[0001] 本发明涉及植物抗病毒基因工程领域，具体地，本发明涉及黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)弱毒株系的筛选及其在交叉保护中的应用。

[0002] 黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，主要侵染西瓜、黄瓜、甜瓜、葫芦等多种葫芦科作物，给这些作物上的安全生产造成巨大损失。由于生产上缺乏免疫或高抗CGMMV的品种，市场上又没有对病毒病特效的药剂，因而CGMMV的防治非常困难。

[0003] 交叉保护是指植株受弱毒株系侵染后，免受后继的病毒强毒株系侵染的现象，已经在许多作物病毒病的防治中取得了成功。限制交叉保护广泛应用的关键因素是可用的弱毒株系太少。目前，关于CGMMV株系划分的研究较多，但是关于CGMMV弱毒株系中的研究很少。本发明通过定点突变技术，获得了两个新的致病力显著降低的CGMMV弱毒株系，攻毒实验证明，弱毒株系CP89A和Rd1069A可以有效控制CGMMV强毒株系的侵染。

[0004] 本发明提供了一种CGMMV弱毒株系的筛选及应用，以CGMMV的侵染性克隆为基础，通过定点突变技术在CGMMV的基因中定点引入突变，明确了调控CGMMV致病力的氨基酸位点，获得了致病力显著下降的CGMMV弱毒突变体。通过测定弱毒株系对强毒株系的交叉保护效果，获得了能有效保护植株免受CGMMV强毒株系侵染的弱毒株系。

[0005] 本发明实施的具体技术方案是：

[0006] a.突变体的获得：以自主构建的黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆为基础，针对其衣壳蛋白(CP)的第89位、114位氨基酸和依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的第68位、869位和1069位氨基酸设计突变引物，利用QuickChangeTM定点突变试剂盒在这些位点引入突变。

[0007] b.弱毒株系的筛选：通过农杆菌浸润法将a中获得的突变体接种到寄主植物本氏烟，观察这些突变体所致症状的变化，筛选致病力明显降低的突变体。

[0008] c.交叉保护效果测定：在接种弱毒株系后10天接种CGMMV强毒株系，观察弱毒株系对强毒株系的交叉保护效果。

[0009] 采用本发明所述的技术方案，可以获得如下的技术效果：

[0010] 1)获得了两个致病力明显降低的CGMMV弱毒株系。

[0011] 2)弱毒株系CP89A和Rd1069A可有效保护植株免受CGMMV强毒株系的侵染。附图说明

[0012] 图1为CGMMV强毒株系和突变体接种后第10天的症状；

[0013] 图2接种10天时CGMMV强毒株系和突变体RNA在烟草中的积累水平；

[0014] 图3接种10天时CGMMV强毒株系和突变体衣壳蛋白(CP)在烟草中的积累水平；

[0015] 图4间隔期为10天，弱毒株系在挑战接种后10天对烟草植株的保护效果；

[0016] 图5为交叉保护实验中烟草植株内CGMMV基因组RNA的积累水平；

[0017] 图6为交叉保护实验中烟草植株内CGMMV蛋白的积累水平。

[0018] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

[0019] 本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表：

[0020]

[0021]

[0022] F代表正向引物，R代表反向引物。利用表中引物可以分别CGMMV CP第89位的D和第114位的R突变为A；将RdRp第68位的E、第869位的K和第1069位的E突变为A，加粗的字母代表突变的核苷酸。CP与ef1α两对引物用于荧光定量PCR检测病毒基因积累水平，其中EF1α为植物内参基因。

[0023] 实施例1：定点突变

[0024] 以黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染性克隆pCaCGMMV为模板，利用PCR对五个位点分别进行突变，所用聚合酶为Phusion高保真聚合酶(Finnzymes)。

[0025] PCR反应体系如下：

[0026]

[0027] 反应结束，在PCR产物中加入0.5μL Dpn I(20U/μL)，37℃处理2h，加入125μL无水乙醇和5μL 3mol/L的醋酸钠(pH＝5.2)混匀，-20℃沉淀过夜。13000r/min离心10min，弃上清，沉淀用1mL 75％乙醇洗涤后置于室温自然干燥，加入10μL ddH2O水回溶，转化大肠杆菌stbl3，突变质粒经测序验证。

[0028] 实施例2：病毒接种

[0029] 将pCaCGMMV或突变质粒转化农杆菌GV3101。经菌落PCR验证后，挑单斑接种于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)、四环素(50μg/mL)的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)及上述三种抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期。离心收集菌体并重新悬浮于10mmol/L MgCl2，10mmol/L MES，150μmol/L AS中，调整浓度使其OD600为0.5左右，室温静置3小时。取5mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，从本氏烟(5－6周龄或4－6片真叶)叶片背面浸润。每株浸润2片叶。浸润的植株置于23℃光照培养箱中培养(16小时光照/8小时黑暗交替)。

[0030] 实施例3：症状观察及病毒浓度检测

[0031] 观察接种植物的症状，用荧光定量PCR及ELISA检测病毒基因及蛋白积累水平。在接种后第10天，野生型病毒及突变体CP114A、Rd68A、Rd869A在本氏烟(Nicotiana benthamiana)系统叶上引起明显的花叶和斑驳等症状，而衣壳蛋白第89位与复制酶RdRp第1069位突变体在本氏烟上几乎不表现症状(图1)。发明人将这些弱毒突变体分别命名为CP89A和Rd1069A(其中，CP89A的CP基因核苷酸序列见Seq ID No.15，其CP氨基酸序列见Seq ID No.17；Rd1069A的RdRp基因核苷酸序列见Seq ID No.16，其RdRp氨基酸序列见Seq ID No.18)。荧光定量PCR检测结果表明，以上两个突变体(株系)在烟草叶片中的RNA表达水平明显低于野生型病毒与其他突变体,病毒积累水平约为野生型病毒的10％(图2)。ELISA检测结果表明，以上两个株系在烟草叶片中的病毒积累量明显低于野生型病毒与其他突变体(图3)。

[0032] 实施例4：交叉保护效果测定

[0033] 选取5周左右的本氏烟，接种弱毒株系CP89A和Rd1069A(保护接种)。保护接种后10天接种强毒株系。每个处理接种3棵本氏烟，重复3次。

[0034] 在接种强毒株系后的第10天调查发病情况，发现只接种强毒株系的本氏烟植株表现严重的花叶症状，发病率为100％；而预先接种CP89A和Rd1069A植株发病率为8.3％和0(图4)，说明在间隔期为10天时，两个弱毒突变体的保护效果分别为91.7％和100％。

[0035] 荧光定量PCR检测结果表明，间隔期为10天的处理中，弱毒突变体保护的烟草中病毒RNA的积累水平明显低于未进行交叉保护的烟草(图5)。同时发现突变体保护的本氏烟攻毒后病毒粒子的浓度极低，以至于Western blot无法检测(图6)。

[0036] 以上结果表明，弱毒株系CP89A和Rd1069A对强毒株系具有较好的交叉保护效果，可有效保护植物免受CGMMV强毒株系的侵染。