一株酶活提高的苯丙氨酸脱氨酶突变体专利检索- 酶专利检索查询-专利查询网

一株酶活提高的苯丙氨酸脱氨酶突变体
申请号	CN201611149184.3	申请日	2016-12-14	公开(公告)号	CN106636048A	公开(公告)日	2017-05-10
申请人	江南大学;			发明人	周哲敏; 张帆; 周丽; 崔文璟; 刘中美; 郭军玲; 陆灿杰;
摘要	本发明公开了一株酶活提高的苯丙氨酸脱氨酶突变体，属于蛋白质工程。本发明提供的苯丙氨酸脱氨酶突变体S73N的比酶活为2.22U/mg，较原酶的1.78U/mg提高了25％；kcat(s‑1)较原酶的1.650s‑1提高了26.7％。
权利要求	1.一种苯丙氨酸脱氨酶突变体，其特征在于，由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码。 2.编码权利要求1所述的苯丙氨酸脱氨酶突变体的基因。 3.携带权利要求2所述基因的载体或细胞。 4.一种重组表达权利要求1所述苯丙氨酸脱氨酶突变体的重组菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主，以pET28a为表达载体。 5.一种重组表达权利要求1所述苯丙氨酸脱氨酶突变体的方法，其特征在于，是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET28a为表达载体，将所得重组菌的种子液接种于含卡那霉素的2YT表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600至0.8-1.0时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，于20℃诱导16-18h苯丙氨酸脱氨酶突变体的表达；所述2YT表达培养基含蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括将重组菌体破碎后，收集上清，上清膜过滤后，用His Trap HF柱分离得到苯丙氨酸脱氨酶突变体。 7.权利要求1所述的苯丙氨酸脱氨酶突变体在制备用于治疗苯丙酮尿症的药物中的应用。 8.权利要求3所述的载体或细胞在制备用于治疗苯丙酮尿症的药物中的应用。 9.权利要求4所述的重组菌在制备用于治疗苯丙酮尿症的药物中的应用。
说明书全文	一株酶活提高的苯丙氨酸脱氨酶突变体技术领域 [0001] 本发明涉及一株酶活提高的苯丙氨酸脱氨酶突变体，属于蛋白质工程。背景技术 [0002] 苯丙氨酸脱氨酶(PAL)可用于有效并长期式地治疗苯丙酮尿症(PKU)。鱼腥藻Anabaena variabilis来源的PAL(Av-PAL)因为其稳定性以及较低免疫原性，在PKU治疗方面展示了较好的潜力。但是原核来源的Av-PAL酶活较真核来源的PAL酶活相差较大，而人们也发现Tyr78这一loop(Ser73至Ala97)对MIO这一家族酶有着非凡的意义，包括酶活和底物的选择性。发明内容 [0003] 本发明旨在提供一株酶活提高的苯丙氨酸脱氨酶突变体，由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码。 [0004] 本发明还提供一种重组表达所述苯丙氨酸脱氨酶突变体的方法，是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET28a为表达载体，将所得重组菌种子液接种于含卡那霉素的2YT表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD600至0.8-1.0时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，20℃诱导16-18h苯丙氨酸脱氨酶突变体的表达。 [0005] 2YT表达培养基含有蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L。 [0006] 在本发明的一种实施方式中，还包括将重组菌体破碎后，收集上清，上清膜过滤后，用His Trap HF柱分离得到苯丙氨酸脱氨酶突变体。 [0007] 本发明提供的苯丙氨酸脱氨酶突变体S73N的比酶活为2.22U/mg，较原酶的1.78U/mg提高了25％；kcat(s-1)较原酶的1.650s-1提高了26.7％。具体实施方式 [0008] 酶活的定义：每分钟每毫克PAL转化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸的量(μmols)。 [0009] 酶活测定方法：在pH 8.5的100mM Tris-Hcl缓冲液中，以10mM L-苯丙氨酸为底物，在37℃下反应20min，根据290nm的吸收值测定生成的肉桂酸浓度，确定酶活。 [0010] 动力学参数的确定：在37℃下，以0.01至0.3mM的L-苯丙氨酸为底物，加入0.5μg纯酶，在pH 8.5的100mM Tris-Hcl缓冲液中反应12min，期间96孔板连续检测产物。 [0011] 实施例1 [0012] (1)突变体S73N的构建： [0013] 以pET28a-PAL为模版，以表1所示引物在表2所示条件下，PCR得到携带编码突变体S73N的基因的重组载体pET28a-PAL/S73N。pET28a-PAL的构建方法参见Moffitt,M.C.,Louie,G.V.,Bowman,M.E.,Pence,J.,Noel,J.P.and Moore,B.S.(2007)Discovery of two cyanobacterial phenylalanine ammonia lyases:Kinetic and structural characterization.Biochemistry-Us,46,1004-1012. [0014] 表1引物 [0015] [0016] 表2全质粒PCR扩增反应体系 [0017] [0018] PCR扩增反应条件为： [0019] [0020] PCR产物用琼脂糖凝胶电泳方法鉴定。然后将PCR产物纯化、消化后转入BL21宿主。 [0021] (2)将重组大肠杆菌BL21/pET28a-PAL/S73N接种于4mL卡那霉素浓度为100μg/mL的LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)，37℃、200r/min振荡过夜培养。 [0022] 将上述过夜培养物按1％的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/mL的100mL 2YT表达培养基(蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L)中，37℃、200r/min振荡培养至OD600至0.8-1.0时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，20℃诱导16-18h得到菌体，5000g的转速离心收菌。 [0023] (3)将重组菌体溶于20mL结合缓冲溶液(50mmol/L Na2HPO4、50mmol/L NaH2PO4、500mmol/L NaCl、20mmol/L imidazole)，超声破碎，13000g离心25min，上清用0.22μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡1mL的His Trap HF柱，用15倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分别用8倍柱体积的150、300和500mmol/L咪唑的缓冲液洗脱蛋白，收集样品并用SDS-PAGE分析鉴定。 [0024] (4)酶活的测定：在400μl pH 8.5的Tris-Hcl缓冲反应体系中分别加入3μg纯化后的突变酶S73N和野生酶(SEQ ID NO.2)，加底物L-苯丙氨酸至10mM，在37℃下反应20min，确定相应比酶活。S73N的比酶活为2.22U/mg，野生酶的1.78U/mg。 [0025] (5)动力学参数的确定：以不同浓度的L-苯丙氨酸为底物(0.01至0.3mM)，确定动力学参数。 [0026] 表1野生酶(WT)和S73N的动力学参数 [0027] [0028] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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