氧化稳定的α‑淀粉酶变体 |
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| 申请号 | CN201580030895.6 | 申请日 | 2015-06-12 | 公开(公告)号 | CN106661563A | 公开(公告)日 | 2017-05-10 |
| 申请人 | 诺维信公司; | 发明人 | C.安德森; A.D.霍格; S.E.拉森; A.法拉赫-阿拉吉; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及 氧 化稳定的α‑ 淀粉 酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，其中所述变体在提供所述变体的氧化稳定性的一个或多个位置处包含取代，其中当与所述亲本α-淀粉酶相比，所述变体的改进系数>1.0，该系数作为洗涤性能的量度，并且其中所述变体具有α-淀粉酶活性。 |
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| 说明书全文 | 氧化稳定的α-淀粉酶变体[0002] 本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。 [0003] 发明背景发明领域 [0004] 本发明涉及氧化稳定的α-淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。 [0005] 相关领域描述 [0007] α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物中的关键酶并且对于衣物洗涤或餐具洗涤期间去除淀粉污渍，其用途已经变得日益重要。 [0008] 一些洗涤剂，特别是餐具洗涤剂，包括漂白系统、漂白活化剂、和漂白催化剂，由于这些分子的氧化，这些洗涤剂对于α-淀粉酶都是不稳定的。因此，重要的是找到如下α-淀粉酶变体，这些变体在包含多种漂白剂的洗涤剂中是稳定的、具有高的洗涤性能、污渍去除作用和/或活性。 [0009] 在本领域中已知的是，通过用，例如亮氨酸，取代在位置197(使用来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶用于编号)处的甲硫氨酸，来稳定对于漂白剂和氧化的α-淀粉酶。例如这已经披 露于WO 199418314中。然而，这些现有技术中氧化稳定的α-淀粉酶具有以下缺点：该α-淀粉酶活性降低。 [0010] 因此，本发明的目的在于提供α-淀粉酶变体，与其亲本α-淀粉酶相比，这些变体在洗涤剂(特别是在餐具洗涤剂和其他包括漂白剂或漂白系统的洗涤剂)中展示出高水平的稳定性，但同时具有改进的洗涤性能。另外的目的是提供如下α-淀粉酶变体，这些变体具有高性能(特别是高洗涤性能，特别是高餐具洗涤性能)。 [0011] 本发明提供了如下α-淀粉酶变体，这些变体，与其亲本相比具有改进的稳定性，并且与其亲本相比具有改进的活性。 [0012] 发明概述 [0013] 本发明涉及亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，其中该变体在提供该变体的氧化稳定性的一个或多个位置处包含取代，其中当与其亲本α-淀粉酶相比，该变体的改进系数>1.0，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。 [0014] 本发明还涉及包含根据本发明所述的变体的组合物。 [0015] 另外，本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞，以及生产这些变体的方法。 [0016] 变体命名规则 [0017] 出于本发明的目的，使用如在SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列来确定另一种α-淀粉酶中的相应的氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：3中阐述的 氨基酸序列进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放 软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16：276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施 (Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48：443-453)来确定与SEQ ID NO：3中所阐述的氨基酸序列中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的这些参数是空位开 放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。 [0018] 可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过 对数-预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic Acids Research)32：1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马 (Kuma)，2002，核酸研究30：3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33：511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23：372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)537：39-64；加藤和都，2010，生物信息学26：1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22：4673- 4680)的EMBOSS EMMA。 [0019] 当其他酶与SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学 杂志(J.Mol.Biol.)295：613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的 更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线) 来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检 测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，《核酸研究》25：3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。 程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287：797-815；麦 古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19：874-881)利用来自不同来 源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构 折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.) 313：903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。 这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可 以评定此类模型的准确度。 [0020] 对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多 种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33：88- 96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(Protein Engineering)11：739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外 用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克 (Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16：566-567)。 [0021] 在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。 [0022] 取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸与丙氨酸的置换命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变由加号(“+”)分隔，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表在位置205和411分别将甘氨酸(G)置换为精氨酸(R)，并且将丝氨酸(S)置换为苯丙氨酸(F)。 [0023] 缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸的缺失命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分隔，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。 [0024] 多种修饰.包含多种修饰的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸 取代。 [0025] 不同修饰.可以在位置上引入不同的修饰时，这些不同的改变由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly, Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体： [0026] “Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。 [0027] 发明详细说明 [0028] 本发明涉及一组序列。为了方便，这些是以下列出的； [0029] SEQ ID NO：1是α-淀粉酶(AAI10)的成熟核苷酸序列 [0031] SEQ ID NO：3是该α-淀粉酶(AAI10)的成熟氨基酸序列 [0032] SEQ ID NO：4是如下α-淀粉酶(AAI10)的成熟氨基酸序列，该α-淀粉酶包含对应于SEQ ID NO：3的位置182和183的氨基酸的缺失 [0033] SEQ ID NO：5是α-淀粉酶(SP707)的成熟氨基酸序列 [0034] SEQ ID NO：6是α-淀粉酶(AA560)的成熟氨基酸序列 [0035] SEQ ID NO：7是α-淀粉酶(K36)的成熟氨基酸序列 [0036] SEQ ID NO：8是蛋白酶(赛威蛋白酶(Savinase))的成熟氨基酸序列 [0037] SEQ ID NO：9是α-淀粉酶(杂交多肽)的成熟氨基酸序列 [0038] SEQ ID NO：10是α-淀粉酶(K38)的成熟氨基酸序列 [0039] SEQ ID NO：11是α-淀粉酶(KSM-AP1378)的成熟氨基酸序列 [0040] SEQ ID NO：12是α-淀粉酶(SP.7-7)的成熟氨基酸序列 [0041] SEQ ID NO：13是α-淀粉酶(AAI6)的成熟氨基酸序列 [0042] 本发明的变体 [0043] 在一方面，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的亲本多肽的变体。因此，在具体的方面，本发明涉及亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，其中该变体在提供该变体的氧化稳定性的 一个或多个位置处包含取代，其中当与其亲本α-淀粉酶相比，该变体的改进系数(作为洗涤 性能的量度)>1.0，并且其中该变体具有α-淀粉酶活性。 [0044] 本发明的诸位发明人已经发现，在提供氧化稳定性的一个或多个位置包含氨基酸取代的变体不损害该变体的洗涤性能，即参见实例3的结果。 [0045] 如在此使用的术语“α-淀粉酶变体”是指，具有α-淀粉酶活性的、在一个或多个(例如若干)位置包含修饰(即取代、插入和/或缺失)的多肽。取代是指占据一个位置的氨基酸由不同的氨基酸代替；缺失是指去除占据一个位置的氨基酸；以及插入是指在占据一个位 置的氨基酸的毗邻处和紧邻处添加一个氨基酸，所有如以上所定义。本发明的变体具有至 少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的SEQ ID NOs：3、4中阐述的氨基酸序列或SEQ ID NO：2的成熟氨基酸序列的α-淀 粉酶活性。 [0046] 如在此使用的术语“α-淀粉酶活性”是指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)的活性，该水解酶构成一组催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖-和 多糖的水解的酶。术语“α-淀粉酶”和“淀粉酶”可以互换地使用并且构成本发明范围内的相同含义和目的。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序测定α-淀粉酶活性。在一个实施例中，本发明的这些变体具有至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的SEQ ID NOs：3或4中阐述的氨基酸序列或者SEQ ID NO：2中阐述的成熟氨基酸序列的α-淀粉酶活性。 [0047] 如在此使用的术语“亲本α-淀粉酶”，是指对其做出改变以产生α-淀粉酶变体的α-淀粉酶。例如，具有SEQ ID NO：3和4中阐述的任何氨基酸序列的α-淀粉酶可以是针对本发明的这些变体的亲本。与SEQ ID NOs：3和4中任一个具有至少80％，例如至少85％、例如至 少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少99％序列一致性的任何氨基酸序列也可以 是针对本发明的这些变体的亲本α-淀粉酶。 [0048] 该亲本多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此结合给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插 入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。 [0049] 在本发明的一些方面，该亲本α-淀粉酶是芽胞杆菌属物种α-淀粉酶，例如，SEQ ID NO：2的α-淀粉酶，其成熟多肽，即SEQ ID NO：3或4。 [0050] 在本发明的一些方面，该亲本α-淀粉酶多肽由SEQ ID NO：1中阐述的核酸序列编码。 [0051] 应理解的是对于前述的种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect and imperfect states)，和其他分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与 它们已知的种名无关。本领域普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。 [0052] 这个物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。 [0053] 可以使用上述探针，鉴定亲本α-淀粉酶并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水，等等)分离的微生物获得该亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水，等等)直接获得DNA样品。直接从天然栖息地分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。随后可以通过 类似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合DNA样品获得编码亲本多肽的多 核苷酸。一旦已经用探针检测到编码亲本多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技 术人员所知的技术分离或克隆多核苷酸(参见，例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，上 文)。 [0054] 在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO：3或4中所阐述的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO：2中所阐述的全长氨基酸序列或由其组成。具体地，该亲本α-淀粉酶可以包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至485或由其组 成。 [0055] 在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶是如在SEQ ID NO：3或4中阐述的、包含SEQ ID NO：3或4的至少475个氨基酸残基(例如至少480个以及至少485个氨基酸残基)的片段。 [0056] 在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO：3或4中所阐述的氨基酸序列的等位基因变体。相应地，该亲本α-淀粉酶可以包含在SEQ ID NO：13中阐述的氨基酸序列。 [0057] 如在此使用的术语“序列一致性”是指两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套 件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗 传学趋势(Trends Genet.)16：276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序 中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学 杂志(J.Mol.Biol.)48：443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参 数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩 阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且 是如下计算的： [0058] (相同残基x100)/(比对的长度-在比对中的空位总数)。 [0059] 出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包 (EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或 更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以 及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使 用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的： [0060] (相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数) [0061] 如在此使用的术语“氧化稳定性”，是指蛋白质(如根据本发明所述的α-淀粉酶变体)的特性，其中由于例如包含这些氧化组分的洗涤剂组合物的活性氧化组分，该蛋白是没 有氧化的，即降解的或制成无活性的蛋白。如在此使用的术语“氧化组分”，是指如在本文其他之处所定义的漂白系统。因此，如本发明的这些变体具有氧化稳定性的变体，甚至在漂白 系统存在下，仍保持活性。 [0062] 如在此使用的术语“洗涤性能”是指，在例如衣物或硬表面清洁(如餐具洗涤)期间去除存在于待清洁的物体上的淀粉或含淀粉污渍的酶的能力。术语“洗涤性能”包括通常清 洁例如硬表面清洁，如在餐具洗涤中，但还包括在纺织品如衣物上的洗涤性能，并且还包括 工业清洁和机构清洁。该洗涤性能可以通过计算所谓的强度值来量化，并且可以将结果显 示为“改进系数”(IF)。可以如在本文的实例中所描述的来确定洗涤性能。 [0063] 如在此使用的术语“强度值”是指如下洗涤性能，该性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品被玷污时，反射光的强度低于干净样品 的反射光强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能，其中更高的强度值与更高的洗 涤性能相关。 [0066] [0067] 如在此使用的术语“不损害该变体的洗涤性能”，是指根据本发明所述的变体的特性，其中在该变体中所做的修饰对其洗涤性能不具有负面或任何影响。 [0069] 如在此使用的术语“自动机械应力测定法(AMSA)”是指用于评估酶(例如α-淀粉酶)的洗涤性能的特定测定法。使用AMSA测试，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性 能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子将待洗涤的纺织品小块布样对所有缝 开口强力挤压。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与 纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。对于具体以下条件，在这些条件下洗 涤性能可以被确定，参见实例3。此外，本领域技术人员知道如何进行一般的AMSA以评估变 体的洗涤性能。 [0070] 如在此使用的术语“洗涤剂”或“洗涤剂溶液”，是指如下组合物，该组合物被认为是适用于洗涤剂，诸如衣物洗涤剂。术语“洗涤剂”或“洗涤剂溶液”在本文中可互换使用，并且具有相同含义和目的，除非上下文另外明确地说明。 [0071] 如在此使用的术语“在所述AMSA中使用的洗涤剂”，是指在所进行的AMSA中使用的特定洗涤剂。即所使用的洗涤剂可以是如在实例3中所述的标准Z洗涤剂。 [0072] 如在此使用的术语“漂白系统”，是指适合作为清洁活性物的无机和有机漂白剂。无机漂白剂包括过氧化氢合物盐，如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐。 无机过氧化氢合物盐通常是碱金属盐。可以包括无机过氧化氢合物盐，作为没有额外的保 护的结晶固体。可替代地，该盐可以被包衣。 [0073] 碱金属过碳酸盐，特别地过碳酸钠是优选的用于在此使用的过氧化氢合物。最优选地将过碳酸盐以包衣形式结合到产品中，这种包衣形式提供产品内稳定性。提供产品内 稳定性的合适的涂层材料包含水溶性碱金属硫酸盐和碳酸盐的混合盐。这种涂层和涂层方 法先前已描述于GB 1,466,799中。混合盐涂层材料与过碳酸盐的重量比位于从1:200至1:4 的范围内，更优选地从1:99至1:9，并且最优选从1:49至1:19。优选地，该混合的盐是硫酸钠和碳酸钠，该盐具有通式Na2S04.n.Na2CO3其中n是从0.1至3，优选地n是从0.3至1.0并且最 优选n是从0.2至0.5。 [0074] 提供产品内稳定性的另外的适合的涂层材料，包含硅酸钠，其中SiO2:Na2O比率从1.8:1至3.0:1，优选地1.8:1至2.4:1，和/或偏硅酸钠，优选地以无机过氧化氢合物盐的重 量计在从2％至10％(通常从3％至5％)的SiO2的水平应用。硅酸镁也可以包括在该涂层中。 包括硅酸盐和硼酸盐类或硼酸或其他无机物的涂层也是合适的。 [0075] 其他涂层，该涂层包括蜡、油、脂肪皂类还可以有利地使用在本发明中。 [0076] 过氧化单硫酸钾盐是另一种在本文中具有实用性的无机过氧化氢合物盐。典型的有机漂白剂是有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧十二烷二酸酸、二 过氧十四烷二酸酸、以及二过氧十六烷二酸酸。过氧化二苯甲酰是本文优选的有机过氧酸。 单-和二过壬酸、单-和二硬脂酸、以及N-邻苯二甲酰氨基过氧己酸是也适用于本文。该二酰 基过氧化物，尤其是二苯酰基过氧化物，应优选地以颗粒的形式存在，这些颗粒具有的重均 直径为从约0.1至约100微米，优选地从约0.5至约30微米，更优选地从约1至约10微米。优选 地，至少约25％，更优选地至少约50％，甚至更优选至少约75％，最优选至少约90％的颗粒 是小于10微米，优选地小于6微米。已经发现，与更大的二酰基过氧化物颗粒相比，在上述粒度范围内的二酰基过氧化物提供更好的污渍去除，尤其是从塑料餐具上，同时在自动餐具 洗涤器中使用期间最小化不想要的沉积和成膜。该优选的二酰基过氧化物粒度，因此允许 该配制者能够以一种低水平的二酰基过氧化物获得良好的污渍去除，这降低了沉积和成 膜。相反，如二酰基过氧化物粒度增加时，需要更多二酰基过氧化物达到良好的去污，这增 加了在餐具洗涤过程中遇到的在表面上的沉积。另外的典型的有机漂白剂包括过氧酸，具 体实例是烷基过氧酸类和芳基过氧酸类。优选的代表是(a)过氧苯甲酸及其环-取代的衍生 物，例如烷基过氧苯甲酸，但是还有过氧基-[α]-萘甲酸以及单过邻苯二甲酸镁，(b)该脂肪族的或取代脂族过氧酸，例如过氧月桂酸、过氧硬脂酸、[ε]-邻苯二甲酰亚胺基过氧己酸 [酞酸亚氨基过氧己酸(PAP)]、邻-羧基苯甲酰胺过氧己酸、N-非烯基酰基过天敌酸和N-壬 烯基酰氨基琥珀酸盐，和(c)脂族和芳脂族过氧化二羧酸，例如1,12-二过氧羧酸、1,9-二过 氧壬二酸、二过氧癸二酸、二过氧木酸、二过氧邻苯二甲酸类、2-癸基-l,4-二酸、N,N-对苯二甲酰基二(6-氨基过丙酸)。 [0077] 在具体的实施例中，将该漂白体系以如下浓度添加：至少5重量％，例如至少8重量％、例如至少10重量％、或例如至少15重量％。 [0078] 如在此使用的术语“重量％”，是指如下组分，如漂白系统，该组分以基于重量而不是体积计算的百分比存在。该术语为本领域技术人员所熟知，该技术人员还能够基于溶液(如洗涤剂溶液)的组分知识计算此类重量％。 [0079] 在一个实施例中，该漂白体系是过碳酸钠。 [0080] 在一个实施例中，该变体的改进因子>1.5，其中该IF已经在AMSA中被确定，其中在该AMSA中该条件是在下55℃下的20min的洗涤循环，并且其中在漂白系统(如过碳酸钠，在 浓度为8重量％)的存在下对该变体进行测试。 [0081] 在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶具有SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列，或具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列具有至少80％，例如至 少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％一致性。 [0082] 在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶具有SEQ ID NO：4中阐述的氨基酸序列，或具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：4中阐述的氨基酸序列具有至少80％，例如至 少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％一致性。 [0083] 在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶具有SEQ ID NO：13中阐述的氨基酸序列，或具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：13中阐述的氨基酸序列具有至少80％，例 如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％一致性。 [0084] 在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO：3中所阐述的氨基酸序列或由其组成。 [0085] 在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO：4中所阐述的氨基酸序列或由其组成。 [0086] 在一个实施例中，该亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO：13中所阐述的氨基酸序列或由其组成。 [0087] 在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO：3的多肽的片段，其中该片段具有α-淀粉酶活性。 [0088] 在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO：4的多肽的片段，其中该片段具有α-淀粉酶活性。 [0089] 在另一个实施例中，该亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO：13的多肽的片段，其中该片段具有α-淀粉酶活性。 [0090] 如在此使用的术语“片段”是指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺少一个或多个(例如若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一个实施例中，一个片段包含至少480个氨基酸残基、至少481个氨基酸残基或至少482个氨基酸残基。 [0091] 在一个实施例中，该变体与SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％、但少于100％序列一致性。 [0092] 在一个实施例中，该变体与SEQ ID NO：4中阐述的氨基酸序列具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％、但少于100％序列一致性。 [0093] 在一个实施例中，该变体与SEQ ID NO：13中阐述的氨基酸序列具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％、但少于100％序列一致性。 [0094] 如在此使用的术语“序列一致性”，是指已经在本文所述的任何定义。可以如在本文其他之处所描述的进行序列一致性的确定。 [0095] 在一个实施例中，该变体在位置202处包含取代，其中所述位置对应于SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列的氨基酸位置。 [0096] 不受任何理论的束缚，除了在对应于SEQ ID NO：3的M202位置上的天然存在的氨基酸外，任何氨基酸取代都将提供氧化稳定的变体，该变体的IF(作为洗涤性能的测量)为 至少1.0。 [0097] 因此，在一个实施例中，在位置202中的取代选自以下各项中任一项：M202A、M202R、M202N、M202D、M202C、M202E、M202Q、M202G、M202H、M202I、M202L、M202K、M202F、M202P、M202S、M202T、M202W、M202Y和M202V，优选地M202L、M202I、M202T、M202F和M202S，其中该位置对应于阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列中的位置。 [0098] 在一个实施例中，该变体包含在如下两个或更多个位置的缺失，这些位置对应于阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列的位置R181、G182、D183、和G184。 [0099] 如在此使用的术语“缺失”，是指去除多肽(例如酶)内的氨基酸。可通过定点诱变或任何其他本领域已知的方法并通过本领域技术人员进行一种或多种氨基酸的此类去除， 即缺失。 [0100] 根据本发明所述的变体(该变体在对应于SEQ ID NO：3的位置R181、G182、D183、和G184的两个或更多个位置处包含缺失)给这些变体提供稳定性以及促进提升这些变体的洗 涤性能。众所周知，α-淀粉酶的这个特定部分给α-淀粉酶变体提供了稳定性，即如在例如WO 1996/023873中所述。如在此背景下使用的术语“稳定性”，是指在洗涤中该α-淀粉酶变体的稳定性。在例如在40℃-60℃下，在洗涤剂溶液中60min的洗涤循环之后，可以通过测量该变 体的活性来确定这种稳定性。其条件是，在对应于SEQ ID NO：3的位置R181、G182、D183、和G184的两个或更多个位置处包含缺失并且在提供变体的氧化稳定性的一个或多个氨基酸 中包含取代的变体在本发明的范围内。 [0101] 因此，在一个实施例中，该变体在对应于R181+G182；R181+D183；R181+G184；G182+D183；G182+G184；或D183+G184的位置中包含缺失，其中这些位置对应于SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列中的那些位置。 [0102] 这些变体可以进一步包括在一个或多个(例如若干个)其他位置处的一个或多个另外的修饰，例如取代。 [0103] 氨基酸变化可以是微小性质的，即不显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守性氨基酸置换或插入；典型地1至30个氨基酸的小缺失；小氨基-端或羧基端延长，如氨基端甲硫 氨酸残基；至多20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一种功能而促进纯化的小 延长部分，如多组氨酸束、抗原表位或结合结构域。 [0104] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、 异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨 酸、丝氨酸、苏氨酸及蛋氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸置换是本领域已知的并且例如 由H.诺伊拉特(H.Neurath)和R.L.希尔(R.L.Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术 出版社(Academic Press)，纽约(New York)中进行描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、 Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。 [0105] 可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等。 [0106] 可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244：1081-1085)来鉴定多肽中的必 需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突 变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还见希尔顿(Hilton)等 人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271：4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的 突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德穧沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255：306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224：899-904；Wlodaver等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309：59-64。也可以从与相关多肽的比对推断必需氨基酸的身份。 [0107] 因此，在一个实施例中，该变体包含1至40个取代，例如1至30，例如1至20，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或 30个取代。 [0108] 在具体的实施例中，取代的数目是1至20个，例如，1至10个和1至5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。 [0109] 在一个实施例中，该变体进一步包括另外的修饰。 [0110] 这些变体可以由430到490个氨基酸，例如440到485个、450到485个以及460到483个氨基酸组成。 [0111] 在一个实施例中，该变体包含下列修饰或由其组成：G182*+D183*+M202L，其中编码根据SEQ ID NO：3所述。 [0112] 在具体的实施例中，该变体包含下列修饰或由其组成：G182*+D183*+N195F+M202L，其中编码根据SEQ ID NO：3所述。 [0113] 在一方面，本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体，其中该亲本α-淀粉酶包含如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列具有至少80％，例如 至少85％、例如至少90％、例如至少95％、或例如至少98％序列一致性，并且其中该变体由 在对应于SEQ ID NO：3的位置M202的位置中的取代组成。 [0114] 在具体的方面，本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶由SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列组成，其中该变体由在对应于SEQ ID NO：3的位置M202的位置中的取代组成。 [0115] 在另外的方面，本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶由SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列组成，其中该变体由修饰G182*+D183*+M202L组成，其中编码根据SEQ ID NO：3所述。 [0116] 在另外的方面，本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体，该亲本α-淀粉酶由SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列组成，其中该变体由修饰G182*+D183*+N195F+M202L组成，其中编码根据SEQ ID NO：3所述。 [0117] 多核苷酸 [0118] 本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。因此，特别地，本发明涉及编码如下变体的多核苷酸，该变体在一个或多个提供该变体的氧化稳定性的位置处包含取代。 [0119] 如在此使用的术语“多核苷酸编码的”是指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，该多肽编码序列是SEQ ID NO：1中阐述的核苷酸序列。 [0120] 在一个实施例中，根据本发明所述的编码变体的多核苷酸与SEQ ID NO：1的多核苷酸具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少 97％、例如至少98％、例如至少99％但是少于100％序列一致性。 [0121] 在一个实施例中，该多核苷酸编码如下变体，该变体在对应于阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列的位置R181、G182、D183、和G184的两个、三个、或四个位置中包含取代和/或缺失，并且在对应于SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列的位置M202的位置中包含取代。 [0122] 核酸构建体 [0123] 本发明还涉及包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序 列在适合的宿主细胞中的表达。因此，特别地，本发明涉及核酸构建体，该构建体包括编码 变体的多核苷酸，该变体在提供该变体氧化稳定性的一个或多个位置处包含取代，其中该 多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列。 [0124] 如在此使用的术语“核酸构建体”是指单链-或双-链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段， 或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。 [0125] 如在此使用的术语“可操作地连接”是指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。 [0126] 可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的 技术是本领域熟知的。 [0127] 控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活 性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以由编码与该宿主细胞同源 或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。 [0128] 在一个实施例中，该核酸构建体包含如下多核苷酸，该多核苷酸编码如下变体，该变体在对应于阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列的位置R181、G182、D183、和G184的两个、三个、或四个位置中包含取代和/或缺失，并且在对应于SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列 的位置M202的位置中包含取代，其中该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列。 [0129] 表达栽体 [0130] 本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。因此，本发明涉及如下表达载体，任选地重组表达载体，该表达载体 包含编码变体的多核苷酸，该变体包括在提供该变体的氧化稳定性的一个或多个位置处的 取代、启动子、以及转录和翻译终止信号。 [0131] 如在此使用的术语“表达载体”是指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。 [0132] 在一个实施例中，该表达载体包含编码如下变体的多核苷酸，该变体在对应于阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列的位置R181、G182、D183、和G184的两个、三个、或四个位置中包含取代和/或缺失，并且在对应于SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列的位置M202的位 置中包含取代，并且其中该表达载体进一步包含启动子、以及转录和翻译终止信号。 [0133] 各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包含一个或多个合宜的限制性位点以允许在这样的位点插入或置换编码该变体的多 核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插 入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使 得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。 [0134] 重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体 的宿主细胞的相容性。 [0135] 该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含任何用于确保自复制的方式。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合 了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体 或质粒(这些载体或质粒共同包含待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。 [0136] 该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、 对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。 [0137] 技术人员将知道哪种表达载体是最适用于特异性表达系统。因此，本发明不局限于任何特异性表达载体，但是任何包含根据本发明所述的变体的多核苷酸的表达载体被视 为本发明的一部分。 [0138] 宿主细胞 [0139] 本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的 产生。因此，本发明涉及宿主细胞，任选地重组宿主细胞，该宿主细胞包含编码如下变体的 多核苷酸，该变体包括在提供该变体的氧化稳定性的一个或多个位置处的取代，并被可操 作地连接到一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导该变体的产生。 [0140] 如在此使用的术语“宿主细胞”，是指对于用包括本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。该术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，由于复制期间发生的突变，该后代与其亲本细胞不完全相同。 [0141] 在一个实施例中，该宿主细胞包含如下多核苷酸，该多核苷酸编码如下变体，该变体在对应于阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列的位置R181、G182、D183、和G184的两个、三个、或四个位置中包含取代和/或缺失，并且在对应于SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列的 位置M202的位置中包含取代，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或 多个控制序列指导该变体的产生。 [0142] 将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，从而该构建体或载体被维持为染色体整合体或被维持为如稍早描述的自我复制染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖由于 复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程 度上将取决于编码该变体的基因及其来源。 [0143] 宿主细胞可以是在重组产生变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。 [0144] 原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。 [0145] 发明方法 [0146] 本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞；并且(b)回收该变体。因此，本发明涉及生产如下变体的方 法，该变体包括在提供该变体的氧化稳定性的一个或多个位置处的取代，其中该方法包括 以下步骤：a)在适合该变体表达的条件下培养根据本发明所述的宿主细胞，和b)回收该变 体。 [0147] 如在此使用的术语“适合于表达的条件”，是指表达根据本发明所述的变体的宿主细胞被培养的设置。这些条件(或设置)可以取决于宿主细胞的类型。即培养酵母宿主细胞 的合适的条件不同于那些培养细菌宿主细胞的条件。确定哪些条件对于特异性宿主细胞是 最佳的，即适合的，是在本领域的普通技术人员的知识内。 [0148] 在一个实施例中，产生变体的方法(该变体在对应于阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列的位置R181、G182、D183、和G184的两个、三个、或四个位置中包含取代和/或缺失，并且在对应于SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列的位置M202的位置中包含取代)包括以下步 骤：a)在适合该变体表达的条件下培养根据本发明所述的宿主细胞，和b)回收该变体。 [0149] 所述宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生所述变体的营养培养基中培养。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条 件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给 料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合的营养培养 基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以 根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到 该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞 裂解液中回收。 [0152] 可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS- PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登 (Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。 [0153] 在可替代的方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。 [0154] 在另外的方面，本发明涉及用于获得变体的方法，这些方法包括将在位置M202处的取代引入亲本α-淀粉酶，其中该位置对应于SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列的位置；b)任选地，在对应于SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列的位置R181、G182、D183、和G184的两个或更多个位置处引入缺失；和c)回收该变体。 [0155] 可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。 [0156] 定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。 [0157] 通过使用涉及包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多 核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常， 消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此 连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76：4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究 (Nucleic Acids Res.)18：7349-4966。 [0158] 还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19： 773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4：285-290；以及凯利萨诺 (Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(Fungal Genet.Newslett.)43：15- 16。 [0159] 在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。 [0160] 合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432：1050-1054)所述的 基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技 术。 [0161] 可以做出单个或多个氨基酸置换、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如Reidhaar-Olson和索尔(Sauer)，1988，科学，241：53-57；鲍威(Bowie)和索尔，1989，美国科学院院刊，86：2152-2156；WO 95/17413或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，罗曼 (Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30：10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(德比舍尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46：145；Ner等 人，1988，DNA 7：127)。 [0162] 诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(奈斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17： 893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方 法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。 [0163] 通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技 术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩 增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行 改组。 [0164] 本发明也涉及改善亲本α-淀粉酶的氧化稳定性的方法，该亲本α-淀粉酶具有SEQ ID NO：3或4的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列一致性，其中所述方法包括以下步骤： [0165] a)在该亲本α-淀粉酶中在一个或多个提供氧化稳定性的位置引入取代；和 [0166] b)任选地，引入如下两个、三个、或四个位置的取代和/或缺失，这些位置对应于阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列的位置R181、G182、D183、和G184， [0167] 其中该变体与阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％、但少于100％序列一致性，并且其中，与其亲本α-淀粉酶相比，该变体具有α-淀粉酶活性和改进的氧化稳定性。 [0168] 在一个实施例中，改善亲本α-淀粉酶的氧化稳定性的方法(该亲本α-淀粉酶具有SEQ ID NO：3或4的氨基酸序列，或与其具有至少80％序列一致性)，其中该方法包括以下步 骤： [0169] a)在对应于SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列的位置M202的位置中引入取代；和 [0170] b)引入如下两个、三个、或四个位置的取代和/或缺失，这些位置对应于阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列的位置R181、G182、D183、和G184， [0171] 其中该变体与阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％、例如至少99％、但少于100％序列一致性，并且其中，与其亲本α-淀粉酶相比，该变体具有α-淀粉酶活性和改进的氧化稳定性。 [0172] 在一个实施例中，该变体具有以下亲本多肽的至少50％，例如至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％的活性，该亲本多肽具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。 [0173] 在另一个实施例中，该变体具有以下亲本多肽的至少50％，例如至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％的活性，该亲本多肽具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。 [0174] 在一个实施例中，根据Phadebas测定来确定其活性。 [0175] 该α-淀粉酶活性可通过使用Phadebas底物(例如来自麦戈尔生命科学(Magle Life Sciences)，隆德(Lund)，瑞典(Sweden))的方法来确定。Phadebas片剂包括互联淀粉 聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将一种蓝色染料共价结合至这些微球。微 球中的互联淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了淀粉聚合 物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在620nm下测量吸光度来确定。蓝 色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。 [0176] 将有待分析的变体样品稀释于具有所需pH的活性缓冲液中。将两个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定 板(MTP)或PCR-MTP。将30μl稀释淀粉酶样品添加至150μl底物并且混合。在37℃下孵育15分钟。通过添加30μl 1M NaOH并且混合来停止反应。在4000xg下离心MTP 5分钟。将100μl转移至新MTP并且测量620nm下的吸光度。 [0177] 该α-淀粉酶样品应稀释成使得620nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。 [0178] 因此，在一个实施例中，通过如下方法确定其活性，该方法包括以下步骤： [0179] a)在37℃，用染色的直链淀粉底物孵育根据本发明所述的α-淀粉酶变体15分钟；和 [0180] b)在OD 620nm处测量吸光度。 [0181] 在另外的实施例中，通过如下方法确定其活性，该方法包括以下步骤： [0182] a)在37℃，用染色的直链淀粉底物孵育根据本发明所述的α-淀粉酶变体15分钟；和 [0183] b)离心该样品； [0184] c)将上层清液转移至读取器板，并且 [0185] 在OD 620nm处测量吸光度。 [0186] 在另一个实施例中，根据如在实例2中所述的pNP-G7测定确定其活性。 [0187] 发酵液配制品或细胞组合物 [0188] 本发明还涉及包含本发明的变体的一种发酵液配制品或一种细胞组合物。因此，在一个实施例中，该发酵液配制品或细胞组合物包括如下变体，该变体在提供该变体的氧 化稳定性的一个或多个位置处包含取代。在另一个实施例中，该发酵液配制品或细胞组合 物包含编码如下变体的多核苷酸，该变体包括取代(该取代位于提供该变体的氧化稳定性 的一个或多个位置处)、编码变体的核酸构建体(该变体在提供该变体的氧化稳定性的一个 或多个位置处包含取代)，或编码变体的表达载体(该变体在提供该变体的氧化稳定性的一 个或多个位置处包含取代)。该发酵液产物可以进一步包括用于发酵过程的另外的成分，例 如像细胞(包括，包含用来产生感兴趣的多肽的编码本发明的多肽的基因的宿主细胞)、细 胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是包含一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。 [0189] 如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质 合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。该发酵液 可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未 分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之 后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含耗尽的细胞培养基、胞外酶、以及有活力 的和/或无活力的微生物细胞。 [0190] 在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸 和/或其盐)。在具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其 盐，或前述两种或更多种的混合物。 [0191] 在一个实施例中，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞 和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。 [0193] 该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细 胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细 胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的细胞培养基、胞外酶和 杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培 养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。 [0194] 如在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以包含不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分，以提供一种澄清的液体组合物。 [0195] 可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。 [0196] 组合物 [0197] 本发明还涉及包含根据本发明所述的变体的组合物。因此，本发明涉及包含如下变体的组合物，该变体在一个或多个提供该变体的氧化稳定性的位置处包含取代。优选地， 这些组合物富含此种变体。术语“富含”意指该组合物的α-淀粉酶活性已经增加，例如，富集因子为1.1。 [0198] 在一个实施例中，该组合物包含如下变体，该变体在对应于SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列的位置M202的位置中包含取代，并且在对应于阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸 序列的位置R181、G182、D183、和G184的两个、三个、或四个位置中包含取代和/或缺失。 [0199] 这些组合物可以根据本领域已知的方法制备，并可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将变体稳定 化。 [0200] 相应地，在一个实施例中，该组合物是液体衣物或液体餐具洗涤组合物，例如自动餐具洗涤(ADW)液体洗涤剂组合物，或粉末状衣物洗涤，例如皂条，或粉末状餐具洗涤组合 物，例如ADW洗涤剂组合物。 [0202] 另外的组分的选择处于本领域技术人员能力范围内并且包含常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的 织物的类型、污渍的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如 将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。 [0203] 在本发明的一个实施例中，可以将本发明的变体以对应于以下各项的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升洗涤液体0.001-100mg的蛋白质，例如0.01-100mg的蛋白质，优选 是0.005-50mg的蛋白质，更优选是0.01-25mg的蛋白质，甚至更优选是0.05-10mg的蛋白质， 最优选是0.05-5mg的蛋白质，并且甚至最优选是0.01-1mg的蛋白质。考虑了该术语“蛋白 质”在本文中应理解为包括根据本发明所述的变体。 [0204] 用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05-5％的酶蛋白。 [0205] 用于在洗衣造粒(laundry granulation)中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋 白。 [0206] 用于在洗衣液中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。 [0207] 可以使用常规稳定剂稳定本发明的这些变体以及另外的活性组分，例如另外的酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生 物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配置该组合物。 [0208] 在某些市场中，不同洗涤条件并且就其本身而言，使用不同类型的洗涤剂。这披露于例如EP 1 025 240中。例如，在亚洲(日本)使用低的洗涤剂浓度体系，而美国使用中等洗 涤剂浓度体系，并且欧洲使用高的洗涤剂浓度体系。 [0209] 低的洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。日本洗涤剂典型地被认为是低的洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中 的大约667ppm的洗涤剂组分。 [0210] 中等洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洗涤剂通常被认为是中等洗涤剂浓度体系，因为它们具有 存在于洗涤水中的大约975ppm的洗涤剂组分。 [0211] 高的洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在多于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高的洗涤剂浓度体系，因为在洗涤水中它们具有大约 4500-5000ppm的洗涤剂组分。 [0212] 拉丁美洲洗涤剂通常是高泡沫磷酸盐助洗剂洗涤剂并且在拉丁美洲使用的洗涤剂的范围可以落入中等和高的洗涤剂浓度两者中，因为在洗涤水中它们的洗涤剂组分的范 围从1500ppm至6000ppm。此类洗涤剂组合物都是本发明的实施例。 [0213] 本发明的变体还可以掺入WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，将该专利通过引用结合在此。 [0214] 在此给出了本发明的组合物的优选用途的实例。该组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。 [0215] 在一个实施例中，该组合物进一步包含漂白系统。 [0216] 如在此使用的术语“漂白系统”，是指适合作为清洁活性物的无机和有机漂白剂。术语“漂白系统”和“漂白剂”在本文中可以可互换地使用并且构成相同的含义和目的，除非另有明示。无机漂白剂包括过氧化氢合物盐，如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐。无机过氧化氢合物盐通常是碱金属盐。可以包括无机过氧化氢合物盐，作为没有 额外的保护的结晶固体。可替代地，该盐可以被包衣。 [0217] 碱金属过碳酸盐，特别地过碳酸钠是优选的用于在此使用的过氧化氢合物。最优选地将过碳酸盐以包衣形式结合到产品中，这种包衣形式提供产品内稳定性。提供产品内 稳定性的合适的涂层材料包含水溶性碱金属硫酸盐和碳酸盐的混合盐。这种涂层和涂层方 法先前已描述于GB 1,466,799中。混合盐涂层材料与过碳酸盐的重量比位于从1:200至1:4 的范围内，更优选地从1:99至1:9，并且最优选从1:49至1:19。优选地，该混合的盐是硫酸钠和碳酸钠，该盐具有通式Na2S04.n.Na2CO3其中n是从0.1至3，优选地n是从0.3至1.0并且最 优选n是从0.2至0.5。 [0218] 提供产品内稳定性的另外的适合的涂层材料，包含硅酸钠，其中SiO2:Na2O比率从1.8:1至3.0:1，优选地1.8:1至2.4:1，和/或偏硅酸钠，优选地以无机过氧化氢合物盐的重 量计在从2％至10％(通常从3％至5％)的SiO2的水平应用。硅酸镁也可以包括在该涂层中。 包括硅酸盐和硼酸盐类或硼酸或其他无机物的涂层也是合适的。 [0219] 其他涂层，该涂层包括蜡、油、脂肪皂类还可以有利地使用在本发明中。 [0220] 过氧化单硫酸钾盐是另一种在本文中具有实用性的无机过氧化氢合物盐。典型的有机漂白剂是有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧十二烷二酸酸、二 过氧十四烷二酸酸、以及二过氧十六烷二酸酸。过氧化二苯甲酰是本文优选的有机过氧酸。 单-和二过壬酸、单-和二硬脂酸、以及N-邻苯二甲酰氨基过氧己酸是也适用于本文。该二酰 基过氧化物，尤其是二苯酰基过氧化物，应优选地以颗粒的形式存在，这些颗粒具有的重均 直径为从约0.1至约100微米，优选地从约0.5至约30微米，更优选地从约1至约10微米。优选 地，至少约25％，更优选地至少约50％，甚至更优选至少约75％，最优选至少约90％的颗粒 是小于10微米，优选地小于6微米。已经发现，与更大的二酰基过氧化物颗粒相比，在上述粒度范围内的二酰基过氧化物提供更好的污渍去除，尤其是从塑料餐具上，同时在自动餐具 洗涤器中使用期间最小化不想要的沉积和成膜。该优选的二酰基过氧化物粒度，因此允许 该配制者能够以一种低水平的二酰基过氧化物获得良好的污渍去除，这降低了沉积和成 膜。相反，如二酰基过氧化物粒度增加时，需要更多二酰基过氧化物达到良好的去污，这增 加了在餐具洗涤过程中遇到的在表面上的沉积。 [0221] 另外的典型的有机漂白剂包括过氧酸，具体实例是烷基过氧酸类和芳基过氧酸类。优选的代表是(a)过氧苯甲酸及其环-取代的衍生物，例如烷基过氧苯甲酸，但是还有过 氧基-[α]-萘甲酸以及单过邻苯二甲酸镁，(b)该脂肪族的或取代脂族过氧酸，例如过氧月 桂酸、过氧硬脂酸、[ε]-邻苯二甲酰亚胺基过氧己酸[酞酸亚氨基过氧己酸(PAP)]、邻-羧基苯甲酰胺过氧己酸、N-非烯基酰基过天敌酸和N-壬烯基酰氨基琥珀酸盐，和(c)脂族和芳脂 族过氧化二羧酸，例如1,12-二过氧羧酸、1,9-二过氧壬二酸、二过氧癸二酸、二过氧木酸、二过氧邻苯二甲酸类、2-癸基-l,4-二酸、N,N-对苯二甲酰基二(6-氨基过丙酸)。 [0222] 在一个实施例中，该组合物进一步包括漂白活化剂、漂白催化剂、硅酸盐和/或一种或多种金属护理剂。 [0223] 如在此使用的术语“漂白活化剂”，是指典型有机过酸前体，该前体在60℃及60℃以下的温度下增强了清洁过程中的漂白作用。适用于本文的漂白活化剂包括如下化合物， 这些化合物在过水解的条件下给出脂肪族过氧羧酸，这些过氧羧酸具有优选地从1至10个 碳原子，特别是从2至4个碳原子，和/或任选地被取代的过苯甲酸。合适的物质带有指定的 碳原子数目的O-酰基和/或N-酰基基团，和/或任选地被取代的苯甲酰基基团。给予优选的 是聚酰化的亚烷基二胺类(特别是四乙酰乙二胺(TAED))、酰化三嗪衍生物(特别是l,5-二 乙酰基-2,4-二氧六氢-l,3,5-三嗪(DADHT))、酰化甘脲(特别是酰基甘脲(TAGU))、N-酰基 亚胺类(特别是N-壬酰琥珀酰亚胺(NOSI)、酰化苯酚磺酸盐(特别是正-壬-或异壬酰氧基苯 磺酸盐(正或异-NOBS)、羧酸酐类(特别是邻苯二甲酸酐)、酰化的多元醇类(特别是三醋精、 乙二醇二乙酸酯和2,5-二乙酰氧基-2,5-二氢呋喃以及还有柠檬酸三乙酯(TEAC))。如果包 括在本发明的组合物中，漂白活化剂是处于从约0.1％至约10％的水平，优选地按该组合物 的重量计从大约0.5％至大约2％。 [0224] 如在此使用的术语“漂白催化剂”是指锰-三氮杂环壬烷和相关络合物(US-A-4246612，US-A-5227084)；Co、Cu、Mn和Fe二吡啶基胺和相关络合物(US-A-5114611)；以及五胺乙酸钴(III)和相关络合物(US-A-4810410)。适用于本文的漂白催化剂的完整描述可见 于WO 99/06521，34页第26行到40页第16行。如果包括在本发明的组合物中，漂白催化剂是 处于从约0.1％至约10％的水平，优选地按该组合物的重量计从大约0.5％至大约2％。 [0225] 根据本发明所述，氧化还原酶，例如氧化酶、加氧酶、过氧化氢酶、过氧化物酶(例如卤素-、氯-、溴-、木质素、葡萄糖、或锰过氧化物酶)、双加氧酶，或漆酶(酚氧化酶、多酚氧化酶)，也可以用来加强其漂白效果。有利地，另外地添加与酶相互作用的、优选地有机的、特别优选地芳香族化合物，以增强相关的氧化还原酶的活性(增强子)或，如果在这些氧化 酶和污渍之间在氧化还原电位上存在很大差异，以保证电子流动(介体)。 [0226] 如在此使用的术语“硅酸盐”，是指硅酸钠类，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶层状硅酸盐。如果存在，硅酸盐处于从约1％至约20％的水平，优选地按该组合物的重量计从大约5％至大约15％。 [0228] (a)苯并三唑类，包括苯并三唑或双-苯并三唑及其取代衍生物。苯并三唑衍生物是其中芳环上可获得的取代位点被部分或完全取代的那些化合物。适合的取代基包括线性 或支链Ci-C20-烷基基团和羟基、硫、苯基或卤素(如氟、氯、溴和碘)的取代基。 [0229] (b)选自下组的金属盐和络合物，该组由以下各项组成：锌、锰、钛、锆、铪、钒、钴，镓和铯盐和/或络合物，这些金属处于氧化态II、III、IV、V或VI之一。在一方面，适合的金属盐和/或金属络合物可以选自下组，该组由以下各项组成：Mn(II)硫酸盐、Mn(II)柠檬酸盐、Mn(II)硬脂酸盐、Mn(II)乙酰丙酮化物、K^TiF6、K^ZrF6、CoSO4、Co(NOs)2和Ce(NOs)3、锌盐，例如，硫酸锌、水锌矿或乙酸锌；(c)硅酸盐，包括硅酸钠或硅酸钾、二硅酸钠、偏硅酸钠、结晶层状硅酸盐及其混合物。 [0230] WO 94/26860和WO 94/26859中披露了用作银/铜腐蚀抑制剂的另外适合的有机和无机氧化还原活性物质。优选地，本发明的组合物按重量计包括从0.1％至5％的金属护理 剂的组合物，优选地该金属护理剂是锌盐。 [0231] 在一个实施例中，该组合物进一步包含表面活性剂。 [0232] 如在此使用的术语“表面活性剂”，具体地是指餐具洗涤组分，该组分是非离子型化合物。适合的非离子表面活性剂包括但不限于低泡非离子(LFNI)表面活性剂。因为它们 向自动餐具洗涤组合物赋予的改进的水膜作用(尤其来自玻璃器皿)，LFNI表面活性剂最典 型地用于自动餐具洗涤组合物中。它们还可以涵盖非硅、磷酸盐或非磷酸盐聚合材料，这些 材料已知使在自动餐具洗涤中遇到的食物污垢消泡。该LFNI表面活性剂可以具有相对低的 浊点和高亲水亲油平衡(HLB)。针对整个全系列水温中的起泡的最优控制，水中1％溶液的 浊点典型地低于约32℃，并且可替代地更低，例如，0℃。如果需要的话，可以使用具有以上特性的可生物降解的LFNI表面活性剂。 [0233] LFNI表面活性剂可以包括但不限于：烷氧基化的表面活性剂，尤其是由伯醇衍生的乙氧基化物，及其与更复杂的表面活性剂(如聚氧丙烯/聚氧乙烯/聚氧丙烯反向嵌段聚 合物)的共混物。符合要求的适合的嵌段聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合化合物可以包括基于以下 的那些：乙二醇、丙二醇、甘油、三羟甲基丙烷和乙二胺、及其混合物。由引发剂化合物与单反应性氢原子(如C 12-)的顺序乙氧基化和丙氧基化制成的聚合化合物是脂肪醇，一般不 在自动餐具洗涤组合物中提供令人满意的泡沫控制。然而，某些由BASF-Wyandotte公司，怀 恩多特，密歇根州命名为PLURONIC(R)和TETRONIC(R)的嵌段聚合表面活性剂化合物适用于 自动餐具洗涤组合物。该LFNI表面活性剂任选地可以按重量计包括高达约15％的量的氧化 丙烯。可以通过美国专利号4,223,163中所描述的工艺制备其他LFNI表面活性剂。该LFNI表 面活性剂还可以源自直链脂肪醇，该直链脂肪醇包含从约16至约20碳原子(C16-C20醇)，可 替代地Ci8醇，在从约6至约15摩尔，或从约7至约12摩尔，和可替代地从约7至约9摩尔的氧 化乙烯/摩尔醇的平均值下缩合。相对于平均值，这样衍生的乙氧基化的非离子表面活性剂 可以具有窄的乙氧基化物分布。 [0234] 在某些实施例中，具有低于30℃浊点的LFNI表面活性剂按重量计可以以从约0.01％至约60％、或从约0.5％至约10％的量存在，并且可替代地，以按重量计从约1％至约 5％的组合物的量存在。 [0235] 在优选的实施例中，该表面活性剂是具有以下相转变温度的非离子表面活性剂或非离子表面活性剂系统，如在蒸馏水中的1％浓度下测量的，在40℃和70℃之间，优选地在 45℃和65℃之间。“非离子表面活性剂系统”本文中意指两种或更多种非离子表面活性剂的 混合物。本文中优选使用的是非离子表面活性剂系统。比单非离子表面活性剂，它们在产品 中似乎具有改进的清洁和整理性质和稳定性。适合的非离子表面活性剂包括：i)通过如下 制备的乙氧基非离子表面活性剂：单羟基化的烷醇或烷基酚与6至20个碳原子反应，其中优 选地至少12摩尔，具体优选地至少16摩尔，并且还更优选至少20摩尔氧化乙烯/摩尔醇或烷 基酚；ii)具有从6至20个碳原子和至少一个乙氧基和丙氧基基团的醇烷氧基化的表面活性 剂。本文中使用优选的是表面活性剂i)和ii)的混合物。 [0236] 另一个适合的非离子表面活性剂是由以下化学式代表的环氧封端的聚(烷氧基化)醇： [0237] R1O[CH2CH(CH3)O]x[CH2CH2O]y[CH2CH(OH)R2] (I) [0238] 其中R1是具有从4至18个碳原子的直链的或支链的脂肪烃基团；R2是具有从2至26个碳原子的直链的或支链的脂肪烃基团；x是具有从0.5至1.5，更优选地约1的平均值的整 数；并且y是具有至少15，更优选地至少20的值的整数。 [0239] 优选地，具有化学式I的表面活性剂在末端环氧单元[CH2CH(OH)R2]中具有至少约10个碳原子。具有化学式I的适合的表面活性剂是Olin公司的POLY-TERGENT(R)SLF-18B非 离子表面活性剂，例如，如由Olin公司1994年10月13日公开的WO 94/22800中所描述的。 [0240] 优选地本文中的非离子表面活性剂和/或系统具有少于360秒的德拉夫斯润湿时间，优选地少于200秒，更优选地少于100秒并且尤其是少于60秒，如通过德拉夫斯润湿方法 所测量的(使用以下条件的标准方法ISO 8022：在25℃的温度下，3-g钩、5-g棉绞纱、按重量计0.1％水溶液)。氧化胺表面活性剂在本发明中作为抗再沉淀表面活性剂也是有用的，这 些抗再沉淀表面活性剂包括具有以下化学式的直链的和支链的化合物： [0241] [0242] 其中R3选自以下各项：烷基、羟烷基、酰氨基丙基和烷基苯基基团、或其混合物，其包含从8至26个碳原子，优选地8至18个碳原子；R4为包含从2至3个碳原子(优选地2个碳原子)的亚烷基或羟基亚烷基基团，或其混合物；X是从0至5，优选地从0至3；并且每个R5为包 含从1至3个碳原子(优选地1至2个碳原子)的烷基或羟基烷基基团，或包含从1至3个(优选 地1个)环氧乙烷基基团的一个聚氧化乙烯基团。这些R5基团可以彼此附接，例如通过氧原 子或氮原子，以形成环状结构。 [0243] 这些氧化胺表面活性剂具体包括C10-C18烷基二甲基氧化胺和C8-C18烷氧基乙基二羟基乙基氧化胺。此类材料的实例包括二甲基辛胺氧化物、二乙基癸胺氧化物、双-(2-羟乙 胺)十二烷胺氧化物、二甲基癸胺氧化物、二丙基十四烷胺氧化物、甲基乙基十六烷胺氧化 物、十二烷基酰胺丙基二甲胺氧化物、十六烷基二甲胺氧化物、十八烷基二甲胺氧化物、牛 脂二甲胺氧化物和二甲基-2-羟基十八烷胺氧化物。优选的是C10-C18烷基二甲胺氧化物、和 C10-C18酰胺烷基二甲胺氧化物。表面活性剂并且尤其是非离子型表面活性剂按重量计可以 按从0至10％，优选地从0.1％至10％，并且最优选地从0.25％至6％的量存在。 [0244] 在一个实施例中，该组合物进一步包含磺化的聚合物。 [0245] 如在此使用的术语“磺化的聚合物”，是指包含磺酸或磺酸酯官能团的聚合物。 [0246] 按组合物的重量计，将该聚合物(如果使用的话)以从约0.1％至约20％，优选地从1％至约15％，更优选地从2％至10％的任何适合的量来使用。磺化/羧化的聚合物特别适用 于本发明小袋中所包含的组合物中。 [0247] 本文描述的适合的磺化/羧化的聚合物可以具有如下的重量平均分子量：小于或等于约100,000Da、或小于或等于约75,000Da、或小于或等于约50,000Da、或从约3,000Da至 约50,000，优选地从约5,000Da至约45,000Da。 [0249] [0250] 其中R1至R4独立地是氢、甲基、羧酸基团或CH2COOH，并且其中可以将该羧酸基团进行中和；(b)任选地，源自具有通式(II)的至少一种非离子单体的一种或多种结构单元： [0251] [0252] 其中R5i是氢、C1至C6烷基、或C1至C6羟烷基，并且X是芳香族的(其中当X是芳香族的时，R5是氢或甲基)抑或者X具有通式(III)： [0253] [0254] 其中R6是(独立于R5)氢、C1至C6烷基、或C1至C6羟烷基，并且Y是O或N；和源自具有通式(IV)的至少一种磺酸单体的至少一种结构单元： [0255] [0256] 其中R7是包括至少一个sp2键的基团，A是O、N、P、S或酰胺或酯键，B是单或多环芳基基团或脂肪烃基团，每个t独立地是0或1，并且M+是阳离子。在一方面，R7是C2至C6烯烃。在另一方面，R7是乙烯、丁烯或丙烯。 [0257] 优选的羧酸单体包括以下各项中的一种或多种：丙烯酸、马来酸、衣康酸、异丁烯酸、或丙烯酸的乙氧基化物酯，更优选的是丙烯酸和甲基丙烯酸。优选的磺化的单体包括以 下各项中的一种或多种：(甲基)烯丙基磺酸钠、磺酸乙烯酯、苯基(甲基)烯丙基酯磺酸钠、 或2-丙烯酰胺-甲基丙磺酸。优选的非离子单体包括以下中的一种或多种：(甲基)丙烯酸甲 酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯、甲基(甲基)丙烯酰胺、乙基(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸叔丁酯、苯乙烯、或[α]-甲基苯乙烯。 [0258] 优选地，该聚合物包括以下水平的单体：按重量计从约40％至约90％，优选地从约60％至约90％的一种或多种羧酸单体的聚合物；按重量计从约5％至约50％，优选地从约 10％至约40％的一种或多种磺酸单体的聚合物；和按重量计任选地从约1％至约30％，优选 地从约2％至约20％的一种或多种非离子单体的聚合物。特别优选的聚合物包括按重量计 约70％至约80％的至少一种羧酸单体的聚合物和按重量计从约20％至约30％的至少一种 磺酸单体的聚合物。 [0259] 该羧酸优选地是(甲基)丙烯酸。该磺酸单体优选地是以下各项之一：2-丙烯酰胺甲基-1-丙磺酸、2-甲基丙烯酰基氨基-2-甲基-1-丙磺酸、3-甲基丙烯酰基氨基-2-羟基丙 磺酸、芳基磺酸、甲芳基磺酸、烯丙氧基苯磺酸、甲烯丙氧基苯磺酸、2-羟基-3-(2-丙烯基氧基)丙磺酸、2-甲基-2-丙烯-l-磺酸、苯乙烯磺酸、乙烯磺酸、丙烯酸3-磺丙酯、甲基丙烯酸 3-磺丙酯、丙烯酸磺甲酯、甲基丙烯酸磺甲酯、及其水溶性盐。该不饱和磺酸单体最优选地 是2-丙烯酰氨基-2-丙磺酸(AMPS)。 [0260] 优选的可商购的聚合物包括：由阿尔科化学公司(Alco Chemical)提供的Alcosperse 240、Aquatreat AR 540和Aquatreat MPS；由Rohm&Haas公司提供的Acumer 3100、Acumer 2000、Acusol 587G和Acusol 588G；由BF Goodrich公司提供的Goodrich K- 798、K-775和K-797；和由ISP技术公司提供的ACP 1042。特别优选的聚合物是由Rohm&Haas 公司提供的Acusol 587G和Acusol 588G。 [0262] 在一个实施例中，该组合物进一步包含助水溶剂。 [0263] 如在此使用的术语“助水溶剂”是指如下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水 的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于 自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)的综述，胶体&界面科学新见 (Current Opinion in Colloid&Interface Science)，12：121-128。助水溶剂并不显示一 个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶 束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多助水溶物显示连续类型的聚集过程，其中 聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包括极性和非极性特征的 物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。 经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物 中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程 中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。 [0264] 洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如按重量计0-5％，例如约0.5至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。 助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺 酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。 [0265] 具体地说，根据本发明所述的组合物进一步包括螯合剂。 [0266] 如在此使用的术语“螯合剂”，是指如下化学品，这些化学品与某些金属离子形成分子，钝化这些离子，从而使得它们不能与其他元件反应。因此，螯合剂可以被定义为结合 剂，该结合剂通过形成螯合物抑制化学活性。螯合是在配体与单一中心原子之间形成或存 在的两种或更多种单独的结合。配体可以是任何有机化合物、硅酸盐或磷酸盐。在本文上下 文中，术语“螯合剂(chelating agent)”包括螯合剂(chelant)、螯合剂(chelating agent)、螯合剂(chelating agent)、络合剂(complexing agent)、或可与如钙和镁等金属 离子形成水溶性复合物的螯合剂(sequestering agent)。螯合物效应描述了与相似的非螯 合配体对于金属离子的相比，螯合配体对于相同的金属离子的增强的亲和力。螯合剂具有 与金属离子特别是钙(Ca2+)离子的结合能力，并广泛应用于洗涤剂，和一般用于洗涤如洗 衣或洗碟的组合物。然而，螯合剂自身呈现出抑制酶活性。在本申请中，术语螯合剂 (chelating agent)与“络合剂(complexing agent)”或“螯合剂(chelating agent)”或“螯合剂(chelant)”互换使用。 [0267] 由于大多数α-淀粉酶具有钙敏感性，螯合剂的存在可影响酶活性。α-淀粉酶的钙敏感性可通过将给定α-淀粉酶在强螯合剂的存在下孵育，并分析该孵育对所述α-淀粉酶的 活性的影响来确定。钙敏感性α-淀粉酶会在孵育过程中丧失其活性的主要部分或全部。该 螯合剂可以按一个量值存在于该组合物中，该量值为从0.0001wt％至20wt％、优选地从 0.01wt％至10wt％、更优选地从0.1wt％至5wt％。 [0268] 螯合剂的非限制性实例是EDTA、DTMPA、HEDP、EDDS、和柠檬酸盐。因此，在一个实施例中，该组合物包括根据本发明所述的变体和如下螯合剂，如EDTA、DT、HEDP、EDDS、或柠檬酸盐。 [0269] 如在此使用的术语“EDTA”，是指乙二胺-四-乙酸，其落在“强螯合剂”的定义下。 [0271] 如在此使用的术语“HEDP”，是指羟基-乙烷二膦酸，其落在“强螯合剂”的定义下。 [0272] 如在此使用的术语“EDDS”，是指氨基聚羧酸，其落在“强螯合剂”的定义下。 [0273] 该螯合作用(chelate effect或chelating effect)描述螯合配体对金属离子的亲和力相对于类似的一组非螯合配体对相同金属的亲和力的增强。然而，该螯合作用的强 度可通过多种类型的测定或测量方法决定，由此根据其螯合作用(或强度)对螯合剂进行区 分和排位。 [0274] 在一个测定中，螯合剂可以通过它们在pH 8.0下将游离钙离子(Ca2+)的浓度从2.0mM降低至0.10mM或更少的能力来表征，例如通过使用基于由M.K.纳卡拉占(Nagarajan) 等人，JAOCS，第61卷，第9期(1984年9月)，第1475-1478页描述的方法的测试。 [0275] 供参考，一种螯合剂与以该螯合剂相等浓度的EDTA在pH下具有将游离钙离子(Ca2+)浓度从2.0mM降低至0.10mM相同能力，则该螯合剂被称为强螯合剂。 [0276] 本发明的组合物可以处于任何合宜的形式，例如，棒，均质片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个隔室的小袋，常规或压型粉末，颗粒，糊剂，凝胶，或常规、压型或浓缩液体。存在多种洗涤剂配制品形式，例如层(相同或不同相)、袋以及用于机械给料装 置的形式。 [0277] 可以将小袋配置为单一隔室或多隔室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积 的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为具有袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料， 优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚 物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选的是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选 地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少大约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000 至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚 合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州盖里 (Gary，Ind.，US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.)销售)加增塑 剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上 可以与包含固体的室不同。参考：(US 2009/0011970A1)。 [0278] 可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的储存相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可 以引起选择的组分的延迟溶解。 [0279] 非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％ 的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30％的有机溶剂。液 体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。 [0280] 另一种组合物形式是呈以下形式：皂条，例如衣物皂条，并且可以用于手动洗涤衣物、织物和/或纺织品。如在此使用的术语“皂条”是指包括衣物条、皂条、组合条(combo bar)、合成条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术 语洗涤皂条包括包含来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗涤皂条具有在室温下为固体 而非液体、凝胶或粉末的物理形式。如在此使用的术语“固体”是指不随时间显著变化的物 理形式，即如果固体物体(如衣物肥皂棒)被放置在容器里，该固体物体不会为了填充其被 放置的容器而发生改变。该棒是固体时典型地是棒的形式但也可能是其他的固体形状例如 圆形或椭圆。 [0281] 该皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污垢释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。 [0282] 该皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包 装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备皂条。可以在工艺的不同阶段向肥皂中添加 本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、酶、任选地一个或多个另外的酶、蛋白酶抑制 剂、和一价阳离子和有机阴离子的盐的该预混料并且然后将该混合物出条。该酶和任选的 另外的酶可以作为酶抑制剂(例如蛋白酶抑制剂)例如以固体的形式同时添加。除了混合步 骤和出条步骤，该过程可以进一步包含以下步骤：研磨、挤出、切割、冲压、冷却和/或封装。 [0283] 在一个实施例中，该组合物包含助洗剂和/或共助洗剂。 [0284] 如在此使用的术语“助洗剂”，是指特定类型的螯合剂。相应地，该组合物可以包含按重量计大约0-65％，如大约5％至大约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂，或其混合物。在餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％、特别地50％-65％。助洗剂和/或共助洗 剂可以特别地是与Ca和Mg形成水溶性络合物的络合剂。可以利用本领域中已知的用于在 ADW洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸 盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例 如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1- 醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为2,2’-亚氨基二乙-1-醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氮基三乙-1-醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。 [0285] 该洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-50％，例如约5％至约30％的洗涤剂共助洗剂。洗涤剂组合物可以包含单独或与助洗剂组合的共助洗剂，例如沸石助洗剂。共助洗剂 的非限制性实例包括聚丙烯酸酯均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/ 马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多 羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸 (NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙 烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸) (DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨 酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲 基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨 酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛 磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N, N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。 [0286] 在一个实施例中，该组合物包括聚合物。该组合物可以包含按重量计0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗 涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供 抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物 包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚 (环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰CMC(HM-CMC)和硅 酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙 二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或 PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸 酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露 于例如WO 2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。 [0287] 根据本发明所述的这些组合物可以包括本发明的变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。在另一个实施例中，该组合物包括至少一种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、纤维素、果胶酸裂合酶、和/或甘露聚糖酶。因此，这些组合物可以包含多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。 [0288] 在具体的实施例中，该组合物进一步包括一种或多种选自下组的另外的酶，该组由以下各项组成： [0289] (i)与SEQ ID NO：5中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括修饰的α-淀粉酶：202； [0290] (ii)与SEQ ID NO：6中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：9、118、149、182、186、195、202、257、295、299、320、323、339、345和458； [0291] (iii)与SEQ ID NO：9中的α-淀粉酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的α-淀粉酶：405、421、422和428； [0292] (iv)α-淀粉酶，其包含SEQ ID NO：7、10、11、和12中阐述的任何一个氨基酸序列；和/或 [0293] (v)与SEQ ID NO：8中的蛋白酶相比，在以下位置处包括一个或多个修饰的蛋白酶：32、33、48-54、58-62、94-107、116、123-133、150、152-156、158-161、164、169、175-186、 197、198、203-216。 [0295] 在一个实施例中，与SEQ ID NO：5中的α-淀粉酶相比，该组合物包括α-淀粉酶变体(该α-淀粉酶变体包括下列修饰或由其组成：G182*+D183*+M202L，其中编号根据SEQ ID NO：3)和α-淀粉酶(该α-淀粉酶在下列位置包含修饰：202)或由它们组成。 [0296] 在一个实施例中，与SEQ ID NO：5中的α-淀粉酶相比，该组合物包括α-淀粉酶变体(该α-淀粉酶变体包括下列修饰或由其组成：G182*+D183*+N195F+M202L，其中编号根据SEQ ID NO：3)和α-淀粉酶(该α-淀粉酶在下列位置包含修饰：202)或由它们组成。 [0297] 在一个实施例中，与SEQ ID NO：6中的α-淀粉酶相比，该组合物包括α-淀粉酶变体(该α-淀粉酶变体包括下列修饰或由其组成：G182*+D183*+M202L，其中编号根据SEQ ID NO：3)和α-淀粉酶(该α-淀粉酶在下列位置包含一个或多个修饰：9、118、149、182、186、195、 202、257、295、299、320、323、339、345、和458)或由它们组成。 [0298] 在一个实施例中，与SEQ ID NO：6中的α-淀粉酶相比，该组合物包括α-淀粉酶变体(该α-淀粉酶变体包括下列修饰或由其组成：G182*+D183*+N195F+M202L，其中编号根据SEQ ID NO：3)和α-淀粉酶(该α-淀粉酶在下列位置包含一个或多个修饰：9、118、149、182、186、195、202、257、295、299、320、323、339、345、和458)或由它们组成。 [0299] 在一个实施例中，与SEQ ID NO：9中的α-淀粉酶相比，该组合物包括α-淀粉酶变体(该α-淀粉酶变体包括下列修饰或由其组成：G182*+D183*+M202L，其中编号根据SEQ ID NO：3)和α-淀粉酶(该α-淀粉酶在下列位置包含一个或多个修饰：405、421、422、和428)或由它们组成。 [0300] 在一个实施例中，与SEQ ID NO：9中的α-淀粉酶相比，该组合物包括α-淀粉酶变体(该α-淀粉酶变体包括下列修饰或由其组成：G182*+D183*+N195F+M202L，其中编号根据SEQ ID NO：3)和α-淀粉酶(该α-淀粉酶在下列位置包含一个或多个修饰：405、421、422、和428)或由它们组成。 [0301] 在一个实施例中，与SEQ ID NO：5中的α-淀粉酶相比，该组合物包括α-淀粉酶变体(该α-淀粉酶变体包括下列修饰或由其组成：G182*+D183*+M202L，其中编号根据SEQ ID NO：3)和α-淀粉酶(该α-淀粉酶包含SEQ ID NO：7、10、11、和12中阐述的任何一个氨基酸序列)或由它们组成。 [0302] 在一个实施例中，与SEQ ID NO：5中的α-淀粉酶相比，该组合物包括α-淀粉酶变体(该α-淀粉酶变体包括下列修饰或由其组成：G182*+D183*+N195F+M202L，其中编号根据SEQ ID NO：3)和α-淀粉酶(该α-淀粉酶包含SEQ ID NO：7、10、11、和12中阐述的任何一个氨基酸序列)或由它们组成。 [0303] 在一个实施例中，与SEQ ID NO：8中的α-淀粉酶相比，该组合物包括α-淀粉酶变体(该α-淀粉酶变体包括下列修饰或由其组成：G182*+D183*+M202L，其中编号根据SEQ ID NO：3)和蛋白酶(该蛋白酶在下列位置包含一个或多个修饰：32、33、48-54、58-62、94-107、 116、123-133、150、152-156、158-161、164、169、175-186、197、198、203-216)或由它们组成。 [0304] 在一个实施例中，与SEQ ID NO：8中的α-淀粉酶相比，该组合物包括α-淀粉酶变体(该α-淀粉酶变体包括下列修饰或由其组成：G182*+D183*+N195F+M202L，其中编号根据SEQ ID NO：3)和蛋白酶(该蛋白酶在下列位置包含一个或多个修饰：32、33、48-54、58-62、94-107、116、123-133、150、152-156、158-161、164、169、175-186、197、198、203-216)或由它们组成。 [0305] 适合的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5, 776,757以及WO 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素 酶。 [0306] 尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457, 046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中描 述的那些。 [0307] 表现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的纤维素酶(EC 3.2.1.4)的实例是已经描述于WO 02/099091中的那些。 [0308] 纤维素酶的其他实例包括描述于WO 96/29397中的家族45纤维素酶，并且特别是在对应于WO 02/099091的SEQ ID NO：8中的以下位置的一个或多个位置处具有取代、插入 和/或缺失的其变体：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、 42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、 93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、 140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、 160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、 186、188、191、192、195、196、200、和/或20，优选选自P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R。 [0309] 可商购的纤维素酶包括Celluzyme、和Carezyme(诺维信公司(Novozymes A/S))、Clazinase、和Puradax HA(杰能科国际有限公司(Genencor International Inc.))、以及 KAC-500(B)(花王株式会社(Kao Corporation))。 [0310] 适合的脂肪酶和角质酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变酶。实例包括如在EP 258 068和EP 305 216中所述的来自嗜热丝孢菌属 (Thermomyces)(例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(以前命名为柔毛腐质霉 (Humicola lanuginosa))的脂肪酶、来自腐质霉(例如特异腐质霉(H.insolens)(WO 96/ 13580))的角质酶、来自假单胞菌属(Pseudomonas)(这些假单胞菌属中的一些现在重命名 为伯克氏菌属)的脂肪酶(例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌 (P.pseudoalcaligene)(EP 218272))、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、菌株SD 705(WO 95/06720&WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)、 GDSL型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)、来自稻瘟病菌(WO 10/107560)的角质酶、来自门 多萨假多胞菌(US 5,389,536)的角质酶、来自嗜热裂孢菌(WO 11/084412)的脂肪酶、嗜热 脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO 11/084417)、来自枯草芽孢杆菌(WO 11/084599)的脂肪酶、以 及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)的脂肪酶和始旋链霉菌(WO 12/137147)。 [0311] 另外的实例是有时被称为酰基转移酶或过水解酶(perhydrolase)的脂肪酶，例如与南极假丝酵母脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌的 酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)、以及耻垢分枝杆菌 过水解酶的变体，特别是用于在来自亨斯迈纺织染化私人有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业化产品Gentle Power Bleach(柔和漂白剂)中使用的S54V变体 (WO 10/100028)。 [0312] 其他实例是脂肪酶变体，例如在EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/ 04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508和WO 09/ 109500中所描述的那些。 [0313] 优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯 公司(Gist-Brocades))。 [0314] 适合的过氧物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过 氧化物酶，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。 [0315] 可商购的过氧化物酶包括Guardzyme(诺维信公司)。 [0316] 可以通过添加包含一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而将洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合 的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等，优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。 [0317] 无尘颗粒例如可以如在US 4,106,991和4,661,452中所披露的那样产生并且可以任选地通过本领域已知的方法包衣。蜡质涂层材料的实例是平均摩尔重量1000至20000的 聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；其中 醇包含12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇； 脂肪酸；和脂肪酸甘油单酯和甘油二酯和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包 衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制品可以例如通过根据已确立的方法添加多元 醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的 方法来制备。 [0318] 这些组合物可以根据本领域已知的方法制备，并可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。 [0319] 还可以利用本领域中已知的用于在ADW洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼 酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独抑或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在ADW洗涤剂中使用的任 何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术内。 [0320] 本发明的组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉末洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两 个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂 科学系列，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker)。 [0321] 本发明的组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N- 乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当在受试组合物中存 在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从大约0.0001％至大约10％、从大约 0.01％至大约5％或甚至从大约0.1％至大约3％的水平存在。 [0322] 本发明的组合物还将优选地包含另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在 本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常 用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二 苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠 盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双- (2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N- 2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-1,2,3-三唑- 2-基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯 基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞 尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯 胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯 基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化 学(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合在本发明中使用的其他荧 光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。 [0323] 适当的荧光增白剂水平包括从大约0.01wt％，从0.05wt％，从大约0.1wt％或甚至从大约0.2wt％至上限水平0.5wt％或甚至0.75wt％的较低水平。 [0324] 用途 [0325] 本发明进一步涉及根据本发明所述的变体在清洁过程(例如衣物或硬表面清洁，包括自动餐具洗涤和工业清洁)中的用途。对于清洁而言重要的污物和污渍由许多不同物 质构成，并且已经开发全都具有不同底物特异性的一系列不同的酶用于在涉及衣物和硬表 面清洁(例如餐具洗涤)两者中使用。认为这些酶提供酶洗涤益处，因为与不具有酶的同一 过程相比，它们在其应用的清洁过程中特异性地改善污渍去除。本领域已知的去污酶包括 以下酶，例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶。 [0326] 在一个实施例中，本发明涉及本发明的变体在洗涤剂组合物中用于在清洁硬表面中使用(例如餐具洗涤)，或在洗衣中或用于去污的用途。在另一个实施例中，本发明涉及根 据本发明所述的变体在清洁过程(例如衣物或硬表面清洁，包括但不限于自动餐具洗涤和 工业清洁)中的用途。因此，在一个实施例中，本发明涉及如下变体的用途，该变体在一个或多个提供该变体的氧化稳定性的位置处包含取代。 [0327] 在具体的实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO：3中阐述的氨基酸序列的位置M202的位置中包含取代，并且在对应于阐述于SEQ ID NO：3中的氨基酸序列的位置R181、 G182、D183、和G184的两个、三个、或四个位置中包含取代和/或缺失。 [0328] 本发明的一个实施例中涉及根据本发明所述的组合物的用途，该组合物包含本发明所述的变体连同一种或多种表面活性剂以及任选地一种或多种选自以下清单的洗涤剂 组分的洗涤剂组合物，该清单包括助水溶剂、助洗剂和共助洗剂、漂白系统、聚合物、织物调色剂和辅料或其任何混合物。 [0329] 另外的实施例是根据本发明所述的组合物的用途，该组合物包含本发明所述的变体连同一种或多种表面活性剂，以及一种或多种选自下组的另外的酶的洗涤剂组合物，该 组包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶或其任何混合物。 [0330] 在另一个方面，本发明涉及洗衣方法，该方法可用于家用洗衣以及工业洗衣。此外，本发明涉及用于洗涤纺织品(例如织物、服装(garment)、衣服(cloth)等)的方法，其中 该方法包括用洗涤溶液处理该纺织品，该洗涤溶液包含洗涤剂组合物以及本发明的α-淀粉 酶。可以使用家用或工业洗衣机进行洗衣或可以使用一种洗涤剂组合物手动地进行洗衣， 该洗涤剂组合物包含本发明的葡糖淀粉酶。 [0331] 在另一个方面，本发明涉及餐具洗涤方法，该方法可用于家用餐具洗涤以及工业餐具洗涤。如在此使用的术语“餐具洗涤”，是指手动餐具洗涤和自动化餐具洗涤两者。此 外，本发明涉及用于洗涤硬表面(例如，用餐工具，如刀、叉、匙；陶器，如盘子、玻璃杯、碗；以及平底锅)的方法，其中该方法包括用洗涤溶液处理该硬表面，该洗涤溶液包含洗涤剂组合 物以及本发明的α-淀粉酶变体。可以例如使用家用或工业洗碗机洗涤硬表面或使用一种洗 涤剂组合物手动地洗涤硬表面，该洗涤剂组合物包含本发明的α-淀粉酶、任选地连同一种 或多种选自下组的另外的酶，该组包括：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶、甘露聚糖酶、或其任何混合物。 [0332] 在另外的方面，本发明涉及用于从表面去除污渍的方法，该方法包括使该表面与在洗涤剂组合物中和在洗涤剂应用中的包括本发明的α-淀粉酶连同一种或多种表面活性 剂以及任选地一种或多种选自以下清单的洗涤剂组分的组合物接触，该清单包括助水溶 剂、助洗剂和共助洗剂、漂白系统、聚合物、织物调色剂和辅料或其任何混合物。一个另外的方面是一种用于从表面去除污渍的方法，该方法包括使该表面与在洗涤剂组合物中和在洗 涤剂应用中包括本发明的α-淀粉酶变体连同一种或多种表面活性剂、一种或多种选自下组 的另外的酶的组合物接触，该组包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶、甘露聚糖酶或其任何混合物。 [0333] 通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。 实施例 [0334] 实例1-变体的产生 [0335] 使用具有阐述于SEQ ID NO：4中的氨基酸序列的亲本α-淀粉酶，构建本发明的变体。通过标准程序分离这些变体，简言之，通过定点诱变将对应于在SEQ ID NO：4(如果编号是根据SEQ ID NO：3，该氨基酸位置是M202)中阐述的氨基酸序列的位置M200的位置处的氨 基酸取代引入该基因，用突变的基因转化枯草芽孢杆菌宿主细胞，发酵这些转化的细胞(例 如如在WO 2004/111220的实例1中描述的)，并纯化来自该发酵液的这些变体。具有SEQ ID NO：3或4中阐述的参照淀粉酶，即该亲本α-淀粉酶，分别以相似的方式重组地产生于枯草芽孢杆菌中。 [0336] 实例2-淀粉分解活性(α-淀粉酶活性)的确定 [0337] 通过pNP-G7测定，测试如在实例1中描述的那样产生的变体的α-淀粉酶活性。 [0338] 通过采用pNP-G7底物(PNP-G7是4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-,D-麦芽庚糖苷的缩写，为一种可以由内切淀粉酶如α-淀粉酶裂解的嵌段寡糖)来确定α-淀粉酶活性。 [0339] 将抗体稀释于磷酸盐缓冲的盐水(PBS)(0.010M磷酸盐缓冲液pH 7.4，0.0027M KCl，0.14M NaCl)缓冲液至10μg/ml的浓度。通过添加100μl稀释的抗体(10μg/ml)至每个 孔，使maxisorp微量滴定板被抗体涂覆并在室温(RT)下孵育1h和在800rpm混合。在孵育之 后，用3x 200μl磷酸盐缓冲盐水和0.05％吐温(PBST)(0.010M磷酸盐缓冲液pH 7.4， 0.0027M KCl，0.14M NaCl，0.05％吐温20)缓冲液，将微量滴定板进行洗涤(使用Bio-Tek ELx405 ELISA洗涤机)。 [0340] 将具有α-淀粉酶变体培养液的微量滴定板进行旋转离心并将上清液转移到新的微量滴定板中，并在PBST缓冲液中稀释4x。将100μl稀释的上清液转移至抗体涂覆的 maxisorp微量微量滴定板中并且在RT下孵育1h以及在800rpm下混合。在孵育后，将微量滴 定板在PBST缓冲液(3x200μl，ELISA洗涤机)中洗涤。 [0341] 在pNP-G7底物的裂解之后，将在使用的试剂盒中所包括的α-葡萄糖苷酶进行消化并且经水解的底物释放出游离pNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度 法在Abs＝405nm(400-420nm)下测量。包含pNP-G7底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏/日立 公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。将100μl pNP-G7底物添加到所有孔中，并在 405nm处测量吸光度之前混合1分钟。确定斜率(每分钟的吸光度)并仅使用曲线的线性范 围。 [0342] 将结果与对照样品相比较并且具有同等或更高活性的样品被认为具有被维持的α-淀粉酶活性。如实例3中所述，进一步评估这些变体的氧化稳定性。 [0343] 也可以通过其他活性测定来确定该特异性α-淀粉酶活性，如amylazyme活性测定、Phadebas活性测定、或如下所述的降低糖活性测定。 [0344] Amylazyme活性测定(来自麦格酶公司(Megazyme)，爱尔兰(Ireland))：Amylazyme片剂包括互联直链淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将一种蓝色染料 共价结合至这些微球。微球中的互联直链淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降 解。当α-淀粉酶降解了直链淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可 通过在650nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。 [0345] 将有待分析的淀粉酶样品稀释于具有所需pH的活性缓冲液中。将一个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴 定板(MTP)。将30μl稀释淀粉酶样品添加至150μl底物并且混合。在37℃下孵育15分钟。通过添加30μl 1M NaOH并且混合来停止反应。在4000xg下离心MTP 5分钟。将100μl转移至新MTP并且测量620nm下的吸光度。 [0346] 淀粉酶样品应稀释成使得650nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。 [0347] Phadebas活性测定(例如来自麦戈尔生命科学(Magle Life Sciences)，隆德(Lund)，瑞典(Sweden))：Phadebas片剂包括互联淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球 状微球形式。将一种蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联淀粉聚合物以与α-淀粉 酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了直链淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶 于水的并且染料浓度可通过在650nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉 酶活性成比例。 [0348] 将有待分析的淀粉酶样品稀释于具有所需pH的活性缓冲液中。将一个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并且在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴 定板(MTP)。将30μl稀释淀粉酶样品添加至150μl底物并且混合。在37℃下孵育15分钟。通过添加30μl 1M NaOH并且混合来停止反应。在4000xg下离心MTP 5分钟。将100μl转移至新MTP并且测量620nm下的吸光度。 [0349] 淀粉酶样品应稀释成使得650nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。 [0350] 还原糖活性测定：通过与p-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)反应来确定用α-淀粉酶水解淀粉中的α-1,4-糖苷键所形成的多个还原端。与PHBAH反应之后，可通过405nm下的吸光度 来测量还原端的数量并且还原端的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。 [0351] 使玉米淀粉底物(3mg/mL)在milliQ水中蒸煮5分钟来溶解并且在测定之前冷却。关于终止液，制备一种Ka-Na-酒石酸盐/NaOH溶液(K-Na-酒石酸盐(默克(Merck)8087)50g/ l，NaOH 20g/l)并且通过将p-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH，西格玛(Sigma)H9882)添加至Ka-Na- 酒石酸盐/NaOH溶液至15mg/mL来新鲜制备终止液。 [0352] 在PCR-MTP中，将50μl活性缓冲液与50μl底物混合。添加50μl稀释酶并且混合。在PCR机器中在所需温度孵育5分钟。通过添加75μl终止液(Ka-Na-酒石酸盐/NaOH/PHBAH)来停止反应。在95℃在PCR机中孵育10分钟。将150μl转移至新MTP并且在405nm测量的吸光度。 [0353] 淀粉酶样品应稀释成使得405nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。 [0354] 实例3-通过AMSA验证的氧化稳定性 [0355] 为了评估如在实例1中描述的那样产生的变体的氧化稳定性，通过使用自动机械应力测定(AMSA)确定这些在如下洗涤剂组合物中的变体的洗涤性能，该洗涤剂组合物包含 氧化剂，例如漂白系统。具有氧化稳定性的变体将具有被维持的洗涤性能，并且甚至可能具 有改进的洗涤性能。 [0356] 测试本发明的这些变体的洗涤性能。通过使用AMSA测试，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子将待洗涤的纺织 品小块布样对所有缝开口强力挤压。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振 动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描 述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。 [0357] 洗涤性能总体描述 [0358] 制备用于AMSA测试的洗涤剂溶液，该溶液包含水(15°dH)、8.67g/l标准Z洗涤剂组合物和处于浓度0、0.1或0.2mg酶蛋白/L的本发明的酶。添加具有淀粉污渍的织物(来自试 验材料BV中心(邮箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰)的CS-28)，并且将它们在55℃洗涤20分钟。在流动自来水下彻底漂洗并且在黑暗中干燥之后，随后测量带有污渍的织物的光强度 值作为洗涤性能的量度。具有0mg酶蛋白/L的测试用作空白并且对应于来自洗涤剂组合物 的贡献。在洗涤步骤期间施加机械作用，例如以将洗涤溶液与织物一起振摇、转动或搅拌的 形式施加。AMSA洗涤性能实验在以下详细说明的实验条件下进行： [0359] 表1：实验条件 [0360]洗涤剂 标准洗涤剂Z(参见表2) 洗涤剂剂量 8.67g/L 测试溶液体积 160μL pH pH 10.4-10.5 洗涤时间 20分钟 温度 55℃ 水硬度 15°dH 测试中的酶浓度 0.1或0.2mg/L 试验材料 CS-28(大米淀粉棉) [0361] 表2：具有漂白剂的标准洗涤剂Z [0362]化合物 化合物的含量(％w/w) 活性组分％(％w/w) LAS，钠盐 7.03 6.0 皂 1.08 1.0 AEO* 1.51 1.5 碳酸钠 20.10 20.0 硅酸二钠 9.99 8.0 沸石A 5.00 4.0 HEDP-Na4 0.24 0.2 柠檬酸钠 2.01 2.0 聚羧酸酯(PCA) 1.09 1.0 过碳酸钠 9.33 8.0 TAED 1.09 1.0 Na2SO4 41.54 41.5 [0363] *在洗涤之前，将AEO单独地添加。 [0364] 注意上至100％的平衡和对碳酸钠和硫酸钠的另外贡献。该平衡是水≤约2.6％(来自LAS约0.1％；来自(二)硅酸钠约1.6％；来自沸石A约0.8％；来自聚羧酸酯约0.1％)； 硫酸钠≤约0.9％ [0366] 通过将CaCl2、MgCl2、和NaHCO3 [0367] (Ca2+:Mg2+:HCO3-＝4:1:7.5)添加至测试系统中，将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。 [0368] 在AMSA中、20min内、55℃下，具有漂白剂的标准洗涤剂Z相对于亲本α-淀粉酶的性能 [0369]突变 0.1mg酶/L 0.2mg酶/L 空白 -0.2 0.0 G182*+D183* 1.0 1.0 G182*+D183*+N195F 0.9 1.1 G182*+D183*+N195F+M202L 1.8 1.6 [0370] 确切地，本发明的这些变体被认为在ADW使用中是特别有效的。因此，为了进一步评价这一点，可以进行AMSA测定ADW性能。可以在下列条件下进行用于ADW的AMSA； [0371] 可以制备测试溶液，该测试溶液包含水(15°dH)、8.67g/L洗涤剂(例如，如下文描述的包含磷酸盐的液体标准洗涤剂)和处于浓度0或0.5mg酶蛋白/L的本发明的变体。添加 具有混合淀粉污渍的三聚氰胺板(来自测试材料中心BV的DM-177，邮箱120，3133KT，弗拉尔 丁恩，荷兰)并且将它们在55℃洗涤20分钟。在流动自来水下短时间漂洗并且在黑暗中干燥 之后，随后测量带有污渍的板的光强度值作为洗涤性能的量度。可以将具有0mg酶蛋白/L的 测试用作空白并且对应于来自洗涤剂的贡献。优选地，在洗涤步骤期间施加机械作用，例如 以将洗涤溶液与板一起振摇、转动或搅拌的形式施加。AMSA自动餐具洗涤性能实验可以在 以下详细说明的实验条件下实施： [0372] 表3：实验条件 [0373]洗涤剂 包含磷酸盐的液体标准洗涤剂(参见表4) 洗涤剂剂量 5mL/L 测试溶液体积 160μL pH ～8 洗涤时间 20分钟 温度 50℃ 水硬度 21°dH 测试中的酶浓度 0.01-0.24mg/L 试验材料 三聚氰胺板(混合淀粉) [0374] 表4：包含磷酸盐的液体标准自动餐具洗涤剂 [0375]化合物 化合物的含量(％w/w) STPP 50.0 碳酸钠 20.0 过碳酸钠 10.0 二硅酸钠 5.0 TAED 2.0 Sokalan CP5(39,5％) 5.0 Surfac 23-6.5(100％) 2.0 硫酸钠 6.0 [0376] 通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝2:1:10)添加至测试系统中将水硬度调节至21°dH。在洗涤之后，将板用自来水沖洗并干燥。 [0377] 表5：实验条件 [0378]洗涤剂 粉末状标准洗涤剂A(参见表6) 洗涤剂剂量 3.94g/L 测试溶液体积 160μL pH 9.9 洗涤时间 20分钟 温度 50℃ 水硬度 21°dH 测试中的酶浓度 0.01-0.24mg/L 试验材料 三聚氰胺板(混合淀粉) [0379] 表6：粉末状自动餐具洗涤标准洗涤剂 [0380]化合物 成分的含量(％w/w) 活性组分％(％w/w) MGDA 28,9 20 柠檬酸钠 17,1 20 碳酸钠 17,1 20 过碳酸钠 9,7 10 硅酸钠 5,3 5 硫酸钠 10,2 12 Acusol 588G 4,6 5 TAED 2,8 3 Surfac 23-6.5(liq) 4,3 5 [0381] 在洗涤前单独添加*Surfac23-6.5(liq) [0382] 通过将CaCl2、MgCl2、和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝2:1:10)添加至测试系统中，将水硬度调节至21°dH。在洗涤之后，将板用自来水沖洗并干燥。 [0383] 洗涤性能的评估 [0384] 洗涤性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品被玷污时，反射光的强度低于干净样品的反射光强度。因此，反射光的强度可以用于测 量洗涤性能。 [0385] 采用以下方式进行颜色测量：使用用于捕获所洗涤纺织品的图像的专业平板扫描仪(EPSON EXPRESSION 10000XL)，并且使用控制的数字成像系统(ColorVectorAnalyzer) 用于捕获所洗涤三聚氰胺板的图像。 [0386] 为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)： [0387] [0388] 在本申请提及的序列表 [0389] [0390] [0391] [0392] [0393] |
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