一种生产低聚木糖和抗菌肽的益生饲用酿酒酵母 |
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| 申请号 | CN201611186554.0 | 申请日 | 2016-12-20 | 公开(公告)号 | CN106636176A | 公开(公告)日 | 2017-05-10 |
| 申请人 | 广州格拉姆生物科技有限公司; | 发明人 | 张宏刚; 李莉; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种生产低聚木糖和抗菌肽的益生饲用酿酒 酵母 ，该 酿酒酵母 中含有能生产低聚木糖和抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，该载体中含有特定的β‑1,4‑内切木聚糖酶基因、β‑1,4‑木糖苷酶基因和抗菌肽基因。本发明基因重组酿酒酵母是可以同时分泌出木聚糖降解相关酶类以及抗菌肽的多功能重组酵母。其能够辅助降解木聚糖生成的低聚木糖(木糖)，能够促进 机体 内肠道中 益生菌 的增殖；同时还可以补充机体中木聚糖酶的不足。同时也能高效抑制杂菌或致病菌。因而其酵母培养物能够更有效促进机体的免疫 力 提高，促进机体的生长，也可以应用到餐厨废弃物降解中，促进废弃物中半 纤维 素成分的降解和杂菌的生长。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种能生产低聚木糖和抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，其特征在于：该载体中含有β-1,4-内切木聚糖酶基因、β-1,4-木糖苷酶基因、抗菌肽基因； |
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| 说明书全文 | 一种生产低聚木糖和抗菌肽的益生饲用酿酒酵母技术领域背景技术[0002] 麦秆、谷壳、糠麸等农副产品含有抗营养因子——木聚糖，它是由β-1，4-糖苷键连接而成的木糖聚合物，是构成细胞壁的主要成分之一。木聚糖酶则是能够降解木聚糖的最主要酶之一，如果将木聚糖酶加以合理利用，则可提高木质纤维素的利用率。而木聚糖则是饲料中主要抗营养因子之一。通过在日粮中添加木聚糖酶就是其中比较简便而有效的方法。木聚糖酶可将木聚糖水解为木二糖和木二糖以上的低聚木糖，以及少量木糖和阿拉伯糖，因而消除木聚糖的抗营养作用。 [0003] 木聚糖经木聚糖降解酶降解产物——低聚木糖(xylo-oligosaccharides，XOs)又称木寡糖，是由2～7个木糖以β-1，4-糖苷键结合而成的直链低聚糖的总称，其有效成分一般为木二糖、木三糖、木四糖、木五糖等，其中以木二糖(xylobiose，X2)和木三糖(xylotriose，X3)为主。目前，用于饲料添加剂的功能性低聚糖主要有低聚乳糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚果糖、低聚甘露糖以及低聚木糖等，其中效果最好的是低聚木糖。低聚木糖相比其他低聚糖，具有以下优点：①高选择性促进双歧杆菌增殖；②不易被体内的消化酶消化；③摄入量少、配伍性好，可与其他成分配伍而不被影响；④对酸和热等稳定。同时，低聚木糖还具有如下益生作用：①调节肠道菌群结构；②抑制病原菌的繁殖、减少有害物质的产生；③提高机体的免疫力；④促使机体合成其他营养物质。 [0004] 本发明通过酿酒酵母系统将木聚糖降解酶类进行表达，可补充木聚糖酶等，并辅助降解木聚糖获得功能性低聚木糖，发挥益生作用；同时将具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌特点及抑杀致病菌、择性免疫激活和调节功能的抗菌肽基因进行共表达，实现多种功能协同促进。因而，发明中重组酿酒酵母将应用到饲料添加、动物养殖以及餐厨废弃物降解中，可以有效发挥其协同作用，发挥益生作用。 发明内容[0005] 本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种能分泌等木聚糖降解酶及抗菌肽，能够应用酵母培养物、木聚糖降解等领域等中的益生饲用的基因重组酵母。 [0006] 本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供一种能够应用酵母培养物、木聚糖降解等领域等中能分泌β-1,4-内切木聚糖酶(endo-1,4-β-xylanase)基因、β-木糖苷酶(β-xylosidase)基因等木聚糖降解酶及抗菌肽基因同时连入酿酒酵母表达载体pTEGC-BsmBI，转入酿酒酵母，并成功分泌表达，获得降解木聚糖生产低聚木糖和分泌抗菌肽的多功能重组酿酒酵母。 [0007] 本发明的目的在于提供一种能生产低聚木糖和抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体及其构建方法。 [0008] 本发明的另一目的在于提供一种能生产低聚木糖和抗菌肽的重组酿酒酵母及其构建方法。 [0009] 本发明所采取的技术方案是： [0010] 一种能生产低聚木糖和抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体，该载体中含有β-1,4-内切木聚糖酶基因、β-1,4-木糖苷酶基因、抗菌肽基因； [0011] 所述β-1,4-内切木聚糖酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示； [0012] 所述β-1,4-木糖苷酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。 [0013] 进一步的，所述抗菌肽基因选自东方铃蟾抗菌肽BLP-2突变体BLP-2-T、异色瓢虫抗菌肽Haxy-Col1突变体Haxy-Col1-T、鲶鱼抗菌肽突变体、脆皮蛙抗菌肽突变体Lf-cath-T； [0014] 所述东方铃蟾抗菌肽BLP-2突变体BLP-2-T的碱基序列如SEQ ID NO：3所示； [0015] 所述异色瓢虫抗菌肽Haxy-Col1突变体Haxy-Col1-T的碱基序列如SEQ ID NO：4所示； [0016] 所述鲶鱼抗菌肽突变体的碱基序列如SEQ ID NO：5所示； [0017] 所述脆皮蛙抗菌肽突变体Lf-cath-T的碱基序列如SEQ ID NO：6所示。 [0019] 进一步的，所述β-1,4-内切木聚糖酶基因的启动子为pgk1-1，其碱基序列如SEQ ID NO：8所示，终止子为pgkt1-1，其碱基序列如SEQ ID NO：9所示； [0020] 所述β-1,4-木糖苷酶基因的启动子为pgk1-2，其碱基序列如SEQ ID NO：10所示，终止子为pgkt1-2，其碱基序列如SEQ ID NO：11所示； [0021] 所述抗菌肽基因的启动子为pgk1-3，其碱基序列如SEQ ID NO：12所示，终止子为pgkt1-3，其碱基序列如SEQ ID NO：13所示。 [0022] 进一步的，上述载体的筛选基因中含有G418抗性基因。 [0023] 进一步的，上述载体的骨架为pGAPZaA质粒。 [0024] 进一步的，上述载体中含有酿酒酵母菌的25s rDNA基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO：15所示。 [0025] 一种能生产低聚木糖和抗菌肽的酿酒酵母，该重组酿酒酵母基因组中插入有上述任一所述的多基因共表达载体。 [0026] 上述任一所述一种能生产低聚木糖和抗菌肽的酿酒酵母多基因共表达载体的构建方法，包括以下步骤： [0027] S1整合表达载体pTEGC-BsmBI构建： [0028] S1.1将G418抗性基因连入pGAPZaA质粒载体的多克隆位点Msc I和EcoR V之间，获得载体pGAPZaA-G418； [0029] S1.2将碱基序列如SEQ ID NO：15所示的rDNA基因序列的连入载体pGAPZaA-G418多克隆位点BamHI和EcoRI之间，获得载体pGAPZaA-G418-rDNA； [0030] S1.3将载体pGAPZaA-G418-rDNA经Bgl II和EcoRI双酶切后，回收大片段产物，得到线性化载体pTEGC，将碱基序列如SEQ ID NO：16所示的BsmBI-2片段与线性化载体pTEGC连接，得整合表达载体pTEGC-BsmBI； [0031] S2启动子、终止子的扩增 [0032] S2.1启动子的扩增：以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别用引物对PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI、PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI、PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI分别扩增出pgk1-1、pgk1-2、pgk1-3启动子片段； [0033] S2.2终止子的扩增：以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别用引物对PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI、PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI、PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI分别扩增出pgkt1-1、pgkt1-2、pgkt1-3终止子片段； [0034] S3α-信号肽基因、α-淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因的获得[0035] S3.1含BsmBI酶切位点的β-1,4-内切木聚糖酶基因的获得：以含β-1,4-内切木聚糖酶基因序列的T载体为模板，通过引物xynF-BsmBI以及xynR-BsmBI进行扩增，得xynA1基因片段，即含有β-1,4-内切木聚糖酶基因的片段； [0036] S3.2含BsmBI酶切位点的β-1,4-木糖苷酶基因的获得：以含β-1,4-木糖苷酶基因序列的T载体为模板，通过引物xylF-BsmBI以及xylR-BsmBI进行扩增，得xyl-1基因片段，即含有β-1,4-木糖苷酶基因的片段； [0037] S3.3α-信号肽-抗菌肽基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含抗菌肽的T载体为模板，通过重叠延伸PCR将α-信号肽序列定向连入无信号肽的抗菌肽基因的5’端，扩增出mfa-amp基因片段，即含有α-信号肽基因序列和抗菌肽基因序列的片段；所述重叠延伸PCR过程中，通过引物将扩增产物mfa-amp的两端引入切割方向相反的BsmBI的切割序列； [0038] S4酿酒酵母多基因共表达载体的构建 [0039] 将上述获得的β-1,4-内切木聚糖酶基因表达盒元件pgk1-1、xynA1、pgkt1-1；β-1,4-木糖苷酶基因表达盒元件pgk1-2、xyl-1、pgkt1-2；抗菌肽基因表达盒元件pgk1-3、mfa-amp、pgkt1-3利用IIs型限制性内切酶BsmBI进行酶切，纯化回收；同时，利用IIs型限制性内切酶BsmBI切割上述整合表达载体pTEGC-BsmBI，将其线性化；将所用这些片段通过一步法定向连入线性化的整合表达载体pTEGC-BsmBI中，即得酿酒酵母多基因共表达载体； [0040] 上述所述引物的碱基序列如下： [0041] PGK1F1-BsmBI：CGTCTCAgatc GAAGTACCTTCAAAG [0042] PGK1R1-BsmBI：CGTCTCGgctaTATATTTGTTGTAAA [0043] PGK1F2-BsmBI：CGTCTCAgtcaGAAGTACCTTCAAAG [0044] PGK1R2-BsmBI：CGTCTCGgcatTATATTTGTTGTAAA [0045] PGK1F3-BsmBI：CGTCTCAtgcaGAAGTACCTTCAAAG [0046] PGK1R3-BsmBI：CGTCTCGtcgaTATATTTGTTGTAAA [0047] PGKT1F1-BsmBI：CGTCTCAtgtacGATCTCCCATCGTCTCTACT [0048] PGKT1R1-BsmBI：CGTCTCGgtcaAAGCTTTTTCGAAACGCAG [0049] PGKT1F2-BsmBI：CGTCTCAtacgGATCTCCCATCGTCTCTACT [0050] PGKT1R2-BsmBI：CGTCTCGtgcaAAGCTTTTTCGAAACGCAG [0051] PGKT1F3-BsmBI：CGTCTCAatcgGATCTCCCATCGTCTCTACT [0052] PGKT1R3-BsmBI：CGTCTCGagtcAAGCTTTTTCGAAACGCAG [0053] xynF-BsmBI：CGTCTCAgcta ATGAAGGTTACTGCTGCT [0054] xynR-BsmBI：CGTCTCAgtac TTAAGAAGAGATAGTAACA [0055] xylF-BsmBI：CGTCTCAgcatATGCCAGGTGCTGCTTCTATCGTTGCT [0056] xylR-BsmBI：CGTCTCAtacg TTATTGTGGAGCGATCAATTGTTCT。 [0057] 一种能生产低聚木糖和抗菌肽的重组酿酒酵母的构建方法，将上述构建的酿酒酵母多基因共表达载体转化酿酒酵母宿主，筛选出阳性单克隆菌落，并测序验证正确，即得能生产低聚木糖和抗菌肽的重组酿酒酵母。 [0058] 本发明的有益效果是： [0059] 本发明基因重组酿酒酵母是可以同时分泌出木聚糖降解相关酶类，如β-1,4-内切木聚糖酶、β-1,4-木糖苷酶，以及抗菌肽的多功能重组酵母。其中β-1,4-内切木聚糖酶、β-1,4-木糖苷酶能够辅助降解木聚糖生成的低聚木糖(木糖)是重要的益生元，能够促进机体内肠道中益生菌的增殖；同时还可以补充机体中木聚糖酶的不足。而选取的抗菌肽也可以抑制杂菌或致病菌。因而其应用产品如酵母培养物等，能够更有效促进机体的免疫力提高，促进机体的生长，也可以应用到餐厨废弃物降解中，促进废弃物中半纤维素成分的降解和杂菌的生长。可以应用到饲料添加、动物养殖以及餐厨废弃物降解利用等多个领域。 附图说明 具体实施方式[0061] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。 [0062] 实施例1整合表达载体pTEGC-BsmBI构建 [0063] 一、整合表达载体pTEGC-BsmBI构建 [0064] 1)G418抗性基因的获得 [0065] PCR扩增目的基因，以载体pPIC9k为模板，利用G418F-MscI和G418R-EcoRV引物(表1)扩增G418抗性基因。PCR反应条件：98℃10s，55℃15s，72℃50s，30个循环，72℃10min。经 2％琼脂糖凝胶电泳验证。 [0066] 目的基因回收、纯化、转化大肠杆菌、验证、送样测序。回收纯化目的片段，保存于-20℃备用。将得到的G418抗性基因与T载体连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃培养，提取其质粒DNA，利用G418F-MscI和G418R-EcoRV引物进行菌落PCR筛选阳性菌株，将阳性克隆送至英潍捷基测序验证基因的正确性。测序结果表明：G418抗性基因及其酶切位点正确连入T载，未发生突变，G418抗性基因的碱基序列如SEQ ID NO：14所示。 [0067] 表1扩增G418抗性基因引物 [0068] [0069] [0070] 注：下划线处字母为限制性内切酶的识别/切割序列。 [0071] 2)载体pGAPZaA-G418的构建 [0072] 在37℃下，利用限制性内切酶MscI和EcoRV切割pGAPZaA质粒，并在1.5％的琼脂糖凝胶电泳验证；利用限制性内切酶切割MscI和EcoRV切割pMD-G418载体，获得G418抗性基因，在1.5％的琼脂糖凝胶电泳验证；回收纯化上述酶切产物中的pGAPZaA载体、G418抗性基因，利用T4连接酶将G418抗性基因连入载体pGAPZaA，获得载体pGAPZaA-G418。 [0073] 3)rDNA基因扩增 [0074] 以酿酒酵母基因组DNA为模板，采用引物rDNAF和rDNAR引物(见表2)PCR扩增rDNA基因；PCR扩增条件为：98℃10s，55℃15s，72℃60s，30个循环，72℃10min；在1％琼脂糖凝胶电泳验证，并在上下游分别引入EcoRI和BamHI酶切位点。 [0075] 将得到的rDNA基因与T载体连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃培养，提取其质粒DNA，利用rDNAF和rDNAR引物进行菌落PCR筛选阳性菌株。测序结果表明：rDNA基因及其酶切位点正确连入T载，未发生突变，rDNA基因的碱基序列如SEQ ID NO：15所示。 [0076] 表2扩增rDNA基因引物 [0077] [0078] 注：下划线处字母为限制性内切酶的识别/切割序列。 [0079] 4)载体pGAPZaA-G418-rDNA构建 [0080] 利用限制性内切酶BamHI和EcoRI分切下上述T载体上的rDNA片段、切割质粒pGAPZaA-G418，回收纯化pGAPZaA-G418载体骨架，利用T4连接酶将rDNA连入线性化后的载体pGAPZaA-G418，获得重组载体pGAPZaA-G418-rDNA。 [0081] 5)整合表达载体pTEGC-BsmBI构建 [0082] 限制性内切酶切割Bgl II和EcoRI切割质粒pGAPZaA-G418-rDNA，切除该载体上BglII到EcoRI酶切位点间的GAP启动子、a-信号肽等序列，回收大片段产物，得到线性化载体pTEGC。 [0083] 以pMD19-T simple载体为模板，通过引物PMDF-BsmBI和PMDR-BsmBI(见表3)扩增出含有2个BsmBI酶切位点识别序列，约233bp的片段BsmBI-2，连入T载体，送至英潍捷基测序，测序正确，未发生突变，BsmBI-2的碱基序列如SEQ ID NO：16所示。 [0084] 利用限制性内切酶切割Bgl II和EcoR I切下重组后的T载体，回收约233bp的DNA片段BsmBI-2，然后利用T4连接酶将其正确连入线性化载体pTEGC，获得整合表达载体pTEGC-BsmBI。 [0085] 表3扩增含BsmBI骨架DNA引物 [0086] [0087] 注：下划线处的大写字母为BglII或EcoRI酶切位点；小写字母为IIs型限制性内切酶BsmBI酶的识别序列。 [0088] 二、启动子、终止子的扩增 [0089] 1)启动子的扩增： [0090] 以酿酒酵母基因组DNA为模板，利用PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI引物(见表4)扩增出pgk1-1启动子片段(其碱基序列如SEQ ID NO：8所示)，用作表达β-1,4-内切木聚糖酶基因的启动子。 [0091] 同理，以酿酒酵母基因DNA为模板，利用PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI引物(见表4)扩增出pgk1-2启动子片段(其碱基序列如SEQ ID NO：10所示)，用作表达β-1,4-木糖苷酶基因的启动子。 [0092] 同理，以酿酒酵母基因DNA为模板，利用PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI引物(见表4)扩增出pgk1-3启动子片段(其碱基序列如SEQ ID NO：12所示)，用作表达抗菌肽基因的启动子。 [0093] 上述扩增所得启动子基因片段均分别连入到pMD19-T Simple载体中，测序验证，保留正确的阳性克隆。 [0094] 2)终止子的扩增： [0095] 以酿酒酵母基因组DNA为模板，利用引物PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI(见表4)扩增pgkt1-1终止子(其碱基序列如SEQ ID NO：9所示)，用于表达β-1,4-内切木聚糖酶基因的终止子。 [0096] 以酿酒酵母基因组DNA为模板，利用引物PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI(见表4)扩增pgkt1-2终止子(其碱基序列如SEQ ID NO：11所示)，用于表达β-1,4-木糖苷酶基因的终止子。 [0097] 以酿酒酵母基因组DNA为模板，利用引物PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI(见表4)扩增pgkt1-3终止子(其碱基序列如SEQ ID NO：13所示)，用于表达抗菌肽基因的终止子。 [0098] 上述扩增得到终止子基因片段均连入到pMD19-T Simple载体中，测序验证，保留正确的阳性克隆。 [0099] 表4扩增酿酒酵母启动子、终止子的引物 [0100] [0101] [0102] 注：下划线处大写字母为IIs型限制性内切酶BsmBI的识别序列，下划线小写粗体字母为IIs型限制性内切酶BsmBI的切割序列。 [0103] 三、α-信号肽基因、β-1,4-内切木聚糖酶基因(xynA1)、β-1,4-木糖苷酶基因(xyl-1)以及抗菌肽基因(amp)的获得 [0104] 1)α-信号肽基因的获得：以酿酒酵母基因组DNA为模板，利用MfaF和MfaR引物(见表5)扩增得到Mfa-BsmBI(即含有α-信号肽基因序列的片段是吗？)片段，扩增程序如下：98℃10s，55℃15s，72℃30s，30个循环，72℃10min；连入T载体，送样测序，挑选正确的阳性克隆，从而将α-信号肽基因(其碱基序列如SEQ ID NO：7所示)保存至T载体中。 [0105] 表5扩增α-信号肽基因、β-1,4-内切木聚糖酶基因、β-1,4-木糖苷酶基因和抗菌肽基因的引物 [0106] [0107] [0108] 注：下划线处大写字母为IIs型限制性内切酶BsmBI的识别序列，下划线处小写粗体字母为IIs型限制性内切酶BsmBI的切割序列。 [0109] 2)β-1,4-内切木聚糖酶基因的获得：通过人工合成优化后的β-1,4-内切木聚糖酶基因xynA1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。 [0110] 3)β-1,4-木糖苷酶基因xyl-1的获得：通过人工合成优化后的β-1,4-木糖苷酶基因xyl-1的碱基序列如SEQ ID NO：2所示； [0111] 4)抗菌肽基因的获得：本研究选用的抗菌肽有以下4种： [0112] 人工合成优化后的东方铃蟾Bombina orientalis的抗菌肽BLP-2突变体BLP-2-T(碱基序列如SEQ ID NO：3所示)，BLP-2-T的氨基酸序列为GIGSKILSAGKGALKGLAKGLAEHFAN(SEQ ID NO:45)； [0113] 人工合成优化后的异色瓢虫Harmonia axyridis的抗菌肽Haxy-Col1突变体Haxy-Col1-T(碱基序列如SEQ ID NO：4所示)，Haxy-Col1-T的氨基酸序列为SLQGGAPNFPQPGQEKQEGWKFDPSLTRGEDGNTRGSINIHHTGPNHEVGANWDKVIRGPNKAKPTYSIHGSWRW(SEQ ID NO:46)； [0114] 人工合成优化后的鲶鱼抗菌肽突变体，其氨基酸序列为KGRGKQGGKVRKSS(SEQ ID NO:47)，碱基序列如SEQ ID NO：5所示； [0115] 人工合成优化后的脆皮蛙的抗菌肽突变体Lf-cath-T(碱基序列如SEQ ID NO：6所示)，Lf-cath-T的氨基酸序列为GKCNVLGQRKQLLRSIGSGSHIGSVVLPRG(SEQ ID NO:48)。 [0116] 本实施例选用东方铃蟾的抗菌肽BLP-2突变体BLP-2-T作为抗菌肽，用于后续酿酒酵母多基因共表达载体的构建。 [0117] 将上述所得β-1,4-内切木聚糖酶基因(xynA1)、β-1,4-木糖苷酶基因(xyl-1)、抗菌肽基因序列分别保存于pMD19-T Simple质粒中，备用。 [0118] 5)含BsmBI酶切位点的β-1,4-内切木聚糖酶基因片段：以含β-1,4-内切木聚糖酶基因片段(xynA1)的T载体为模板，用特异引物xynF-BsmBI以及xynR-BsmBI(见表5)进行扩增，获得含有BsmBI的切割位点的β-1,4-内切木聚糖酶基因片段xynA1。 [0119] 6)含BsmBI酶切位点的β-1,4-木糖苷酶基因片段：以含β-1,4-木糖苷酶基因片段的T载体为模板，用特异引物xylF-BsmBI以及xylR-BsmBI(见表5)进行扩增，获得含有BsmBI的切割位点的β-1,4-木糖苷酶基因片段xyl-1。 [0120] 7)α-信号肽-抗菌肽基因的获得：分别以含α-信号肽基因序列的T载体、含东方铃蟾抗菌肽BLP-2突变体BLP-2-T基因的T载体为模板，用引物MfaF3-BsmBI、Mfa-ampR、Mfa-ampF以及Mfa-ampR-BsmBI(见表5)通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)将α-信号肽序列定向连入无信号肽的抗菌肽基因的5’端，扩增出mfa-blp基因片段(含有α-信号肽基因序列和抗菌肽BLP-2突变体BLP-2-T基因)。 [0121] 上述扩增得到基因片段均连入到pMD19-Simple载体中，测序验证，保留正确的阳性克隆。 [0122] 四、能生产低聚木糖和抗菌肽的多基因共表达载体的构建 [0123] 将上述“二”和“三”中获得的β-1,4-内切木聚糖酶基因表达盒元件pgk1-1(启动子)、xynA1(含有β-1,4-内切木聚糖酶基因xynA1)、pgkt1-1(终止子)；β-1,4-木糖苷酶基因表达盒元件pgk1-2(启动子)、xyl-1(含有β-1,4-木糖苷酶基因xyl-1)、pgkt1-2(终止子)；抗菌肽基因表达盒元件pgk1-3(启动子)、mfa-blp(含有α-信号肽基因序列和抗菌肽BLP-2突变体BLP-2-T基因)、pgkt1-3(终止子)利用IIs型限制性内切酶BsmBI分别从T载体切下，纯化回收；同时，利用IIs型限制性内切酶BsmBI切割上述“一”中构建的整合表达载体pTEGC-BsmBI，将其线性化。利用T4连接酶将上述片段一次连接反应定向连入整合表达载体pTEGC-BsmBI，获得酿酒酵母多基因共表达载体pTEGC-xynA1-xyl-1-blp，转化大肠杆菌DH5a，挑选转化子，测序验证，获得正确连接的阳性转化子，提取质粒，即得能生产低聚木糖和抗菌肽的多基因共表达载体pTEGC-xynA1-xyl-1-blp。 [0124] 实施例2能生产低聚木糖和抗菌肽的重组酿酒酵母 [0125] 一、重组酿酒酵母的筛选与验证 [0126] 在酿酒酵母进行电转化之前，对酿酒酵母进行抗性筛选标记G418的敏感性实验，结果发现在G418浓度为200μg/ml的YPD平板上酵母被抑制不能生长，选取200μg/ml以上的抗性浓度进行筛选，如300μg/ml。 [0127] 将实施例1构建的酿酒酵母多基因共表达载体pTEGC-xynA1-xyl-1-blp用限制性内切酶HpaI线性化，采用醋酸锂介导的电穿孔转化法转入酿酒酵母中，在G418浓度为300μg/ml的YPD平板上培养48h以上，挑取长出的单菌落为转化子。经PCR验证后的转化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液体培养基中筛选，获得阳性单克隆菌落，测序验证，获得正确连接的阳性重组酵母转化子，即得能生产低聚木糖和抗菌肽的重组酿酒酵母，简称为Glam-x1。 [0128] 二、重组酿酒酵母Glam-x1的木聚糖酶活性检测 [0129] 1)刚果红染色法鉴定重组酿酒酵母的木聚糖酶活性 [0130] 实验方法： [0131] 将本实施例构建的重组酿酒酵母Glam-x1转接含1％木聚糖的YP(配方如下：5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨)琼脂平板中，培养72h以上。然后，加入10mL 0.1％刚果红染色液，常温染色40min，再用1M NaCl溶液脱色30min，观察水解圈。 [0132] 实验结果： [0133] 观察结果如图1所示，从中可以看出，本实施例构建的重组酿酒酵母的不同单克隆周围均有明显的水解圈出现，说明本实施例构建的重组酿酒酵母具有很好的木聚糖酶活性。 [0134] 2)DNS法测定重组酿酒酵母的木聚糖酶活性及pNP法测定重组酿酒酵母β-木糖苷酶活性 [0135] 实验方法： [0136] 参考国标GB/T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力测定对本实施例构建的重组酿酒酵母Glam-x1的木聚糖酶酶活进行测定；重组酵母Glam-x1的β-木糖苷酶酶活测定参考Lacke AH的方法：吸取200μL用50mmol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液配制的5mmol/L底物(pNP-X)，在55℃预热3min,加入50μL适当稀释的酶液,反应10min，再加入750μL 2mol/L碳酸钠溶液终止反应,冷却后测定A410,以pNP为标准计算酶活力。 [0137] 实验结果： [0138] 实施例2构建的重组酿酒酵母的木聚糖酶的活性检测结果如表6所示，从中可以看出，实施例2重组酿酒酵母Glam-x1的总木聚糖酶酶活约在0.5U/ml以上，显著高于对照组宿主酿酒酵母。 [0139] 表6实施例2构建的重组酿酒酵母的木聚糖酶酶活测定 [0140]组别 木聚糖酶酶活(U/ml) 宿主酿酒酵母 0.01 实施例2重组酿酒酵母Glam-x1 0.53 [0141] 实施例2构建的重组酿酒酵母的β-木糖苷酶的活性检测结果如表7所示，从中可以看出，实施例2重组酿酒酵母Glam-x1的β-木糖苷酶酶活约在3.58U/ml以上，显著高于对照组宿主酿酒酵母。 [0142] 表7实施例2构建的重组酿酒酵母的β-木糖苷酶的活性测定 [0143]组别 β-木糖苷酶酶活(U/ml) 宿主酿酒酵母 0.01 实施例2重组酿酒酵母Glam-x1 3.58 [0144] 三、重组酿酒酵母的抑菌效果检测 [0145] 实验方法： [0146] ①将大肠杆菌CICC10899、铜绿假单胞菌CICC10419作为受试菌，受试菌经液体培养基中培养至在OD600nm＝0.4，适当稀释、混匀、均匀涂布至MH培养基中平板上(培养基配方为：5g/l牛肉膏浸粉、17.5g/l酪素水解物、1.5g/l淀粉、琼脂粉20g/l)。 [0147] ②将适量体积的本实施例所得重组酿酒酵母菌的发酵液，加入牛津杯中，以灭菌水为阴性对照，以氨苄青霉素(1.5μg)为阳性对照，在37℃培养16-18h。 [0148] ③观察，统计抑菌圈情况。 [0149] 实验结果： [0150] 实验结果如表8所示，从中可以看出，本实施例构建的重组酿酒酵母菌的发酵液对大肠杆菌CICC10899、铜绿假单胞菌CICC10419均有明显的抑菌圈，说明所得重组酿酒酵母菌Glam-x1成功分泌出抗菌肽。 [0151] 表8重组菌抑菌效果 [0152] [0153] [0154] 注：“-”无抑菌效果，“+”抑菌圈直径在7到14mm，“++”抑菌圈直径在14mm以上。 [0155] 实施例3能生产低聚木糖和抗菌肽的多基因共表达载体的构建 [0156] 本实施例构建酿酒酵母多基因共表达载体的方法同实施例1，除了连入载体的抗菌肽基因替换为异色瓢虫Harmonia axyridis的抗菌肽Haxy-Col1突变体Haxy-Col1-T基因(碱基序列如SEQ ID NO：4所示)外，其他均与实施例1相同，本实施例构建的酿酒酵母多基因共表达载体命名为pTEGC-xynA1-xyl-col。 [0157] 实施例4能生产低聚木糖和抗菌肽的多基因共表达载体的构建 [0158] 本实施例构建酿酒酵母多基因共表达载体的方法同实施例1，除了连入载体的抗菌肽基因替换为鲶鱼抗菌肽突变体基因(碱基序列如SEQ ID NO：5所示)外，其他均与实施例1相同，本实施例构建的酿酒酵母多基因共表达载体命名为pTEGC-xynA1-xyl-1-par。 [0159] 实施例5能生产低聚木糖和抗菌肽的多基因共表达载体的构建 [0160] 本实施例构建酿酒酵母多基因共表达载体的方法同实施例1，除了连入载体的抗菌肽基因替换为脆皮蛙的抗菌肽突变体Lf-cath-T(碱基序列如SEQ ID NO：6所示)外，其他均与实施例1相同，本实施例构建的酿酒酵母多基因共表达载体命名为pTEGC-xynA1-xyl-cath。 [0161] 实施例6能生产低聚木糖和抗菌肽的重组酿酒酵母的构建 [0162] 将实施例3构建的酿酒酵母多基因共表达载体pTEGC-xynA1-xylcol用限制性内切酶线性化，采用醋酸锂介导的电穿孔转化法转入酿酒酵母中，在G418浓度为300μg/ml的YPD平板上培养48h以上，挑取长出的单菌落为转化子。经PCR验证后的转化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液体培养基中筛选，获得阳性单克隆菌落，测序验证，获得正确连接的阳性重组酵母转化子，即可获得能生产低聚木糖和抗菌肽的重组酿酒酵母的构建，将本实施例所得的重组酿酒酵母简称为Glam-x2。 [0163] 实施例7能生产低聚木糖和抗菌肽的重组酿酒酵母的构建 [0164] 将实施例4构建的酿酒酵母多基因共表达载体pTEGC-xynA1-xyl-par用限制性内切酶线性化，采用醋酸锂介导的电穿孔转化法转入酿酒酵母中，在G418浓度为300μg/ml的YPD平板上培养48h以上，挑取长出的单菌落为转化子。经PCR验证后的转化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液体培养基中筛选，获得阳性单克隆菌落，测序验证，获得正确连接的阳性重组酵母转化子，即可获得能生产低聚木糖和抗菌肽的重组酿酒酵母的构建，将本实施例所得的重组酿酒酵母简称为Glam-x3。 [0165] 实施例8能生产低聚木糖和抗菌肽的重组酿酒酵母的构建 [0166] 将实施例5构建的酿酒酵母多基因共表达载体pTEGC-xynA1-xyl-cath用限制性内切酶线性化，采用醋酸锂介导的电穿孔转化法转入酿酒酵母中，在G418浓度为300μg/ml的YPD平板上培养48h以上，挑取长出的单菌落为转化子。经PCR验证后的转化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液体培养基中筛选，获得阳性单克隆菌落，测序验证，获得正确连接的阳性重组酵母转化子，即可能生产低聚木糖和抗菌肽的重组酿酒酵母的构建，将本实施例所得的重组酿酒酵母简称为Glam-x4。 [0167] 实施例9抗菌肽突变体与原抗菌肽的抗菌性能对比 [0168] 通过生物公司合成东方铃蟾Bombina orientalis的抗菌肽BLP-2及其突变体BLP-2-T(碱基序列如SEQ ID NO：3所示)、异色瓢虫Harmonia axyridis的抗菌肽Haxy-Col1及其突变体Haxy-Col1-T(碱基序列如SEQ ID NO：4所示)、鲶鱼抗菌肽及其突变体(碱基序列如SEQ ID NO：5所示)、脆皮蛙的抗菌肽Lf-cath及其突变体Lf-cath-T(碱基序列如SEQ ID NO：6所示)。以沙门氏菌CMCC50071、大肠杆菌CICC10899和金黄色葡萄球菌ATCC22023作为指示菌，检测各种抗菌肽突变前后对上述指示菌的最小抑菌浓度(MIC)。 [0169] 检测结果如表9所示，经过改造后的抗菌肽突变体均优于未突变的抗菌肽。其中东方铃蟾的抗菌肽BLP-2及其突变体BLP-2-T、异色瓢虫抗菌肽及其突变体Haxy-Col1-T的抗菌性能较好(MIC低)。 [0170] 表9抗菌肽抗菌性能对比表 [0171] [0172] 下面对上述不同实施例制备的重组酿酒酵母作进一步的性能检测。 [0173] 一、不同重组酿酒酵母酶解木聚糖活性的检测 [0174] 实验方法： [0175] 挑选经刚果红染色鉴定的各实施例中的最大水解圈的单克隆，分别取等量的活化后的实施例2、6、7、8构建的重组酿酒酵母菌(Glam-x1、Glam-x2、Glam-x3、Glam-x4)和未经改造的原始宿主酿酒酵母菌，分别接入含0.15％的木聚糖的YPD液体培养中，按照10％(v/v)接种量进行接种，培养条件为30℃，200rpm，培养时间为96h以上。在0h、48h和96h取样，样品在10000rpm，离心15min，取上清，用HPLC(流动相0.05M H2SO4，进样量20μl)检测分析培养基的木糖和低聚木糖的含量(以木二糖和木三糖为例)。 [0176] 实验结果： [0177] 检测结果如表10所示，从中可以看出，在48h和96h吸取上清液进行HPLC分析发现，Glam-x1经发酵酶解生成木二糖和木三糖的浓度明显高于Glam-x2、Glam-x3以及Glam-x4生成的，其中Glam-x1、Glam-x3、Glam-x4、Glam-x2的木二糖和木三糖生成量依次降低。木糖的生成量，Glam-x1在48h也高于其他实施例的重组菌，在96h均被酿酒酵母吸收、消耗部分。 [0178] 表10不同重组酿酒酵母酶解木聚糖的活性检测 [0179] [0180] 二、不同重组酿酒酵母对含木聚糖原料进行固态发酵的效果检测 [0181] 实验方法： [0182] 分别取等量的活化后的实施例2、6、7、8构建的重组酿酒酵母菌(Glam-x1、Glam-x2、Glam-x3、Glam-x4)和未经改造的原始宿主酿酒酵母菌对含木聚糖原料进行发酵，其具体方法如下： [0183] 1)斜面复苏：将不同重组酿酒酵母接种YPD琼脂斜面上，30℃培养2d，复苏活化。 [0185] 3)三级放大液体发酵。分别按照500mL到5L，再到30L的三级放大，接种量分别为10％(v/v)、10％(v/v)、16.7％(v/v)，接种确保各组酿酒酵母的用量相同，从而快速获得大量的菌体。液体发酵培养基如下：糖蜜为碳源，三级放大浓度分别为15g/l→50g/l→100g/l；玉米浆为氮源，三级放大浓度分别为0.4％(v/v)→0.6％(v/v)→0.8％(v/v)；无机盐包括0.1％(w/v)硫酸镁、0.05％(w/v)氯化钙、0.1％(w/v)磷酸二氢钾、0.1％(w/v)磷酸氢二钠；初始pH调整在6.0。 [0186] 4)高密度有氧固态发酵。按照如下配方进行：按照甘蔗渣：麸皮：玉米粉：豆粕：木聚糖比例为41.9：25：18：15：0.1加入配比，其中料水比为1：1.44。其中水包括液体发酵液及部分补充的蒸馏水(比例为0.44:1)，种子液接种量为44％(v/m，L/kg)。每隔8h进行翻料，翻料后2h内增加通风，翻料后洒水或缓冲液补充湿度、调节pH接近6.0。通过浅层高密度固态发酵时间为3d。 [0187] 5)深层厌氧发酵破壁。将高密度固态发酵料堆叠，增加料层厚度，补加Hcl稀释液降低发酵料的pH至5.5，温度至28℃，深层发酵厌氧48h；然后，补加Hcl稀释液降低发酵料的pH至4.0，同时发酵温度升至55℃进行破壁20h。酵母破壁率可达95％，无活酵母。 [0188] 6)参考GB/T 6432-1994“饲料中粗蛋白测定”的凯氏定氮法测定粗蛋白含量；参考国标GB/T 6434-2006“饲料中粗纤维的含量测定”；参考国标GB/T 22492-2008“大豆肽粉”提取并测定酸溶蛋白含量；参考GB/T 13093-2006“饲料中细菌总数的测定”检测细菌数，利用HPLC分析低聚木糖，对重组菌的酵母培养物进行粗蛋白、酸溶蛋白、粗纤维、木二糖、木三糖、细菌数(杂菌数)等指标，并与市售产品对比。 [0189] 实验结果： [0190] 检测结果如表11所示，对比发现，本发明的酵母培养物的各指标皆优于市售产品，且提供了足量低聚木糖(以木二糖和木三糖为例)，同时本发明的酵母培养物的除酵母菌外的杂菌数明显小于市售产品和对照组。其中，实施例2的重组酿酒酵母(Glam-x1)指标优于市售产品和其他实施例的重组酿酒酵母的酵母培养物。 [0191] 表11不同重组酿酒酵母对含木聚糖原料进行发酵的产物成分检测 [0192] [0193] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 |
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