.1.1.258下(如来自ChnD的基因))，例如归类于EC 1.1.1.-下的5-羟基戊酸脱氢酶，如CpnD的基因产物(参见例如Iwaki等，2002，Appl.Environ.Microbiol.，68(11):5671-5684)，来自Clostridium viride的5-羟基戊酸脱氢酶，或4-羟基丁酸脱氢酶，如gabD(参见例如，Lütke-Eversloh和Steinbüchel， 1999，FEMS Microbiology Letters，181(1):63-71)。参见图7。 [0194] 在一些实施方案中，导致1,7庚二醇合成的第二末端羟基由醇脱氢酶酶促形成，所述醇脱氢酶例如归类于EC 1.1.1.-(如EC 1.1.1.1，EC 1.1.1.2，EC 1.1.1.21，或EC 1.1.1.184)下。 [0195] 生物化学途径 [0196] 在C7主链生物合成中使用乙酰CoA或2-酮戊二酸作为中心代谢物的途径。 [0197] 在一些实施方案中，从如下中心代谢物乙酰CoA合成戊二酰-CoA：通过β-酮硫解酶(例如归类于EC 2.3.1.9下)如atoB或phaA的基因产物，或者通过乙酰CoA羧化酶(例如归类于EC 6.4.1.2下)和乙酰乙酰CoA合酶(例如归类于EC 2.3.1.194下)将乙酰CoA转化为乙酰乙酰CoA；然后通过3-羟基酰基-CoA脱氢酶(例如归类于EC 1.1.1.-，如EC 1.1.1.157或EC 1.1.1.35下)，如hbd的基因产物，转化为3-羟基丁酰-CoA；然后通过烯酰CoA还原酶(例如归类于EC 4.2.1.-(如EC 4.2.1.17)下)，如crt的基因产物，转化为巴豆酰-CoA，然后通过戊烯二酰基-CoA脱羧酶(如归类于EC 4.1.1.70下)转化为a)戊烯二酰基-CoA；然后通过(i)烯酰基-[acp]还原酶(如归类于EC 1.3.1.9下)或(ii)反式-2-烯酰CoA还原酶(如归类于EC 1.3.1.44下)如ter或tdter的基因产物转化为戊二酰-CoA，或(b)通过来自Synthrophus aciditrophicus的经受电子分叉(electron bifurcation)的戊二酰-CoA脱氢酶如Genbank登录号(1)ABC77899.1，(2)ABC76101.1，(3)ABC76260.1，(4)ABC76949或(5)ABC78863.1的脱氢酶，转化为戊二酰-CoA。参见图1。 [0198] 在一些实施方案中，从如下中心代谢物2-酮戊二酸合成戊二酰-CoA：通过高柠檬酸合酶(例如归类于EC 2.3.3.14或EC 2.3.3.13下)，如来自酿酒酵母的LYS20和LYS21的基因产物或来自嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)hcs的基因产物，将2-酮戊二酸转化为(高)1柠檬酸；然后通过高柠檬酸脱水酶和高乌头酸水合酶(例如归类于EC 4.2.1.114，EC 4.2.1.36或EC 4.2.1.33下)，如来自酿酒酵母的LYS4的基因产物或来自嗜热栖热菌的lysT和LysU的基因产物，转化为异(高)1柠檬酸；然后通过异(高)1柠檬酸脱氢酶(例如归类于EC 1.1.1.85，EC 1.1.1.87或EC 1.1.1.286下)，如来自酿酒酵母的LYS12的基因产物或来自嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)的hicdh的基因产物，转化为2-氧代己二酸；然后通过脱羧酶(如归类于EC 4.1.1.43，EC 4.1.1.74，EC 4.1.1.72下)，如吲哚丙酮酸脱羧酶(如GenBank登录号CAC48239.1)，支链alpha-酮酸脱羧酶(如GenBank登录号AAS49166.1)或alpha-酮异戊酸脱羧酶(如GenBank登录号ADA65057.1)，转化为戊二酸半醛；然后通过戊二酸半醛脱氢酶(例如归类于EC 1.2.1.20，EC 1.2.1.16，EC 1.2.1.79，EC 1.2.1.3，或EC 1.2.1.63)下，如CpnE，ChnE，或ThnG的基因产物，转化为戊二酸；然后通过戊二酸:CoA连接酶(例如归类于EC 6.2.1.6下)或通过CoA-转移酶(例如归类于EC 2.8.3.12下)，转化为戊二酰-CoA。参见，例如图1。 [0199] 在一些实施方案中，如下从如上所述产生的戊二酰-CoA合成庚二酰-CoA：通过β-酮硫解酶(例如归类于EC 2.3.1.-,如EC 2.3.1.174或EC 2.3.1.16下)，如paaJ或paaJ的同源物的基因产物(如GenBank登录号ABC78517.1，AAC74479.1，或ABC78881.1)或通过β-酮酰基-[acp]合酶(例如归类于EC 2.3.1.41，EC 2.3.1.179，EC 2.3.1.180下)，将戊二酰-CoA转化为3-酮庚二酰-CoA；然后通过3-羟基己二酰-CoA脱氢酶(例如归类于EC 1.1.1.157下)，如paaH或paaH的同源物的基因产物(如GenBank登录号ABC77793.1)，转化为3-羟基庚二酰-CoA；然后通过烯酰CoA水合酶，如paaF或paaF的同源物的基因产物(例如GenBank登录号ABC77794.1或GenBank登录号ABC78950.1)，转化为2(E)-庚烯二酰基-CoA(也称为2,3-脱氢庚二酰CoA)；然后通过以下转化为2(E)-庚烯二酸：酰基-[acp]硫酯酶(例如归类于3.1.2.-下)，如来自短乳杆菌的酰基-[acp]硫酯酶(GenBank登录号ABJ63754.1，SEQ ID NO:4)或来自植物乳杆菌的酰基-[acp]硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1，SEQ ID NO:5)，或者CoA-转移酶，例如归类于EC 2.8.3.-如EC 2.8.3.12下(参见例如分别为GenBank登录号CAA57199.1(GctA)和CAA57200.1(GctB)，SEQ ID NO:24和25)，然后使用如下转化为2(E)-庚烯二酸甲酯：脂肪酸O-甲基转移酶(例如归类于EC 2.1.1.15下)，如来自以下的脂肪酸O-甲基转移酶：海分枝杆菌M(GenBank登录号ACC41782.1，SEQ ID NO:1)；耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK73223.1，SEQ ID NO:2)，恶臭假单胞菌(参见GenBank登录号CAA39234.1，SEQ ID NO:3)；然后通过CoA连接酶(例如归类于EC 6.2.1.-下(例如归类于EC 6.2.1.2下的丁酸-CoA连接酶或归类于EC 6.2.1.3下的长链脂肪酸-CoA连接酶)转化为2(E)-庚烯二酰基-CoA甲酯；然后使用反式-2-烯酰基-CoA还原酶(例如归类于EC 1.3.1.44下)，如ter或tdter的基因产物，转化为庚二酰-CoA甲酯；然后通过庚二酰-[acp]甲酯酯酶(例如归类于EC 3.1.1.85下)如来自大肠杆菌bioH的基因产物(GenBank登录号 AAC76437.1，SEQ ID NO:6)，转化为庚二酰-CoA。参见，例如图1。 [0200] 在一些实施方案中，可以如下从中心代谢物2-酮戊二酸，通过两循环的2-酮酸链延伸合成庚二酰-CoA：通过(高)n柠檬酸合酶，例如归类于EC 2.3.3.14或EC 2.3.3.13下(例如参见AksA，GenBank登录号AAB98494.1)，将2-酮戊二酸转化为(高)1柠檬酸；然后通过(高)n柠檬酸脱水酶和(高)n乌头酸水合酶，例如归类于EC 4.2.1.114，EC 4.2.1.36或EC 4.2.1.33(例如参见AksD和AksE，GenBank登录号AAB99007.1和AAB99277.1)转化为异(高)1柠檬酸；然后通过异(高)n柠檬酸脱氢酶，例如归类于EC 1.1.1.85，EC 1.1.1.87或EC 1.1.1.286下(例如参见AksF，GenBank登录号ACA28837.1)，转化为2-氧代己二酸；然后通过(高)n柠檬酸合酶，例如归类于EC 2.3.3.14或EC 2.3.3.13(例如参见AksA，GenBank登录号AAB98494.1)，转化为(高)2柠檬酸；然后通过(高)n柠檬酸脱氢酶和(高)n乌头酸水合酶，例如归类于EC 4.2.1.114，EC 4.2.1.36或EC 4.2.1.33下(参见例如Genbank登录号 AAB99007.1和AAB99277.1)，转化为异(高)2柠檬酸(也称为1-羟基戊烷-1,2,5-三羧酸或苏-异(高)2柠檬酸)；然后通过异(高)n柠檬酸脱氢酶，例如归类于EC 1.1.1.85，EC 1.1.1.87，或EC 1.1.1.286(例如参见AksF，GenBank登录号ACA28837.1)，转化为2-氧代-庚二酸；然后使用醇脱氢酶(例如归类于EC 1.1.1.-下)，如HgdH的基因产物(参见Djurdjevic等，2011，同上)或LdhA的基因产物(参见Kim等，2005，FEBS Journal，272，550-561)，转化为 2-氧代-庚二酸；然后通过CoA-转移酶如戊烯二酸CoA转移酶，例如归类于EC 2.8.3.12下(如GctAB的基因产物)，转化为2-羟基庚二酰-CoA；然后通过以下转化为2(E)-庚烯二酰基-CoA：通过2-羟基戊二酰-CoA脱水酶(例如归类于EC 4.2.1.-下)如HgdAB的基因产物与其激活子(activator)HgdC的基因产物(参见Djurdjevic等，2011，同上)组合或2-羟基异己酰基-CoA脱水酶(例如归类于EC 4.2.1.-下)，如hadBC的基因产物与其激活子(activator)hadI的基因产物(Kim等，2005，同上)组合；然后通过CoA-转移酶如戊烯二酸CoA转移酶，例如归类于EC 2.8.3.12下(如GctAB的基因产物)，转化为2(E)-庚烯二酸；然后使用以下转化为2(E)-庚烯二酸甲酯：脂肪酸O-甲基转移酶(例如归类于EC 2.1.1.15下)，如来自以下的脂肪酸O-甲基转移酶：海分枝杆菌M(GenBank登录号ACC41782.1，SEQ ID NO:1)；耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK73223.1，SEQ ID NO:2)，恶臭假单胞菌(参见GenBank登录号CAA39234.1，SEQ ID NO:3)；然后通过CoA连接酶，例如归类于EC 6.2.1.-下(例如归类于EC 6.2.1.2下的丁酸-CoA连接酶或归类于EC 6.2.1.3下的长链脂肪酸-CoA连接酶)，转化为2(E)-庚烯二酰基-CoA甲酯；然后使用反式-2-烯酰基-CoA还原酶(例如归类于EC 1.3.1.44下)，如ter或tdter的基因产物，转化为庚二酰-CoA甲酯；然后通过庚二酰-[acp]甲酯酯酶(例如归类于EC 3.1.1.85下)如来自大肠杆菌bioH的基因产物(GenBank登录号 AAC76437.1，SEQ ID NO:6)，转化为庚二酰-CoA。参见图2。 [0201] 在C7主链生物合成中使用琥珀酸半醛作为中心代谢物的途径 [0202] 在一些实施方案中，如以下从(i)中心代谢物2-酮戊二酸或从(ii)中心代谢物琥珀酰-CoA合成庚二酰-CoA：(i)通过例如归类于EC 4.1.1.72下的支链alpha-酮酸脱羧酶(如GenBank登录号AAS49166.1)，或例如归类于EC 4.1.1.74下的alpha-酮异戊酸脱羧酶(如GenBank登录号ADA65057.1)将2-酮戊二酸转化为琥珀酸半醛，或(ii)通过琥珀酸半醛脱氢酶(例如归类于EC 1.2.1.76下)将琥珀酰-CoA转化为琥珀酸半醛；然后通过4-羟基-2-氧代庚二酸醛缩酶，例如归类于EC 4.1.2.52下(如Hpa1的基因产物)，转化为2,4-二羟基庚-2-烯二酸；然后通过2-氧代-庚-3-烯-1,7-二酸水合酶(例如归类于EC 4.2.1.-下)，如HpaH的基因产物(如GenBank登录号AAB91474.1)转化为2-氧代庚-3-烯二酸；然后通过以下转化为2-氧代庚二酸：2-烯酸还原酶，例如归类于EC 1.3.1.-，如EC 1.3.1.31或EC 1.6.99.-如EC 1.6.99.1下(如由GenBank登录号BAA12619.1，AAN66878.1，AAA98815.1，AGP69310.1，CAA37666.1，ABY93685.1,或AAB38683.1编码)；然后通过2-羟基戊二酸脱氢酶，例如归类于EC 1.1.1.-，如EC 1.1.1.337下(如HgdH或ldhA的基因产物)转化为2-羟基庚二酸；然后通过CoA-转移酶如戊烯二酸CoA转移酶，例如归类于EC 2.8.3.12下(如GctAB的基因产物)转化为2-羟基庚二酰-CoA；然后通过以下转化为2(E)-庚烯二酰基-CoA：2-羟基戊二酰-CoA脱水酶(例如归类于EC 4.2.1.-下)，如HgdAB的基因产物与其活化子 (activator)，HgdC的基因产物(参见Djurdjevic等，2011，同上)组合或2-羟基异己酰基-CoA脱水酶(例如归类于EC 4.2.1.-下)，如hadBC的基因产物与其活化子(activator)，hadI的基因产物(Kim等，2005，同上)组合；然后通过CoA-转移酶如戊烯二酸CoA转移酶，例如归类于EC 2.8.3.12下(如GctAB的基因产物)，转化为2(E)-庚烯二酸；然后使用以下转化为2(E)-庚烯二酸甲酯：脂肪酸O-甲基转移酶(例如归类于EC 2.1.1.15下)，如来自海分枝杆菌(GenBank登录号ACC41782.1，SEQ ID NO:1)；耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号 ABK73223.1，SEQ ID NO:2)，或恶臭假单胞菌(参见GenBank登录号CAA39234.1，SEQ ID NO: 3)；然后通过CoA连接酶(例如归类于EC 6.2.1.-下)如丁酸-CoA连接酶(例如归类于EC 6.2.1.2下)或长链脂肪酸-CoA连接酶，例如归类于6.2.1.3下(如GenBank登录号 CAA50321.1或CAJ95550.1)，转化为2(E)-庚烯二酰基-CoA甲酯；然后使用反式-2-烯酰基-CoA还原酶(例如归类于EC 1.3.1.44下)如ter的基因产物(例如GenBank登录号 AAW66853.1)或tdter的基因产物(GenBank登录号AAS11092.1)转化为庚二酰-CoA甲酯；然后通过庚二酰-[acp]甲酯酯酶(例如归类于EC 3.1.1.85下)如来自大肠杆菌bioH的基因产物(GenBank登录号AAC76437.1，SEQ ID NO:6)，转化为庚二酰-CoA。参见，例如图3。 [0203] 使用庚二酰-CoA或庚二酸半醛作为中心前体至庚二酸的途径 [0204] 在一些实施方案中，如下从中心前体庚二酰-CoA合成庚二酸：通过乙酰化醛脱氢酶(例如归类于EC 1.2.1.10下)如PduB或PduP的基因产物(参见例如Lan等，2013，Energy Environ.Sci.，6:2672-2681)，将庚二酰-CoA转化为庚二酸半醛；然后通过以下转化为庚二酸：7-氧代庚酸脱氢酶(例如归类于EC 1.2.1.-下)如ThnG的基因产物，6-氧代己酸脱氢酶(例如归类于EC 1.2.1.63下)如ChnE的基因产物，5-氧代戊酸脱氢酶(例如归类于EC 1.2.1.-下)如CpnE的基因产物，或醛脱氢酶(例如归类于EC 1.2.1.3下)。参见图4。 [0205] 在一些实施方案中，如下从中心前体庚二酰-CoA合成庚二酸：通过硫酯酶(例如归类于EC 3.1.2.-下)，如YciA，tesB的基因产物(GenBank登录号AAA24665.1，SEQ ID NO:21)，Acot13，来自短乳杆菌的酰基-[acp]硫酯酶(GenBank登录号ABJ63754.1，SEQ ID NO: 4)，或来自植物乳杆菌的酰基-[acp]硫酯酶(GenBank登录号CCC78182.1，SEQ ID NO:5)，将庚二酰-CoA转化为庚二酸。参见图4。 [0206] 在一些实施方案中，如下从中心前体庚二酰-CoA合成庚二酸：通过CoA-转移酶，如戊烯二酸CoA转移酶(例如归类于EC 2.8.3.12下)，将庚二酰-CoA转化为庚二酸。参见图4。 [0207] 在一些实施方案中，如下从中心前体庚二酰-CoA合成庚二酸：通过可逆的CoA-连接酶，如可逆的琥珀酸CoA连接酶(例如归类于EC 6.2.1.5下)，将庚二酰-CoA转化为庚二酸。参见图4。 [0208] 使用庚二酰-CoA或庚二酸半醛作为中心前体至7-氨基庚酸的途径 [0209] 在一些实施方案中，如下从中心前体庚二酰-CoA合成7-氨基庚酸：通过乙酰化醛脱氢酶(例如归类于EC 1.2.1.10下)，如PduB或PduP的基因产物，将庚二酰-CoA转化为庚二酸半醛；然后通过ω-转氨酶将庚二酸半醛转化为7-氨基庚酸，所述ω-转氨酶例如归类于EC 2.6.1.-如EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下，如来自于紫色色杆菌(参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:13)，丁香假单胞菌(参见GenBank登录号AAY39893.1，SEQ ID NO:15)，球形红杆菌(参见GenBank登录号ABA81135.1，SEQ ID NO:16)，或河流弧菌(参见GenBank登录号AEA39183.1，SEQ ID NO: 18)。参见图5。 [0210] 在一些实施方案中，如下从中心前体庚二酸合成7-氨基庚酸：通过羧酸还原酶将庚二酸转化为庚二酸半醛，所述羧酸还原酶例如归类于EC 1.2.99.6下，如来自Segniliparus rugosus(GenBank登录号EFV11917.1，SEQ ID NO:9)或Segniliparus rotundus(GenBank登录号ADG98140.1，SEQ ID NO:12)，与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp基因编码(GenBank登录号CAA44858.1，SEQ ID NO:19)或来自诺卡氏菌的npt基因编码(GenBank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:20))，或来自灰色链霉菌GriC和GriD的基因产物(Suzuki等，J.Antibiot.，2007，60(6)，380-387)组合；然后通过ω-转氨酶将庚二酸半醛转化为7-氨基庚酸，所述ω-转氨酶例如归类于EC 2.6.1.-如EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.48，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.82下，例如来自紫色色杆菌(参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:13)，丁香假单胞菌(参见GenBank登录号AAY39893.1，SEQ ID NO:15)，球形红杆菌(参见GenBank登录号ABA81135.1，SEQ ID NO: 16)，或河流弧菌(参见GenBank登录号AEA39183.1，SEQ ID NO:18)。参见图5。 [0211] 使用7-氨基庚酸，7-羟基庚酸或庚二酸半醛作为中心前体至七亚甲基二胺的途径[0212] 在一些实施方案中，如下从中心前体7-羟基庚酸合成七亚甲基二胺：通过羧酸还原酶(例如归类于EC 1.2.99.6下)，如car的基因产物(见上)，与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp基因编码(GenBank登录号CAA44858.1，SEQ ID NO:19)或来自诺卡氏菌的npt基因编码(GenBank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:20))，或GriC和GriD的基因产物(Suzuki等，J.Antibiot.，2007，60(6)，380-387)组合，将7-氨基庚酸转化为7-氨基庚醛；然后通过ω-转氨酶将7-氨基庚醛转化为七亚甲基二胺，所述ω-转氨酶例如归类于EC 2.6.1.-如2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下，例如来自紫色色杆菌(参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:13)，铜绿假单胞菌(参见GenBank登录号AAG08191.1，SEQ ID NO:14)，丁香假单胞菌(参见GenBank登录号AAY39893.1，SEQ ID NO:15)，球形红杆菌(参见GenBank登录号ABA81135.1，SEQ ID NO:16)，大肠杆菌(参见GenBank登录号AAA57874.1，SEQ ID NO:17)，或河流弧菌(参见GenBank登录号AEA39183.1，SEQ ID NO:18)。参见图6。 [0213] 由car的基因产物编码的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂npt或sfp具有广泛的底物特异性，其包括末端双官能的C4和C5羧酸(Venkitasubramanian等，Enzyme and Microbial Technology，2008，42，130-137)。 [0214] 在一些实施方案中，如下从中心前体7-羟基庚酸(其可以如图7中描述的产生)合成七亚甲基二胺：通过羧酸还原酶与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp基因编码(GenBank登录号CAA44858.1，SEQ ID NO:19)或来自诺卡氏菌的npt基因编码(GenBank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:20))或GriC和GriD的基因产物(Suzuki等，J.Antibiot.，2007，60(6)，380–387)组合，将7-羟基庚酸转化为7-羟基庚醛，所述羧酸还原酶例如归类于EC 1.2.99.6下，如来自海分枝杆菌(参见GenBank登录号ACC40567.1，SEQ ID NO:7)，耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK71854.1，SEQ ID NO:8)，Segniliparus rugosus(参见GenBank登录号EFV11917.1，SEQ ID NO:9)，耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK75684.1，SEQ ID NO:10)，马赛分枝杆菌(参见GenBank登录号 EIV11143.1，SEQ ID NO:11)，或Segniliparus rotundus(参见GenBank登录号ADG98140.1，SEQ ID NO:12)；然后通过ω-转氨酶将7-氨基庚醛转化为7-氨基庚醇，所述ω-转氨酶例如归类于EC 2.6.1.-如EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下，来自紫色色杆菌(参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:13)，丁香假单胞菌(参见GenBank登录号AAY39893.1，SEQ ID NO:15)，或球形红杆菌(参见GenBank登录号ABA81135.1，SEQ ID NO:16)；然后通过醇脱氢酶转化为7-氨基庚醛，所述醇脱氢酶例如归类于EC 1.1.1.-(如EC 1.1.1.1，EC 1.1.1.2，EC 1.1.1.21，或EC 1.1.1.184)下，如YMR318C的基因产物(例如归类于EC 1.1.1.2下，参见GenBank登录号CAA90836.1)(例如归类于EC 1.1.1.2下，参见GenBank登录号CAA90836.1)或YqhD的基因产物(来自大肠杆菌，GenBank登录号AAA69178.1)(Liu等，Microbiology，2009，155，2078-2085；Larroy等，2002，Biochem J.，361(Pt 1)，163–172；Jarboe，2011，Appl.Microbiol.Biotechnol.，89(2)， 249-257)或具有GenBank登录号CAA81612.1(来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus))的蛋白；然后通过ω-转氨酶转化为七亚甲基二胺，所述ω-转氨酶例如归类于EC 2.6.1.-如EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下，例如来自紫色色杆菌(参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:13)，铜绿假单胞菌(参见GenBank登录号AAG08191.1，SEQ ID NO:14)，丁香假单胞菌(参见GenBank登录号AAY39893.1，SEQ ID NO:15)，球形红杆菌(参见GenBank登录号ABA81135.1，SEQ ID NO:16)，大肠杆菌(参见GenBank登录号AAA57874.1，SEQ ID NO:17)，或河流弧菌(参见GenBank登录号AEA39183.1，SEQ ID NO:18)。参见图6。 [0215] 在一些实施方案中，如下从中心前体7-氨基庚酸合成七亚甲基二胺：通过N-乙酰转移酶，如赖氨酸N-乙酰转移酶(例如归类于EC 2.3.1.32下)，将7-氨基庚酸转化为N7-乙酰基-7-氨基庚酸；然后通过羧酸还原酶与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp基因编码(GenBank登录号CAA44858.1，SEQ ID NO:19)或来自诺卡氏菌的npt基因编码(GenBank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:20))或GriC和GriD的基因产物(Suzuki等，J.Antibiot.，2007，60(6)，380-387)组合，转化为N7-乙酰基-7-氨基庚醛，所述羧酸还原酶例如归类于EC 1.2.99.6下，例如来自耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK71854.1，SEQ ID NO:8)，马赛分枝杆菌(参见GenBank登录号EIV11143.1，SEQ ID NO:11)，或Segniliparus rotundus(参见GenBank登录号ADG98140.1，SEQ ID NO:12)；然后通过ω-转氨酶转化为N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷，所述ω-转氨酶例如归类于EC 2.6.1.-如EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，EC 2.6.1.46，或EC 2.6.1.82下，如来自紫色色杆菌(参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:13)，铜绿假单胞菌(参见GenBank登录号AAG08191.1，SEQ ID NO:14)，丁香假单胞菌(参见GenBank登录号 AAY39893.1，SEQ ID NO:15)，球形红杆菌(参见GenBank登录号ABA81135.1，SEQ ID NO: 16)，大肠杆菌(参见GenBank登录号AAA57874.1，SEQ ID NO:17)，或河流弧菌(参见GenBank登录号AEA39183.1，SEQ ID NO:18)；然后通过乙酰腐胺脱乙酰酶(例如归类于EC 3.5.1.62或EC 3.5.1.17下)，转化为七亚甲基二胺。参见图6。 [0216] 在一些实施方案中，如下从中心前体庚二酸半醛合成七亚甲基二胺：通过羧酸还原酶与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp基因编码(GenBank登录号CAA44858.1，SEQ ID NO:19)或来自诺卡氏菌的npt基因编码(GenBank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:20))或GriC和GriD的基因产物(Suzuki等，J.Antibiot.，2007， 60(6)，380-387)组合，将庚二酸半醛转化为庚二醛，所述羧酸还原酶例如归类于EC 1.2.99.6下，如来自Segniliparus rotundus(参见GenBank登录号ADG98140.1，SEQ ID NO: 12)；然后通过ω-转氨酶(例如归类于EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下)转化为7-氨基庚醛；然后通过ω-转氨酶转化为七亚甲基二胺，所述ω-转氨酶例如归类于EC 2.6.1.-如2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82，如来自紫色色杆菌(参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:13)，铜绿假单胞菌(参见GenBank登录号AAG08191.1，SEQ ID NO:14)，丁香假单胞菌(参见GenBank登录号AAY39893.1，SEQ ID NO:15)，球形红杆菌(参见GenBank登录号 ABA81135.1，SEQ ID NO:16)，大肠杆菌(参见GenBank登录号AAA57874.1，SEQ ID NO:17)，或河流弧菌(参见GenBank登录号AEA39183.1，SEQ ID NO:18)。参见图6。 [0217] 使用庚二酸或庚二酸半醛作为中心前体至7-羟基庚酸和1,7-庚二醇的途径 [0218] 在一些实施方案中，如下从中心前体庚二酸合成7-羟基庚酸：通过羧酸还原酶(例如归类于EC 1.2.99.6下)与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp基因编码(GenBank登录号CAA44858.1，SEQ ID NO:19)或来自诺卡氏菌的npt基因编码(GenBank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:20))或来自灰色链霉菌的GriC和GriD的基因产物相组合，将庚二酸转化为庚二酸半醛，所述羧酸还原酶如来自Segniliparus rugosus(GenBank登录号EFV11917.1，SEQ ID NO:9)或Segniliparus rotundus(GenBank登录号ADG98140.1，SEQ ID NO:12)；然后通过以下转化为7-羟基庚酸：醇脱氢酶(例如归类于EC 1.1.1.-下)，如6-羟基己酸脱氢酶(例如归类于EC 1.1.1.258下)(例如来自ChnD的基因)， 5-羟基戊酸脱氢酶(例如归类于EC 1.1.1.-下)(例如CpnD的基因产物)(例如参见，Iwaki等，2002，Appl.Environ.Microbiol.，68(11):5671-5684)，来自Clostridium viride的5-羟基戊酸脱氢酶，或4-羟基丁酸脱氢酶如gabD(例如参见，Lütke-Eversloh和Steinbüchel， 1999，FEMS Microbiology Letters，181(1):63-71)。参见图7。 [0219] 在一些实施方案中，如下从中心前体庚二酰-CoA合成7-羟基庚酸：通过乙酰化醛脱氢酶(例如归类于EC 1.2.1.10下)如PduB或PduP的基因产物，将庚二酰-CoA转化为庚二酸半醛；然后通过醇脱氢酶(例如归类于EC 1.1.1.-下)，转化为7-羟基庚酸，所述醇脱氢酶如6-羟基己酸脱氢酶(例如归类于EC 1.1.1.258下)(例如来自ChnD的基因)，5-羟基戊酸脱氢酶(例如归类于EC 1.1.1.-下)，例如CpnD的基因产物，来自Clostridium viride的5-羟基戊酸脱氢酶，或4-羟基丁酸脱氢酶如gabD。参见图7。 [0220] 在一些实施方案中，如下从中心前体7-羟基庚酸合成1,7-庚二醇：通过羧酸还原酶(例如归类于EC 1.2.99.6下)与磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(例如由来自枯草芽孢杆菌的sfp基因编码(GenBank登录号CAA44858.1，SEQ ID NO:19)或来自诺卡氏菌的npt基因编码(GenBank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:20))或GriC和GriD的基因产物(Suzuki等，J.Antibiot.，2007，60(6)，380-387)相组合，将7-羟基庚酸转化为7-羟基庚醛，所述羧酸还原酶例如来自海分枝杆菌(参见GenBank登录号ACC40567.1，SEQ ID NO:7)，耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK71854.1，SEQ ID NO:8)，Segniliparus rugosus(参见GenBank登录号EFV11917.1，SEQ ID NO:9)，耻垢分枝杆菌(参见GenBank登录号ABK75684.1，SEQ ID NO:10)，马赛分枝杆菌(参见GenBank登录号EIV11143.1，SEQ ID NO:11)，或Segniliparus rotundus(参见GenBank登录号ADG98140.1，SEQ ID NO:12)；然后通过醇脱氢酶(例如归类于EC1.1.1.-(如EC 1.1.1.1，EC 1.1.1.2，EC 1.1.1.21，或EC 1.1.1.184)下)，将7-羟基庚醛转化为1,7庚二醇，所述醇脱氢酶如YMR318C的基因产物(例如归类于EC1.1.1.2下，参见GenBank登录号CAA90836.1)或YqhD的基因产物(来自大肠杆菌，GenBank登录号AAA69178.1)(Liu等，Microbiology，2009，155，2078–2085；Larroy等，2002，Biochem J.， 361(Pt 1)，163-172；Jarboe，2011，Appl.Microbiol.Biotechnol.，89(2)，249-257)或具有GenBank登录号CAA81612.1的蛋白(来自嗜热脂肪地芽孢杆菌)。参见图8。 [0221] 培养策略 [0222] 在一些实施方案中，培养策略需要实现需氧，厌氧，微需氧或混合氧/反硝化培养条件。在体外表征为对氧敏感的酶需要保持非常低的溶解氧浓度的微需氧培养策略(例如参见Chayabatra和Lu-Kwang，Appl.Environ.Microbiol.，2000，66(2)，493-498；Wilson和Bouwer，1997，Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，18(2-3)，116-130)。 [0223] 在一些实施方案中，培养策略需要营养限制，如氮磷酸盐或氧限制。 [0224] 在一些实施方案中，可以使用除氧以外的最终电子受体，例如硝酸盐。 [0225] 在一些实施方案中，可以采用使用例如陶瓷膜的细胞保留策略来实现并维持补料分批或连续发酵期间的高细胞密度。 [0226] 在一些实施方案中，在一种或多种C7构件块的合成中对发酵补料的主要碳源可以源自生物或非生物给料。 [0227] 在一些实施方案中，生物给料可以是或可以源自单糖，二糖，木质纤维素，半纤维素，纤维素，木质素，乙酰丙酸和甲酸，甘油三酯，甘油，脂肪酸，农业废物，浓缩的酒糟可溶物(condensed distillers'solubles)，或城市废物。 [0228] 已经在几种微生物(诸如大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食油假单胞菌、恶臭假单胞菌和解脂耶罗维亚酵母)中证明了源自生物柴油产生的粗制甘油的有效分解代谢(Lee等，Appl.Biochem.Biotechnol.，2012，166:1801-1813；Yang等，Biotechnology for Biofuels，2012，5:13；Meijnen等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2011，90:885-893)。 [0229] 已经在几种生物体(诸如钩虫贪铜菌和恶臭假单胞菌)中在经由前体丙酰基-CoA合成3-羟基戊酸中证明了木质纤维素衍生的乙酰丙酸的有效分解代谢(Jaremko和Yu，Journal of Biotechnology，2011，155，2011，293-298；Martin和Prather，Journal of Biotechnology，2009，139，61-67)。 [0230] 已经在几种微生物(诸如恶臭假单胞菌、钩虫贪铜菌)中证明了木质素衍生的芳香族化合物诸如苯甲酸类似物的有效分解代谢(Bugg等，Current Opinion in Biotechnology，2011，22，394-400；Pérez-Pantoja等，FEMS Microbiol.Rev.，2008，32， 736-794)。 [0231] 已经在几种微生物(包括解脂耶罗维亚酵母)中证明了农业废物(诸如橄榄磨坊废水)的有效利用(Papanikolaou等，Bioresour.Technol.，2008，99(7):2419-2428)。 [0232] 已经对几种微生物(诸如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和德氏乳杆菌和乳酸乳球菌)证明了可发酵糖类(诸如源自纤维素、半纤维素、甘蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其它农业来源的单糖和二糖)的有效利用(参见例如Hermann等，Journal of Biotechnology，2003，104，155-172；Wee等，Food Technol.Biotechnol.，2006，44(2)，163-172；Ohashi等，Journal of Bioscience and Bioengineering，1999，87(5)，647–654)。 [0233] 已经针对钩虫贪铜菌证明了源自多种农业木质纤维素来源的糠醛的有效利用(Li et al.,Biodegradation,2011,22,1215–1225)。 [0234] 在一些实施方案中，非生物给料可以是或者可以源自天然气，合成气，CO2/H2，甲醇，乙醇，苯甲酸酯，非挥发性残留物(NVR)，或来自环己烷氧化过程的碱洗液(caustic wash)废物流，或对苯二甲酸/间苯二甲酸混合物废物流。 [0235] 已经对甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母证明了甲醇的有效分解代谢。 [0236] 已 经对克鲁佛梭菌证明了乙醇的有效分解代谢(Seedorf等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2008，105(6)2128-2133)。 [0237] 已经对钩虫贪铜菌证明了CO2和H2(其可以源自天然气和其它化学和石油化学来源)的有效分解代谢(Prybylski等，Energy，Sustainability and Society，2012，2:11)。 [0238] 已经对多种微生物(诸如杨氏梭菌和自产乙醇梭菌)证明了合成气的有效分解代谢( 等，Applied and Environmental Microbiology，2011，77(15):5467-5475)。 [0239] 已经对多种微生物(诸如食酸代尔夫特菌和钩虫贪铜菌)证明了来自环己烷过程的非挥发性残留物废物流的有效分解代谢(Ramsay等，Applied and Environmental Microbiology，1986，52(1):152-156)。在一些实施方案中，宿主微生物可以是原核生物。例如，原核生物可以是来自以下的细菌：埃希氏菌属如大肠杆菌；梭菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或者克鲁佛梭菌；棒状杆菌属如谷氨酸棒状杆菌；贪铜菌属如钩虫贪铜菌或者耐金属贪铜菌；假单胞菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌；代尔夫特菌属如食酸代尔夫特菌；芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌；乳杆菌属如德氏乳杆菌；或者乳球菌属如乳酸乳球菌。此类原核生物也可以是构建能够生成一种或多种C7构件块的本文中描述的重组宿主细胞的基因来源。 [0240] 在一些实施方案中，宿主微生物可以是真核生物。例如，真核生物可以是丝状真菌，例如来自曲霉属如黑曲霉的。另外，真核生物可以是酵母，例如来自酵母属如酿酒酵母；来自毕赤氏酵属如巴斯德毕赤酵母；来自耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵母；来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母；来自德巴利酵母属如汉逊德巴利酵母；来自Arxula属如Arxula adenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属如乳酸克鲁维酵母菌的酵母。此类真核生物也可以是构建能够生成一种或多种C7构件块的本文中描述的重组宿主细胞的基因来源。 [0241] 代谢工程 [0242] 本文件提供方法，所述方法牵涉对所有上述途径描述的少于所有的步骤。此类方法可牵涉例如此类步骤中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或者更多个。在此类方法包含少于所有步骤的情况下，第一个步骤(且尽在一些事实方案中)可为所列步骤中的任一个。 [0243] 此外，本文中描述的重组宿主可以包括上述酶中的任何组合，使得所述步骤中的一个或者多个，例如此类步骤中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或者更多个可以在重组宿主内实施。本文件提供了所列出的任何属和种的宿主细胞，并且被遗传工程化以表达一种或多种(例如，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或更多种)本文件中所述的任何酶的重组形式。因此，例如，宿主细胞可以含有编码酶的外源核酸，所述酶催化本文中所述的任何途径的一个或多个步骤。 [0244] 另外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受CoA活化的底物的情况下，存在与[acp]结合底物相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。 [0245] 此外，本文件认识到，在酶已经被描述为接受底物的(R)-对映异构体的情况下，存在与底物的(S)-对映异构体相关的相似的酶活性，其不一定为相同的酶种类。 [0246] 本文件还认识到，在已经显示酶接受特定辅因子如NADPH或者共底物如乙酰基-CoA的情况下，许多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同辅因子或者共底物方面是泛宿主性的(promiscuous)。此外，本文件认识到，在酶对例如特定辅因子如NADH具有高特异性的情况下，对辅助因子NADPH具有高特异性的具有相似或者相同活性的酶可为不同的酶种类。 [0247] 在一些实施方案中，概述于本文的途径中的酶是经由非直接或者合理酶设计方法的酶工程的结果，目的在于改善活性、改善特异性、降低反馈抑制、降低阻抑、改善酶溶解度、改变立体特异性，或者改变辅因子特异性。 [0248] 在一些实施方案中，将概述于本文的途径中的酶经由附加型或者染色体整合方法基因投入(gene dose)(即，通过在宿主生物中具有多个拷贝的基因的过表达)至所得的经遗传修饰的生物体中。 [0249] 在一些实施方案中，可以使用基因组级别(genome-scale)系统生物学技术如通量平衡分析(Flux Balance Analysis)来设计用于将碳流量引导至C7构件块的基因组级别的弱化或者敲除策略。 [0250] 弱化策略包括但不限于使用转座子，同源重组(双交叉方法)，诱变，酶抑制剂和RNAi干扰。 [0251] 在一些实施方案中，可以利用通量组(fluxomic)、代谢物组(metabolomic)和转录物组(transcriptomal)数据来告知或者支持基因组级别的系统生物学技术，由此在将碳流量导向C7构件块中设计基因组级别的弱化或者敲除策略。 [0252] 在一些实施方案中，可以通过在选择性环境中连续培养，改善了宿主微生物对高浓度C7构件块的耐受性。 [0253] 在一些实施方案中(例如参见图1至3)，弱化或增强宿主微生物的生物化学网络以(1)确保2-酮戊二酸和乙酰CoA的细胞内利用度，(2)创建NADPH不平衡，其可通过形成C7构件块来平衡，(3)防止导致并包括C7构件块的中心代谢物、中心前体的降解和(4)确保从细胞有效的流出。 [0254] 在一些需要2-酮戊二酸细胞内利用度的实施方案中，可以在宿主中过表达PEP羧激酶或PEP羧化酶以产生添补碳流(anaplerotic carbon flux)进入朝向2-酮戊二酸的Krebs循环(Schwartz等，2009，Proteomics，9，5132-5142)。 [0255] 在一些需要2-酮戊二酸细胞内利用度的实施方案中，可以在宿主中过表达丙酮酸羧化酶以产生添补碳流进入朝向2-酮戊二酸的Krebs循环(Schwartz等，2009，Proteomics，9，5132-5142)。 [0256] 在一些需要2-酮戊二酸细胞内利用度的实施方案中，可以在宿主中过表达PEP合酶以增强从丙酮酸到PEP的流量(flux)，从而增加经由PEP羧激酶或PEP羧化酶的碳流进入Krebs循环(Schwartz等，2009，Proteomics，9，5132-5142)。 [0257] 在需要2-酮戊二酸细胞内利用度用于C6构件块合成的一些实施方案中，可以在宿主生物体中过表达添补反应酶(anaplerotic reactions enzymes)，如磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(例如pck的基因产物)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(例如ppc的基因产物)，苹果酸酶(例如sfcA的基因产物)和/或丙酮酸羧化酶(Song和Lee，2006，Enzyme Micr.Technol.，39，352–361)。 [0259] 在一些需要乙酰CoA缩合用于C7构件块合成的实施方案中，可以弱化一种或多种催化仅乙酰CoA缩合至乙酰乙酰CoA的内源β-酮硫解酶，如AtoB或phaA的内源基因产物。 [0260] 在一些需要乙酰CoA细胞内利用度的实施方案中，可以弱化产生乙酸的内源性磷酸转乙酰酶，例如pta(Shen等，Appl.Environ.Microbiol.，2011，77(9):2905–2915)。 [0261] 在一些需要乙酰CoA细胞内利用度的实施方案中，可以弱化乙酸合成途径中编码乙酸激酶的内源基因，如ack。 [0262] 在需要乙酰CoA和NADH细胞内利用度用于C7构件块合成的一些实施方案中，可以弱化编码催化丙酮酸降解至乳酸的酶的内源基因，如由ldhA编码的乳酸脱氢酶(Shen等，2011，同上)。 [0263] 在需要Krebs循环中间体细胞内利用度用于C6构件块合成的一些实施方案中，2-酮戊二酸脱氢酶在其一个或多个亚基中弱化。 [0264] 在需要Krebs循环中间体细胞内利用度用于C6构件块合成的一些实施方案中，通过在宿主微生物中诱导来过表达2-酮戊二酸脱氢酶的调控子(regulator)。 [0265] 在需要乙酰CoA和NADH细胞内利用度用于C7构件块合成的一些实施方案中，可以弱化编码催化磷酸烯醇丙酮酸降解至琥珀酸的酶，如menaquinol-延胡索酸氧化还原酶的内源基因，如frdBC(例如参见Shen等，2011，同上)。 [0266] 在需要乙酰CoA和NADH细胞内利用度用于C7构件块合成的一些实施方案中，可以弱化编码催化乙酰CoA降解至乙醇的酶(例如由adhE编码的醇脱氢酶)的内源基因(例如参见Shen等，2011，同上)。 [0267] 在一些实施方案中，其中宿主使用经由内消旋-2,6-二氨基庚二酸的赖氨酸生物合成途径，将编码从2-酮戊二酸合成2-氧代己二酸的基因投入到(dosed into)宿主中。 [0268] 在一些实施方案中，其中宿主使用经由2-氧代己二酸的赖氨酸生物合成途径，将编码经由内消旋-2,6-二氨基庚二酸的赖氨酸合成的基因投入到宿主中。 [0269] 在一些实施方案中，弱化编码催化丙酮酸降解至乙醇的酶(如丙酮酸脱羧酶)的内源基因。 [0270] 在一些实施方案中，其中途径需要过量的NADPH或NADH辅因子用于C7构件块合成，可以弱化消耗辅因子不平衡的内源性转氢酶，如归类于EC 1.6.1.1，EC 1.6.1.2，或EC 1.6.1.3下的。 [0271] 在一些实施方案中，其中途径需要过量的NADPH辅因子用于C7构件块合成，可以过表达将NADH转化为NADPH的外源转氢酶，如归类于EC 1.6.1.1，EC 1.6.1.2或EC 1.6.1.3下的。 [0272] 在使用天然积累聚羟基链烷酸的宿主的一些实施方案中，可以在宿主菌株中弱化编码聚羟基链烷酸合酶的内源基因。 [0273] 在使用天然积累脂质体的宿主的一些实施方案中，弱化编码牵涉脂质体合成的酶的基因。 [0274] 在需要乙酰CoA细胞内利用度用于C7构件块合成的一些实施方案中，可以在微生物中过表达重组乙酰CoA合成酶如acs的基因产物(Satoh等，J.Bioscience and Bioengineering，2003，95(4):335-341)。 [0275] 在一些实施方案中，可以在宿主中过表达L-丙氨酸脱氢酶，以从丙酮酸再生L-丙氨酸，作为用于ω-转氨酶反应的氨基供体。 [0276] 在一些实施方案中，可以在宿主中过表达NADH特异性L-谷氨酸脱氢酶，以从2-酮戊二酸再生L-谷氨酸，作为用于ω-转氨酶反应的氨基供体。 [0277] 在一些实施方案中，可以弱化降解导致并包括C7构件块的中心代谢物，中心前体的酶，所述酶如庚二酰-CoA脱氢酶如归类于EC 1.3.1.62下；酰基-CoA脱氢酶如归类于EC 1.3.8.7或EC 1.3.8.1；和/或戊二酰-CoA脱氢酶如归类于EC 1.3.8.6下。 [0278] 在一些实施方案中，可以弱化经由辅酶A酯化活化C7构件块的酶，如CoA-连接酶，如例如归类于EC 6.2.1.14下的庚二酰-CoA合成酶。 [0279] 在一些实施方案中，可以通过弱化内源性葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)将碳流引导入戊糖磷酸循环来增加NADPH的供应。 [0280] 在一些实施方案中，可以通过过表达6-磷酸葡糖酸脱氢酶和/或转酮醇酶将碳流重新引导入戊糖磷酸循环来增加NADPH的供应(Lee等，2003，Biotechnology Progress，19(5)，1444-1449)。 [0281] 在一些实施方案中，其中途径在C7构件块的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以在宿主生物体中过表达编码吡啶(puridine)核苷酸转氢酶的基因，如UdhA(Brigham等，Advanced Biofuels and Bioproducts，2012，Chapter 39，1065-1090)。 [0282] 在一些实施方案中，其中途径在C7构件块的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以在宿主生物体中过表达重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因如GapN(Brigham等，2012，同上)。 [0283] 在一些实施方案中，其中途径在C7构件块的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以在宿主生物体中过表达重组苹果酸酶基因如maeA或maeB(Brigham等，2012，同上)。 [0284] 在一些实施方案中，其中途径在C7构件块的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以在宿主生物体中过表达重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因如zwf(Lim等，J.Bioscience and Bioengineering，2002，93(6)，543-549)。 [0285] 在一些实施方案中，其中途径在C7构件块的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以在宿主生物体中过表达重组果糖1,6二磷酸酶基因如fbp(Becker等，J.Biotechnol.，2007，132:99-109)。 [0286] 在一些实施方案中，其中途径在C7构件块的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以弱化内源性丙糖磷酸异构酶(EC 5.3.1.1)。 [0287] 在一些实施方案中，其中途径在C7构件块的合成中需要过量的NADPH辅因子，可以在宿主生物体中过表达重组葡萄糖脱氢酶如gdh的基因产物(Satoh等，J.Bioscience and Bioengineering，2003，95(4):335–341)。 [0288] 在一些实施方案中，可以弱化促进将NADPH转化为NADH的内源性酶，如可经由EC 1.4.1.2(NADH-特异的)和EC 1.4.1.4(NADPH-特异的)下分类的谷氨酸脱氢酶的相互转换产生的NADH产生循环。例如，避免NADPH向C7构件块的不平衡的消散，可以弱化NADH特异性谷氨酸脱氢酶。 [0289] 在一些实施方案中，可以弱化利用NADH和NADPH两者作为辅因子的内源谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3)。 [0290] 在一些实施方案中，可以在宿主中过表达甲醇脱氢酶或甲醛脱氢酶以允许经由甲酸的甲醇分解代谢。 [0291] 在一些实施方案中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶可以在宿主中过表达以产生S-腺苷酰基-L-甲硫氨酸作为用于脂肪酸O-甲基转移酶的辅因子。 [0292] 在一些实施方案中，可以在宿主中过表达3-磷酸甘油酸脱氢酶，3-磷酸丝氨酸转氨酶和磷酸丝氨酸磷酸酶中的一种或多种，以产生丝氨酸作为S-腺苷酰基-L-甲硫氨酸循环的甲基供体。 [0293] 在一些实施方案中，膜结合烯酰CoA还原酶可以通过作为与小的可溶性蛋白(如麦芽糖结合蛋白)的融合蛋白表达而可溶(Gloerich等，FEBS Letters，2006，580，2092-2096)。 [0294] 在一些实施方案中，可以通过遗传工程化改造对细胞膜的结构修饰或者提高C7构件块的任何关联转运蛋白活性增强或放大C7构件块穿过细胞膜到胞外介质的流出。 [0295] 可以通过过表达宽底物范围的多药物转运蛋白来增强或放大七亚甲基二胺的流出，所述多药物转运蛋白如来自枯草芽孢杆菌的Blt(Woolridg等，1997，J.Biol.Chem.，272(14):8864–8866)；来自大肠杆菌的AcrB和AcrD(Elkins和Nikaido，2002，J.Bacteriol.，184(23)，6490-6499)或来自金黄色葡萄球菌的NorA(Ng等，1994，Antimicrob Agents Chemother，38(6)，1345-1355)或来自枯草芽孢杆菌的Bmr(Neyfakh，1992，Antimicrob Agents Chemother，36(2)，484–485)。 [0296] 可以通过过表达可溶的转运蛋白(如来自谷氨酸棒杆菌的lysE转运蛋白)来增强或放大7-氨基庚酸和七亚甲基二胺的流出(Bellmann等，2001，Microbiology，147，1765–1774)。 [0297] 可以通过过表达二羧酸转运蛋白(例如来自谷氨酸棒杆菌的SucE转运蛋白)来增强或放大庚二酸的流出(Huhn等，Appl.Microbiol.&Biotech.，89(2)，327–335)。 [0298] 使用重组宿主产生C7构件块 [0299] 通常，可以通过提供宿主微生物并用包含如上所述的合适碳源的培养基培养所提供的微生物来产生一种或多种C7构件块。通常，培养基和/或培养条件可以使得微生物生长至足够的密度并有效地产生C7构件块。对于大规模产生方法，可以使用任何方法，如在别处描述的方法(Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，2nd Edition，Editors:A.L.Demain and J.E.Davies，ASM Press；和Principles of Fermentation Technology，P.F.Stanbury and A.Whitaker，Pergamon)。简言之，用特定微生物接种含有合适培养基的大罐(例如，100加仑、200加仑、500加仑或更大的罐)。接种后，温育微生物以允许产生生物质。一旦达到所需的生物质，可以将含有微生物的培养基转移到第二个罐。此第二罐可以是任何尺寸。例如，第二罐可以更大，更小，或者与第一罐尺寸相同。通常，第二罐大于第一罐，使得可以将额外的培养基添加到来自第一罐的培养基。此外，此第二罐内的培养基可以与第一罐中使用的培养基相同或不同。 [0300] 一旦转移，可以温育微生物以允许产生C7构件块。一旦产生，任何方法可以用于分离C7构件块。例如，可以通过吸附过程从发酵液中选择性回收C7构件块。在庚二酸和7-氨基庚酸的情况下，可以通过蒸发进一步浓缩，通过蒸发和/或冷却结晶结晶所得洗脱液，并且通过离心回收晶体。在七亚甲基二胺和1,7-庚二醇的情况下，可以采用蒸馏以达到所需的产物纯度。 [0301] 因此，本文提供的方法可以在重组宿主中进行。在一些实施方案中，本文提供的方法可以通过发酵在重组宿主中进行。在一些实施方案中，重组宿主经受需氧，厌氧或微需氧培养条件下的培养策略。在一些实施方案中，重组宿主在营养限制(如磷酸盐，氮和氧限制)的条件下培养。在一些实施方案中，使用陶瓷膜保留重组宿主以维持发酵期间的高细胞密度。 [0302] 在一些实施方案中，补料到发酵的主要碳源源自生物或非生物给料。在一些实施方案中，生物给料可以是或可以源自单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的酒糟可溶物或城市废物。在一些实施方案中，所述非生物给料可以是或可以源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐/酯(benzoate)、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)碱洗液(caustic wash)废物流，或对苯二甲酸/间苯二甲酸混合物废物流。 [0303] 在一些实施方案中，所述宿主微生物是原核生物。在一些实施方案中，所述原核生物可以来自埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichia coli)；来自梭菌属(Clostridia)如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)或者克鲁佛梭菌(Clostridium kluyveri)；来自棒状杆菌属(Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；来自贪铜菌属(Cupriavidus)如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或者耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；来自假单胞菌属(Pseudomonas)如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或者食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)；来自代尔夫特菌属(Delftia)，如食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)； 来自芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)；来自乳杆菌属 (Lactobacillus)如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)；或者来自乳球菌属 (Lactococcus)如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；或者来自红球菌(Rhodococcus)如马红球菌(Rhodococcus equi)。 [0304] 在一些实施方案中，重组宿主可以真核生物。在一些实施方案中，真核生物来自曲霉属如黑曲霉；来自酵母属，如酿酒酵母；来自毕赤氏酵属如巴斯德毕赤酵母；来自耶罗维亚酵母属如解脂耶罗维亚酵母；来自伊萨酵母属如东方伊萨酵母；来自德巴利酵母属如汉逊德巴利酵母；来自Arxula属如Arxula adenoinivorans；或者来自克鲁维酵母菌属如乳酸克鲁维酵母菌的真核生物 [0305] 在一些实施方案中，重组宿主包括一种或多种具有弱化活性的以下多肽：聚羟基链烷酸合酶活性，乙酰CoA硫酯酶活性，乙酰CoA特异性β-酮硫解酶活性，形成乙酸磷酸转乙酰酶活性，乙酸激酶活性，乳酸脱氢酶活性，menaquinol-延胡索酸氧化还原酶活性，产生异丁醇的2-酮酸脱羧酶，形成乙醇的醇脱氢酶活性，丙糖磷酸异构酶活性，丙酮酸脱羧酶活性，葡萄糖-6-磷酸异构酶活性，消耗NADPH不平衡的转氢酶活性，消耗NADPH不平衡的谷氨酸脱氢酶活性，利用NADH/NADPH的谷氨酸脱氢酶活性，庚二酰-CoA脱氢酶活性；接受C7构件块和中心前体作为底物的酰基-CoA脱氢酶活性；戊二酰-CoA脱氢酶活性；或庚二酰-CoA合成酶活性。 [0306] 在一些实施方案中，重组宿主过表达一种或多种编码具有以下活性的多肽的基因：乙酰CoA合成酶活性；转酮酶活性；吡啶(puridine)核苷酸转氢酶活性；甲酸脱氢酶活性；甘油醛-3P-脱氢酶活性；苹果酸酶活性；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性；果糖1,6二磷酸酶活性；L-丙氨酸脱氢酶活性；PEP羧化酶活性，丙酮酸羧化酶活性；PEP羧激酶活性；PEP合酶活性；对用于产生辅因子不平衡的NADPH特异性的L-谷氨酸脱氢酶活性；甲醇脱氢酶活性，甲醛脱氢酶活性，赖氨酸转运蛋白活性；二羧酸转运蛋白活性；S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性；3-磷酸甘油酸脱氢酶活性；3磷酸丝氨酸转氨酶活性；磷酸丝氨酸磷酸酶活性；或多药物转运蛋白活性 [0307] 本文件还提供了包含至少一种编码具有以下活性的外源核酸的重组宿主：(i)β-酮酰基-[acp]合酶活性或β-酮硫解酶活性，(ii)3-羟基丁酰-CoA脱氢酶活性，和(iii)烯酰-CoA水合酶活性。 [0308] 在一些实施方案中，所述重组宿主还包括一种或多种具有以下活性的外源多肽：高柠檬酸合酶活性，高柠檬酸脱水酶活性，高乌头酸水合酶，异高柠檬酸脱氢酶，2-羟基戊二酸脱氢酶活性，戊烯二酸CoA转移酶活性，或2-羟基戊二酰CoA脱水酶活性。 [0309] 在一些实施方案中，所述重组宿主还包括一种或多种具有以下活性的外源多肽：戊二酸半醛脱氢酶活性，4-羟基-2-氧代庚二酸醛缩酶活性，2-氧代-庚-3-烯-1,7-二酸水合酶活性，2-烯酸还原酶活性，2-羟基戊二酸脱氢酶活性，戊烯二酸CoA-转移酶活性，或2-羟基戊二酸-CoA脱水酶活性。 [0310] 在一些实施方案中，所述重组宿主还包括一种或多种具有以下活性的外源多肽：硫酯酶活性，醛脱氢酶活性，7-氧代庚酸脱氢酶活性，6-氧代己酸脱氢酶活性，戊烯二酸CoA转移酶活性，可逆的琥珀酰-CoA连接酶活性，乙酰化醛脱氢酶活性，或羧酸还原酶活性，所述宿主还产生庚二酸或庚二酸半醛。 [0311] 在一些实施方案中，所述重组宿主还包括具有ω-转氨酶活性的外源多肽，所述宿主还产生7-氨基庚酸。 [0312] 在一些实施方案中，所述重组宿主还包括一种或多种具有以下活性的外源多肽：4-羟基丁酸脱氢酶活性，5-羟基戊酸脱氢酶活性，6-羟基己酸脱氢酶活性，或醇脱氢酶活性，所述宿主还产生7-羟基庚酸。 [0313] 在一些实施方案中，所述重组宿主还包括一种或多种具有以下活性的外源多肽：ω-转氨酶活性，脱乙酰酶活性，N-乙酰转移酶活性，或醇脱氢酶活性，所述宿主还产生七亚甲基二胺。 [0314] 在一些实施方案中，所述重组宿主还包括一种或多种具有以下活性的外源多肽：(a)通过磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性增强的羧酸还原酶活性，或(b)醇脱氢酶活性，所述宿主还产生1,7-庚二醇。 [0315] 在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。实施例 [0316] 实施例1 [0317] 使用庚二酰-CoA作为底物并形成庚二酸的硫酯酶的酶活性 [0318] 将编码N-末端His-标签的序列添加到编码硫酯酶的来自大肠杆菌的tesB基因(SEQ ID NO:21，参见图9)，使得可以产生N末端加HIS标签的ω-转氨酶。将修饰的tesB基因在T7启动子控制下克隆到pET15b表达载体中。将表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。所得的重组大肠杆菌菌株在含有50mL Luria肉汤(LB)培养基和抗生素选择压力的500mL摇瓶培养物中于37℃在以230rpm振荡下培养。使用0.5mM IPTG在17℃诱导每种培养物过夜。 [0319] 通过离心收获来自每个诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬所述团粒并在Y-perTM溶液(ThermoScientific，Rockford，IL)中裂解。通过离心从上清液中分离细胞碎片。使用Ni亲和层析从上清液纯化硫酯酶，并且用缓冲液置换洗脱液并通过超滤浓缩。 [0320] 在由终浓度为50mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，0.1mM Ellman’s试剂和667μM庚二酰-CoA(作为底物)的缓冲液中一式三份进行酶活性测定。通过将0.8μM tesB的基因产物加入到含有庚二酰-CoA的测定缓冲液中来开始酶活性测定反应，并在37℃下温育20分钟。通过在412nm的吸光度来监测辅酶A的释放。从活性酶测定吸光度减去与仅底物的对照(其包含煮沸后的酶)相关的吸光度，并与空载体对照比较。tesB的基因产物接受庚二酰-CoA作为底物，如通过相对分光光度法(relative spectrophotometry)证实(参见图10)，并且合成庚二酸作为反应产物。 [0321] 实施例2 [0322] 使用庚二酸半醛作为底物并形成7-氨基庚酸的ω-转氨酶的酶活性 [0323] 将编码N-末端His-标签的序列添加到分别编码SEQ ID NO：13，15，16，和18的ω-转氨酶的来自紫色色杆菌、丁香假单胞菌、球形红杆菌和河流弧菌的基因(参见图9)，使得可以产生N末端加HIS标签的ω-转氨酶。将得到的每个修饰的基因在T7启动子控制下克隆到pET21a表达载体中，并将每个表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。所得的重组大肠杆菌菌株在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中于37℃在以230rpm振荡下培养。使用1mM IPTG在16℃诱导每种培养物过夜。 [0324] 通过离心收获来自每个诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒并通过超声处理裂解。通过离心从上清液中分离细胞碎片，并将无细胞提取物立即用于酶活性测定。 [0325] 在由终浓度为50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM 7-氨基庚酸，10mM丙酮酸和100μM吡哆醛5’磷酸盐组成的缓冲液中进行反向(reverse direction)(即7-氨基庚酸至庚二酸半醛)的酶活性测定。通过将ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物加入到含有7-氨基庚酸的测定缓冲液中来开始每个酶活性测定反应，并在25℃在250rpm振荡的情况下温育24小时。通过RP-HPLC对由丙酮酸形成的L-丙氨酸定量。 [0326] 不含7-氨基庚酸的每个仅酶的对照表明丙酮酸向L-丙氨酸的低基线转化。参见图16。如针对空载体对照所证实的，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，和SEQ ID NO:18的基因产物接受7-氨基庚酸作为底物。参见图17。 [0327] 对于SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，和SEQ ID NO:18的转氨酶，证实了正向(forward direction)(即庚二酸半醛至7-氨基庚酸)的酶活性。酶活性测定在由终浓度为50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM庚二酸半醛，10mM L-丙氨酸和100μM吡哆醇5'磷酸盐组成的缓冲液中进行。通过将ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物加入到含有庚二酸半醛的测定缓冲液中来开始每个酶活性测定反应，并在25℃在250rpm振荡的情况下温育4小时。通过RP-HPLC定量丙酮酸的形成。 [0328] 如针对空载体对照所证实的，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，和SEQ ID NO:18的基因产物接受庚二酸半醛作为底物。参见图18。证实了ω-转氨酶活性的可逆性，这表明SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，和SEQ ID NO:18的ω-转氨基酶接受己二酸半醛作为底物，并合成7-氨基庚酸作为反应产物。 [0329] 实施例3 [0330] 使用庚二酸作为底物并形成庚二酸半醛的羧酸还原酶的酶活性 [0331] 将编码His-标签的序列添加到分别编码SEQ ID NO：9和12的羧酸还原酶的来自Segniliparus rugosus和Segniliparus rotundus的基因(参见图9)，使得可以产生N末端加HIS标签的羧酸还原酶。将每个修饰的基因与编码加His标签的来自枯草芽孢杆菌的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的sfp基因一同克隆到pETDuet表达载体中，均在T7启动子下。将每个表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中，并且在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中于37℃在230rpm振荡的情况下培养每个所得的重组大肠杆菌菌株。使用自诱导培养基在37℃诱导每种培养物过夜。 [0332] 通过离心收获来自每个诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒并通过超声处理裂解，并通过离心从上清液中分离细胞碎片。使用Ni亲和层析从上清液纯化羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，以10倍稀释到50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)中，并通过超滤浓缩。 [0333] 在由终浓度为50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，2mM庚二酸，10mM MgCl2，1mM ATP和1mM NADPH组成的缓冲液中一式三份进行酶活性(即从庚二酸到庚二酸半醛)测定。通过将纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶或空载体对照加入到含有庚二酸盐的测定缓冲液中，开始每个酶活性测定反应，然后在室温温育20分钟。通过在340nm处的吸光度监测NADPH的消耗。不含庚二酸的每个仅酶的对照表明NADPH的低基线消耗。参见图11。 [0334] 如针对空载体对照所证实的，通过sfp的基因产物增强的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12的基因产物接受庚二酸作为底物(参见图12)，并合成庚二酸半醛。 [0335] 实施例4 [0336] 使用7-羟基庚酸作为底物并形成7-羟基庚醛的羧酸还原酶的酶活性 [0337] 将编码His-标签的序列添加到分别编码SEQ ID NO：7至12的羧酸还原酶的来自海分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、Segniliparus rugosus、耻垢分枝杆菌、马赛分枝杆菌、和Segniliparus rotundus的基因(参见图19)，使得可以产生N末端加HIS标签的羧酸还原酶。将每个修饰的基因与编码加His标签的来自枯草芽孢杆菌的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的sfp基因一同克隆到pET Duet表达载体中，均在T7启动子的控制之下。 [0338] 将每个表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶培养物中于37℃在230rpm振荡的情况下培养每个所得的重组大肠杆菌菌株。使用自诱导培养基在37℃诱导每种培养物过夜。 [0339] 通过离心收获来自每个诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒并通过超声处理裂解。通过离心从上清液中分离细胞碎片。使用Ni亲和层析从上清液纯化羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，以10倍稀释到50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)中，并通过超滤浓缩。 [0340] 在由终浓度为50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，2mM 7-羟基庚酸，10mM MgCl2，1mM ATP和1mM NADPH组成的缓冲液中一式三份进行酶活性(即7-羟基庚酸到7-羟基庚醛)测定。通过将纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶或空载体对照加入到含有7-羟基庚酸盐的测定缓冲液中，开始每个酶活性测定反应，然后在室温温育20分钟。通过在340nm处的吸光度监测NADPH的消耗。不含7-羟基庚酸的每个仅酶的对照表明NADPH的低基线消耗。 参见图11。 [0341] 如针对空载体对照所证实的，通过sfp的基因产物增强的SEQ ID No：7至12的基因产物接受7-羟基庚酸作为底物(参见图13)，并合成7-羟基庚醛。 [0342] 实施例5 [0343] 用于7-氨基庚醇，形成7-氧代庚醇的ω-转氨酶活性 [0344] 将编码N-末端His-标签的核苷酸序列添加到分别编码SEQ ID NO：13，15，和16的ω-转氨酶的紫色色杆菌、丁香假单胞菌和球形红杆菌基因(参见图9)，使得可以产生N末端加HIS标签的ω-转氨酶。将修饰的基因在T7启动子下克隆到pET21a表达载体中。将每个表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。将每个所得的重组大肠杆菌菌株在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶中于37℃在230rpm振荡情况下培养。使用1mM IPTG在16℃诱导每种培养物过夜。 [0345] 通过离心收获来自每个诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒并通过超声处理裂解。通过离心从上清液中分离细胞碎片，并将无细胞提取物立即用于酶活性测定。 [0346] 在由终浓度为50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM 7-氨基庚醇，10mM丙酮酸和100μM吡哆醛5’磷酸盐组成的缓冲液中进行反向(即7-氨基庚醇至7-氧代庚醇)酶活性测定。通过将ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物加入到含有7-氨基庚醇的测定缓冲液中来开始每个酶活性测定反应，并在25℃在250rpm振荡的情况下温育4小时。通过RP-HPLC定量L-丙氨酸的形成。 [0347] 不含7-氨基庚醇的每个仅酶的对照具有丙酮酸向L-丙氨酸的低基线转化。参见图16。 [0348] 如针对空载体对照所证实的，SEQ ID NO:13，15，和16的基因产物接受7-氨基庚醇作为底物(参见图21)并合成7-氧代庚醇作为反应产物。鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例2)，可以得出结论，SEQ ID NO:13，15，和16的基因产物接受7-氧代庚醇作为底物并形成7-氨基庚醇。 [0349] 实施例6 [0350] 使用七亚甲基二胺作为底物并形成7-氨基庚醛的ω-转氨酶的酶活性 [0351] 将编码N-末端His-标签的序列添加到分别编码SEQ ID NO:13至18的ω-转氨酶的紫色色杆菌、铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、球形红杆菌、大肠杆菌和河流弧菌基因(参见图9)，使得可以产生N末端加HIS标签的ω-转氨酶。将修饰的基因在T7启动子下克隆到pET21a表达载体中。将每个表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。将每个所得的重组大肠杆菌菌株在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶中37℃在230rpm振荡下培养。 使用1mM IPTG在16℃诱导每种培养物过夜。 [0352] 通过离心收集来自每个诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒并通过超声处理裂解。通过离心从上清液中分离细胞碎片，并将无细胞提取物立即用于酶活性测定。 [0353] 在由终浓度为50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM七亚甲基二胺，10mM丙酮酸和100μM吡哆醛5’磷酸盐组成的缓冲液中进行反向(即七亚甲基二胺至7-氨基庚醛)酶活性测定。通过将ω-转氨酶基因产物或空载体对照的无细胞提取物加入到含有七亚甲基二胺的测定缓冲液中来开始每个酶活性测定反应，并在25℃以250rpm振荡温育4小时。通过RP-HPLC定量L-丙氨酸的形成。 [0354] 不含七亚甲基二胺的每个仅酶的对照具有丙酮酸向L-丙氨酸的低基线转化。参见图16。 [0355] 如针对空载体对照所证实的，SEQ ID NO：13至18的基因产物接受七亚甲基二胺作为底物(参见图19)并合成7-氨基庚醛作为反应产物。鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例2)，可以得出结论，SEQ ID NO:13至18的基因产物接受7-氨基庚醛作为底物并形成七亚甲基二胺。 [0356] 实施例7 [0357] 羧酸还原酶针对N7-乙酰基-7-氨基庚酸，形成N7-乙酰基-7-氨基庚醛的酶活性[0358] 在由终浓度为50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，2mM N7-乙酰基-7-氨基庚酸，10mM MgCl2，1mM ATP和1mM NADPH组成的缓冲液中一式三份测定用于将N7-乙酰基-7-氨基庚酸转化为N7-乙酰基-7-氨基庚醛的每个N末端加His标签的SEQ ID NO:8，11，和12的羧酸还原酶(参见实施例4和图9)的活性。通过将纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶或空载体对照加入到含有N7-乙酰基-7-氨基庚酸的测定缓冲液中来开始测定，然后在室温温育20min。通过340nm处的吸光度监测NADPH的消耗。不含N7-乙酰基-7-氨基庚酸的每个仅酶的对照表明NADPH的低基线消耗。参见图11。 [0359] 如针对空载体对照所证实的，通过sfp的基因产物增强的SEQ ID NO:8，11，和12的基因产物接受N7-乙酰基-7-氨基庚酸作为底物(参见图14)，并合成N7-乙酰基-7-氨基庚醛。 [0360] 实施例8 [0361] 使用N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷，并形成N7-乙酰基-7-氨基庚醛的ω-转氨酶的酶活性 [0362] 使用由终浓度为50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，10mM N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷，10mM丙酮酸和100μM吡哆醛5’磷酸盐组成的缓冲液测定用于将N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷转化为N7-乙酰基-7-氨基庚醛的N末端加His标签的SEQ ID NO：13至18的ω-转氨酶(参见实施例6和图9)的活性。通过将ω-转氨酶的无细胞提取物或空载体对照加入到含有N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷的测定缓冲液中来开始每个酶活性测定反应，然后在25℃在250rpm振荡的情况下温育4小时。通过RP-HPLC定量L-丙氨酸的形成。 [0363] 不含N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷的每个仅酶的对照表明丙酮酸到L-丙氨酸的低基线转化。参见图16。 [0364] 如针对空载体对照所证实的，SEQ ID No：13至18的基因产物接受N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷作为底物(参见图20)并合成N7-乙酰基-7-氨基庚醛作为反应产物。 [0365] 鉴于ω-转氨酶活性的可逆性(参见实施例2)，SEQ ID NO:13至18的基因产物接受N7-乙酰基-7-氨基庚醛作为形成N7-乙酰基-1,7-二氨基庚烷的底物。 [0366] 实施例9 [0367] 使用庚二酸半醛作为底物并形成庚二醛的羧酸还原酶的酶活性 [0368] 使用庚二酸半醛作为底物测定N-末端加His标签的SEQ ID NO:12的羧酸还原酶(参见实施例4和图9)。在由终浓度为50mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，2mM庚二酸半醛，10mM MgCl2，1mM ATP和1mM NADPH组成的缓冲液中一式三份进行酶活性测定。通过将纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶或空载体对照加入到含有己二酸半醛的测定缓冲液中来开始酶活性测定反应，并然后在室温温育20min。通过340nm处的吸光度监测NADPH的消耗。不含庚二酸半醛的每个仅酶的对照表明NADPH的低基线消耗。参见图11。 [0369] 如针对空载体对照所证实的，通过sfp的基因产物增强的SEQ ID NO:12的基因产物接受己二酸半醛作为底物(参见图15)，并合成庚二醛。 [0370] 实施例10 [0371] 使用庚二酰-CoA甲酯作为底物并形成庚二酰-CoA的庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶的酶活性 [0372] 将编码C-末端His-标签的核苷酸序列添加到编码SEQ ID NO:6的庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶的来自大肠杆菌的基因(参见图9)，使得可以产生C末端加HIS标签的庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶。将所得的修饰的基因在T7启动子下克隆到pET28b+表达载体中，并将表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。将所得的重组大肠杆菌菌株在含有100mL LB培养基和抗生素选择压力的500mL摇瓶中于37℃在230rpm振荡情况下培养。使用0.3mM IPTG在18℃诱导每种培养物过夜。 [0373] 通过离心收集来自每个诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒并通过超声处理裂解。通过离心从上清液中分离细胞碎片。使用Ni亲和层析从上清液纯化庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶，进行缓冲液置换，并通过超滤浓缩至20mM HEPES缓冲液(pH＝7.5)，并在4℃下储存。 [0374] 在由终浓度为25mM Tris·HCl缓冲液(pH＝7.0)和5[mM]庚二酰-CoA甲酯组成的缓冲液中一式三份进行将庚二酰-CoA甲酯转化为庚二酰-CoA的酶活性测定。通过将庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶(到10[μM]的终浓度)加入到含有庚二酰-CoA甲酯的测定缓冲液中来开始酶活性测定反应，并在30℃以250rpm振荡温育1小时。通过LC-MS定量庚二酰-CoA的形成。 [0375] 不含酶的仅底物的对照没有表现出底物庚二酰-CoA甲酯向庚二酰-CoA的转化。参见图22。如通过LC-MS所证实的，SEQ ID NO:6的庚二酰-[acp]甲酯甲酯酶接受庚二酰-CoA甲酯作为底物并合成庚二酰-CoA作为反应产物。参见图22。 [0376] 实施例11 [0377] 使用戊二酰-CoA和乙酰CoA作为底物并形成3-酮庚二酰-CoA的β-酮硫解酶的酶活性 [0378] 将编码N-末端His-标签的核苷酸序列添加到分别编码SEQ ID NO：28至40的β-酮硫解酶的Pseudomonas reinekei MT1，恶臭假单胞菌，Burkholderia xenovorans，节杆菌属物种，Burkholderia xenovorans，Geobacillus kaustophilus，Gordonia bronchialis，弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，伯克氏菌属物种(Burkholderia sp.)，印度拜耶林克氏菌(Beijerinckia indica)，Arthrobacter arilaitensis，钩虫贪铜菌和大肠杆菌(参见图9)，使得可以产生N末端加HIS标签的β-酮硫解酶。将所得的修饰的基因在T7启动子下克隆到pET15b表达载体中，并且将表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。将所得的重组大肠杆菌菌株在含有350mL LB培养基和抗生素选择压力的1L摇瓶中于37℃在230rpm振荡情况下培养。使用1mM IPTG在25℃诱导每种培养物过夜。 [0379] 通过离心收集来自每个诱导的摇瓶培养物的团粒。重悬每个团粒并通过超声处理裂解。通过离心从上清液中分离细胞碎片。使用Ni亲和层析从上清液纯化β-酮硫解酶，进行缓冲液置换，并通过超滤浓缩至50mM磷酸钾缓冲液(pH＝6.8)。 [0380] 在由终浓度为50mM磷酸钾缓冲液(pH＝6.8)和1mM戊二酰-CoA和1mM乙酰CoA组成的缓冲液中一式三份进行将戊二酰-CoA和乙酰CoA转化为3-酮庚二酰基-CoA的酶活性测定。通过将β-酮硫解酶(到7[μM]的终浓度)加入到含有1mM戊二酰-CoA和1mM乙酰CoA的测定缓冲液中来开始酶活性测定反应，并在30℃轻柔振荡温育3小时。通过LC-MS定量3-酮庚二酰基-CoA的形成。 [0381] 不含酶的仅底物的对照没有表现出底物庚二酰-CoA甲酯向庚二酰-CoA的转化。参见图23。如通过针对空载体对照的LC-MS所证实的，SEQ ID NO:28至40的β-酮硫解酶接受戊二酰-CoA和乙酰CoA作为底物，并合成3-酮庚二酰基-CoA作为反应产物。参见图23。 [0382] 其它实施方案 |
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