[0001] 本发明涉及用于连续生产纯化蛋白质的集成处理方法及相关设备。

[0002] 背景

[0003] 大规模、经济的蛋白质纯化越来越成为生物技术和制药工业中的一个重要问题。通常，蛋白质通过细胞培养来生产，其使用通过插入含有感兴趣蛋白质的基因的重组质粒而工程改造为产生该蛋白质的哺乳动物、酵母或细菌细胞系。由于使用的细胞系是活生物体，因此必须向它们提供含有糖、氨基酸和生长因子的复合生长培养基。从提供给细胞的化合物混合物和细胞本身的副产物中分离所需蛋白质以达到足以用作人类治疗剂的纯度成为一个巨大的挑战。生物制药工业正在不断寻找能够符合严格产品质量要求的经济有效的灵活制造策略。在此背景下，自动化的连续制造处理有潜力通过在产品质量稳定的情况下赋予高容积生产能力和稳态运行而提供有吸引力的生物处理解决方案。之前已经报道了将上游灌注培养与下游连续捕获相集成的策略(Warikoo等人，Integrated continuous production of recombinanttherapeutic proteins，Biotechnol.Bioeng.109：3018-3029(2012))。

[0004] 通过从分批制造向连续制造转换而实现的处理强化已被长期应用于一些产业，并且在生物处理产业中正显现出明确的兴趣。主要驱动力为稳态运行、停留时间和处理时间短、流水线化的处理流程和高容积生产能力。设备尺寸的减小和中间保留步骤的去除允许使设施小型化，这使得资本成本显著降低。

[0005] 在生物技术中，连续处理还具有在蛋白质质量方面提供优势的潜力。处理时间的缩短和中间保留步骤的去除减少了目标蛋白质向酶促、化学和物理降解/修饰的暴露，从而提高了蛋白质质量。

[0006] 当连接两个连续运行的独立处理单元时，将它们的液流相匹配存在挑战，即上游单元的流出应该与下游单元的流出匹配(例如，以避免由于溢流/超压或气泡引起的处理失败)。

[0007] 常见的解决方案是引入中间缓冲(surge)容器作为两个单元之间的缓冲器。例如，Warikoo等人(Biotechnol.Bioeng.2012；109：3018-3029)描述了借助于中间缓冲袋与连续捕获色谱单元集成的灌注培养。WO 2006/039588描述了使用缓冲容器将连续澄清化与超滤或半连续快速色谱法集成的实例(Vogel等人，Biotechnol.Bioeng.2012；109：3049-3058)。

[0008] US 4,630,639公开了由通道连接的两个系统，该通道进而具有恒流控制阀和恒压控制阀，其中第一个系统可以是液压源，而第二个系统可以是缸体。

[0009] WO 2011/037522涉及一种分离系统，其包含两个分离单元，其中这两个分离单元以出口至入口的方式串联，从而形成使用的分离单元管线；以及在每个分离单元之间在管线内(in-line)提供的感测和调节装置，以用于连续监测并调节流体在分离单元管线中从一个分离单元向后续分离单元流动的至少一种环境性质参数。

[0010] 本研究考虑不使用缓冲容器的集成系统，因为这类装置对于具有稳定性问题的蛋白质是成问题的。本发明方法缩短了目标分子从其表达到纯化或分离的处理时间。

[0011] 概述

[0012] 在一个方面，本发明涉及实现结合上游和下游端对端连续生物处理平台的连续处理概念。

[0013] 当连接连续处理中的两个独立处理单元时，将它们的液流相匹配存在挑战，即在前单元的流出应该与在后单元的流出相匹配。通过本发明，已经开发了避免引入中间储存/缓冲容器的常规步骤的设备和方法，该步骤会延长处理时间并增加蛋白质向酶促、化学和物理降解/修饰的暴露。本发明的目的在于提供一种改进的自动化分离系统，该系统能够进一步减少开发时间、处理时间和商品成本，并且不需要中间储存罐(holding tank)。

[0014] 本发明的第一个方面涉及一种设备，其包含

[0015] a.至少两个独立的处理单元，即第一处理单元和第二处理单元，每个处理单元包含流体入口、流体出口和流体输送装置，其中第一和第二处理单元通过至少一个流体连接件(fluid connection)串联连接，流体从一个处理单元的出口流向后续处理单元的入口，以及

[0016] b.用于向所述流体连接件引入额外液体的至少一个工具(means)

[0017] c.用于从所述流体连接件中除去过量液体的至少一个工具。

[0018] 本发明的另一方面涉及一种设备，其包含

[0019] a.至少两个独立的处理单元，即第一和第二处理单元，每个处理单元包含流体入口、流体出口和流体输送装置，其中第一和第二处理单元通过至少一个流体连接件串联连接，流体从一个处理单元的出口流向后续处理单元的入口；

[0020] b.在两个处理单元之间的流体连接件中的至少一个流体入口

[0021] c.在两个处理单元之间的流体连接件中的至少一个流体出口。

[0022] 本发明的相关方面涉及一种从细胞系生产重组蛋白的方法，其包括以下步骤：

[0023] i.使用本发明的设备，在培养单元中培养细胞系，其中培养上清液的流出由泵提供，该泵将所述培养单元连接至(自动化)纯化单元；

[0024] ii.使用由泵提供的进料流入在所述(自动化)纯化单元上进行蛋白质纯化。

[0025] 本发明还涉及一种从非均匀流体混合物中分离一种或多种目标蛋白质的方法，其包括

[0026] i.第一处理步骤，其包括产生含有感兴趣蛋白质的流体混合物

[0027] ii.借助于单向流动将流体混合物从第一处理步骤的出口转移至第二处理步骤的入口(不使用中间储存容器)

[0028] iii.通过除去过剩的液体或加入相容的液体，使从第一处理步骤输送的液体的流速与第二处理步骤中接收的流体的流速相匹配

[0029] iv.第二处理步骤，其包括产生进一步纯化的含有感兴趣蛋白质的流体混合物。

[0030] 本发明的另一个相关方面涉及一种从非均匀流体混合物中分离感兴趣蛋白质的方法，其包括

[0031] i.通过第一处理步骤产生含有感兴趣蛋白质的流体混合物

[0032] ii.将所述流体混合物从第一处理步骤的出口转移至第二处理步骤的入口，其包括通过除去过剩的液体或加入相容的液体，使从第一处理步骤输送的液体的流速与第二处理步骤接收的流体的流速相匹配

[0033] iii.通过所述第二处理步骤产生进一步纯化的含有感兴趣蛋白质的流体混合物。

[0034] 值得注意的是，步骤ii)中的转移和匹配没有使用中间储存容器。

[0035] 本发明还涉及一种连续或半连续生产纯化蛋白质的处理，该处理包括使用集成的设备，该设备包含

[0036] a.具有连续流出的、带有细胞分离单元的细胞培养生物反应器

[0037] b.利用连续流入至少部分地纯化蛋白质的工具，如用于进行色谱分析的工具或用于过滤的工具，

[0038] c.具有两个三向连接器和两个止回阀的装置，其用于将所述生物反应器的流出与用于至少部分地纯化蛋白质的工具的流入相匹配。

[0039] 附图简述

[0040] 图1描绘了本发明的一个实施方案，其包含第一处理单元，(a)系统1的泵，第二处理单元，(b)系统2的泵，止回阀(c)和(d)，以及例如缓冲溶液的液流(e)和流向例如收集罐的(f)过剩液流(surplus flow)。

[0041] 图2描绘了本发明实施方案的另一配置，其包含第一处理单元，(a)系统1的泵，第二处理单元，(b)系统2的泵，止回阀(c)和(d)，以及例如缓冲溶液的液流(e)和流向例如收集罐的(f)过剩液流。

[0042] 图3描绘了本发明实施方案的又一配置，其包含第一处理单元，(a)系统1的泵，第二处理单元，(b)系统2的泵，止回阀(c)和(d)，以及例如缓冲溶液的液流(e)和流向例如收集罐的(f)过剩液流。

[0043] 图4描绘了本发明实施方案的一种配置，其包含第一处理单元，(a)系统1的泵，第二处理单元，(b)系统2的泵，止回阀(c)和(d)，来自系统1的额外液流(e)以及流向例如收集罐的(f)过剩液流。

[0044] 图5描绘了本发明实施方案的一种设置(setup)，其包括与连续纯化集成的蛋白质灌注生产，(a)新鲜培养基供给，(b)进料泵(蠕动泵——由液面传感器控制)，(c)细胞培养生物反应器，(d)ATF细胞截留装置，(e)排放泵(蠕动泵——由生物质/电容信号控制)，(f)废弃细胞容器，(g)0.22μm绝对过滤器，(h)收获泵(蠕动泵——针对限定的灌注速度而设置)，(i)止回阀1，(j) 加样泵，(k)平行捕获柱，(1)止回阀2，(m)容器，(n)缓冲瓶，(o) 梯度泵，(p)混合器，(q)废物容器，(r)柱3和5，(s)柱2、4和6，(t)UV和电导率检测器，(u)最终纯化的蛋白质池(pool)。

[0045] 图6描绘了通过实施例1的最终凝胶过滤池中的RP-HPLC测定的FVIII浓度。

[0046] 图7描绘了实施例1中的最终凝胶过滤池的SDS-PAGE。

[0047] 图8描绘了来自实施例2中的最终凝胶过滤步骤的UV色谱图的实例。

[0048] 图9描绘了实施例2中的集成运行周期。左图：活细胞密度(VCD)。右图：对应的子批(sub-batch)中纯化二聚体和二聚体级分的估计值(基于凝胶过滤色谱图)。

[0049] 图10描绘了实施例2中的集成运行周期。左图：对应的子批中纯化二聚体和二聚体级分的估计值(基于凝胶过滤色谱图)。右图：在培养条件改变之前、期间和之后，选定的凝胶过滤色谱图。

[0050] 图11描绘了FVII变体的集成连续捕获中，实施例3中的集成运行周期的捕获产率。

[0051] 图12描绘了FVII变体的集成连续捕获中，实施例3中的ATF灌注培养的活细胞密度(VCD)、生存力和滴度。灰色区域表示集成的连续培养和捕获的周期。

[0052] 图13描绘了 纯化系统的流入减少至初始流速的75％时，实施例4中的连续运行期间收集罐的重量增加。

[0053] 图14描绘了用于实施例4中的子批产率评价的SE-HPLC色谱图。示出了以初始纯化系统流入流速的100％(A)、75％(B)和125％(C)运行的子批。

[0054] 图15描绘了通过在实施例4中运行的单克隆抗体子批的SDS-PAGE得到的产品质量评价。代表性的子批以初始 纯化系统流入流速的100％(A)、75％(B)和125％(C)运行。

[0055] 图16描绘了用于上游和下游集成的胰岛素前体生产的设置。图例(a)酵母生长培养基供给，(b)进料泵，(c)生物反应器，(d)蠕动泵，(e)收集容器，(f)双头蠕动泵，(g)废物瓶，(h)交叉流过滤容器，(i)0.2μm交叉流过滤器，(j)错流过滤泵(TMP控制的)，(k)稀释缓冲液，(l)具有止回阀1的缓冲瓶，(m)具有止回阀2的容器，(n)具有管线内稀释的活塞泵，(o)稀释缓冲液，(p)缓冲液[例如，pH8的100mM Tris缓冲液(洗脱缓冲液)]，(q)梯度活塞泵，(r)混合器，(s)平行捕获柱，(t)废物瓶，(u)UV和电导率检测器，(v)最终纯化的蛋白质池。

[0056] 图17描绘了回收的胰岛素前体的SDS-PAGE。泳道A包含胰岛素前体，而泳道B包含ALP消化的胰岛素前体。标记物为SeeBlue Plus2并且其为非还原条件。

[0057] 图18描绘了与 耦合的错流过滤装置，在它们之间具有(1)缓冲瓶，其具有只允许从该瓶中流出的止回阀，和(2)过剩液流收集罐，其具有只允许流入该罐中的止回阀。两个瓶平衡放置。 流速初始设置为11ml/min(100％)。

[0058] 详述

[0059] 连续处理设计提供了一些优势，包括流水线化的处理流程和高容积生产能力。这使得能够减小设备尺寸并去除中间保留步骤，进而允许紧凑的设施和降低的资本成本。对于生物处理，总处理时间的缩短和中间储存的去除也减少了产物向酶促、化学和物理修饰的暴露。这使得连续处理对于脆性蛋白质的生产特别有吸引力。

[0060] 作为本发明的一部分，我们开发了基于灌注培养和自动化多步纯化，用于端对端生产复杂脆性蛋白质的集成连续框架。在上游，该集成系统可由具有ATF细胞截留系统的搅拌釜生物反应器组成。使用在线电容探针对活生物质的自动反馈控制保证了在稳定状态下的稳健的长期运行，因此保证了用于下游加工的恒定且一致的产物流。澄清化的收获物可直接进入用作连续纯化单元的过滤或色谱系统，如任何常规的色谱系统，例如但不限于色谱系统。两个交替的捕获柱可位于具有各柱的完全灵活性和控制的多步纯化系列之前。

[0061] 这种集成设置提供了一种紧凑的自动化台式工厂，其在无需中间储存的情况下以有效方式将细胞培养基转化为纯化的蛋白质。与传统的分批处理相比，其缩短了从开始表达到纯化蛋白质的前置时间。此外，这种集成方法也提供了对过程的连续监测，从而允许“恰好”的生产和更好的资源利用。

[0062] 一种或多种目标分子是指应该与样品中的一种或多种杂质分离、分开或纯化的任何分子、物质或化合物或其混合物。所述一种或多种目标分子通常为蛋白质、核酸序列或核苷酸，如DNA或RNA序列。蛋白质，诸如已经经历表达的来自第一处理单元的样品的那些部分，通常在第二处理单元中经历纯化。在优选的实施方案中，目标分子为蛋白质或者两种或更多种蛋白质的混合物。在非常优选的实施方案中，目标分子为抗体或凝血因子，如因子V、VII、VIII、IX、X和XIII，或其缀合物及变体。目标分子还可选自凝血因子，以及凝血因子与蛋白质如抗体或其片段、与白蛋白结合物如脂肪酸链或与蛋白质如白蛋白的融合体或缀合物。或者，目标蛋白质可选自胰岛素或其变体，以及在胰岛素加工中使用的酶，如胰蛋白酶或赖氨酰特异性蛋白酶，如水解无色杆菌(Achromobacter lyticus)蛋白酶。

[0063] 术语“抗体”是指具有与抗原特异性结合的能力的蛋白质。通常，抗体具有由两条重链和两条轻链组成的基本的四多肽链结构，所述链例如通过链间二硫键来稳定。抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以以单体或聚合体形式存在，例如，以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。抗体还可包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们保留或经修饰包含配体特异性结合域即可。术语“片段”是指抗体或抗体链的一部分或一段，其包含比完整或完全的抗体或抗体链要少的氨基酸残基。可通过对完整或完全的抗体或抗体链进行化学或酶处理来获得片段。片段还可通过重组方法获得。当重组生产时，片段可单独表达或作为被称为融合蛋白的更大蛋白质的一部分表达。示例性的片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc和/或Fv片段。示例性的融合蛋白包括Fc融合蛋白。根据本发明，术语“抗体”还包括融合蛋白。

[0064] 如上所述，在一些实施方案中，抗体为含有Fc区的蛋白质，例如免疫球蛋白。在一些实施方案中，含有Fc区的蛋白质为包含与另一多肽或其片段融合的免疫球蛋白Fc区的重组蛋白。示例性的多肽包括，例如，肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；a-1-抗胰蛋白酶；胰岛素、胰岛素α链；胰岛素β链；胰岛素原；和在胰岛素加工中使用的酶，如胰蛋白酶或赖氨酰特异性蛋白酶，诸如水解无色杆菌蛋白酶，促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，如因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XIII、组织因子和血管性血友病因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子，如蛋白C；心房钠尿肽；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；RANTES(活化后调节的、正常T细胞表达的并分泌的因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；穆勒氏管抑制物；
松弛素α链；松弛素β链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，如β-内酰胺酶；
DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)(例如，CTLA-4)；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或蛋白D；类风湿因子；神经营养因子，如骨源性神经营养因子(BDNF)；神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-βδ；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34和CD40；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；
表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，如CD 11a、CD 11b、CD 11c、CD 18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，如HER2、HER3或HER4受体；以及上面列举的多肽的片段和/或变体。此外，根据本发明的抗体是与以上列举的任何多肽特异性结合的任何蛋白质或多肽、其片段或变体。

[0065] 在合适的实施方案中，第一处理单元是具有连续流出的培养单元，如灌注培养单元。培养单元是用于培养悬浮或粘附细胞的任何系统，如灌注培养系统，并且通常包含细胞和细胞培养基制剂。术语“细胞培养”、“细胞灌注”或“细胞灌注培养”旨在表示宿主细胞或生物体在其中产生目标蛋白质的任何系统，如具有包含目标蛋白质的收获的细胞培养液的系统。第一处理单元的实施方案包括细胞灌注系统，如装备有细胞截留系统的生物反应器和发酵罐。这样的细胞截留系统的一个例子是ATFTM系统，其基于通过隔板在泵头内向上移动然后向下移动的动作产生的交替切向流技术，该系统连接至过滤器外壳并附接至标准生物反应器。第一处理单元如培养单元提供了用于通过第二处理单元加工的样品。

[0066] 术语“样品”是指含有目标分子的任何组合物或混合物。如所讨论的，样品可来源于来自第一处理单元的生物来源或其他来源。生物来源包括真核生物和原核生物来源，诸如植物和动物细胞、组织及器官。样品还可包括发现与目标分子混合的稀释液、缓冲液、去污剂和污染物、碎片等。

[0067] 通常，所述处理单元之一或两者包括将目标分子纯化。

[0068] 如本文中可互换使用的术语“纯化”、“分开”或“分离”是指从包含目标分子和一种或多种杂质的组合物或样品中提高目标分子的纯度。通常，通过从组合物中(完全或部分地)除去至少一种杂质来提高目标分子的纯度。

[0069] 术语“色谱法”是指从混合物中存在的其他分子中分离感兴趣分析物(例如，目标分子)的任何类型的技术。通常，由于混合物中的各分子在流动相的影响下迁移通过固定介质的速率不同，或在结合和洗脱过程中的速率不同，目标分子与其他分子分离。术语“基质”或“色谱基质”在本文中可互换使用，并指在分离过程中将目标分子(例如，含有Fc区的蛋白质，如免疫球蛋白)与混合物中存在的其他分子分离的任何种类的吸附剂、树脂或固相。非限制性实例包括微粒状、片块状或纤维状树脂以及可放入柱或筒中的膜。用于形成基质的材料的实例包括多糖(诸如琼脂糖和纤维素)；和其他机械上稳定的基质，诸如二氧化硅(例如，可控孔度玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷颗粒，以及上述任一种的衍生物。适用于本发明方法的典型基质类型的实例为阳离子交换树脂、亲和树脂、阴离子交换树脂或混合模式树脂。“配体”为附接至色谱基质并决定基质的结合性质的官能团。“配体”的实例包括但不限于离子交换基团、疏水相互作用基团、亲水相互作用基团、亲硫相互作用基团、金属亲和基团、亲和基团、生物亲和基团和混合模式基团(上述种类的组合)。可在本文中使用的一些优选配体包括但不限于强阳离子交换基团，如磺基丙基、磺酸；强阴离子交换基团，如三甲基氯化铵；弱阳离子交换基团，如羧酸；弱阴离子交换基团，如N5N二乙胺或DEAE；疏水相互作用基团，如苯基、丁基、丙基、己基；以及亲和基团，如蛋白A、蛋白G和蛋白L。

[0070] 术语“亲和色谱法”是指一种蛋白质分离技术，其中目标蛋白质(例如，含Fc区的感兴趣蛋白质或抗体)与对该目标蛋白质具有特异性的配体特异性结合。这样的配体通常被称为生物特异性配体。在一些实施方案中，生物特异性配体(例如，蛋白A或其功能性变体)共价附接于色谱基质材料，并在溶液接触色谱基质时可接近溶液中的目标蛋白质。在色谱步骤期间，目标蛋白质通常保留其对生物特异性配体的特异性结合亲和力，而混合物中的其他溶质和/或蛋白质不与该配体明显或特异性结合。目标蛋白质与固定化配体的结合允许污染的蛋白质或蛋白质杂质穿过色谱基质，而目标蛋白质保持与固相材料上的固定化配体特异性结合。然后在合适的条件(例如，低pH、高pH、高盐、竞争配体等)下，将特异性结合的目标蛋白质以活性形式从固定化配体上移除，并与洗脱缓冲液一起穿过色谱柱，其中不含之前已穿过该柱的污染的蛋白质或蛋白质杂质。任何组分均可用作用于纯化其各自特异性结合蛋白质例如抗体的配体。然而，在根据本发明的多种方法中，使用蛋白A作为针对含有Fc区的目标蛋白质的配体。将目标蛋白质(例如，含有Fc区的蛋白质)从生物特异性配体(例如，蛋白A)上洗脱的条件可由本领域普通技术人员容易地确定。在一些实施方案中，蛋白G或蛋白L或其功能性变体可用作生物特异性配体。在一些实施方案中，生物特异性配体如蛋白A在5-9的pH范围下使用，以供与含有Fc区的蛋白质结合，洗涤或再平衡生物特异性配体/目标蛋白质缀合物，随后用pH大约为或低于4、含有至少一种盐的缓冲液洗脱。

[0071] 如上所述，本发明的一个方面涉及一种设备，其包含

[0072] a.至少两个独立的处理单元，即第一处理单元和第二处理单元，每个处理单元包含流体入口、流体出口和流体输送装置，其中第一和第二处理单元通过至少一个流体连接件串联连接，流体从一个处理单元的出口流向后续处理单元的入口；

[0073] b.用于向该流体连接件引入额外液体的至少一个工具；以及

[0074] c.用于从该流体连接件中除去过量液体的至少一个工具。

[0075] 如另外定义的，所述设备通常包含

[0076] a.至少两个独立的处理单元，即第一处理单元和第二处理单元，每个处理单元包含流体入口、流体出口和流体输送装置，其中第一和第二处理单元通过至少一个流体连接件串联连接，流体从一个处理单元的出口流向后续处理单元的入口；

[0077] b.在两个处理单元之间的流体连接件中的至少一个流体入口，其提供用于向该流体连接件引入额外液体的工具；以及

[0078] c.在两个处理单元之间的流体连接件中的至少一个流体出口，其提供用于从该流体连接件中除去过量液体的工具。

[0079] 通过单向流动控制工具适当地限制入口的流动方向，以将液体限制成单向地流向两个处理单元之间的流体连接件。所述流体连接件的入口优选具有通过单向流动控制工具限制的流动方向，以将液体限制成单向地流向处理单元之间的流体连接件。

[0080] 可替代地或组合地，可通过单向流动控制工具限制出口的流动方向，以将液体限制成单向地流出处理单元之间的流体连接件。优选地，所述流体连接件的出口具有通过单向流动控制工具限制的流动方向，以将液体限制成单向地流出处理单元之间的流体连接件。限制入口或出口的单向流动的工具通常为止回阀。

[0081] 在各个实施方案中，该设备的至少一个流体输送装置包括泵。这两个流体输送装置或其中一个可包括泵。

[0082] 本发明的设备通常旨在用于从细胞系生产重组蛋白。因此，本发明的进一步的方面涉及一种从细胞系生产重组蛋白的方法，其包括以下步骤

[0083] i.使用由本发明限定的任何设备，在培养单元中培养细胞系，其中培养上清液的流出由泵提供，该泵将培养单元连接至纯化单元；以及

[0084] ii.使用由泵提供的进料流入在所述纯化单元上进行蛋白质纯化。该纯化单元通常为从业者已知的自动化纯化单元。

[0085] 非限制性地，所述细胞系可来自原核或真核细胞，但通常为哺乳动物细胞系。该细胞系可选自酵母、细菌细胞系和真核细胞系。典型的细菌细胞系可选自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、棒杆菌(Corynebacterium)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。真核细胞系可进一步选自酿酒酵母(S.cerevisiae)和芽孢杆菌属(Bacillus gender)的那些种、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)以及丝状真菌，如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)。该细胞系还可来自杆状病毒感染的细胞、非溶解性昆虫细胞表达昆虫细胞或哺乳动物细胞(HeLa、HEK 293)。该细胞系可来自植物系统，如烟草以及番茄、莴苣、胡萝卜植物和叶绿体转基因植物，如包含叶绿体表达载体的植物。该细胞系可来自哺乳动物系统，包括牛(如原牛(Bos primigenius))、小鼠(如小家鼠(Mus musculus))、中国仓鼠卵巢、幼仓鼠肾和人胚肾细胞。

[0086] 非限制性地，所述目标蛋白质可为包括糖肽的多肽。感兴趣的实施方案是其中蛋白质选自抗体，凝血因子如因子V、VII、VIII、IX、X和XIII或其变体，可溶性受体，生长激素，以及胰岛素或其变体，特别是其中蛋白质选自凝血因子和抗体的实施方案。蛋白质纯化通常通过过滤或色谱法进行。

[0087] 本发明的一个方面涉及一种用于从非均匀流体混合物中分离感兴趣的分子的设备，其包含

[0088] a.至少两个独立的处理单元，即第一和第二处理单元，每个处理单元包含流体入口、流体出口和流体输送装置，其中第一和第二处理单元通过至少一个流体连接件串联连接，流体从一个处理单元的出口流向后续处理单元的入口；

[0089] b.在两个处理单元之间的流体连接件中的至少一个流体入口；

[0090] c.在两个处理单元之间的流体连接件中的至少一个流体出口。

[0091] 第一处理单元通常可选自生物反应器、发酵单元、管式反应器、超滤单元、均质器、离心机单元和色谱单元，其每一个都具有连续或半连续流出，优选连续流出。第二处理单元通常选自超滤单元、均质器、离心机单元和色谱单元，其每一个都具有连续或半连续流出，优选连续流入。

[0092] 在合适的实施方案的一个组合中，第一处理单元为具有连续流出的培养单元，如灌注培养单元，而第二处理单元为具有连续流入的色谱系统。

[0093] 在合适的实施方案的又一组合中，第一处理单元为具有连续流出的超滤单元，而第二处理单元为具有连续流入的色谱系统。

[0094] 在合适的实施方案的一个组合中，第一处理单元为具有连续或半连续流出的色谱系统，如 色谱系统，而第二处理单元为具有连续流入的超滤单元。

[0095] 在合适的实施方案的又一组合中，第一处理单元为具有连续流出的模拟移动床色谱系统，而第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如 色谱系统。

[0096] 在合适的实施方案的另一组合中，第一处理单元为具有连续或半连续流出的色谱系统，如 色谱系统，而第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如 色谱系统。

[0097] 在合适的实施方案的再一组合中，第一处理单元为具有连续或半连续流出的管式反应器，而第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如 色谱系统。

[0098] 在合适的实施方案的再一组合中，第一处理单元为具有连续流出的均质器，而第二处理单元为具有连续流入的连续离心机。

[0099] 在合适的实施方案的再一组合中，第一处理单元为具有连续流出的连续发酵罐，而第二处理单元为具有连续流入的连续离心机。

[0100] 在合适的实施方案的另一组合中，第一处理单元为具有连续流出的连续离心机，而第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如 色谱系统。

[0101] 在每个实施方案中，半连续的出口流可与连续的入口流相匹配。例如，来自第一处理单元如均质器的出口流可以以脉冲形式进入连续的第二处理单元，如离心机。本发明提出，在脉冲之间提供减少的流动，或者“填充空白”，来匹配流动。

[0102] 本发明的又一方面涉及一种纯化含有至少一种目标分子的液体的方法，其包括使用如本文所限定的设备。

[0103] 本发明的一个令人关注的方面涉及一种从非均匀流体混合物中分离一种或多种目标蛋白质的方法，其包括

[0104] i.第一处理步骤，其包括产生含有感兴趣蛋白质的流体混合物

[0105] ii.借助于单向流动将流体混合物从第一处理步骤的出口转移至第二处理步骤的入口(不使用中间的储存容器)

[0106] iii.通过除去过剩的液体或加入相容的液体，使从第一处理步骤输送的液体的流速与第二处理步骤接受的液体的流速相匹配

[0107] iv.第二处理步骤，其包括产生进一步纯化的含有感兴趣蛋白质的流体混合物。

[0108] 在本发明的一些实施方案中，在将第一处理步骤产生的流体混合物转移到第二处理步骤的入口之前，例如通过过滤对该流体混合物进行部分纯化可能是优选的。

[0109] 在本发明的示例性实施方案中，第一处理步骤为产生含有感兴趣蛋白质的澄清化细胞培养收获流体的连续培养过程；而第二处理步骤为产生含有一种或多种目标蛋白质的部分纯化流体的连续色谱过程。

[0110] 本发明进一步涉及一种连续或半连续生产纯化蛋白质的处理，该处理包括使用集成的设备，该设备包含

[0111] a.具有连续流出的、带有细胞分离单元的细胞培养生物反应器

[0112] b.利用连续流入至少部分地纯化蛋白质的工具，如用于进行色谱分析的工具或用于过滤的工具，

[0113] c.具有两个三向连接器和两个止回阀的装置，其用于将生物反应器的流出与用于至少部分地纯化蛋白质的工具的流入相匹配。

[0114] 所述集成系统的上游部分——第一处理单元——可包含使用ATF细胞截留系统、以灌注模式运行的生物反应器。使用在线电容探针对活细胞浓度的反馈控制可用于保证在稳定状态下的稳健的长期运行。在下游， 后跟随着该应用的管线内稀释选项，导致在灵活且良好控制的多步纯化系统之前有两个交替的色谱捕获柱。对来自生物反应器的流进行管线内稀释的选项(即pH调节、添加盐等)拓宽了捕获方法的选择。下游过程的监测通过使柱阀之间的流动路径中具有检测器来实现。此外，使用缓冲液交换柱调节各柱步骤之间的参数如电导率和/或pH，从而允许具有多种柱组合的纯化处理的自动化。总之，这使得端对端设置非常灵活。

[0115] 第一处理步骤为灌注培养且第二处理步骤包括连续多步纯化的实施方案使得灵活且高产的制造单元成为可能。此外，保留步骤或缓冲容器的去除使得不希望的蛋白质降解的风险减至最低，这使其理想地适用于生产复杂的不稳定蛋白质。因此，以使用化学成分确定的培养基在CHO细胞中表达的复杂重组蛋白为例来说明端对端的连续制造策略。

[0116] 在本发明的一个实施方案中，本发明将具有柱间完全控制和连续运行可行性的多步纯化与色谱系统如 色谱系统组合起来。通过组合这两个方面，基础色谱系统如系统可转变为连续纯化单元。提出的这种设置基于现成的解决方案，无需定制部分如个性化软件策略，从而使自动化且连续的色谱法广泛适用。

[0117] 当连接连续处理中的两个独立处理单元时，将它们的液流相匹配存在挑战，即在前单元的流出应该与在后单元的流出匹配。在现有技术中，这已经通过引入中间储存/缓冲容器而得到解决。这引入了不必要的储存，从而延长了处理时间并增加了蛋白质向酶促、化学和物理降解/修饰的暴露。

[0118] 当连接半连续处理与连续处理时，也存在液流匹配的挑战，现有技术的解决方案使用储存/缓冲容器。该缓冲容器再次引入了不必要的储存，从而延长了总体处理时间并降低了蛋白质稳定性。

[0119] 根据本发明的典型实施方案，采用具有两个三向连接器和两个止回阀的布置，在没有中间缓冲/储存容器的情况下，两个连续处理单元之间直接连接，或一个半连续单元与连续单元连接(参见图1-3的不同配置)。如果从第一处理单元输送的液流低于第二处理单元需要的液流，则相差的液流(e)将会经由连接至例如相容缓冲溶液供给的止回阀(c)输送。如果从第一处理单元输送的液流高于第二处理单元接受的液流，则过剩的液流(f)将会通过止回阀(d)到达例如收集罐。

[0120] 如果来自第一处理单元的液流是半连续、分批输送的，则在第一处理单元空闲期(其中来自第一处理单元的流量为零)期间维持流动所需的液体将会经由连接至例如相容缓冲溶液供给的止回阀(c)输送。

[0121] 按照这种方式，该处理中没有引入额外的储存和处理时间。

[0122] 在图1-3中描绘的通用配置的变化形式可包括相差和/或过剩的液流来自第一处理单元和/或第二处理单元的配置。例如，参见图4，其中相差的液流(e)来自系统1。这种配置的一种具体实施方式可参见图5，其中ATF灌注培养系统与 纯化系统连接。如果由ATF收获泵(h)输送的液流低于 泵(j)接受的液流，则相差的液流将会经由止回阀(i)提供。如果由ATF泵输送的液流高于 泵(j)接受的液流，则过剩的液流将会通过止回阀(l)到达例如收集容器(m)。

[0123] 如所讨论的，本发明的方法包括将至少第一和第二处理单元设备组合成一个设备，其中处理单元通过至少一个流体连接件串联连接，流体从一个处理单元的出口流向后续处理单元的入口。单独地，每个处理单元为独立的处理单元。

[0124] 第一处理单元通常选自生物反应器、发酵单元、管式反应器、超滤单元、均质器、离心机单元和色谱单元，其每一个都具有连续或半连续流出，优选连续流出。

[0125] 第二处理单元通常选自超滤单元、均质器、离心机单元和色谱单元，其每一个都具有连续或半连续流出，优选连续流入。

[0126] 在一个实施方案中，第一处理单元为具有连续流出的培养单元，如灌注培养单元，而第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如 色谱系统。该实施方案在图5中以非限制性方式示出。

[0127] 在另一个合适的实施方案中，第一处理单元为具有连续流出的超滤单元，而第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如 色谱系统。

[0128] 在另一个合适的实施方案中，第一处理单元为具有连续或半连续流出的色谱系统，如 色谱系统，而第二处理单元为具有连续流入的超滤单元。

[0129] 在另一个合适的实施方案中，第一处理单元为具有连续流出的模拟移动床色谱系统，而第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如 色谱系统。

[0130] 在另一个合适实施方案中，第一处理单元为具有连续或半连续流出的色谱系统，如 色谱系统，而第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如 色谱系统。

[0131] 在另一个合适的实施方案中，第一处理单元为具有连续或半连续流出的管式反应器，而第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如 色谱系统。

[0132] 在另一个合适的实施方案中，第一处理单元为具有连续流出的均质器，而第二处理单元为具有连续流入的连续离心机。

[0133] 在另一个合适的实施方案中，第一处理单元为具有连续流出的连续发酵罐，而第二处理单元为具有连续流入的连续离心机。

[0134] 在另一个合适的实施方案中，第一处理单元为具有连续流出的连续离心机，而第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如 色谱系统。

[0135] 可将本发明描述为总体上涉及借助于执行所需功能的装置(或在不存在中间储存装置的情况下)将两个连续处理步骤耦合成用于生长/合成/制备(不稳定或不方便临时储存的)产品的集成处理。

[0136] 本发明的方面可涉及将具有ATF模块的细胞培养生物反应器与用于蛋白质纯化的一组柱子耦合成集成系统(该生物反应器和柱子都是连续流入处理)，以及将两个连续流入处理步骤耦合，该连续流入处理方法的类型(培养、过滤、色谱法、均化、离心)没有限制。

[0137] 更具体地，所述装置可涉及一种用于制备和纯化蛋白质的装置(蛋白质的类型没有限制)。

[0138] 尤其能够用于不稳定的蛋白质，如FVIII，但是该装置在制备和纯化包括凝血因子、胰岛素、GLP衍生物、GH、受体、抗体/FAb等所有蛋白质中提供了至少一些优势。

[0139] 以下实施方案为实施本发明的优选模式：

[0140] 1.一种设备，其包含

[0141] a.至少两个独立的处理单元，即第一处理单元和第二处理单元，每个处理单元包含流体入口、流体出口和流体输送装置，其中第一和第二处理单元通过至少一个流体连接件串联连接，流体从一个处理单元的出口流向后续处理单元的入口，以及

[0142] b.用于向该流体连接件引入额外液体的至少一个工具

[0143] c.用于从该流体连接件中除去过量液体的至少一个工具。

[0144] 2.根据实施方案1所述的设备，其包含

[0145] a.至少两个独立的处理单元，即第一处理单元和第二处理单元，每个处理单元包含流体入口、流体出口和流体输送装置，其中第一和第二处理单元通过至少一个流体连接件串联连接，流体从一个处理单元的出口流向后续处理单元的入口，以及

[0146] b.在两个处理单元之间的流体连接件中的至少一个流体入口，其提供用于向该流体连接件引入额外液体的工具

[0147] c.在两个处理单元之间的流体连接件中的至少一个流体出口，其提供用于从该流体连接件中除去过量液体的工具。

[0148] 3.根据实施方案1或2的任一项所述的设备，其中所述流体连接件的入口具有通过单向流动控制工具限制的流动方向，以将液体限制为单向地流向处理单元之间的流体连接件。

[0149] 4.根据实施方案1至3中任一项所述的设备，其中所述流体连接件的出口具有通过单向流动控制工具限制的流动方向，以将液体限制为单向地流出处理单元之间的流体连接件。

[0150] 5.根据实施方案3至4中任一项所述的设备，其中单向流动工具为止回阀。

[0151] 6.根据前述任一实施方案所述的设备，其中所述流体输送装置中的至少一个包括泵。

[0152] 7.一种从细胞系生产重组蛋白的方法，其包括以下步骤

[0153] i.使用实施方案1至5中任一项限定的设备，在培养单元中培养细胞系，其中培养上清液的流出由泵提供，该泵将培养单元连接至纯化单元；

[0154] ii.使用由泵提供的进料流入在所述纯化单元上进行蛋白质纯化。

[0155] 8.根据实施方案7所述的方法，其中所述细胞系为哺乳动物细胞系。

[0156] 9.根据实施方案7或8所述的方法，其中所述蛋白质选自凝血因子、包含凝血因子的融合蛋白、胰岛素、GLP衍生物、GH、受体和包括Fab在内的抗体。

[0157] 10.根据实施方案9所述的方法，其中所述蛋白质选自凝血因子和抗体。

[0158] 11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述培养单元的流出与所述纯化系统的进料相匹配。

[0159] 12.根据实施方案7至10中任一项所述的方法，其中所述蛋白质纯化通过色谱法、过滤或其组合来进行。

[0160] 13.一种设备，其包含

[0161] a.至少两个独立的处理单元，即第一和第二处理单元，每个处理单元包含流体入口、流体出口和流体输送装置，其中第一和第二处理单元通过至少一个流体连接件串联连接，流体从一个处理单元的出口流向后续处理单元的入口；

[0162] b.在两个处理单元之间的流体连接件中的至少一个流体入口

[0163] c.在两个处理单元之间的流体连接件中的至少一个流体出口。

[0164] 14.用于从非均匀流体混合物中分离感兴趣分子的根据实施方案13所述的设备，其包含

[0165] a.至少两个独立的处理单元，即第一和第二处理单元，每个处理单元包含流体入口、流体出口和流体输送装置，其中第一和第二处理单元通过至少一个流体连接件串联连接，流体从一个处理单元的出口流向后续处理单元的入口；

[0166] b.在两个处理单元之间的流体连接件中的至少一个流体入口；以及

[0167] c.在两个处理单元之间的流体连接件中的至少一个流体出口。

[0168] 15.根据实施方案13或14的任一项所述的设备，其中所述流体连接件的入口具有通过单向流动控制工具限制的流动方向，以将液体限制成单向地流向处理单元之间的流体连接件。

[0169] 16.根据实施方案13至14中任一项所述的设备，其中所述流体连接件的出口具有通过单向流动控制工具限制的流动方向，以将液体限制成单向地流出处理单元之间的流体连接件。

[0170] 17.根据实施方案15至16中任一项所述的设备，其中单向流动工具为止回阀。

[0171] 18.根据实施方案13至17中任一项所述的设备，其中所述第一处理单元选自生物反应器、发酵单元、管式反应器、超滤单元、均质器、离心机单元和色谱单元，其每一个都具有连续或半连续流入，优选连续流入。

[0172] 19.根据实施方案13至18中任一项所述的设备，其中所述第二处理单元通常选自超滤单元、均质器、离心机单元和色谱单元，其每一个都具有连续或半连续流出，优选连续流出。

[0173] 20.根据实施方案13至19中任一项所述的设备，其中所述第一处理单元为具有连续流出的培养单元，如灌注培养单元，并且所述第二处理单元为具有连续流入的色谱系统。

[0174] 21.根据实施方案13至19中任一项所述的设备，其中所述第一处理单元为具有连续流出的超滤单元，并且所述第二处理单元为具有连续流入的色谱系统。

[0175] 22.根据实施方案13至19中任一项所述的设备，其中所述第一处理单元为具有连续或半连续流出的色谱系统，如 色谱系统，并且所述第二处理单元为具有连续流入的超滤单元。

[0176] 23.根据实施方案13至19中任一项所述的设备，其中所述第一处理单元为具有连续流出的模拟移动床色谱系统，并且所述第二处理单元为具有连续流入的色谱系统。

[0177] 24.根据实施方案13至19中任一项所述的设备，其中所述第一处理单元为具有连续或半连续流出的色谱系统，如 色谱系统，并且所述第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如 色谱系统。

[0178] 25.根据实施方案13至19中任一项所述的设备，其中所述第一处理单元为具有连续或半连续流出的管式反应器，并且所述第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如色谱系统。

[0179] 26.根据实施方案13至19中任一项所述的设备，其中所述第一处理单元为具有连续流出的均质器，并且所述第二处理单元为具有连续流入的色谱系统。

[0180] 27.根据实施方案13至19中任一项所述的设备，其中所述第一处理单元为具有连续流出的连续发酵罐，并且所述第二处理单元为具有连续流入的连续离心机。

[0181] 28.根据实施方案13至19中任一项所述的设备，其中所述第一处理单元为具有连续流出的连续离心机，并且所述第二处理单元为具有连续流入的色谱系统，如 色谱系统。

[0182] 29.一种纯化含有至少一种目标分子的液体的方法，其包括使用如实施方案13至32中任一项限定的任何设备。

[0183] 30.一种从非均匀流体混合物中分离一种或多种目标蛋白质的方法，其包括[0184] i.第一处理步骤，该步骤包括产生含有感兴趣蛋白质的流体混合物

[0185] ii.借助于单向流动将所述流体混合物从第一处理步骤的出口转移至第二处理步骤的入口

[0186] iii.通过除去过剩的液体或加入相容的液体，使从第一处理步骤输送的液体的流速与第二处理步骤接受的液体的流速匹配。

[0187] iv.第二处理步骤，其包括产生进一步纯化的含有感兴趣蛋白质的流体混合物。

[0188] 31.根据实施方案30所述的方法，其中所述第一处理步骤为产生含有感兴趣蛋白质的澄清化细胞培养收获流体的连续培养过程；并且所述第二处理步骤为产生含有一种或多种目标蛋白质的部分纯化流体的连续色谱过程。

[0189] 32.一种用于连续或半连续生产纯化蛋白质的处理方法，该处理方法包括使用集成的设备，该设备包含

[0190] a.具有连续流出的、带有细胞分离单元的细胞培养生物反应器

[0191] b.使用连续流入至少部分地纯化蛋白质的工具，如用于进行色谱分析的工具或用于过滤的工具，

[0192] c.具有两个三向连接器和两个止回阀的装置，其用于将生物反应器的流出与用于至少部分地纯化蛋白质的工具的流入相匹配。实施例

[0193] 实施例1-B域缺失的FVIII变体的集成连续生产

[0194] 将用于生产B域缺失的FVIII变体的处理(如Thim等人，Haemophilia(2010)，16，349-359所描述的)转化为集成连续生产设置。

[0195] 简言之，将表达FVIII变体的克隆中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系在化学成分确定的无动物组分培养基中培养。增殖后，用该细胞系接种具有ATF细胞截留系统的5L搅拌釜生物反应器，该生物反应器在灌注模式下运行，并输送澄清化细胞收获物的输出以供纯化。使用来自在线电容探针的反馈控制来操控流出速率(bleed rate)以维持恒定的活生物质。

[0196] 原始分批模式纯化程序包括以下四个色谱步骤

[0197] ·在Capto MMC柱(GE HealthCare，Uppsala，Sweden)上的捕获步骤

[0198] ·免疫亲和色谱步骤

[0199] ·阴离子交换色谱步骤(Macro-Prep 25Q Support，BioRad Laboratories，Hercules，CA，USA)

[0200] ·凝胶过滤步骤(Superdex 200，GE HealthCare)，将该纯化程序转化为Pure色谱系统(GE Healthcare)上的连续纯化程序。这通过使用双交替捕获柱及随后的自动化多步纯化而实现。在步骤1-2与3-4之间引入缓冲液交换柱(Sephadex G-25，GEHealthcare)，以代替手动稀释，因此柱的数目增加至六个。当在一个捕获柱上加载收获物时，在另一个捕获柱和随后的色谱步骤上进行纯化和清洗，而无需任何中间储存。以这种方式， 色谱系统被转化为具有澄清化细胞培养收获物的连续输入和以大约16小时的循环时间输送纯化蛋白质子批的半连续输出的系统。

[0201] 用于生产B域缺失的FVIII变体的集成连续系统通过将上游单元(ATF灌注设置)的出口与下游单元( 系统)的入口连接而获得，参见图5。来自ATF的流速通过收获泵(h)控制，而流向 的流速由加样泵(j)控制。对于连续操作，这些流速需要匹配以避免由于溢流/超压或气泡/压力不足引起的处理失败。为了在不向处理流程中引入任何中间储存的情况下解决此问题，采用两个三向连接器和两个止回阀的布置。如果由收集泵(h)输送的液流低于加样泵(j)接受的液流，则相差的液流将会经由止回阀(i)从ATF系统获取。如果由收集泵(h)输送的液流高于加样泵(j)接受的液流，则过剩的液流将会通过止回阀(1)到达例如收集罐(m)。

[0202] 结果

[0203] 使用本发明的设备将ATF灌注设置与下游 系统连接。连接时，对ATF和进行单独且独立地微调。这意味着例如下游 的停止和启动 无需考
虑上游ATF灌注设置，且不会在无菌运行条件和新鲜细胞培养基的供给方面危害细胞培养。
然后，在用于表达B域缺失的FVIII变体的灌注培养系统中，在第24培养日与第31培养日之间评价该集成连续生产设置。在一周的不间断连续运行后主动停止该集成系统，此时对应于11个纯化的子批。通过RP-HPLC和SDS-PAGE(图6和图7)测量从最终凝胶过滤步骤产生的池(pool)，并且可以看出，就滴度和质量而言输出是恒定且一致的。这证明了所提出的设置能够在稳定状态下长期集成连续运行。

[0204] 在步骤之间具有中间储存的分批模式处理中，从澄清化的收获物到纯化的蛋白质的正常处理时间为至少4天左右。在提出的集成连续处理中，子批内的平均处理时间为16小时。缩短的处理时间使得该集成连续方法很好地适用于易于降解的脆性蛋白质。与分批模式处理相比，该集成连续处理也使得从开始培养到最终的纯化蛋白质的前置时间缩短了至少3天。此外，纯化色谱图提供了关于每个子批中纯化蛋白质量的信息，这提供了对该集成处理的连续监测。例如，这可以用于在已经产生足够的蛋白质时停止运转(“恰好”的生产)，从而允许更进一步缩短前置时间。

[0205] 实施例2-二聚体蛋白质的集成连续生产

[0206] 设计了用于生产二聚体形式的重组蛋白的集成连续设置。

[0207] 将表达重组蛋白的克隆中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系在化学成分确定的无动物组分培养基中培养。增殖后，使用该细胞系接种具有ATF细胞截留系统的5L搅拌釜生物反应器，该生物反应器在灌注模式下运行，并输送澄清化细胞收获物的输出以供纯化。使用来自在线电容探针的反馈控制来操控流出速率以维持恒定的活生物质。澄清化的收获物同时含有该重组蛋白的单体和二聚体形式。

[0208] 在 Pure色谱系统(GE Healthcare)上进行包括以下三个色谱步骤的连续纯化程序

[0209] ·免疫亲和色谱步骤

[0210] ·离子交换色谱步骤

[0211] ·凝胶过滤步骤。

[0212] 这通过使用双交替捕获柱及随后的自动化多步纯化而实现。当在一个捕获柱上加载收获物时，在另一个捕获柱和随后的色谱步骤上进行纯化和清洗，而无需任何中间储存。以这种方式， 色谱系统被转化为具有澄清化细胞培养收获物的连续输入和以大约
18小时的循环时间输送纯化蛋白质子批的半连续输出的系统。

[0213] 如实施例1所述，用于生产二聚体形式重组蛋白的集成连续系统通过将上游单元(ATF灌注设置)的出口与下游单元( 系统)的入口连接而获得，但不需要色谱柱4-6。重要的是，来自最终凝胶过滤步骤的UV吸收色谱图(参见图8中的实例)可用于例如通过二聚体和单体峰下面积的积分，监测纯化二聚体的量以及二聚体与单体或二聚体级分之间的比例。

[0214] 结果

[0215] 使用三向连接器单元将ATF灌注设置与下游 系统连接。连接时，对ATF和进行单独且独立的微调。这意味着例如下游 的停止和启动无需考虑上游ATF灌注设置，且不会在无菌运行条件和新鲜细胞培养基的供给方面危害细胞培养。然后，在用于表达重组蛋白的灌注培养中，在第18培养日与第29培养日之间评价该集成连续生产设置。在此期间，培养中期望的运行点存在变化(活生物质的增加)。在15个纯化子批后主动停止该集成系统，此时对应于约11天。

[0216] 当活生物质增多时，如从凝胶过滤色谱图所估算的，纯化二聚体的量存在伴随的增加(参见图9)。此外，由于培养的变化，存在二聚体级分增加的迹象。对该变化之前、期间和之后的单个色谱图进行的目测表明，确实存在由于培养变化导致的二聚体级分的增加(参见图10)。

[0217] 该实施例再次证明了所提出的设置能够长期集成连续运行。特别是，该实施例还证明了该集成系统通过跟踪处理变化及检测产品质量属性变化而进行监测的能力。

[0218] 实施例3-FVII变体的集成连续捕获

[0219] 设计了用于培养并捕获重组FVII变体的集成连续设置。

[0220] 将表达FVII变体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系在化学成分确定的无动物组分培养基中培养。增殖后，使用该细胞系接种具有ATF细胞截留系统的15L搅拌釜生物反应器，该生物反应器在灌注模式下运行并输送澄清化细胞收获物的输出以供纯化。通过恒定的细胞流出速率达到活生物质的稳定状态。

[0221] 基于免疫亲和色谱法的连续捕获程序在采用双交替捕获柱的 Pure色谱系统(GE Healthcare)上进行。当在一个捕获柱上加载收获物时，在另一个捕获柱上进行纯化和清洗。以这种方式， 色谱系统被转化为具有澄清化细胞培养收获物的连续输入和以大约24小时的循环时间输送捕获的蛋白质子批的半连续输出的系统。

[0222] 如实施例1所述，用于培养并捕获FVII变体的集成连续系统通过将上游单元(ATF灌注设置)的出口与下游单元( 系统)的入口连接而获得，但不需要色谱柱2-6。

[0223] 培养和ATF收获物中的FVII变体滴度通过亲和HPLC测量。捕获池中的FVII变体滴度通过SE-HPLC测量。

[0224] 结果

[0225] 在用于表达FVII变体的灌注培养中，在第7培养日与第28培养日之间评价该集成连续生产设置(参见图12)。在21个捕获子批后主动停止该集成系统，此时对应于21天。

[0226] 捕获产率在约为74％的平均值左右轻微变化，但没有性能随时间降低的趋势或其他迹象(图11)。该实施例进一步证明了所提出的设置能够长期集成连续运行。

[0227] 实施例4-单克隆抗体的集成连续生产

[0228] 设计了用于生产单克隆抗体的集成连续设置。

[0229] 将表达IgG4形式的单克隆抗体的克隆CHO细胞系在化学成分确定的无动物组分培养基中培养。增殖后，使用该细胞系接种具有ATF细胞截留系统的5L搅拌釜生物反应器，该生物反应器在灌注模式下运行并输送澄清化收获物的输出以供纯化。在培养7天后将温度设定点由36.5℃变为32℃以减少细胞生长，并开始恒定速率的细胞流出。

[0230] 包括单个蛋白A亲和色谱步骤的连续纯化程序在 Explorer色谱系统(GE Healthcare)中进行。这通过使用双交替捕获柱实现。以这种方式，该 色谱系统被转化为具有澄清化细胞培养收获物的连续输入和以大约2.5小时的循环时间输送纯化蛋白质子批的半连续输出的系统。

[0231] 用于生产单克隆抗体的集成连续系统通过使用图4中示出的设备将上游单元(ATF灌注机构)与下游单元( 系统)连接而获得。该集成已在实施例1中详细说明。

[0232] 结果

[0233] 在灌注培养的第8培养日评价了该集成连续生产设置的短生产运行。生产了三个子批以测试该系统并评价该系统相对于纯化系统上的流量变化的稳定性。为了方便这一点，使用与 系统上2.5mL/min初始流速的100％(子批A)、75％(子批B)和125％(子批C)分别对应的 系统上的流入流速运行了这三个连续的子批。

[0234] 观察到，在100％的设置下，灌注系统的流出与纯化系统的流入差不多匹配。灌注流出和纯化流入的流速分别为2.59mL/min和2.5mL/min，并且在收集罐中可观察到少量液体。当 系统的流入减少至75％时，灌注收获物以0.72g/min的流速流向收集罐(在100％ 流速下完全匹配时预期为0.63g/min)，参见图13。这说明了该集成装置在两个连接的系统上维持恒定流动的能力，其中第一系统的流出高于第二系统的流入。

[0235] 为了研究该集成系统在反过来的情况下是否合适，将 系统的流入增加至起始值的125％。因此，灌注系统的总体稀释率增加。

[0236] 图14中显示了用于量化纯化的子批的SE-HPLC色谱图。可观察到AUC从子批A至子批B的减小，这与由 系统上的泵速下降导致的容积负荷降低有关。对来自子批A和子批C的AUC进行比较，可观察到AUC的增加。该增加低于容积负荷的增加，这可归因于由灌注系统的稀释率增加导致的收获物滴度降低。如图15中所示，所有子批的产品质量都是相当的。

[0237] 这表明，该集成装置能够匹配两个独立运行的连续单元操作的液流。此外，还证明了使用该集成装置的连续生产设置对液流变化的稳定性。

[0238] 实施例5-胰岛素前体的集成连续捕获

[0239] 设计了用于生产胰岛素前体的集成连续设置。

[0240] 使表达胰岛素前体的重组酿酒酵母菌株在需氧条件下在0.3L实验室生物反应器中以连续培养设置在标准酵母生长培养基(葡萄糖、酵母提取物、盐和维生素)中生长。为了维持生物反应器中的恒定体积，频繁地将培养液泵出并引导至缓冲瓶，该培养液连续地从该缓冲瓶泵入到用于细胞分离的微过滤设置中。在除去细胞之后，在通过利用管线内稀释降低pH之前，通过本发明的设备运送该液流，并且将无细胞收获物加至CIEX捕获柱上。为了能够处理无细胞收获物的连续液流，使用包括SP Sepharose FF(GE Healthcare)的双交替捕获柱。当一个捕获柱加载时，对另一个进行洗涤、洗脱和再平衡，然后反复地对它们进行切换和再切换。整个设置可参见图16。

[0241] 该实验的目的在于(1)验证连续并集成地生产胰岛素前体是否可行，和(2)评估本发明的设备是否可以抵消细胞分离装置(错流过滤装置)与纯化设置(改进的explorer)之间不希望的液流变化。

[0242] 结果：

[0243] 为了验证是否可能采用集成的上游和下游装置连续地生产胰岛素前体，将回收的肽用赖氨酸特异性ALP酶处理并通过SDS-PAGE分析(图17)。SDS-PAGE显示出预期的结果；胰岛素前体被ALP熟化。

[0244] 当测试图1中描绘的设置时，具有止回阀1的缓冲瓶(参见图16的图例)和具有止回阀2的过剩液流收集瓶(图16中的图例项m)平衡放置，并且监测它们的重量。

[0245] 在图18中，在时段A中， 泵被设置为据认为与来自细胞分离装置的流出流相对应的值。然而其显示出，由于通过重量增加所检测到的，过剩液流被引导至收集容器中，因此来自细胞分离装置的流速要高得多。在时段B中， 流速增加至150％，但是过剩液体仍被收集在过剩液流收集瓶中。在时段C中，在初始 流速的200％下，过剩液体向过剩液流收集容器中的流动停止，表明从细胞分离装置的流出和向纯化设置中的流入相等。在时间间隔D中，暂停 导致液体被直接引导至收集容器中，而在间隔E中，错流过滤装置停止，导致仅从缓冲瓶中抽取液体。在这个两小时的试验中，即使应用了强制的流速错配，错流装置和纯化设备两者仍不受干扰地持续工作。

[0246] 当渗透侧上的压力改变时，因此当 流改变时，错流过滤装置在一定程度上改变了通过其膜的液流。这意味着当没有从错流过滤膜流出的液流时，只能预期从缓冲瓶(图例项l；图16)中抽取液体，这已经观察到。