一种人尿激肽原酶粗制品的制备方法 |
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| 申请号 | CN201611101691.X | 申请日 | 2016-12-02 | 公开(公告)号 | CN106754839A | 公开(公告)日 | 2017-05-31 |
| 申请人 | 广东天普生化医药股份有限公司; | 发明人 | 王旭; 章华; 何建国; 曾永峰; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种人尿激肽原酶粗制品的制备方法，包括如下步骤：收集 吸附 剂，洗脱，收集尿蛋白洗脱峰；进行 超滤 浓缩，调节pH为4～5.8，电导率为20～70mS/cm，得到浓缩液；上样金属螯合亲和层析柱，平衡液冲洗金属螯合亲和层析柱，然后使用 水 作为洗脱液进行洗脱，收集人尿激肽原酶洗脱峰；缓慢加入 硫酸 铵，搅拌，静置，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品。本发明属于色谱分离技术领域，本发明提高了人尿激肽原酶粗制品收率，降低了生产成本，获得的人尿激肽原酶粗制品产品 质量 好，KN比活高。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种人尿激肽原酶粗制品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种人尿激肽原酶粗制品的制备方法技术领域[0001] 本发明属于色谱分离技术领域，尤其涉及一种人尿激肽原酶粗制品的制备方法。 背景技术[0002] 人尿激肽原酶(Urinary Kallidinogenase，KN)，是从人尿中分离提取的由238个氨基酸组成的糖蛋白，等电点在4左右，分子量约54000D。人尿激肽原酶能够激活人血浆激肽原转化为激肽，从而行使一系列生理功能，例如，起到扩张毛细血管，松弛血管平滑肌，改善微循环，增加血流量，抗凝，溶血栓等作用，对极性脑梗死等具有显著的疗效。 [0003] 人尿胰蛋白酶抑制剂(Urinary trypsininhibitor，UTI)是从人尿中分离纯化的由143个氨基酸组成的糖蛋白，等电点在2左右，分子量约65000D，人尿胰蛋白酶抑制剂具有抑制多种蛋白酶、糖酶和脂酶等酶的活性，从而抑制炎症介质的过度释放，抑制全身性炎症反应，改善微循环和组织灌注，起到保护脏器等作用。 [0004] 尿蛋白产品主要的生产步骤包括：通过尿蛋白的吸附、洗脱、沉淀等步骤制备尿蛋白粗制品，然后尿蛋白粗制品经过精制，得到尿蛋白精制品。吸附剂、洗脱液、平衡液等都会对尿蛋白粗制品的收率和纯度产生影响。 [0005] 中国专利申请CN102660525公开了一种制备人尿激肽原酶粗制品的方法，包括如下步骤：采用阴离子交换树脂作为吸附剂，收集尿液中的尿蛋白后，使用0.5－1.0M的NaCl溶液进行集中洗脱，将洗脱液上样金属螯合亲和层析住，金属螯合亲和层析柱平衡液为0.01－0.2M磷酸盐缓冲液，NaCl浓度为0－2M，pH6.0－9.0，使用pH4.5－2.8的0.01－0.2M醋酸－醋酸钠溶液作为洗脱溶液，从而实现KN和UTI的分离。通过该方法，可快速吸附KN并集中系统，提高KN的稳定性的优点，但是该方法在阴离子交换树脂和金属螯合亲和层析柱洗脱时的KN收率都较低，不利于工业化生产。 [0006] 中国专利申请CN105754977公开了一种制备人尿激肽原酶粗制品的方法，包括如下步骤：将阴离子交换树脂作为吸附剂吸附尿蛋白，用NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液进行超滤浓缩，调节超滤浓缩液的pH值为3.2-4.2，电导为0.05-8Ms/cm，再上样已经用平衡液平衡好的阳离子交换树脂，冲洗，平衡液为0.01-0.5mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，电导为0.05-8Ms/cm，pH值为3.2-4.2，用洗脱液洗脱，收集洗脱液，在洗脱液中加入65％硫酸铵粉末搅拌，收集沉淀，得人尿激肽原酶粗制品。该方法在阴离子树脂洗脱时的KN收率较低，不利于工业化生产。 [0007] 因此，研究开发操作简单、收率高、纯度较高的人尿激肽原酶粗制品的制备方法具有重要的产业化意义。 发明内容[0008] 为解决现有技术中存在收率不够理想的问题，本发明提供人尿激肽原酶粗制品的制备方法，对阴离子交换树脂、金属螯合亲和层析柱的洗脱液和平衡液等进行了优化，提高了人尿激肽原酶粗制品收率，降低了生产成本，获得的人尿激肽原酶粗制品产品质量好，KN比活高。 [0009] 本发明提供一种人尿激肽原酶粗制品的制备方法，包括如下步骤： [0010] S1收集吸附尿蛋白后的吸附剂，洗脱，收集尿蛋白洗脱峰； [0011] S2将步骤S1得到的尿蛋白洗脱峰进行超滤浓缩，调节pH为4～5.8，电导率为20～70mS/cm，得到浓缩液； [0012] S3将步骤S2得到的浓缩液上样金属螯合亲和层析柱，平衡液冲洗金属螯合亲和层析柱，然后使用水作为洗脱液进行洗脱，收集人尿激肽原酶洗脱峰；所述平衡液由0.5～2mol/L的磷酸盐缓冲液和0.01～0.1mol/L的醋酸溶液以3～5：1的体积比组成，平衡液的pH为4～5.8； [0013] S4向步骤S3得到的人尿激肽原酶洗脱峰中缓慢加入硫酸铵，搅拌，静置，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品。 [0014] 采用上述技术方案，可以实现高效收集以及KN和UTI的高效分离，提高了人尿激肽原酶粗制品收率，降低了生产成本，获得的粗制品产品质量好，KN比活高。 [0015] 优选地，所述步骤S2中，调节pH为4.5～5.5，电导率为25～60mS/cm。 [0016] 优选地，所述步骤S3中，平衡液由0.8～1.2mol/L的磷酸盐缓冲液和0.03～0.5mol/L的醋酸溶液以3～4：1的体积比组成，平衡液的pH为4.2～5.0。 [0017] 优选地，所述步骤S3中，平衡液由1.0～1.2mol/L的磷酸盐缓冲液和0.1～0.3mol/L的醋酸溶液以4：1的体积比组成，平衡液的pH为4.4～4.8，电导率为40～55mS/cm。 [0018] 优选地，所述步骤S1中，吸附剂为阴离子交换树脂。更优选地，阴离子交换树脂为强碱型阴离子交换树脂，如：大孔型强阴离子交换树脂、强碱型阴离子交换柱Q Sepharose H.p、Q Sepharose F.F、Q Sepharose 4F.F、Q Sepharose XL、QAE Sephadex A-25、QAE Sephadex A-50或STREAMLINE。所述大孔型强阴离子交换树脂CAS号为9037-24-5。 [0019] 优选地，所述步骤S1中，洗脱液为0.3～2mol/L的磷酸盐缓冲液，pH为4～6，NaCl的浓度为0.01～0.45mol/L。 [0020] 优选地，所述金属螯合亲和层析柱的金属离子为Cu2+、Zn2+或Ni2+。 [0021] 优选地，所述金属螯合亲和层析柱的金属离子为Cu2+。 [0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过使用pH为4～6的0.3～2mol/L的磷酸盐缓冲液作为阴离子交换树脂的洗脱液，可以实现KN从吸附剂中的充分洗脱，洗脱收率提高；通过使用0.5～2mol/L的磷酸盐缓冲液和0.01～0.1mol/L的醋酸溶液以3～5：1的体积比组成金属螯合亲和层析柱的平衡液，水作为洗脱液，可以实现KN和UTI的高效分离，提高了人尿激肽原酶粗制品收率，大大降低了KN和UTI后续精制的难度，降低了生产成本，获得的人尿激肽原酶粗制品产品质量好，KN比活高。附图说明 [0023] 图1本发明实施例一中经亲和层析的人尿激肽原酶洗脱峰的HPLC图。 具体实施方式[0024] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。 [0025] 实施例一人尿激肽原酶粗制品的制备 [0026] 人尿激肽原酶粗制品的制备方法包括如下步骤：收集吸附尿蛋白并水冲洗后的阴离子交换柱Q Sepharose F.F 100kg，洗脱，洗脱液为pH为4.5的0.5mol/L的磷酸盐缓冲液，NaCl的浓度为0.3mol/L，收集尿蛋白洗脱峰；将得到的尿蛋白洗脱峰进行超滤浓缩，调节pH为4.5，电导率为40mS/cm，得到浓缩液；将得到的浓缩液上样已平衡好的Cu2+金属螯合亲和层析柱(Chelating sepharose Fast Flow，购自通用电气医疗集团(GE公司、GE Healthcare)，平衡液冲洗金属螯合亲和层析柱，平衡液由1.0mol/L的磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的醋酸溶液以4：1的体积比组成，平衡液的pH为4.5，电导率为40mS/cm，然后使用去离子水作为洗脱液进行洗脱，收集人尿激肽原酶洗脱峰，进行HPLC检测，结果如图1所示； 向得到的人尿激肽原酶洗脱峰中缓慢加入硫酸铵，搅拌至饱和，静置，加入硅藻土5g，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品(KN粗制品)41g。收集上样穿透液和冲洗穿透液，缓慢加入硫酸铵，搅拌至饱和，静置，加入硅藻土20g，收集沉淀，得到人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品(UTI粗制品)303g。 [0027] 从图1可知，经本实施例提供的平衡液和洗脱液洗脱收集的人尿激肽原酶洗脱峰的人尿激肽原酶含量高达69.02％，而人尿胰蛋白酶抑制剂(对应的保留时间为8.5)的含量低。 [0028] 实施例二人尿激肽原酶粗制品的制备 [0029] 人尿激肽原酶粗制品的制备方法包括如下步骤：收集吸附尿蛋白并水冲洗后的大孔型强阴离子交换树脂100kg，洗脱，洗脱液为pH为4的1mol/L的磷酸盐缓冲液，NaCl的浓度为0.1mol/L，收集尿蛋白洗脱峰；将得到的尿蛋白洗脱峰进行超滤浓缩，调节pH为4.5，电导率为40mS/cm，得到浓缩液；将得到的浓缩液上样已平衡好的Cu2+金属螯合亲和层析柱(Chelating sepharose Fast Flow，购自通用电气医疗集团(GE公司、GE Healthcare))，平衡液冲洗金属螯合亲和层析柱，平衡液由1.0mol/L的磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的醋酸溶液以4：1的体积比组成，平衡液的pH为4.5，电导率为40mS/cm，然后使用去离子水作为洗脱液进行洗脱，收集人尿激肽原酶洗脱峰；向得到的人尿激肽原酶洗脱峰中缓慢加入硫酸铵，搅拌至饱和，静置，加入硅藻土5g，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品47g。收集上样穿透液和冲洗穿透液，缓慢加入硫酸铵，搅拌至饱和，静置，加入硅藻土20g，收集沉淀，得到人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品327g。 [0030] 对比例一人尿激肽原酶粗制品的制备 [0031] 人尿激肽原酶粗制品的制备方法包括如下步骤：收集吸附尿蛋白并水冲洗后的阴离子交换柱Q Sepharose F.F 100kg，洗脱，洗脱液为0.8mol/L的NaCl溶液，收集尿蛋白洗脱峰；将得到的尿蛋白洗脱峰进行超滤浓缩，调节pH为4.5，电导率为40mS/cm，得到浓缩液；将得到的浓缩液上样已平衡好的Cu2+金属螯合亲和层析柱(Chelating sepharose Fast Flow，购自通用电气医疗集团(GE公司、GE Healthcare))，平衡液冲洗金属螯合亲和层析柱，平衡液由1.0mol/L的磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的醋酸溶液以4：1的体积比组成，平衡液的pH为4.5，电导率为40mS/cm，然后使用去离子水作为洗脱液进行洗脱，收集人尿激肽原酶洗脱峰；向得到的人尿激肽原酶洗脱峰中缓慢加入硫酸铵，搅拌至饱和，静置，加入硅藻土5g，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品22g。收集上样穿透液和冲洗穿透液，缓慢加入硫酸铵，搅拌至饱和，静置，加入硅藻土20g，收集沉淀，得到人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品282g。 [0032] 对比例一与实施例一的区别在于：阴离子交换柱的洗脱液改为0.8mol/L的NaCl溶液。 [0033] 对比例二人尿激肽原酶粗制品的制备 [0034] 人尿激肽原酶粗制品的制备方法包括如下步骤：收集吸附尿蛋白并水冲洗后的大孔型强阴离子交换树脂100kg，洗脱，洗脱液为pH为4.5的0.5mol/L的磷酸盐缓冲液，NaCl的浓度为0.3mol/L，收集尿蛋白洗脱峰；将得到的尿蛋白洗脱峰进行超滤浓缩，调节pH为8.0，电导率为2.2mS/cm，得到浓缩液；将得到的浓缩液上样已平衡好的Cu2+金属螯合亲和层析柱(Chelating sepharose Fast Flow，购自通用电气医疗集团(GE公司、GE Healthcare))，平衡液冲洗金属螯合亲和层析柱，平衡液的pH为8.0，含0.02mol/L的磷酸盐缓冲液和0.2mol/L的NaCl溶液，然后使用pH3.8的20mmol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液作为洗脱液进行洗脱，收集人尿激肽原酶洗脱峰；向得到的人尿激肽原酶洗脱峰中缓慢加入硫酸铵，搅拌至饱和，静置，加入硅藻土5g，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗制品24g。收集上样穿透液和冲洗穿透液，缓慢加入硫酸铵，搅拌至饱和，静置，加入硅藻土20g，收集沉淀，得到人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品296g。 [0035] 对比例二与实施例一的区别在于：将得到的尿蛋白洗脱峰进行超滤浓缩，调节pH为8.0，电导率为2.2mS/cm，得到浓缩液；平衡液的pH为8.0，含0.02mol/L的磷酸盐缓冲液和0.2mol/L的NaCl溶液；使用pH3.8的20mmol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液作为洗脱液。 [0036] 试验例：人尿激肽原酶粗制品和人尿胰蛋白酶抑制剂粗制品的检测[0037] 分别对实施例一、实施例二、对比例一、对比例二制得的KN粗制品和UTI粗制品使用荧光法进行检测，结果如表1所示。 [0038] 表1不同实施例的KN粗制品和UTI粗制品检测结果表 [0039] [0040] [0041] 从表1可知，实施例一，KN粗制品中KN的比活为5.8，UTI粗制品中UTI的比活为389实施例二，KN粗制品中KN的比活为6.2，UTI粗制品中UTI的比活为426对比例一，KN粗制品中KN的比活为0.8，UTI粗制品中UTI的比活为139对比例二，KN粗制品中KN的比活为1.1，UTI粗制品中UTI的比活为152 [0042] 因此，本发明提供的人尿激肽原酶粗制品的制备方法能实现KN的高效洗脱，实现KN粗制品和UTI粗制品的高效分离，UTI基本集中在UTI粗制品中，KN基本集中在KN粗制品中，利于KN粗制品和UTI粗制品的后续精制。 [0043] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。 |
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