转基因遗传标签和使用的方法 |
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| 申请号 | CN201580030814.2 | 申请日 | 2015-04-08 | 公开(公告)号 | CN106536558A | 公开(公告)日 | 2017-03-22 |
| 申请人 | 西雅图儿童医院(DBA西雅图儿童研究所); | 发明人 | 迈克尔·C·延森; 亚当·约翰逊; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供可操作地连接于转基因的遗传标签。遗传标签的表达使得能 鉴别 、检测、选择和清除表达转基因和遗传标签的细胞。在一些供选择的方案中，基因修饰的宿主细胞包括转基因和编码遗传标签的多核苷酸，所述转基因包括编码含有配体结合域的嵌合 抗原 受体的多核苷酸、包括间隔区的多核苷酸、包括跨膜域的多核苷酸和包括胞内 信号 传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，基因修饰的宿主细胞包括转基因和编码遗传标签的多核苷酸，所述转基因包括编码含有配体结合域的嵌合抗原受体的多核苷酸、包括间隔区的多核苷酸、包括跨膜域的多核苷酸和包括胞内信号传导域的多核苷酸，并且其中多肽进一步包括含有 氨 基酸GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)的柔性接头。还描述了通过所述方法方法生产的药物制剂和使用该药物制剂的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种分离多肽，与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中，所述分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中，所述分离多肽不包括全长成熟HER2。 |
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| 说明书全文 | 转基因遗传标签和使用的方法[0001] 相关申请的交叉引用 [0002] 本申请要求2014年10月2日提交的美国临时专利申请号62/058,973、2014年4月10日提交的美国临时专利申请号61/977,751、2014年4月30日提交的美国临时专利申请号61/986,479、2014年12月9日提交的美国临时专利申请号62/089,730、2014年12月11日提交的美国临时专利申请号62/090845和2014年12月5日提交的美国临时专利申请号62/088,363的优先权的权益。上述申请的全部公开内容特别地通过引用全文并入。 [0004] 本发明连同电子格式的序列表一起提交。序列表提供为2015年4月7日创建的大小为47kb的命名为SCRI-066WO-SEQUENCE_LISTING.TXT的文件。信息是电子格式的序列表通过引用全文并入本文。 技术领域[0005] 本发明涉及用于检测细胞中转基因表达的组合物和方法。 背景技术[0006] 在细胞中表达转基因正在成为针对各种病症的重要的治疗方法。例如，在过继免疫治疗中，人T淋巴细胞是通过基因转移以表达对表达于肿瘤细胞上的表面分子特异性的嵌合抗原受体(CAR)工程化的。嵌合受体是包括胞外配体结合域的合成受体，最常见的是连接于胞内信号传导组件的单克隆抗体的单链可变区片段(scFv)，最常见的是单独的CD3ζ或与一个或多个共刺激域组合的CD3ζ。用转基因修饰的细胞治疗的病症的其他例子包括地中海贫血、血友病、心肌梗塞和重度联合免疫缺陷。然而，主要问题在于获得转基因表达在与内源基因相当的水平上的稳定表达。需要鉴别用于选择和/或检测高水平表达转基因的细胞的组合物和方法。 发明内容[0007] 同源产物的使用和选择已成为基因治疗策略的临床成功和再现性的限制因素。如本文提供的，设计了一种候选遗传标签和用于细胞工程的工具。在一些供选择的方案中，遗传标签包括基于人Her2的表位，指定为Her2t。在具体的供选择的方案中，Her2t缺少所有Her2胞内组件，而含有Her2跨膜区，Her2跨膜区是由单克隆抗体曲妥珠单抗(赫赛汀)识别的构象完整的表位和促进表面表达的肽。Her2t构建体的三个变体被并入慢病毒包装质粒epHIV7中并在CHO细胞中表征，三个变体中一个含有完整的Her2域IV，两个构象表位基于与赫赛汀复合的Her2的三维结构而设计。 [0008] 在一些方面，使用Her2t作为遗传标签允许在体外选择和纯化表达感兴趣的转基因的细胞治疗的同源群。另外，Her2t可以用于追踪体内的细胞治疗；例如，Her2t可以用作血液、骨髓和脑脊液抽出物的赫赛汀染色的靶标以检查转基因表达细胞治疗的存留以使癌症缓解遵循在患者中的治疗持续性。通过在与另一种转遗传标签如EGFRt使用时，使表达多个转基因的细胞协同纯化，Her2t扩展了CAR治疗的治疗范围(therapeutic reach)。 [0009] 在一些供选择的方案中，本公开提供了与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的分离多肽，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第511至652位或第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。本文包括编码分离多肽的核酸。 [0010] 在其他供选择的方案中，提供了包括编码分离多肽的核酸的宿主细胞，所述分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第511至562位氨基酸或第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，并且其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位。宿主细胞可选自由CD8T细胞、CD4T细胞、CD4初始T细胞、CD8初始T细胞、CD8中枢记忆T细胞、CD4中枢记忆T细胞和其组合组成的组。宿主细胞可进一步包括连接于第二遗传标签的、编码第二嵌合抗原受体的第二核酸。在一些供选择的方案中，第二核酸可被导入相同的宿主细胞作为编码分离多肽的核酸，所述分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第511至562位氨基酸或第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位。在其他供选择的方案中，第二核酸被导入第二宿主细胞群，并且至少两个宿主细胞群被合并到单一组合物中。在一些供选择的方案中，T细胞包括前体T细胞。在一些供选择的方案中，前体T细胞是造血干细胞。 [0011] 本公开的另一方面提供了制备包含如本文所述的宿主细胞的组合物的方法。在一些供选择的方案中，方法包括：将分离核酸引入宿主细胞，所述分离核酸如编码分离多肽的核酸，所述分离多肽与HER2多肽的胞外域(ECD)的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域(ECD)的多肽具有SEQ ID NO：23的第511至652位氨基酸或第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位；以及在包含至少一种生长因子的培养基中培养宿主细胞。在一些供选择的方案中，方法进一步包括在培养步骤之前或之后或在培养步骤之前和之后两者选择表达ECD的宿主细胞。在其他供选择的方案中，制备方法进一步包括将编码第二嵌合抗原受体的第二核酸和第二遗传标签导入宿主细胞。在一些供选择的方案中，方法进一步包括在培养步骤之前或之后或在培养步骤之前和之后两者选择表达第二遗传标签的宿主细胞。 [0012] 在其他供选择的方案中，提供了一种方法，其中该方法包括：将第一分离核酸引入第一宿主细胞，所述第一分离核酸如编码分离多肽的核酸，所述分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第511至562位氨基酸或第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位；选择表达ECD的第一宿主细胞；将编码第二嵌合抗原受体的第二核酸和第二遗传标签导入第二宿主细胞；选择表达第二遗传标签的第二宿主细胞；以及任选地，在包含至少一种生长因子的培养基中培养第一宿主细胞和第二宿主细胞。在一些供选择的方案中，组合物包含第一宿主细胞群和第二宿主细胞群。 [0013] 本公开的另一方面涉及用于治疗癌症、在体内追踪组合物的细胞和在体内杀伤组合物的细胞的组合物的方法和用途。在一些供选择的方案中，提供了一种方法，其中该方法包括治疗患有癌症和表达肿瘤抗原的患者，其中方法进一步包括施用有效量的宿主细胞的组合物，所述宿主细胞包括连接于遗传标签的、编码嵌合抗原受体的一种或多种核酸。在一些供选择的方案中，组合物的宿主细胞包括连接于第一标签的、编码第一嵌合抗原受体的第一核酸和连接于第二标签的、编码第二嵌合抗原受体的第二核酸。在一些供选择的方案中，方法进一步包括施用特异地结合于遗传标签的抗体或其抗原结合片段。在一些供选择的方案中，施用结合于第一遗传标签的抗体，施用特异地结合于第二遗传标签的抗体，或施用两者。在一些供选择的方案中，用可检测标记、细胞毒性剂或两者标记抗体。 [0014] 在一些供选择的方案中，提供了分离多肽，其中分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。 在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽具有SEQ ID NO：17的序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。 [0015] 在一些供选择的方案中，提供了分离多肽，其中分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER，并且其中具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列的HER2多肽的胞外域通过包含氨基酸GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)的序列连接于跨膜域。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽包括SEQ ID NO：17所记载的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。 [0016] 在一些供选择的方案中，提供了分离核酸，其中分离核酸编码多肽。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽具有SEQ ID NO：17的序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、 96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER，并且其中具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列的HER2多肽的胞外域通过包含氨基酸GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)的序列连接于跨膜域。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第 563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽包括如SEQ ID NO：17所记载的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括启动子。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括转基因。在一些供选择的方案中，转基因包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括抗原结合域、间隔区、跨膜域和至少一个刺激域。在一些供选择的方案中，编码转基因的多核苷酸通过自切割接头连接于编码HER2多肽的核酸。在一些供选择的方案中，HER2多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，自切割接头是具有LEGGGEGRGSLLTCG(SEQ ID NO：26)的序列的T2A接头。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：25(CD20CAR)的氨基酸序列。 [0017] 在一些供选择的方案中，提供了宿主细胞，其中宿主细胞包括分离核酸，其中分离核酸编码多肽。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第 582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽具有SEQ ID NO：17的序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER，并且其中具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列的HER2多肽的胞外域通过包含氨基酸GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)的序列连接于跨膜域。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽包括如SEQ ID NO：17所记载的氨基酸序列。 在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括启动子。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括转基因。在一些供选择的方案中，转基因包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括抗原结合域、间隔区、跨膜域和至少一个刺激域。在一些供选择的方案中，编码转基因的多核苷酸通过自切割接头连接于编码HER2多肽的核酸。在一些供选择的方案中，HER2多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，自切割接头是具有LEGGGEGRGSLLTCG(SEQ ID NO：26)的序列的T2A接头。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO： 25(CD20CAR)的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，宿主细胞选自由CD8T细胞、CD4T细胞、CD4初始T细胞、CD8初始T细胞、CD8中枢记忆T细胞、CD4中枢记忆T细胞和其组合组成的组。 在一些供选择的方案中，宿主细胞是自体的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是抗原特异性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。 [0018] 在一些供选择的方案中，提供了包含宿主细胞的组合物，其中宿主细胞包括分离核酸，其中分离核酸编码多肽。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽具有SEQ ID NO：17的序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER，并且其中具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列的HER2多肽的胞外域通过包含氨基酸GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)的序列连接于跨膜域。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽包括如SEQ ID NO：17所记载的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括启动子。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括转基因。在一些供选择的方案中，转基因包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括抗原结合域、间隔区、跨膜域和至少一个刺激域。在一些供选择的方案中，编码转基因的多核苷酸通过自切割接头连接于编码HER2多肽的核酸。在一些供选择的方案中，HER2多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，自切割接头是具有LEGGGEGRGSLLTCG(SEQ ID NO：26)的序列的T2A接头。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：25(CD20CAR)的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，宿主细胞选自由CD8T细胞、CD4T细胞、CD4初始T细胞、CD8初始T细胞、CD8中枢记忆T细胞、CD4中枢记忆T细胞和其组合组成的组。在一些供选择的方案中，宿主细胞是自体的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是抗原特异性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。 [0019] 在一些供选择的方案中，提供了制备组合物的方法，其中方法包括将分离核酸导入宿主细胞以及在包含至少一种生长因子的培养基中培养宿主细胞。在一些供选择的方案中，分离核酸编码多肽。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23 的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽具有SEQ ID NO：17的序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER，并且其中具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列的HER2多肽的胞外域通过包含氨基酸GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)的序列连接于跨膜域。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽包括如SEQ ID NO：17所记载的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括启动子。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括转基因。在一些供选择的方案中，转基因包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括抗原结合域、间隔区、跨膜域和至少一个刺激域。在一些供选择的方案中，编码转基因的多核苷酸通过自切割接头连接于编码HER2多肽的核酸。在一些供选择的方案中，HER2多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，自切割接头是具有LEGGGEGRGSLLTCG(SEQ ID NO：26)的序列的T2A接头。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：25(CD20CAR)的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，宿主细胞选自由CD8T细胞、CD4T细胞、CD4初始T细胞、CD8初始T细胞、CD8中枢记忆T细胞、CD4中枢记忆T细胞和其组合组成的组。在一些供选择的方案中，宿主细胞是自体的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是抗原特异性的。在一些供选择的方案中，生长因子选自由IL-15、IL-7、IL-21、IL-2和其组合组成的组。在一些供选择的方案中，方法进一步包括选择表达Her2t多天的细胞。在一些供选择的方案中，在培养基中培养细胞之前选择细胞。在一些供选择的方案中，使用结合于Her2的域IV的抗体选择细胞。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，方法进一步包括导入连接于第二遗传标签的、编码嵌合抗原受体的第二分离核酸。在一些供选择的方案中，方法进一步包括选择表达第二遗传标签的细胞。在一些供选择的方案中，第二遗传标签包括EGFRt。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。 附图说明 [0020] 图1.Her2t的结构示意图。(图A)Her2t(中)与Her2(ErbB2；左)的胞外域和跨膜域的分子模型。Her2t与赫赛汀Fab形成的复合体(右)。(图B)含有由用于使表面表达的GMCSF受体α链信号序列(GMCSFRss)组成的前导肽的Her2t的示意图。其余的Her2t序列由Her2(ErbB2)域IV(89个氨基酸)的表位和23个氨基酸的跨膜域组成。(图C)将Her2t克隆在CAR和T2A下游的框内以允许共表达。 [0021] 图2.Her2t与曲妥珠单抗(赫赛汀)配偶以免疫磁性地富集表达Her2t的细胞。(图A)生物素化赫赛汀的滴定相对于表达Her2t的细胞系。(图B)用生物素化赫赛汀和抗生物素微珠(Miltenyi)预选择和后选择的Her2t转导的K562细胞。细胞纯化至高达95％Her2t阳性。(图C)Her2t的表位被赫赛汀特异地识别，并且不能被商业的Her2t抗体识别。(图D)使用商业抗体(上)或生物素化赫赛汀(下)进行的蛋白印迹(Western blot)分析，例证了Her2t (25kDa)和ErbB2(250kDa)之间在kDa大小上的差异。泳道从左到右(1-4)：分子量标准(MW ladder)，K562亲代，K562Her2t，K562ErbB2(Her2)。 [0022] 图3.Her2t是与中枢记忆T细胞(Tcm)中的EGFRt相一致的有效的选择标记。(图A)使用两步柱纯化方案从PBMC纯化CD8Tcm。使用CD8分离试剂盒(用于富集CD8阳性细胞)和CD45RA微珠(用于移除CD45RA阳性细胞)最初选择CD8+CD45RA-细胞。然后使用CD62L微珠阳性选择细胞。(图B)使用生物素化赫赛汀或爱必妥和抗生物素微珠选择的、用CD19CAR-T2A-Her2、CD20CAR-T2A-EGFRt或两者转导的CD8Tcm。可以顺序纯化用CD19CAR-T2A-Her2t和CD20CAR-T2A-EGFRt(两者)转导的CD8Tcm，得到用于CAR治疗的双特异性T细胞。第五幅图为双纯化的Tcm直方图(两者)。上部直方图显示赫赛汀SA-PE染色(Her2t+)，以及下部直方图显示对双纯化Tcm的爱必妥SA-PE染色(EGFRt+)。(图C)对Her2t或EGFRt纯化的CD8Tm的细胞裂解物，使用CD3ζ特异性抗体的蛋白印迹分析。泳道从左到右(1-4)：分子量标准(MW ladder)，模拟转导，CD19CAR-T2A-Her2t转导，CD19CAR-T2A-EGFRt转导。条带强度说明当对于Her2t染色的细胞(图B)中的MFI较低时，Her2t纯化的细胞比EGFRt纯化的细胞具有更高的转基因表达水平。上部条带＝CD19CAR；下部条带＝内源CD3ζ。CARζ链(上图-50kDa)和宿主细胞的内在ζ链(下图-15kDa)之间的条带强度的比较显示了表达CARher2t构建体的细胞的CAR表达是CAREGFRt构建体的约2倍。 [0023] 图4.Her2t和Her2t/EGFRt转导的细胞保持效应表型和靶向特异性。(图A)K562靶板的表征，从左到右：K562亲代，K562CD19，K562CD20和K562CD19/CD20(X轴：CD19+；Y轴：CD20+)。(图B)4小时的铬释放测定，显示了CD19CAR T细胞和CD20CAR T细胞特异性对抗K562靶板细胞。将CD8Tcm与K562靶细胞以50∶1、25∶1、12.5∶1或6.25∶1的比共培养。仅双转导的T细胞能够靶向表达所有抗原的K562细胞。CD19CAR-T2A-Her2t CD8Tcm和CD19CAR-T2A-EGFRt CD8Tcm证实了相似的裂解能力。(图C)24小时的细胞因子释放测定。将CD8Tcm与K562靶细胞以2∶1的T细胞与靶细胞比共培养24个小时，然后分析上清中效应细胞因子的存在。相对于CD19CAR-T2A-EGFRt转导的CD8Tcm，CD19CAR-T2A-Her2t转导的CD8 Tcm产生更多不同的所有组成成分(diverse repertoire)和更高水平的效应细胞因子。各图C与图A和B是相同的(从左到右：K562亲代，K562CD19，K562CD20和K562CD19/CD20)。在CD4Tcm中可见相似的结果(未显示数据)。(图D)来自24小时的细胞因子释放测定的代表性的细胞因子产生的倍数。与CD19CAR-EGFRt相比，当与表达CD19的K562共培养时(上文)，通过Her2t(CD19CAR-Her2t)纯化的CD8Tcm产生显著更高的IL2、IFNy和TNFα效应细胞因子水平。学生t检验p＞0.05。 [0024] 图5.Her2t作为用于工程化细胞的体内检测和荧光染色的标记的使用。(图A)将表达CD19CAR-T2A-Her2t或CD19CAR-T2A-EGFRt的CD4和CD8Tcm(107个)经静脉注入NOD/scid IL-2RγC缺陷型小鼠，伴随皮下注射5×106个 细胞以提供人IL-15的全身供给。注射后14天收获骨髓，并通过流式细胞术分析细胞悬液。(图B)三张图显示对有生活力的细胞(93.6％淋巴细胞)、单个细胞(98.8％)和活细胞(99.9％)设门的细胞。(B)CD8和CD45染色从左到右(模拟，CD19CAR-T2A-Her2t，CD19CAR-T2A-EGFRt Tcm)。至少1×107个细胞被记录在有生活力的细胞、单个细胞和活细胞门内。所以尽管CD45+细胞代表约1％的群，但其等价于1x105个细胞。其余的细胞是小鼠骨髓细胞。(图C)用生物素化赫赛汀或爱必妥和SA-APC将人CD45+细胞共染色。鉴别来自骨髓的表达Her2t或EGFRt的Tcm。(图D)使用聚L-赖氨酸将表达TM-LCL亲代、Her2t或EGFRt的Tcm粘附在载玻片上，然后用生物素化赫赛汀和SA-AF647染色。当用生物素化赫赛汀和SA-AF647染色时，仅表达Her2或Her2t的细胞呈现染色。 [0025] 图6.Her2t和EGFRt阳性T细胞的多重分选纯化。将H9细胞(5×106个亲代、Her2t+、EGFRt+或Her2t+/EGFRt+细胞)混合在一起，然后经历纯化。基于生物素化赫赛汀和抗生物素多重分选珠，初始地纯化细胞。然后将多重分选珠移除，随后基于爱必妥APC和抗APC微珠使阳性部分经历纯化。最终的阳性部分对Her2t和EGFRt是双阳性的。 [0027] 图8.Her2tG显示与赫赛汀结合的提高。用具有Her2t或Her2tG的慢病毒以MOI为1转导H9细胞。然后通过生物素化赫赛汀和抗生物素微珠根据制造商的方案纯化转导的细胞。然后使用生物素化赫赛汀和链霉亲和素-PE针对Her2t或Her2tG将纯化的群染色。直方图显示与Her2tG更强的结合。 [0028] 图9.Her2tG显示结合赫赛汀的最大能力。用0.05、0.1、0.25、0.5、1和3μl的慢病毒(从左到右)转导H9细胞，之后5天分析赫赛汀的结合。Her2t变体Her2t(CD28铰链)能够以与原始Her2t相似的水平结合赫赛汀(未显示Her2t染色而是基于之前的经验)。相对于Her2t或Her2t(CD28铰链)，Her2t(CD4铰链)提高了赫赛汀结合，然而Her2tG变体具有最大的结合赫赛汀和使转导的H9细胞染色的能力。 [0029] 定义 [0030] 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的意义。 [0031] 如本文使用的“大约”当指可测值时，意思是涵盖给定值的±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，以及进一步更优选±0.1％的变化。 [0032] 如本文使用的“抗原”或“Ag”指引起免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的激活，或上述两者。显而易见的是抗原可以是合成产生的，重组产生的或可以来源于生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体，例如血液、血浆和腹水。 [0033] 如本文描述的“抗肿瘤作用”指可以通过肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数量的减少、转移数目的减少、预期寿命的增加或与癌症病症相关的各种生理症状的减少证明的生物作用。“抗肿瘤作用”也可以通过复发减少或复发前时间的增加证明。在一些供选择的方案中，提供了治疗患者的方法，其中方法包括施用有效量的组合物，其中组合物包括细胞，组合物的细胞表达嵌合抗原受体和遗传标签，所述嵌合抗原受体包括结合于癌细胞上表达的肿瘤抗原的抗原结合域。在一些供选择的方案中，组合物具有抗肿瘤作用。 [0034] 如本文描述的“嵌合受体”指合成设计的受体或其他受体如共刺激域，所示合成设计的受体包括抗体或其他蛋白序列的配体结合域，所示其他蛋白序列结合于疾病或紊乱相关的分子，并且通过间隔域连接于T细胞的一个或多个胞内信号传导域。嵌合受体也可以指人工T细胞受体、嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体和嵌合抗原受体(CAR)。这些CAR是工程化的受体，该工程化的受体可以将任意的特异性移植于免疫受体细胞上。一些研究者所称的嵌合抗原受体或“CAR”包括抗体或抗原片段、间隔区、信号传导域和跨膜域。然而，因为修饰CAR的不同组件或域如表位结合区(例如，抗体片段，scFv或其部分)、间隔区、跨膜域和/或信号传导域的惊人作用，在本文的某些上下文中CAR的组件作为独立元件被描述。CAR的不同元件的变化例如可以导致对特异性表位更强的结合亲和性。 [0035] 如本文使用的术语“共刺激域”指向T细胞提供信号的信号部分，所述信号除例如TCR/CD3复合物的CD3ζ链提供的初级信号以外，介导T细胞应答，包括但不限于激活、增殖、分化、细胞因子分泌等。共刺激域可以包括但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和/或与CD83特异性结合的配体中的全部或一部分。在一些供选择的方案中，共刺激域是与其他胞内介质相互作用以介导包括激活、增殖、分化和细胞因子分泌等的细胞应答的胞内信号传导域。在本文描述的一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括共刺激域。 [0036] 本文使用的“编码”指在如基因、cDNA或mRNA的多核苷酸中核苷酸的作为模板用于合成其他大分子如定义的氨基酸序列的特异性序列的性质。编码(Coding for)可以与术语“编码(encoding)”交换地使用。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。“编码多肽的核酸序列”包括所有彼此的简并形式和编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。 [0037] 如本文使用的“细胞毒性T淋巴细胞”(CTL)，指在其表面上表达CD8的T淋巴细胞(即CD8+T细胞)。在一些供选择的方案中，这样的细胞优选是抗原刺激过的(antigen-experienced)“记忆”T细胞(TM细胞)。 [0038] 如本文使用的“中枢记忆”T细胞(或“TCM”)，指与初始细胞相比，在其表面上表达CD62L或CCR-7和CD45RO，并且不表达或减少表达CD45RA的抗原刺激过的CTL。在一些供选择的方案中，中枢记忆细胞与初始细胞相比，对CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和/或CD95表达呈阳性，和/或具有减少的CD54RA表达。在一些供选择的方案中，提供了宿主细胞，其中宿主细胞是抗原特异性的。在一些供选择的方案中，细胞是中枢记忆T细胞。 [0039] 如本文使用的“效应记忆”T细胞(或“TEM”)指与中枢记忆细胞相比，在其表面上不表达或减少表达CD62L，并且与初始细胞相比，不表达或具有减少的CD45RA表达的抗原刺激过的T细胞。在一些供选择的方案中，效应记忆细胞对与初始细胞或中枢记忆细胞相比，CD62L和CCR7表达呈阴性，以及具有CD28和CD45RA的可变表达。在一些供选择的方案中，提供了宿主细胞，其中宿主细胞是抗原特异性的。在一些供选择的方案中，细胞是效应记忆T细胞。 [0040] 如本文使用的“初始”T细胞指与中枢记忆细胞或效应记忆细胞相比，表达CD62L和CD45RA，并且不表达CD45RO-的非抗原刺激过的T淋巴细胞。在一些供选择的方案中，初始CD8+T淋巴细胞被表征为初始T细胞的包括CD62L、CCR7、CD28、CD127和/或CD45RA的表型标记物的表达。在一些供选择的方案中，提供了宿主细胞，其中宿主细胞是抗原特异性的。在一些供选择的方案中，细胞是初始T细胞。 [0041] 如本文使用的“效应”“TE”T细胞指与中枢记忆T细胞或初始T细胞相比，不表达或减少表达CD62L、CCR7和/或CD28的抗原刺激过的细胞毒性T淋巴细胞，并且对颗粒酶B和/或穿孔素呈阳性。在一些供选择的方案中，提供了宿主细胞，其中宿主细胞是抗原特异性的。在一些供选择的方案中，细胞是效应T细胞。 [0042] 如本文描述的“T细胞前体”指可以迁移至胸腺并成为不表达T细胞受体的T细胞前体的淋巴样前体细胞。所有T细胞来源于骨髓中的造血干细胞。来自造血干细胞的造血祖细胞(淋巴样祖细胞)位于胸腺并通过细胞分裂扩增产生一大群不成熟的胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，并且因此被分类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着它们通过发育发展，它们成为双阳性胸腺细胞(CD4+CD8+)，并且最终成熟为单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)胸腺细胞，然后从胸腺释放至外周组织。 [0043] 大约98％的胸腺细胞在胸腺中的发育过程中通过阳性选择或阴性选择失败而死亡，而其他2％胸腺细胞存活并离开胸腺成为成熟的免疫活性T细胞。 [0044] 前体T细胞的双阴性(DN)阶段集中于产生功能性β-链，而双阳性(DP)阶段集中于产生功能性α-链，最终产生功能性αβT细胞受体。随着发育中的胸腺细胞发展经过4个DN阶段(DN1、DN2、DN3和DN4)，T细胞表达不变的α-链但是重排β-链基因座。如果重排的β-链成功地与不变的α-链配对，产生停止β-链的重排(并沉默交互等位基因)，并且导致细胞增殖的信号。虽然这些信号需要在细胞表面处的这种前-TCR，但是他们依赖于结合于前-TCR的配体。这些胸腺细胞然后会表达CD4和CD8两者并发展至发生α-链选择的双阳性(DP)阶段。如果重排的β-链没有导致任意信号传导(例如由于不能与不变的α-链配对)，细胞可能由于被忽略而死亡(缺少信号传导)。 [0045] 如本文描述的“造血干细胞”或“HSC”，是可以引起骨髓样细胞的前体细胞，所述骨髓系细胞例如巨噬细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞和淋巴系(例如T细胞、B细胞、NK细胞)。HSC具有异源群体，其中存在三类干细胞，通过他们在血液中淋巴系与骨髓系后代的比例(L/M)区分他们。 [0046] 如本文使用的以描述混合物中细胞类型的量的“富集的”和“贫化的”指使细胞的混合物经历方法或步骤，导致“富集的”型细胞的数目的增加，以及“贫化的”细胞的数目减少。因此，根据经历富集方法的细胞的原始群的来源，混合物或组合物可含有60、70、80、90、95％或99％或更多(数目或计数上)的“富集的”细胞，包括任意的列出的值的任意两个端点之间的任意整数，和/或40、30、20、10、5％或1％或更少(数目或计数上)的“贫化的”细胞，包括任意的列出的值的任意两个端点之间的任意整数。 [0047] 如本文使用的“表位”指被包括抗体、T细胞和/或B细胞的免疫系统识别的抗原或分子的一部分。表位通常具有至少7个氨基酸，并且可以是线性的或构象的。 [0048] “Her2”或“ERBB2”指需要用于配体结合的共受体的膜结合蛋白激酶受体。Her2的示例性多肽参考序列见于Uniprot记录P04626和SEQ ID NO：23(表8)。全长参考序列具有1255个氨基酸，包括第1-22位氨基酸为信号序列，第23-652位氨基酸为胞外域，第653-675位氨基酸为跨膜域，以及第676-1255位氨基酸为胞浆域，如表8中所示。全长成熟多肽序列具有1233个氨基酸，因为成熟多肽中不包括前导序列。许多天然存在的变体和同种型是已知的。在Genbank X03363/gI 31197找到核酸参考序列。胞外域具有4个区域，对应于：SEQ ID NO：23的第23-217位氨基酸为域I；第218-341位氨基酸为域II；第342-510位氨基酸为域III；和第511-562位氨基酸为域IV。 [0049] “Her2t”指Her2的序列片段，并用作对转基因表达的遗传标签。在一些供选择的方案中，Her2t包括Her2胞外域的域IV，并且不包括全长Her2。在一些供选择的方案中，Her2t特异地结合于对Her2的域IV特异性的抗体。在其他供选择的方案中，Her2t包括SEQ ID NO：23的第511-562位氨基酸或第563-652位氨基酸。 [0050] “分离的”用于描述本文公开的不同的多肽，并且意思是已经从其自然环境的组分中鉴别和分开和/或回收的多肽或核酸。优选地，分离多肽或核酸不与所有与其自然关联的组分关联。其自然环境的污染组分是将典型地干扰多肽或核酸的诊断或治疗用途并且可以包括酶、激素和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质的物质。 [0051] 如本文使用的“胞内信号传导域”指提供淋巴细胞的激活的分子(这里是嵌合受体分子)的一个或多个域的全部或部分。这样的分子的胞内域通过与胞内介质相互作用介导信号，导致增殖、分化、激活和其他效应功能。在一些供选择的方案中，这样的分子包括CD28、CD3和/或4-1BB的全部或部分或其组合。 [0052] 如本文使用的“配体”指特异性结合另一种物质以形成复合物的物质。配体的例子包括抗原上的表位，结合于受体、底物、抑制剂、激素和激活剂的分子。如本文使用的“配体结合域”指结合于配体的物质或物质的一部分。配体结合域的例子包括抗体的抗原结合部分、受体的胞外域和酶的活性位点。 [0053] 如本文使用的“可操作地连接”指调控序列和异源核酸序列间的功能性连接导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列以功能性关系放置时，则第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。比如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接于编码序列。一般地，可操作地连接的DNA是连续的，并且，必要时其在相同的读码框内连接两个蛋白编码区。 [0054] 关于本文鉴别的遗传标签多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列一致性”被定义为在比对序列，并如需要引入空缺以获得最大百分比序列一致性，并不考虑任意保守置换作为序列一致性的一部分之后，在与参比序列中的氨基酸残基一致的候选序列中氨基酸残基的百分比。以确定百分比氨基酸序列一致性的为目的的比对，可以以多种本领域技术中的方法完成比对，比如，使用公开可获得的电脑软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适的参数，包括用于获得对要比较的序列的全长的最大对比需要的任意算法。例如，使用WU-BLAST-2计算机程序[Altschul等人，Methods in Enzymology，266：460-480(1996)]产生的％氨基酸序列一致性值使用数个搜索参数，其中大多数设置为缺省值。不设置为缺省值的那些值(即可调参数)设置为以下值：重叠跨距＝1，重叠分数＝0.125，词阈值(T)＝11以及打分矩阵＝BLOSUM62。通过将(a)SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸中提供的参比Her2序列的每个或所有多肽氨基酸序列与通过WU-BLAST-2测量的感兴趣的对比氨基酸序列之间的匹配一致的氨基酸残基的数目除以(a)感兴趣的多肽的氨基酸残基总数来确定％氨基酸序列一致性值。 [0055] 如本文使用的“遗传标签变体多肽”指如下定义的编码多肽的核酸分子，即该核酸分子与SEQ ID NO：15所示的多核苷酸序列或核苷酸或特异地衍生的其片段具有至少约80％核酸序列一致性。通常，多肽或其片段的变体与如SEQ ID NO：14中所示的核酸序列或衍生的其片段具有至少80％的核酸序列一致性，更优选至少81％的核酸序列一致性，更优选至少82％的核酸序列一致性，更优选至少83％的核酸序列一致性，更优选至少84％的核酸序列一致性，更优选至少85％的核酸序列一致性，更优选至少86％的核酸序列一致性，更优选至少87％的核酸序列一致性，更优选至少88％的核酸序列一致性，更优选至少89％的核酸序列一致性，更优选至少90％的核酸序列一致性，更优选至少91％的核酸序列一致性，更优选至少92％的核酸序列一致性，更优选至少93％的核酸序列一致性，更优选至少94％的核酸序列一致性，更优选至少95％的核酸序列一致性，更优选至少96％的核酸序列一致性，更优选至少97％的核酸序列一致性，更优选至少98％的核酸序列一致性以及又更优选至少99％的核酸序列一致性，或任意两个列出的核酸序列一致性百分比的值之间的任意核酸序列一致性百分比。变体不涵盖天然的核苷酸序列。就这一点而言，因为遗传密码的简并性，本领域技术人员会立刻认识到大量与SEQ ID No：14或编码具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽的核苷酸具有至少约80％的核酸序列一致性。 [0056] 基本上纯化的”指具有10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％或更少的其他分子类型或其他细胞类型的分子，或任意两个列出的纯化值之间的任意值。基本上纯化的细胞也指已经从在其处于天然存在状态时与其通常相关的其他细胞类型中单独细胞。在某些情况下，基本上纯化的细胞群指细胞的同源群体。 [0057] 当“大体上没有发现”用于参比中时，在正常细胞上的肿瘤抗原或其他分子的存在指具有抗原或分子的正常细胞类型的百分比和/或在细胞上的抗原的密度。在一些供选择的方案中，大体上没有发现的意思是与在肿瘤细胞或其他疾病细胞上发现的细胞的量或抗原的量相比，抗原或分子在少于50％的正常细胞类型上发现，和/或少于50％的密度。 [0058] 如本文使用的“T细胞”或“T淋巴细胞”可以来自任意哺乳动物物种，优选灵长类动物物种，包括猴子、狗和人。在一些供选择的方案中，T细胞是同种异体的(来自同物种但不同供体)作为受体受试者；在一些供选择的方案中，T细胞是自体的(供体和受体相同)；在一些供选择的方案中，T细胞是同源的(供体和受体不同但是同卵双胞胎)。 [0059] “载体”或“构建体”是用于将异源核酸引入具有调控元件的细胞以提供异源核酸在该细胞中的表达的核酸。载体包括但不限于质粒、小环、酵母和病毒基因组。在一些供选择的方案中，载体是质粒、小环、酵母和病毒基因组。 具体实施方式[0060] 本公开提供了对表达转基因的细胞提供选择标记和/或鉴别标记有用的遗传标签多肽或其变体，和编码遗传标签的核酸。 [0061] 转基因遗传标签和多肽及变体 [0062] 本发明的一个方面提供了用于转基因表达的遗传标签，所述遗传标签提供细胞中转基因表达的稳定表达。在一些供选择的方案中，遗传标签提供转导细胞的选择，所述转导细胞在与内源基因相当的水平上表达转基因。在一些供选择的方案中，遗传标签表达于细胞表面、具有降低的免疫原性、基本上不增加载体的遗传净负荷，和/或在各种细胞中提供转基因表达。 [0063] 在一些供选择的方案中，遗传标签是至少包括由抗Her2抗体识别的表位的Her2的片段，指定为Her2t。在一些供选择的方案中，抗体特异地结合于Her2的域IV。在其他供选择的方案中，抗体特异地结合于Her2的域IV并且不结合于Her2的域I、域II和/或域III中的表位。在一些供选择的方案中，抗Her2抗体是对治疗癌症在治疗上有用的抗体。在一些供选择的方案中，表位由曲妥珠单抗(赫赛汀)识别。在一些供选择的方案中，表位由曲妥珠单抗和/或与曲妥珠单抗竞争结合的抗体识别，但所述抗体不是结合于例如Her2的域I、域II和/或域III中的表位的其他抗Her2的抗体。 [0064] 在具体的供选择的方案中，表位包括如通过与赫赛汀Fab复合的Her2的晶体结构确定的氨基酸(Cho等人，Nature(2003)421：756)。Her2和赫赛汀之间的相互作用发生在域IV中的三个环区(两个静电环区和一个疏水环区)之间。HER2中关键的对赫赛汀相互作用的氨基酸如下：环1(静电的)，其包括氨基酸序列第580-584位EADQC(包括Glu 580和Asp 582)(SEQ ID NO：42)；环2(疏水的)，其包括氨基酸序列第592-595位DPPF(包括Asp 592和Phe 595)(SEQ ID NO：43)；以及环3(静电的)，其包括氨基酸序列第616-625位FPDEEGACQP(包括Gln 624)(SEQ ID NO：44)(氨基酸编码系统基于SEQ ID NO：23的整个ErbB2(Her2)序列，其包括信号传导序列，并如表8所示)。使用Cho等人的编码系统，所述编码系统从信号序列移除22个氨基酸，导致产生以下的涉及赫赛汀的HER2的氨基酸：环1Glu 558和Asp 560，环 2Asp570和Phe 573，以及环3Gln 602。在一些供选择的方案中，Her2的片段含有至少这些氨基酸残基，并且当表达于细胞表面时，进一步被选择结合于曲妥珠单抗或与曲妥珠单抗竞争结合的抗体。虽然不意味着限制本公开的范围，相信至少含有第563-652位氨基酸的Her2t片段包括可以结合曲妥珠单抗的表位，因为含有第578-652位氨基酸的更小的表位不结合于曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，Her2t片段包括Her2t的第563-652位氨基酸。 在一些供选择的方案中，Her2t片段包括Her2t的第580-584位氨基酸、Her2t的第592-595位氨基酸和Her2t的第616-625位氨基酸。 [0065] 在具体的供选择的方案中，Her2的片段包括、基本上由以下组成或由以下组成：第511-652位氨基酸(域IV)或第563-652位氨基酸，如表6所示(SEQ ID NO：18)。在一些供选择的方案中，Her2片段的变体与SEQ ID NO：18的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性或由任意两个前述的百分比限定的范围之间的序列一致性百分比，并且当表达于细胞表面上时结合于曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，变体片段具有至少9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换，优选保守的氨基酸置换。可以使用与赫赛汀Fab复合的Her2的晶体结构(Cho等人，Nature(2003))辨别这样的置换。在一些供选择的方案中，如本文描述的变体片段不包括在涉及与曲妥珠单抗结合的残基中的氨基酸置换。在一些供选择的方案中，片段包括Her2的域IV中的残基，并且不包括一个或多个Her2的其他域(包括域I、域II、域III和/或胞内域)。 [0066] 在一些供选择的方案中，遗传标签产生很少或不产生免疫应答。在一些供选择的方案中，遗传标签选自内源存在的蛋白质以利用受试者对内源蛋白质的耐受性。在一些供选择的方案中，用处理预测算法的软件分析遗传标签以预测抗原表位如MHC-I抗原肽.对于抗原决定簇分析序列：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPCHPECQPQNGSVT(SEQ ID NO：16)。在一些供选择的方案中，遗传标签的核酸序列源自和/或修饰自用于并入人工的或合成的转基因构建体中的生殖细胞系序列。 [0067] 在一些供选择的方案中，遗传标签进一步包括跨膜域。跨膜域可以源自天然来源或合成来源。当来源是天然来源时，域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜域至少包括T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3、CD45、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154的跨膜域。在具体的供选择的方案中，跨膜域包括如表6所示的Her2跨膜域的氨基酸序列(例如第653-675位氨基酸(SEQ ID NO：20))。编码Her2跨膜域的代表性多核苷酸序列(SEQ ID NO：19)如表6所示。 [0068] 在一些供选择的方案中，合成跨膜域或变体跨膜域主要包括疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些供选择的方案中，跨膜域可与表6所示的跨膜域具有至少80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸序列一致性或由任意两个前述的百分比限定的范围之间的序列一致性百分比。变体跨膜域优选具有通过凯特-杜利特(Kyte Doolittle)计算的至少50的疏水分数。 [0069] 在一些供选择的方案中，遗传标签包括提高遗传标签的表面表达的肽。这样的肽包括，例如包括粒细胞巨噬细胞刺激因子信号序列、内源Her2前导肽(第1-22个氨基酸)、I型信号肽、IgGκ信号肽和/或CD8前导序列。在一些供选择的方案中，前导序列具有SEQ ID NO：17的序列。 [0070] 在具体的供选择的方案中，遗传标签包括结合曲妥珠单抗的Her2的片段，和以SEQ ID NO：20为示例的跨膜域。在另一种具体的供选择的方案中，遗传标签包括提高表面表达的肽，结合曲妥珠单抗的Her2的片段，和以SEQ ID NO：15为示例的跨膜域。在一些供选择的方案中，遗传标签的变体与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：20的序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性或由任意两个前述的百分比限定的范围之间的序列一致性百分比，并且当表达于细胞表面上时结合于曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，变体片段具有至少9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换，优选保守的氨基酸置换。在一些供选择的方案中，变体片段不包括涉及结合于曲妥珠单抗的残基的氨基酸置换。 [0071] 任选地，接头序列可以在遗传标签序列和/或遗传标签的单独的一个或多个功能域(例如提高表面表达的肽、遗传标签、跨膜域)之前。接头序列任选地是可切割的，例如，T2A序列(如表1所示)或IRES序列。可切割的接头序列典型地位于核酸构建体中的遗传标签之前。其他接头序列典型地是约2-15个氨基酸的短肽，并位于遗传标签的功能域(包括提高表面表达的肽、遗传标签和跨膜域)之间。在一些供选择的方案中，接头在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸之间，并位于遗传标签的功能域(包括提高表面表达的肽、遗传标签和跨膜域)之间。在一些供选择的方案中，接头是可切割的接头。在一些供选择的方案中，接头是可切割的T2A序列。在一些供选择的方案中，接头包括IRES序列。 [0072] 在一些供选择的方案中，系统进一步包括一个或多个另外的遗传标签。在供选择的方案中，另外的遗传标签序列是表皮生长因子受体(EGFRt)序列的片段。表7中提供了这样的序列的例子。典型地，遗传标签序列具有允许选择转导的细胞和/或检测转导的细胞的功能性特征。在一些供选择的方案中，遗传标签序列与人淋巴细胞的转导相容。 [0073] 在其他供选择的方案中，另外的遗传标签是阳性选择标记。阳性选择遗传标签可以是基因，在该基因被引入宿主细胞时，表达允许携带所述基因的细胞的阳性选择的显性表型。该类型的基因是本领域已知的，并且包括，尤其是提供对潮霉素B抗性的潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)，编码对抗生素G418抗性的来自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)，提供对氨甲蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，DHFR dm，提供对嘌呤霉素抗性的pac基因，使博来霉素失活的Sh ble基因、腺苷脱氨酶基因(ADA)和多药抗性(MDR)基因。在这些药剂的存在下培养的转导的细胞会存活并被选择。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。 [0074] 在供选择的方案中，第一核酸进一步包括编码遗传标签序列的多核苷酸。在一些供选择的方案中，遗传标签序列是Her2t序列。Her2t序列的示例性多核苷酸和氨基酸示于表6并分别由SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15提供。在供选择的方案中，遗传标签序列是表皮生长因子受体片段(EGFRt)，如表7所示截短的表皮生长因子受体的示例性多核苷酸是SEQ ID NO：22。 [0075] 可以通过合成方法或重组方法由氨基酸序列容易地制备编码遗传标签的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码遗传标签序列的多核苷酸可操作地连接于编码接头序列的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码遗传标签序列的多核苷酸也可在编码序列的5’和/或3’端具有一个或多个限制性酶切位点，以用另一种编码不同遗传标签序列的多核苷酸提供编码该标签序列的多核苷酸的容易的切除和替换。在一些供选择的方案中，编码标记序列的多核苷酸是针对在哺乳动物细胞，优选人被密码子优化的。 [0076] 在一些供选择的方案中，可以采用两个或更多个遗传标签序列。在一些供选择的方案中，第一遗传标签序列可操作地连接于第一嵌合抗原受体，并提供转导细胞表达第一CAR的指示。在其他供选择的方案中，第二遗传标签序列可操作地连接于第二且不同的CAR，并提供转导细胞表达第二CAR的指示。 [0077] 核酸和载体 [0078] 本公开的另一方面包括编码如本文描述的遗传标签的核酸构建体和其变体。 [0079] 在一些供选择的方案中，核酸编码片段Her2或其变体的氨基酸序列。在具体的供选择的方案中，核酸编码具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的多肽。在具体的供选择的方案中，核酸编码具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的多肽。在供选择的方案中，遗传标签序列是如表7所示的表皮生长因子受体片段(EGFRt)。用于截短的表皮生长因子受体的示例性多核苷酸是SEQ ID NO：21。核酸包括核酸序列、退化序列(degenerate sequences)和变体序列，所述核酸序列是针对在人体内表达被密码子优化的。 [0080] 载体 [0081] 在一些供选择的方案中，载体包括编码遗传标签的核酸。编码遗传标签的核酸可以被包装于载体中作为单独的构建体或连接于编码转基因的核酸。在一些供选择的方案中，编码遗传标签的核酸被包装于载体中作为单独的构建体或连接于编码转基因的核酸。 [0082] 可以构建各种载体组合以提供转导和转基因表达的效率。在一些供选择的方案中，载体是双包装的或单独的(所有在一个中)病毒载体。在其他供选择的方案中，载体可以包括病毒载体和质粒载体的组合。其他病毒载体包括泡沫病毒、腺病毒载体、反转录病毒载体和慢病毒载体。在供选择的方案中，载体是慢病毒载体。 [0083] 在一些供选择的方案中，质粒载体或病毒载体包括核酸，所述核酸包括编码遗传标签的多核苷酸。在一些供选择的方案中，遗传标签包括编码Her2t的多核苷酸，并进一步包括启动子、编码提高表面表达的肽的多核苷酸和/或编码跨膜域的多核苷酸。在具体的供选择的方案中，可操作地连接于启动子的第一核酸编码具有SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：15的序列的多肽或其变体。 [0084] 在一些供选择的方案中，质粒或病毒载体包括可操作地连接于编码嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子，编码嵌合抗原受体的多核苷酸可操作地连接于编码遗传标签的多核苷酸。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体指向CD19或CD20，并且遗传标签包括Her2t片段。在一些供选择的方案中，编码CAR的多核苷酸用自切割接头可操作地连接于遗传标签。在其他供选择的方案中，质粒或病毒载体包括可操作地连接于编码CD19嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子，编码CD19嵌合抗原受体的多核苷酸可操作地连接于编码Her2t或EGFRt的多核苷酸。在其他供选择的方案中，质粒或病毒载体包括可操作地连接于编码CD20嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子，编码CD20嵌合抗原受体的多核苷酸可操作地连接于编码Her2t或EGFRt的多核苷酸。 [0085] 核酸的每个元件可以用接头序列，优选自切割接头如T2A自切割序列相互分开。 [0086] 在其他供选择的方案中，异种(对载体异种的，例如慢病毒载体)核酸序列受另外的可以包装在载体中的遗传组件的量限制。在一些供选择的方案中，构建体含有至少两个对病毒载体异种的基因。在一些供选择的方案中，构建体含有不多于4个对病毒载体异种的基因。对可以包装在载体中的病毒载体异种的基因的数目可以通过检测一个或多个转基因的表达以及选择提供转导至少10％的细胞和/或转基因在至少10％细胞中的可检测的表达水平的载体构建体来确定。 [0087] 在一些供选择的方案中，慢病毒是双包装病毒。双包装病毒含有至少一种核酸，所述核酸包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸和第一遗传标签。任选地，核酸进一步包括编码细胞因子和/或趋化因子受体的多核苷酸。双包装病毒含有至少一个核酸，所述核酸包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸和第二遗传标签。任选地，核酸进一步包括编码细胞因子和/或趋化因子受体的多核苷酸。在具有两个构建体的系统的一些供选择的方案中，可以将每个构建体包装于单独的病毒载体，并且将所述病毒载体可以混合在一起用于在细胞群转导。在一些供选择的方案中，第一遗传标签和第二遗传标签是彼此不同。 [0088] 在一些供选择的方案中，双包装病毒提供在单个细胞类型中至少两个不同的转基因的表达(如CAR构建体)。使用不同的遗传标签提供双转导细胞的选择。在具体的供选择的方案中，质粒或病毒载体包括可操作地连接于编码CD19 嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子，编码CD19嵌合抗原受体的多核苷酸可操作地连接于编码Her2t的多核苷酸。在其他供选择的方案中，质粒或病毒载体进一步包括可操作地连接于编码CD20嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子，编码CD20嵌合抗原受体的多核苷酸可操作地连接于编码EGFRt的多核苷酸。 [0089] 在一些供选择的方案中，载体是小环。小环是作为没有任何细菌质粒DNA骨架的环状表达盒产生的附加体DNA载体。小环的更小的分子大小使得能够更有效的转染，并且与仅工作几天的标准质粒载体相比提供了在几周的时间内的持续表达。在一些供选择的方案中，小环包括连接于编码嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子，编码嵌合抗原受体的多核苷酸连接于遗传标签。可以采用一个或多个小环。在一些供选择的方案中，一种小环包括连接于编码嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子和第一遗传标签，另一种小环包括连接于编码嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子和不同的第二遗传标签。在一些供选择的方案中，构建体的每个元件被核酸，如编码自切割T2A序列的元件分开。在一些供选择的方案中，每个小环在嵌合抗原受体上区别于彼此，包括但不限于间隔区长度和序列、胞内信号传导域和/或遗传标签序列。 [0090] 在一些供选择的方案中，载体是Piggy Bac转座子。PiggyBac(PB)转座子是通过“剪切和粘贴”机制有效地在载体和染色体间转座的可移动遗传元件。在转座期间，PB转座酶识别位于转座子载体两个末端的转座子特异性反向末端重复序列(ITRs)，并有效地从原始位点移动内容物并有效将所述内容物整合到TTAA染色体位点。PiggyBac转座子系统的强大活性使在PB载体中的两个ITR之间的感兴趣的基因能够容易地移入靶基因组。 [0091] 在一些供选择的方案中，PB含有连接于编码嵌合抗原受体的多核苷酸启动子，编码嵌合抗原受体的多核苷酸可操作地连接于遗传标签。可采用一个或多个PB转座子。在一些供选择的方案中，一种PB包括连接于编码嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子和第一遗传标签，另一种PB包括连接于编码嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子和不同的第二遗传标签。在一些供选择的方案中，构建体的每个元件被核酸，如编码自切割T2A序列的元件分开。在一些供选择的方案中，每个PB在嵌合抗原受体上彼此不同，所述不同包括但不限于间隔区长度和序列、胞内信号传导域和/或遗传标签序列。 [0092] 在一些供选择的方案中，第一核酸包括：第一启动子，所述第一启动子可操作地连接于编码包括配体结合域的嵌合抗原受体的多核苷酸，其中配体结合域结合于配体，其中配体是肿瘤特异性分子、病毒分子或适合于通过淋巴细胞介导识别和清除的表达于靶细胞群上任何其他分子；编码多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区提供了与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加；编码跨膜域的多核苷酸；以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，第一核酸进一步包括遗传标签。 [0093] 在一些供选择的方案中，第二核酸包括编码不同的第二嵌合抗原受体的多核苷酸。第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体可在配体结合域、靶抗原、靶抗原的表位、间隔区的长度和序列(短、中或长)以及区别于胞内信号传导域方面彼此不同。在一些供选择的方案中，第二核酸进一步包括来自第一核酸的不同的第二遗传标签。 [0094] 在一些供选择的方案中，在单个慢病毒构建体中，可通过基因组绝缘子核酸如海胆绝缘子染色质域将第一核酸和第二核酸分隔。 [0095] 在一些供选择的方案中，本文使用的启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。诱导型启动子包括它莫西芬诱导型启动子，四环素诱导型启动子和强力霉素诱导型启动子(例如tre)启动子。组成型启动子包括SV40、CMV、UBC、EF1alpha、PGK和CAGG。 [0096] 这些载体中的一个或多个可以用于相互结合以转导耙细胞并提供嵌合抗原受体的表达。 [0097] 转基因 [0098] 数个转基因也是本发明的方面。 [0099] 本文描述的遗传标签用于选择、追踪和杀伤用转基因转导和表达转基因的细胞。遗传标签可以与任何数目的不同转基因使用。在本公开中，嵌合抗原受体转基因是示例性的，但相似的原理施用于其他表达于转导的细胞中的转基因的设计、鉴别和选择。 [0100] 嵌合抗原受体 [0101] 数个嵌合抗原受体可以用于本文描述的供选择的方案中。 [0102] 用于嵌合抗原受体表达的系统包括：第一核酸，所述第一核酸包括连接于编码嵌合抗原受体的多核苷酸的第一启动子，所述嵌合抗原受体包括配体结合域，其中配体结合域结合于配体，其中配体是肿瘤特异性分子、病毒分子或适合于通过淋巴细胞介导识别和清除的表达于靶细胞群上任何其他分子；编码多肽间隔区的多核苷酸，其中间隔区提供了与参比嵌合受体相比应答配体的T细胞增殖和/或细胞因子产生的增加；编码跨膜域的多核苷酸；以及d)编码胞内信号传导域的多核苷酸。在其他供选择的方案中，另一种编码嵌合抗原受体的多核苷酸在组成型启动子的控制下。 [0103] 配体结合域 [0104] 许多配体结合域可以用于本文描述的供选择的方案中。 [0105] 在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括编码配体结合域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，配体结合域特异性结合于肿瘤或病毒特异性抗原。在一些供选择的方案中，配体结合域包括但不限于受体或其部分、小肽、模拟肽、底物、细胞因子等。在一些供选择的方案中，配体结合域是抗体或其片段。可以容易地确定抗体或抗体片段的核酸序列。在具体的供选择的方案中，多核苷酸编码特异性结合CD19的单链Fv。在其他具体的供选择的方案中，多核苷酸编码特异性结合CD20、HER2、CE7、hB7H3或EGFR的单链Fv。这些抗体的序列对本领域技术人员是已知的，并且可以容易地被本领域技术人员确定。 [0106] 肿瘤抗原是通过引起免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本公开的配体结合域的选择取决于要治疗的癌症的类型，并且可以靶向于肿瘤抗原或其他肿瘤细胞表面分子。来自受试者的肿瘤样本可以通过某些生物标记物或细胞表面标记物的存在来表征。例如，来自受试者的乳腺癌细胞对Her2Neu、雌激素受体和/或黄体酮受体中的每一个可以是阳性或阴性的。选取在个体受试者的肿瘤细胞上可以发现的肿瘤抗原或细胞表面分子。肿瘤抗原和细胞表面分子是本领域中熟知的，并且包括例如癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、黄体酮受体、ephrinB2、CD19、CD171、EGFR、CD20、CD22、CD23、CD123、CS-1、CE7、hB7H3、ROR1、间皮素、c-Met、GD-2和/或MAGE A3 TCR。在一些供选择的方案中，靶分子是在肿瘤细胞上发现的细胞表面分子，并且基本上在正常组织上没有发现或其表达限于不重要的正常组织。 [0107] 在一种供选择的方案中，肿瘤上的靶分子包括与恶性肿瘤相关的一个或多个表位。恶性肿瘤表达可以充当用于T细胞受体或嵌合受体介导的识别的靶抗原的大量蛋白质。其他靶分子属于细胞转化相关分子如CD19或CD20的组。在一些供选择的方案中，与相同组织类型的对照细胞相比，在肿瘤细胞上选择性地表达或过表达肿瘤抗原。在其他供选择的方案中，肿瘤抗原是细胞表面多肽。 [0108] 一旦鉴别可以用嵌合受体靶向的肿瘤细胞表面分子，选择和表征靶分子的表位。可以使用获得单克隆抗体的方法、噬菌体展示的方法、产生人或人源化抗体的方法或使用工程化以产生人抗体的转基因动物或植物的方法制备特异性结合肿瘤细胞表面分子的抗体。部分或全部的合成抗体的噬菌体展示文库是可用的并且可以筛选用于可以结合靶分子的抗体或其片段。人抗体的噬菌体展示文库也是可用的。在一些供选择的方案中，抗体特异性结合于肿瘤细胞表面分子并且不与如牛血清白蛋白或其他不相关的抗原的非特异性组分交叉反应。一旦鉴别，可以分离和/或确定编码抗体的氨基酸序列或多核苷酸序列。在一些供选择的方案中，针对可以结合于靶分子的抗体或其片段，筛选部分或全部的合成抗体的噬菌体展示文库。 [0109] 抗体或抗原结合片段包括多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微体和线性抗体中的全部或部分。“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区，并且可以被容易地制备。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和FV片段；双价抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。 [0110] 在一些供选择的方案中，可以分离和表征大量结合于具体肿瘤细胞表面分子的不同抗体。在一些供选择的方案中，基于靶分子的表位特异性表征抗体。另外，在一些供选择的方案中，可以基于抗体对表位的亲和性选择结合于相同表位的抗体。在一些供选择的方案中，抗体具有至少1mM以及优选＜50nM的亲和性。在一些供选择的方案中，选择与其他抗体相比对表位具有更大亲和性的抗体。在一些供选择的方案中，选择亲和性为结合于相同表位的参比抗体的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或至少50倍的抗体。在一些供选择的方案中，选择亲和性为结合于相同表位的参比抗体的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或至少50倍，或亲和性大于任意两个上述值限定的范围内的参比抗体的亲和性的抗体。 [0111] 在一些供选择的方案中，靶分子选自CD19、CD20、CD22、CD23、CE7、hB7H3、EGFR、CD123、CS-1、ROR1、间皮素、Her2、c-Met、PSMA、GD-2，和/或MAGE A3 TCR和其组合。在一些供选择的方案中，当Her2CAR构建体是希望的时，遗传标签包括不结合于用于CAR构建体中的Her2的scFv的表位。在一些供选择的方案中，当EGFR CAR是希望的时，遗传标签包括不结合于用于CAR构建体中的EGFR的scFv的表位。 [0112] 在具体的供选择的方案中，靶抗原是CD19。大量对CD19特异性的抗体对本领域技术人员是已知的，并且可以容易地表征序列、表位结合和亲和性。在具体的供选择的方案中，嵌合受体构建体包括来自FMC63抗体的scFV序列。在其他供选择的方案中，scFV是包括含有可变区轻链的人或人源化ScFv，所述可变区轻链包括RASQDISKYLN(SEQ ID NO：27)的CDRL1序列、SRLHSGV(SEQ ID NO：28)的CDRL2序列和GNTLPYTFG(SEQ ID NO：29)的CDRL3序列。在其他供选择的方案中，scFV是包括含有可变区重链的人或人源化ScFv，所述可变区重链包括DYGVS(SEQ ID NO：30)的CDRH1序列，VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO：31)的CDRH2序列和YAMDY(SEQ ID NO：32)的CDRH3序列。本公开也考虑与FMC63的scFv具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性或由任意两个前述的百分比限定的范围之间的百分比序列一致性，以及对CD19至少具有相同亲和性的可变区。 [0113] 在一些供选择的方案中，在如Kabat编号的如下的抗体区域内发现CDR区：对轻链，CDRL1第24-34位氨基酸、CDRL2第50-56位氨基酸、CDRL3在第89-97位氨基酸；对于重链，CDRH1在第31-35位氨基酸、CDRH2在第50-65位氨基酸、以及CDRH3在第95-102位氨基酸。可以容易地确定抗体中的CDR区。 [0114] 在具体的供选择的方案中，靶抗原是CD20。大量对CD20特异性的抗体对本领域技术人员是已知的，并可以容易地表征序列、表位结合和亲和性。在具体的供选择的方案中，嵌合受体构建体包括如表9所示的scFV序列。在其他供选择的方案中，scFV是包括轻链可变区的人或人源化ScFv，所述可变区轻链包括CDRL1序列R A S S S V N Y M D(SEQ ID NO：33)、CDRL2序列A T S N L A S(SEQ ID NO：34)和CDRL3序列Q Q W S F N P P T(SEQ ID NO：35)。在其他供选择的方案中，scFV是包括重链可变区的人或人源化ScFv，所述可变区重链包括CDRH1序列S Y N M H(SEQ ID NO：36)、CDRH2序列A I Y P G N G D T S Y N Q K F K G(SEQ ID NO：37)和CDRH3序列S N Y Y G S S Y W F F D V(SEQ ID NO：38)。可以从scFV的氨基酸序列容易地确定CDR序列。本公开也预期了与CD20的scFv具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列一致性，或由任意两个前述的百分比限定的范围之间的序列一致性百分比以及对CD20至少具有相同亲和性的可变区。 [0115] 在一些供选择的方案中，编码配体结合域的多核苷酸可操作地连接于编码间隔区的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码配体结合域的多核苷酸也可以在编码序列的5’和/或3’端具有一个或多个限制性酶切位点，以用编码不同抗原的或具有不同结合特征的、编码配体结合域的另一个多核苷酸提供该多核苷酸的容易的切除和替换。例如，在前导序列的上游编码限制性酶切位点NheI；以及位于铰链区内的3’RsrII使得将任何希望的scFv亚克隆至嵌合受体载体。在一些供选择的方案中，多核苷酸是针对在人细胞中表达而密码子优化的。在一些供选择的方案中，多核苷酸是针对在人细胞中表达被密码子优化的。 [0116] 在一些供选择的方案中，编码配体结合域的多核苷酸可操作地连接于信号肽。在一些供选择的方案中，信号肽是用于粒细胞集落刺激因子的信号肽。可以利用编码其他信号肽如CD8α的多核苷酸。 [0117] 一些供选择的方案中，编码配体结合域的多核苷酸可操作地连接于启动子。选择提供在哺乳动物细胞中表达嵌合抗原受体的启动子。在具体的供选择的方案中，启动子是诱导型启动子。 [0118] 编码配体结合域的多核苷酸的具体的供选择的方案作为来自特异性结合CD19如FMC63的抗体的scFv示于表1中。编码包括氨基酸GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：39)的柔性接头的多核苷酸分离scFV 的VH和VL链。包括接头的scFv的氨基酸序列示于表1(SEQ ID NO：2)。其他靶向CD19的抗体如SJ25C1和HD37是已知的(SJ25C1：Bejcek等人.Cancer Res 2005，PMID 7538901；HD37：Pezutto等人.JI 1987，PMID 2437199)。 [0119] 编码配体结合域的多核苷酸的具体的供选择的方案作为来自特异性结合CD20的抗体的scFv示于表9中。编码包括氨基酸GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：39)的柔性接头的多核苷酸分离scFV的VH和VL链。scFv的氨基酸序列示于表9(SEQ ID NO：25)。其他靶向CD20的抗体如1F5是已知的(Budde等人.2013，PLOS One)。 [0120] 间隔区 [0121] 在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括编码间隔区的多核苷酸。典型地，在嵌合受体的配体结合域和跨膜域之间发现间隔区。在一些供选择的方案中，间隔区提供配体结合域的柔性，使得在淋巴细胞中高表达。具有229个氨基酸的间隔区的CD19特异性嵌合受体具有比具有仅由修饰的IgG4铰链组成的短间隔区的CD19特异性嵌合受体低的抗肿瘤活性。 [0122] 在一些供选择的方案中，间隔区具有至少10至229个氨基酸、10至200个氨基酸、10至175个氨基酸、10至150个氨基酸、10至125个氨基酸、10至100个氨基酸、10至75个氨基酸、10至50个氨基酸、10至40个氨基酸、10至30个氨基酸、10至20个氨基酸或10至15个氨基酸，或由任意两个上述的氨基酸长度限定的范围内的长度。在一些供选择的方案中，间隔区具有12个氨基酸或更少但多于1个氨基酸、119个氨基酸或更少但多于1个氨基酸，或229个氨基酸或更少但多于1个氨基酸。 [0123] 在一些供选择的方案中，间隔区源自免疫球蛋白样分子的铰链区。在一些供选择的方案中，间隔区包括来自人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4的铰链区的全部或部分，并且可以含有一个或多个氨基酸置换。在表5中提供了铰链区的示例性序列。在一些供选择的方案中，铰链区的部分包括在可变区重链和核心之间发现的上部铰链氨基酸和包括聚脯氨酸区的核心铰链氨基酸。 [0124] 在一些供选择的方案中，可以用一个或多个氨基酸修饰铰链区序列以避免不希望的结构性相互作用如二聚化。在具体的供选择的方案中，间隔区包括来自IgG4的修饰的人铰链区的部分，例如如表1或表5(SEQ ID NO：10)所示。在表1(SEQ ID NO：1)中提供了编码修饰的IgG4铰链区的部分的多核苷酸的代表。在一些供选择的方案中，铰链区可以与表1或表5中鉴别的铰链区氨基酸序列具有至少约90％、92％、95％或100％序列一致性。在具体的供选择的方案中，来自IgG4的人铰链区的部分在从CPSP至CPPC的核心氨基酸中具有氨基酸置换。 [0125] 在一些供选择的方案中，铰链区的全部或部分与免疫球蛋白的恒定区的一个或多个域结合。例如铰链区的部分可以与CH2或CH3域或其变体结合。在一些供选择的方案中，间隔区不包括来自CD8α的第47-48位氨基酸的铰链区序列或包括CD28分子的胞外部分的间隔区。 [0126] 在一些供选择的方案中，短间隔区具有约12个氨基酸或更少但大于1个氨基酸，并包括IgG4铰链区序列或其变体的全部或部分，中等间隔区具有约119个氨基酸或更少但大于1个氨基酸，并包括IgG4铰链区序列和CH3区或其变体的全部或部分，以及长间隔区具有约229个氨基酸或更少但大于1个氨基酸，并包括IgG4铰链区序列、CH2区和CH3区或其变体的全部或部分。 [0127] 可以容易地通过合成或重组方法由氨基酸序列制备编码间隔区的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码间隔区的多核苷酸可操作地连接于编码跨膜域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码间隔区的多核苷酸也可以在编码序列的5’和/或3’端具有一个或多个限制性酶切位点，以用另一个编码不同间隔区的多核苷酸提供该多核苷酸的容易的切除和替换。在一些供选择的方案中，编码间隔区的多核苷酸针对在哺乳动物细胞中表达而密码子优化的。在一些供选择的方案中，编码间隔区的多核苷酸针对在人细胞中表达被密码子优化。 [0128] 在供选择的方案中，间隔区是选自来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其部分的铰链区序列，来自与CH2区或其变体的全部或部分组合的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的铰链区序列，来自与CH3区或其变体的全部或部分组合的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的铰链区序列，和来自与CH2区或其变体和/或CH3区或其变体的全部或部分组合的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的铰链区序列。在一些供选择的方案中，短间隔区是具有12个氨基酸或更少但大于1个氨基酸的修饰的IgG4铰链序列(SEQ ID NO：10)，中等间隔区是具有119个氨基酸或更少但大于1个氨基酸的具有CH3序列的修饰的IgG4铰链序列；或具有229 个氨基酸或更少但大于1个氨基酸的具有CH2和CH3区的IgG4铰链序列。在一些供选择的方案中，短间隔区具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸或由任意两个上述氨基酸长度定义的范围内的大小。在一些供选择的方案中，中等间隔区具有13、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或119个氨基酸或由任意两个上述氨基酸长度定义的范围内的大小。在一些供选择的方案中，间隔区具有120、 130、140、150、160、170、180、190、200、210或219个氨基酸或由任意两个上述氨基酸长度定义的范围内的大小。 [0129] 跨膜域 [0130] 在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括编码跨膜域的多核苷酸。跨膜域提供嵌合受体在膜中的锚定。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体的跨膜域不同于遗传标签的跨膜域。 [0131] 在供选择的方案中，使用与嵌合受体中的域中的一个天然相关的跨膜域。在一些情况下，可以通过氨基酸置换选择或修饰跨膜域以避免这样的域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜域结合以使与受体复合物的其他膜的相互作用最小化。 [0132] 跨膜域可以源自天然来源或合成来源。当来源是天然的，域可以源自任意膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜域至少包括T细胞受体CD28、CD3、CD45、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154的α、β或ζ链的跨膜域。在具体的供选择的方案中，跨膜域包括如表2所示的CD28跨膜域的氨基酸序列。编码CD28跨膜域的代表性多核苷酸序列显示于表1(SEQ ID NO：2)中。 [0133] 跨膜域可以是合成的或天然存在的跨膜域的变体。在一些供选择的方案中，合成跨膜域或变体跨膜域主要包括疏水残基如亮氨酸和缬氨酸。在一些供选择的方案中，跨膜域与如表2或表6所示的跨膜域可以具有至少80％、85％、90％、95％或100％氨基酸序列一致性或由任意两个前述的百分比限定的范围内的百分比的序列一致性。变体跨膜域优选具有如由凯特-杜利特(Kyte Doolittle)计算的至少50的疏水分数。 [0134] 可以通过合成或重组方法制备编码跨膜域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码跨膜域的多核苷酸可操作地连接于编码胞内信号传导区的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码跨膜域的多核苷酸也可以在编码序列的5’和/或3’端具有一个或多个限制性酶切位点，以用另一种编码不同跨膜域的多核苷酸提供编码跨膜域的多核苷酸的容易的切除和替换。在一些供选择的方案中，编码间隔区的多核苷酸针对在哺乳动物细胞，优选人细胞中表达被密码子优化。 [0135] 胞内信号传导域 [0136] 在一些供选择的方案中，嵌合受体核酸包括编码胞内信号传导域的多核苷酸。胞内信号传导域提供在结合于肿瘤细胞上表达的配体时，激活表达嵌合受体的转导细胞的一个功能。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域含有一个或多个胞内信号传导域。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域是提供激活转导细胞的至少一个功能的胞内信号传导域的部分和/或变体。 [0137] 用于本公开的嵌合受体的胞内信号传导域的例子包括CD3ζ链的胞浆序列，和/或共同起作用以在嵌合受体衔接后起始信号转导的共受体，以及这些序列的任意衍生物或变体和具有相同功能能力的任意合成序列。T细胞激活可以被认为通过两个不同类别的胞浆信号传导序列介导的：起始抗原依赖性初级激活并提供T细胞受体样信号的那些胞浆信号传导序列(初级胞浆信号传导序列)和以抗原依赖性方式起作用以提供二级或共刺激信号的那些胞浆信号传导序列(二级胞浆信号传导序列)。以刺激方式起作用的一级胞浆信号传导序列可以含有被称为受体酪氨酸基激活基序或ITAM的信号传导基序。含有初级胞浆信号传导序列的ITAM的例子包括源自CD3ζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和/或CD66d的那些ITAM。在一些供选择的方案中，初级信号传导胞内域与具有表4中所提供的序列的CD3ζ可以具有至少80％、85％、90％或95％的序列一致性，或由任意两个前述的百分比限定的范围内的序列一致性百分比。在一些供选择的方案中，CD3ζ的变体保持如表4所示的至少1个、2个、3个或全部的ITAM区。 [0138] 在优选的供选择的方案中，嵌合受体的胞内信号传导域可以设计为包括单独的CD3-ζ信号传导域或与任意其他希望的胞浆域组合的CD3-ζ信号传导域。例如，嵌合受体的胞内信号传导域可以包括CD3ζ链和共刺激信号传导区。 [0139] 共刺激信号传导区指包括共刺激分子的胞内域的嵌合受体的部分。共刺激分子是不同于淋巴细胞对抗原应答需要的抗原受体或其配体的细胞表面分子。这样的分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD 137)、OX40、CD30、CD40、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ζ链相关蛋白激酶(ZAP70)和/或与CD83特异性结合的配体。在一些供选择的方案中，共刺激信号传导域与如表2所示的CD28的胞内域或与具有表3中提供的序列的4-1BB可以具有至少80％、85％、90％或95％的氨基酸序列一致性或由任意两个前述的百分比限定的范围内的任意序列一致性百分比。在供选择的方案中，CD28胞内域的变体包括在第186-187位的氨基酸置换，其中用GG置换LL。 [0140] 嵌合受体的胞内信号传导序列可以以随机或特定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度为2至10个氨基酸，可以形成连接。在一些供选择的方案中，短寡肽或多肽接头包括2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸大由任意两个前述的大小限定的范围内的大小。在一种供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3-ζ或其变体的信号传导域的全部或部分和CD28或其变体的信号传导域的全部或部分。在另一供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3-ζ或其变体的信号传导域的全部或部分和4-1BB或其变体的信号传导域的全部或部分。在又一种供选择的方案中，胞内信号传导域包括CD3-ζ或其变体的信号传导域的全部或部分、CD28或其变体的信号传导域的全部或部分和4-1BB或其变体的信号传导域的全部或部分。在具体的供选择的方案中，包括CD3ζ的变体和4-1BB胞内信号传导域的部分的胞内信号传导域的氨基酸序列提供于表1中。在表1中提供了代表性的核酸序列(SEQ ID NO：2内)。 [0141] 在供选择的方案中，编码胞内信号传导域的多核苷酸包括连接于CD3ζ域的一部分的4-1BB胞内域。在其他供选择的方案中，4-1BB胞内域和CD28胞内域连接于CD3ζ域的一部分。 [0142] 可以通过合成或重组方法从氨基酸序列容易地制备编码胞内信号传导域的多核苷酸。在一些供选择的方案中，编码胞内信号传导域的多核苷酸也可以在编码序列的5’和/或3’端具有一个或多个限制性酶切位点，以用另一种编码不同胞内信号传导域的多核苷酸提供编码胞内信号传导域的多核苷酸的容易的切除和替换。在一些供选择的方案中，编码胞内信号传导域的多核苷酸是针对在哺乳动物细胞中的表达而密码子优化的。在一些供选择的方案中，编码胞内信号传导域的多核苷酸是针对在人细胞中表达被密码子优化的。 [0143] 接头域 [0144] 在一些供选择的方案中，提供了用于CAR构建体中的域之间的柔性的接头域。如下文显示的，Her2的跨膜域和域IV之间的接头(SEQ ID NO：45)导致了形成构建体Her2tG。接头用于诱导蛋白质域之间的柔性。在其他例子中，许多CAR的scFv含有位于CAR的scFv的VH和VL域之间的4个连续G3S亚单位。这使得两个scFv域的折叠具有柔性。在示例性的供选择的方案中，合理使用两个G3S接头亚单位足以能够诱导Her2tG柔性的量的增加。 [0145] 连接为一个的两个G3S接头亚单位(SEQ ID NO：45)，也可以用于模仿CD28铰链和IgG4铰链的间隔区长度。CD28铰链和IgG4铰链两者之前都已用作功能性的CAR中scFv和跨膜域之间的间隔区。CD28铰链和IgG4铰链两者均含有促进二聚化的半胱氨酸。虽然对CAR是有帮助的，但这种二聚化作用可以抑制Her2t的柔性，因此不能使得显著识别赫赛汀。使用两个G3S接头(SEQ ID NO：45)而非三个或四个G3S接头的优势是限制载体净负荷，潜在清除不必要的序列，并且同时获得提高的功能性。 [0146] 在一些供选择的方案中，提供了分离多肽，其中分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER，并且其中具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸序列的HER2多肽的胞外域通过包含氨基酸GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)的序列连接于跨膜域。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563- 652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽包括如SEQ ID NO：17所述的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。 [0147] 宿主细胞和组合物：T淋巴细胞群 [0148] 本文描述的组合物提供具有如本文描述的载体和/或构建体的基因修饰的宿主细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是CD4+和/或CD8+T淋巴细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。 [0149] 可以根据已知的技术收集T淋巴细胞，并且通过已知的技术如亲和结合于抗体如流式细胞术和/或免疫磁珠选择富集或消耗T淋巴细胞。富集和/或消耗步骤之后，可以根据对本领域技术人员来说显而易见的已知的技术或其改变进行体外扩增希望的T淋巴细胞。在一些供选择的方案中，T细胞是获得自患者的自体T细胞。 [0150] 例如，可以通过以下方法扩增希望的T细胞群或亚群，在体外将初始T淋巴细胞群添加至培养基中，然后添加至培养基饲养细胞如不分裂的外周血单核细胞(PBMC)，(例如，这样使得产生的细胞群对要扩增的初始群中的每个T淋巴细胞含有至少5、10、20或40或更多个PBMC饲养细胞或由任意连个前述的数量限定的范围内的数量)；以及温育培养物(例如，温育充足的时间以扩增T细胞的数目)。不分裂的饲养细胞可以包括γ-辐射的PBMC饲养细胞。在一些供选择的方案中，用γ射线以3000至3600拉德的范围辐射PBMC以防止细胞分裂。在一些供选择的方案中，用γ射线以3000、3100、3200、3300、3400、3500或3600拉德，或任意列出值的任意两个端点之间的任意拉德值辐射PBMC以防止细胞分裂。如需要，T细胞和饲养细胞添加至培养基的顺序可以颠倒。可以典型地在适于T淋巴细胞生长的温度等的条件下温育培养物。例如对人T淋巴细胞的生长，温度一般会在至少25℃，优选至少30℃，更优选约37℃。在一些供选择的方案中，人T淋巴细胞的生长的温度是22、24、26、28、30、32、34、36、37℃或任意列出值的任意两个端点之间的任意其他温度。 [0151] 扩增的T淋巴细胞包括可对人肿瘤或病原体上存在的抗原特异性的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4+辅助T淋巴细胞。 [0152] 任选地，扩增方法可以进一步包括添加不分裂的EBV转化的淋巴样干细胞(LCL)作为饲养细胞的步骤。可以用γ射线以6000至10,000拉德辐射LCL。在一些供选择的方案中，用γ射线以6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10,000拉德，或任意列出值的两个端点之间的任意量的拉德辐射LCL。可以以任何适当的量提供LCL饲养细胞，如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞比为至少约10∶1。 [0153] 任选地，扩增方法可以进一步包括将抗CD3和/或抗CD28抗体添加至培养基的步骤(例如，浓度为至少约0.5ng/ml)。任选地，扩增方法可以进一步包括将IL-2和/或IL-15添加至培养基的步骤(例如，其中IL-2的浓度为至少约10个单位/ml)。 [0154] 在分离T淋巴细胞后，无论在扩增前或扩增后均可以将细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞两者分选为初始T细胞、记忆T细胞和效应T细胞亚群。 [0155] 可以通过使用标准方法获得CD8+细胞。在一些供选择的方案中，通过鉴别与CD8+细胞的那些类型中的每一个相关的细胞表面抗原将CD8+细胞进一步分选为初始细胞、中枢记忆细胞和效应记忆细胞。在一些供选择的方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个亚集中。在用抗CD8和抗CD62L抗体染色后，将PBMC分选为CD62L-CD8+和CD62L+CD8+部分。在一些供选择的方案中，中枢记忆TCM的表型标记的表达包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和CD127，并且对颗粒酶B呈阳性或是低的。在一些供选择的方案中，中枢记忆T细胞是CD45RO+，CD62L+，CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，效应TE对CD62L、CCR7、CD28和CD127呈阴性，并且对颗粒酶B和穿孔素呈阳性。在一些供选择的方案中，初始CD8+T淋巴细胞被表征为初始T细胞的包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA的表型标记的表达。 [0156] 通过鉴别具有细胞表面抗原的细胞群将CD4+T辅助细胞分选为初始细胞、中枢记忆细胞和效应细胞。可以通过标准方法获得CD4+淋巴细胞。在一些供选择的方案中，初始CD4+T淋巴细胞是CD45RO-，CD45RA+，CD62L+，CD4+T细胞。在一些供选择的方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些供选择的方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。 [0157] 可以通过使用对表面标记特异的抗体和同种型匹配对照抗体染色的流式细胞术确定细胞或细胞群对具体的细胞表面标记是否是阳性。对标记呈阴性的细胞群指用特异性抗体不存在高于同种型对照的细胞群的显著染色，阳性指细胞群的均一染色高于同种型对照。在一些供选择的方案中，一个或多个标记的表达的减少指平均荧光强度损失1log10和/或显示标记的细胞的百分比与参比细胞群相比减少至少20％的细胞、25％的细胞、30％的细胞、35％的细胞、40％的细胞、45％的细胞、50％的细胞、55％的细胞、60％的细胞、65％的细胞、70％的细胞、75％的细胞、80％的细胞、85％的细胞、90％的细胞、95％的细胞和100％的细胞或20至100％之间任何％，或与参比细胞群相比任意前述的值的百分比之间的任意百分比范围的细胞。在一些供选择的方案中，对一个或标记呈阳性的细胞群指显示标记的细胞的百分比与参比细胞群相比为至少50％的细胞、55％的细胞、60％的细胞、65％的细胞、70％的细胞、75％的细胞、80％的细胞、85％的细胞、90％的细胞、95％的细胞和100％的细胞和由任意两个前述的百分比限定的范围内的任意百分比。 [0158] 在一些供选择的方案中，可以通过用抗原刺激初始T淋巴细胞或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性的CD4+和CD8+群。例如，通过从感染的受试者分离T细胞和在体外用相同抗原刺激细胞可以使抗原特异性T细胞系或克隆产生巨细胞病毒抗原。也可以使用初始T细胞。可以利用来自肿瘤细胞的任意数目的抗原作为引发T细胞应答的靶标。在一些供选择的方案中，过继细胞免疫治疗组合物在对包括实体瘤、恶性血液肿瘤、乳腺癌或黑色素瘤的疾病或紊乱治疗中是有用的。 [0159] T淋巴细胞群的修饰 [0160] 在一些供选择的方案中，根据本发明将功能性基因引入待用于免疫治疗的T细胞可以是希望的。例如，引入的基因或多个基因可以通过促进转移的T细胞的生存能力和/或功能改善治疗的疗效；或所述功能性基因可以提供遗传标记以及允许在体内存活或迁移的选择和/或评价；或所述功能性基因可以合并改善免疫治疗的安全性的功能，例如通过使细胞易受转基因的控制表达的影响。这可以使用基于本发明对本领域技术人员来说显而易见的已知技术进行。 [0161] 在一些供选择的方案中，用编码如本文描述的遗传标签修饰T细胞。在一些供选择的方案中，用包括可操作地连接于遗传标签的编码嵌合抗原受体的多核苷酸修饰细胞。在其他供选择的方案中，用包括单独的编码遗传标签的多核苷酸的载体修饰细胞。在一些供选择的方案中，T细胞获得自要治疗的受试者，在其他供选择的方案中，淋巴细胞获得自同种异体的人供体，优选健康的人供体。 [0162] 通过利用例如抗体分子的抗原结合片段或抗体可变域可以构建对任意细胞表面标记具有特异性的嵌合受体。抗原结合分子可以连接于一个或多个细胞信号传导组件。在一些供选择的方案中，细胞信号传导组件包括CD3跨膜域、CD3胞内信号传导域和CD28跨膜域。在一些供选择的方案中，胞内信号传导域包括连接于CD3ζ胞内域的CD28跨膜域和信号传导域。 [0163] 在一些供选择的方案中，可以将相同或不同的嵌合受体引入CD4+和CD8+T淋巴细胞的每个群中。在一些供选择的方案中，在这些群中的每一个中嵌合受体具有特异性结合于在肿瘤细胞或感染的细胞上的相同配体或不同抗原或表位的配体结合域。细胞信号传导组件可以不同。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T细胞的胞内信号传导域与CD4+辅助T细胞的胞内信号传导域相同。在其他供选择的方案中，CD8+细胞毒性T细胞的胞内信号传导域与CD4+辅助T细胞的胞内信号传导域不同。每个嵌合受体可操作地连接于不同的遗传标签，使得选择和鉴别表达两种嵌合抗原受体的转导细胞。 [0164] 供选择的方案包括制备包含如本文描述的宿主细胞的组合物的方法。在一些供选择的方案中，方法包括：将分离核酸导入宿主细胞，所述分离核酸如编码分离多肽的核酸，所述分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第511至652位氨基酸或第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位；以及在包含至少一种生长因子的培养基中培养宿主细胞。在一些供选择的方案中，方法进一步包括在培养步骤之前或之后或在培养步骤之前和之后两者选择表达Her2t的宿主细胞。在其他供选择的方案中，制备方法进一步包括将编码第二嵌合抗原受体的第二核酸和第二遗传标签导入宿主细胞。在一些供选择的方案中，方法进一步包括在培养步骤之前或之后或在培养步骤之前和之后两者选择表达第二遗传标签的宿主细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。 [0165] 在其他供选择的方案中，方法包括：将第一分离核酸导入第一宿主细胞，所述第一分离核酸如编码分离多肽的核酸，所述分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第511至652位氨基酸或第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位；选择表达Her2t的第一宿主细胞；将编码第二嵌合抗原受体的第二核酸和第二遗传标签导入第二宿主细胞；选择表达第二遗传标签的第二宿主细胞；以及任选地，在包含至少一种生长因子的培养基中培养第一宿主细胞和第二宿主细胞。在一些供选择的方案中，组合物包含第一宿主细胞群和第二宿主细胞群。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。 [0166] 在一些供选择的方案中，在如本文描述的在转导之前可以将CD4或CD8T淋巴细胞中的每一个分选为初始细胞、中枢记忆细胞、效应记忆细胞或效应细胞。在一些供选择的方案中，在转导之后可以将CD4或CD8T淋巴细胞中的每一个分选为初始细胞、中枢记忆细胞、效应记忆细胞或效应细胞。 [0167] 如本文描述的，在一些供选择的方案中，初始CD4+细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+和/或CD4+阳性T细胞。在一些供选择的方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L阳性和/或CD45RO阳性的。在一些供选择的方案中，效应CD4+细胞是CD62L阴性和/或CD45RO阳性的。可以用嵌合受体独立地修饰这些群中的每一个。 [0168] 如本文描述的，在一些供选择的方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和/或CD62L-两个亚集中。在用抗CD8和抗CD62L抗体染色后，将PBMC分选为CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+部分。在一些供选择的方案中，中枢记忆T细胞(TCM)的表型标记的表达包括CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127，并且对颗粒酶B呈阳性或是低的。在一些供选择的方案中，中枢记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+和/或CD8+T细胞。在一些供选择的方案中，效应T细胞(TE)对CD62L、CCR7、CD28和/或CD127呈阴性，并且对颗粒酶B和/或穿孔素呈阳性。在一些供选择的方案中，初始CD8+T淋巴细胞被表征为CD8+、CD62L+、CD45RO+、CCR7+、CD28+CD127+和/或CD45RO+。可以用嵌合受体独立地修饰这些群中的每一个。 [0169] 已经发展了各种转导技术，所述转导技术利用用于基因递送的重组感染病毒颗粒。这代表当前优选的转导本发明的T淋巴细胞的方法。已经用于该方法的病毒载体包括源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、慢病毒载体和反转录病毒的病毒载体。因此，基因转移和表达方法是很多的但是在哺乳动物细胞中引入和表达遗传物质的基本功能。数种上述的技术已经用于转导造血细胞或淋巴样细胞，所述技术包括磷酸钙转染；原生质体融合；电穿孔；和用重组腺病毒、腺伴随病毒和反转录病毒载体感染。通过电穿孔和通过反转录病毒或慢病毒感染已经成功转导了原代T淋巴细胞。 [0170] 反转录病毒和慢病毒载体提供了用于将基因转移入真核细胞的高效的方法。此外，反转录病毒或慢病毒的整合以控制的方式发生，并导致每个细胞中新的遗传信息中的一个或几个拷贝的稳定整合。在一些供选择的方案中，反转录病毒载体或慢病毒载体用于基因转移至真核细胞。在一些供选择的方案中，细胞是人细胞。 [0171] 预期刺激因子(例如淋巴因子或细胞因子)的过表达可以是对治疗的个体有毒性的。因此，包括导致本发明的T细胞在体内对阴性选择敏感的基因片段在本发明的范围内。所谓的“阴性选择”，它的意思是由于个体的体内条件的改变，可以消除输注的细胞。阴性选择性表型可以由提供对施用药剂例如化合物的敏感性的基因的插入产生。在一些供选择的方案中，遗传标签Her2t也在体内提供阴性选择。例如，如果希望清除具有遗传标签Her2t的表达CAR的细胞，则将结合于Her2的域IV的抗体(例如曲妥珠单抗)或与结合于Her2的域IV的抗体竞争结合的抗体施用于受试者。在清除转导细胞的优选的供选择的方案中，抗体含有Fc区以激活抗体依赖性的细胞毒性反应以杀伤转导的细胞。在其他供选择的方案中，抗体或其片段连接于细胞毒性剂。细胞毒性剂缀合物结合于表达CAR和her2t的细胞并杀伤细胞。该方法提供清除施用的细胞的方法，所述施用的细胞与毒性或不良的副作用相关。 [0172] 其他阴性选择性基因在本领域是已知的，并且包括，尤其是以下：提供更昔洛韦敏感性的单纯性疱疹病毒I胸苷激酶(HSV-I TK)基因；细胞次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因、细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)基因以及细菌胞嘧啶脱氨基酶。 [0173] 可以采用如本领域熟知的各种方法转导T淋巴细胞。在一些供选择的方案中，使用慢病毒载体进行转导。 [0174] 在一些供选择的方案中，CD4+和CD8+细胞各自可以分别用编码嵌合受体的表达载体修饰以形成定义的群。在一些供选择的方案中，细胞可以分别用包括编码CAR的多核苷酸和第一遗传标签的载体和/或包括编码CAR的多核苷酸和不同的第二遗传标签的载体修饰。在一些供选择的方案中，CAR构建体可以是相同的或不同的。例如，用具有第一遗传标签的CAR构建体转导CD8T细胞，以及用具有第二遗传标签的相同CAR转导CD4 T细胞。 [0175] 在一些供选择的方案中，通过分选对细胞群中的每一个独特的细胞表面抗原，将这些细胞进一步分选为如上文描述的初始细胞、中枢记忆细胞和效应细胞的亚群。另外，可以通过CD4+或CD8+细胞群的细胞因子谱或增殖活性选择CD4+或CD8+细胞群。例如，可以选择当用抗原刺激时，与假转导细胞或转导CD8+细胞相比细胞因子如IL-2、IL-4、IL-10、TNFα和/或IFNγ的产生提高的CD4+T淋巴细胞。在其他供选择的方案中，选择IL-2和/或TNFα的产生提高的初始或中枢记忆CD4+T细胞。同样地，选择与假转导CD8+细胞相比IFNγ产生提高的CD8+细胞。在一些供选择的方案中，通过CD4+或CD8+细胞群的细胞因子谱或增殖活性选择CD4+或CD8+细胞群。在一些供选择的方案中，选择当用抗原刺激时，与假转导细胞或转导CD8+细胞相比细胞因子如IL-2、IL-4、IL-10、TNFα和/或IFNγ的产生提高的CD4+T淋巴细胞。 [0176] 在一些供选择的方案中，选择对承载抗原的细胞有细胞毒性的CD4+和CD8+细胞。在一些供选择的方案中，预期与CD8+细胞相比CD4+是弱细胞毒性的。在优选的供选择的方案中，使用针对特定类型的癌症建立的动物模型选择在体内提供杀伤肿瘤细胞的转导淋巴细胞如CD8+中枢记忆细胞。 [0177] 在又一种供选择的方案中，选择表达遗传标签的转导细胞。在一些供选择的方案中，转导后，使用结合于遗传标签的抗体选择表达例如Her2t或EGFRt的细胞。在一些供选择的方案中，抗体提供选择含有至少80-100％细胞对遗传标签呈阳性的细胞群。 [0178] 使用如蛋白印迹或流式细胞术的技术评价选择的细胞的转基因表达。在一些供选择的方案中，还进一步通过分析例如刺激域(例如CD3ζ)、蛋白质L和T2A的量，表征选择的表达遗传标签的细胞的CAR的表达。在一些供选择的方案中，选择具有约1∶0.1至10∶0.1的CAR表达与遗传标签表达的比的细胞。在一些供选择的方案中，选择具有约1∶0.1、2∶0.1、3∶0.1、4∶0.1、5∶01、6∶0.1、7∶0.1、8∶0.1、9∶01或10∶0.1的CAR表达与遗传标签表达的比，或任意列出的比之间的任意其他比的CAR表达与遗传标签表达的细胞。在一些供选择的方案中，在CAR表达低的情况下，可以使用Her2t遗传标签，因为它提供比EGFRt更好的转基因表达水平。在一些供选择的方案中，Her2t遗传标签提供是EGFRt遗传标签的至少1.5倍、2倍、5倍或 10倍，或任意两个列出的值之间的任意其他倍数的转基因表达的增加。 [0179] 在又一种供选择的方案中，使用针对特定类型的癌症建立的动物模型选择能在体内存留的表达转导的嵌合受体的T细胞。在一些供选择的方案中，转导的嵌合受体CD8+中枢记忆细胞已显示在引入动物体内3天或更多、10天或更多、20天或更多、30天或更多、40天或更多或50天或更多，或任意两个列出的值之间的任意其他时间后在体内存留。通过用结合于遗传标签如Her2t或EGFRt的可检测标记的抗体成像确定体内存留。 [0180] 本公开预期将在组合物中使用CD4+和CD8+T细胞的组合。在一种供选择的方案中，可以将嵌合受体转导的CD4+细胞的组合物与相同配体特异性的嵌合受体转导的CD8+细胞组合，或与对有区别的肿瘤配体和不同的遗传标签特异性的嵌合受体转导的CD8+T细胞组合。在其他供选择的方案中，将嵌合受体转导的CD8+细胞与对表达于肿瘤上的不同配体特异性的嵌合受体转导的CD4+细胞组合。在又一种供选择的方案中，将嵌合受体修饰的CD4+和CD8+细胞组合。在一些供选择的方案中，可以以不同的比组合CD8+和CD4+细胞，例如CD8+与CD4+的比为1∶1，CD8+与CD4+的比为10∶1或CD8+与CD4+的比为100∶1或CD8+与CD4+的比在任意两个的列出的比值之间的任意其他比。在一些供选择的方案中，在体外和/或在体内测试组合的群的细胞增殖并且选择提供细胞增殖的细胞的比。 [0181] 在对承载嵌合受体的细胞转导和/或选择之前或之后，细胞群优选在体外扩增直到获得足够数目的细胞以提供至少对人受试者的一次输注典型地为约104个细胞/kg至109个细胞/kg。在一些供选择的方案中，在抗原承载细胞、抗CD3、抗CD28、和IL 2、IL-7、IL 15和/或IL-21和其组合存在下培养转导细胞。 [0182] 可以将CD4+和CD8+细胞的亚群中的每一个与另一个组合。在具体的供选择的方案中，将修饰的初始或中枢记忆CD4+细胞与修饰的中枢记忆CD8+T细胞组合以在抗原承载细胞如肿瘤细胞上提供协同的细胞毒性作用。 [0183] 组合物 [0184] 本公开提供了过继细胞免疫治疗组合物，该组合物包含如本文描述的基因修饰的T淋巴细胞细胞制剂。 [0185] 在一些供选择的方案中，T淋巴细胞制剂包括：具有嵌合受体和如本文所述的遗传标签的CD4+T细胞，所述嵌合受体包括，对与疾病或紊乱相关的配体特异的胞外抗体可变域、间隔区、跨膜域和T细胞受体的胞内信号传导域。在其他供选择的方案中，过继细胞免疫治疗组合物进一步包含提供细胞免疫应答的嵌合受体修饰的肿瘤特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂，其中细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体和如本文所述的遗传标签的CD4+T细胞，所述嵌合受体包括对与疾病或紊乱相关的配体特异的胞外单链抗体、间隔区、跨膜域和T细胞受体的胞内信号传导域。在一些供选择的方案中，本公开的嵌合受体修饰的T细胞群可以在体内存留约3天或更久。在供选择的方案中，可以将这些群中的每一个与另一个组合或与其他细胞类型组合以提供组合物。 [0186] 供选择的方案包括如本文描述的CD4和/或CD8宿主细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞包括分离核酸，如编码分离多肽的核酸，所述分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第511至652位氨基酸或第563至652位氨基酸，所述HER2多肽的胞外域的多肽连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位；和编码第二嵌合抗原受体的第二核酸和第二遗传标签。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。 [0187] 在其他供选择的方案中，组合物包含第一宿主细胞，所述第一宿主细胞包括：第一分离核酸，如编码分离多肽的核酸，所述分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第511至652位氨基酸或第563至652位氨基酸，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位；以及第二宿主细胞包括编码第二嵌合抗原受体的第二核酸和第二遗传标签。在一些供选择的方案中，第一宿主细胞和第二宿主细胞可以是相同的或不同类型的宿主细胞，例如第一宿主细胞可以是CD8中枢记忆T细胞，第二宿主细胞可以是初始CD4细胞。在一些供选择的方案中，第一宿主细胞和第二宿主细胞的各自选自由CD8T细胞、CD4T细胞，CD4初始T细胞、CD8初始T细胞、CD8中枢记忆T细胞、CD4中枢记忆T细胞和其组合组成的的组。 [0188] 在一些供选择的方案中，CD4+T辅助淋巴细胞选自由初始CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞或混合CD4+T细胞组成的组。在一些供选择的方案中，CD4+辅助淋巴细胞是初始CD4+T细胞，其中初始CD4+T细胞包括CD45RO-，CD45RA+，CD62L+CD4+T细胞。 [0189] 在一些供选择的方案中，CD8+T细胞毒性淋巴细胞选自由初始CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或混合CD8+T细胞组成的组。在一些供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，其中中枢记忆T细胞包括CD45RO+，CD62L+，CD8+T细胞。在其他的供选择的方案中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞是中枢记忆T细胞，以及CD4+辅助T淋巴细胞是初始或中枢记忆CD4+T细胞。 [0190] 方法 [0191] 本公开提供制备过继免疫治疗组合物的方法和使用这些组合物以对患有疾病或紊乱的受试者进行细胞免疫治疗的用途或方法。 [0192] 供选择的方案包括制备包含如本文描述的宿主细胞的组合物的方法。在一些供选择的方案中，方法包括：将分离核酸导入宿主细胞，所述分离核酸如编码分离多肽的核酸，所述分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第511 至652位氨基酸或第563至652位氨基酸，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位；以及在包含至少一种生长因子的培养基中培养宿主细胞。在一些供选择的方案中，方法进一步包括在培养步骤之前或之后或在培养步骤之前和之后两者选择表达Her2t的宿主细胞。在其他供选择的方案中，制备方法进一步包括将编码第二嵌合抗原受体的第二核酸和第二遗传标签导入宿主细胞。在一些供选择的方案中，方法进一步包括在培养步骤之前或之后或在培养步骤之前和之后两者选择表达第二遗传标签的宿主细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。 [0193] 在其他供选择的方案中，方法包括：将第一分离核酸导入第一宿主细胞，所述分离核酸如编码分离多肽的核酸，所述分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第511至652位氨基酸或第563至652位氨基酸，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位；选择表达Her2t的第一宿主细胞；将编码第二嵌合抗原受体的第二核酸和第二遗传标签导入第二宿主细胞；选择表达第二遗传标签的第二宿主细胞；以及任选地，在包含至少一种生长因子的培养基中培养第一宿主细胞和第二宿主细胞。在一些供选择的方案中，组合物包含第一宿主细胞群和第二宿主细胞群。 [0194] 在一些供选择的方案中，制备组合物的方法包括：获得修饰的初始或中枢记忆CD4+T辅助细胞，其中修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体和如本文描述的遗传标签的CD4+T细胞，所述嵌合受体包括：对肿瘤细胞表面分子特异的配体结合域、间隔区、跨膜域和胞内信号传导域。 [0195] 在另一供选择的方案中，方法进一步包括获得修饰的CD8+中枢记忆T细胞，其中修饰的中枢记忆CD8 T淋巴细胞细胞制剂包含具有嵌合受体和如本文描述的遗传标签的CD8+细胞，所述嵌合受体包括对肿瘤细胞表面分子特异性的配体结合域、间隔区、跨膜域和胞内信号传导域。在其他供选择的方案中，CD8+细胞具有在诱导型启动子控制下的细胞因子或趋化因子受体。 [0196] 修饰的CD4+T细胞和修饰的CD8+细胞毒性T细胞中的嵌合抗原受体和遗传标签可以是相同的或不同的。例如，修饰的CD4+T细胞具有第一CAR和第一遗传标签，而CD8+细胞毒性T细胞包括具有不同的第二CAR和不同的第二遗传标签的CD8+细胞。在一些供选择的方案中，多核苷酸可编码在CD4+和CD8+细胞群中相同的嵌合抗原受体。两个CAR构建体之间的差异可以包括配体结合域对抗原或表位的特异性或亲和性、间隔区的长度和序列以及胞内信号组件。 [0197] 上文以及实例中已经描述了用嵌合受体修饰的CD4+和CD8+细胞的制剂。抗原特异性T淋巴细胞可以获得自患有疾病或紊乱的患者，或可以通过在体外在抗原存在下刺激T淋巴细胞制备。针对抗原特异性未选择的CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群也可以如本文描述被分离并且在制备方法中组合。有利地选择表达一个或多个遗传标签如Her2t和/或EGFRt的细胞群。 [0198] 在一些供选择的方案中，通过至少两代可以评价细胞群的组合的细胞表面标记的一致性、增殖能力以具有一致的细胞分化状态。通过确定CAR的表达与遗传标签的表达的比进行质量控制。可以通过流式细胞术确定嵌合受体修饰的T细胞上的细胞分化状态和细胞表面标记。在一些供选择的方案中，CD8+细胞上的标记和细胞分化状态包括CD3、CD8、CD62L、CD28、CD27、CD69、CD25、PD-1、CTLA-4、CD45RO和/或CD45RA。在一些供选择的方案中，CD4+细胞上的标记和细胞分化状态包括CD3、CD4、CD62L、CD28、CD27、CD69、CD25、PD-1、CTLA-4 CD45RO和/或CD45RA。 [0199] 在一些供选择的方案中，如本文描述的嵌合受体修饰的T细胞能够在体内存留至少3天或至少10天。在一些供选择的方案中，如本文描述的嵌合受体修饰的T细胞能够在体内存留至少3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天或由任意两个前述的时间点限定的范围内的任意时间。在一些供选择的方案中，嵌合受体修饰的T细胞可以在体内增殖经过至少2代或至少3代，如通过CFSE染料稀释所确定。通过使用疾病或紊乱的动物模型和施用细胞并通过使用结合于遗传标签如爱必妥(爱必妥)(EGFRt)和赫赛汀(Her2t)的可检测的标记抗体检测细胞确定转移的细胞的增殖和/或存留能力，可以确定嵌合受体修饰的T细胞的增殖和存留。当使用抗体或抗原结合片段体内检测表达转基因的细胞时，抗体或抗原结合片段优选不包括Fc部分以使任何ADCC反应最小化。在其他某些供选择的方案中，通过经历用抗原承载细胞进行多循环激活可以在体外测试增殖和激活。 [0200] 本公开也提供对患有疾病或紊乱的受试者进行细胞免疫治疗的方法，其包括：施用表达一个或多个嵌合抗原受体和如本文描述的遗传标签的淋巴细胞的组合物。在一些供选择的方案中，提供了对患有疾病或紊乱的受试者进行细胞免疫治疗的方法，其中方法包括施用表达一个或多个嵌合抗原受体和遗传标签的淋巴细胞的组合物。 [0201] 供选择的方案包括治疗具有表达肿瘤抗原的癌症的患者的方法，该方法包括，施用有效量的如本文描述的组合物，组合物的细胞表达嵌合抗原受体和遗传标签，所述嵌合抗原受体包括结合于癌细胞上表达的肿瘤抗原的抗原结合域。在一些供选择的方案中，癌症具有由细胞上的嵌合抗原受体识别的肿瘤抗原。在一些供选择的方案中，癌症选自由乳腺癌、弥漫大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、ALL、CLL和多发性骨髓瘤。 [0202] 在一些供选择的方案中，治疗具有表达肿瘤抗原的癌症的患者的方法包括，施用有效量的如本文描述的组合物，其中组合物的细胞表达第一嵌合抗原受体和第一遗传标签，第一嵌合抗原受体包括抗原结合域，所述抗原结合域结合于表达于癌细胞上的肿瘤抗原；以及第二嵌合抗原受体和第二遗传标签，第二嵌合抗原受体包括抗原结合域，所述抗原结合域结合于表达于癌细胞上的肿瘤抗原。 [0203] 在一些供选择的方案中，治疗具有表达肿瘤抗原的癌症的患者的方法，包括施用有效量的组合物，所述组合物包含表达第一嵌合抗原受体的第一宿主细胞和第一遗传标签，所述第一嵌合受体包括抗原结合域，所述抗原结合域结合于表达于癌细胞上的肿瘤抗原；以及第二宿主细胞包括第二嵌合抗原受体和第二遗传标签，所述第二嵌合抗原受体包括抗原结合域，所述抗原结合域结合于表达于癌细胞上的肿瘤抗原。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。 [0204] 在其他供选择的方案中，提供了治疗具有癌症和/或表达肿瘤抗原的患者的方法，其中方法包括施用有效量的如本文描述的组合物和特异地结合于遗传标签的抗体，组合物的细胞表达嵌合抗原受体和遗传标签，所述嵌合抗原受体包括结合于癌细胞上表达的肿瘤抗原的抗原结合域。在一些供选择的方案中，抗体结合于Her2的域IV或结合于EGFRt。在一些供选择的方案中，抗体是赫赛汀或爱必妥。 [0205] 在一些供选择的方案中，如果观察到组合物的毒性作用，则施用结合遗传标签的抗体。抗体可结合于并杀伤组合物的表达CAR的细胞，以避免毒性和/或致命的副作用。在一些供选择的方案中，抗体或抗原结合片段优选含有Fc片段以激活ADCC反应。在其他供选择的方案中，抗体或抗原结合片段缀合于细胞毒性剂。细胞毒性剂包括穿天蛇素类似物(cantansinoids)、卡奇霉素和/或阿里他汀。在一些供选择的方案中，细胞毒性剂包含穿天蛇素类似物(cantansinoids)、卡奇霉素和/或阿里他汀。 [0206] 在一些供选择的方案中，抗体可检测地被标记以使得在体内追踪细胞。在一些供选择的方案中，当抗体用于体内检测，优选抗体或抗体结合片段缺少Fc区的全部或部分，以避免ADCC反应。可检测的标记包括生物素、His标签、myc标签、放射性标记和/或荧光标记。在一些供选择的方案中，可检测标记包含生物素、His标签、myc标签、放射性标记和/或荧光标记。 [0207] 在其他供选择的方案中，方法包括：向受试者施用提供细胞免疫应答的基因修饰的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂，其中细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂包括：具有嵌合受体的CD8+T细胞和如本文描述的第一遗传标签，所述嵌合受体包括对肿瘤细胞表面分子特异性的配体结合域、间隔区、跨膜域和胞内信号传导域；和/或向受试者施用基因修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂，所述基因修饰的辅助T淋巴细胞细胞制剂引起直接肿瘤识别和增强基因修饰的细胞毒性T淋巴细胞细胞制剂介导细胞免疫应答的能力，其中辅助T淋巴细胞细胞制剂包括具有嵌合受体的CD4+T细胞和如本文描述的第二遗传标签，所述嵌合受体包括对肿瘤细胞表面分子特异性的配体结合域、间隔区、跨膜域和胞内信号传导域。 [0208] 另一种供选择的方案描述了对患有疾病或紊乱的受试者进行细胞免疫治疗的方法，所述方法包括：分析受试者的生物样品中与疾病或紊乱相关的靶分子存在，并施用本文描述的过继免疫治疗组合物，其中嵌合受体特异性结合于靶分子。 [0209] 可以通过本发明治疗的受试者一般是人和其他灵长类受试者，如用于兽医学目的的猴子和猿类。受试者可以是雄性或雌性，并且可以是任何适当的年龄，包括婴幼儿、少年、青少年、成年和老年受试者。在一些供选择的方案中，受试者是灵长类受试者或人。 [0210] 在治疗例如恶性血液肿瘤、黑色素瘤、乳腺癌、脑癌和其他上皮恶性肿瘤或实体瘤中，该方法是有用的。在一些供选择的方案中，与疾病或紊乱相关的分子选自由孤独酪氨酸激酶受体ROR1、Her2、EGFR、CE7、hB7H3、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原组成的组。 [0211] 可以治疗的受试者包括患有癌症的受试者，所述癌症包括但不限于结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌(包括黑色素瘤)、骨癌和脑癌等。在一些供选择的方案中，肿瘤相关抗原或分子是已知的，如黑色素瘤、乳腺癌、鳞状细胞癌、结肠癌、白血病、骨髓瘤和前列腺癌。在其他供选择的方案中，肿瘤相关分子可以被表达工程化嵌合受体的基因修饰的T细胞靶向。例子包括但不限于B细胞淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌和白血病。在一些供选择的方案中，受试者具有B细胞淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌和/或白血病。 [0212] 可以根据基于本公开对本领域技术人员来说显而易见的已知的技术或其变体在用于过继免疫治疗的方法和组合物中利用如上文制备的细胞。 [0213] 在一些供选择的方案中，通过以下方式配制细胞，即首先从细胞培养基中收获细胞，然后洗涤并在适于以治疗有效量施用的介质和容器系统(“药学上可接受的”载体)中浓缩细胞。适当的输注介质可以是任何等渗介质制剂，典型为生理盐水、Normosol R(Abbott)或勃脉力A(Plasma-Lyte A)(Baxter)，而且也可以利用5％葡萄糖的水溶液或乳酸林格氏液。可以用人血清白蛋白、胎牛血清或其他人血清组分补充输注介质。 [0214] 在一些供选择的方案中，组合物中的细胞的治疗有效的量是转导的CD4或CD8细胞或至少2个细胞亚集(例如1个CD8+中枢记忆T细胞亚集和1个CD4+辅助T细胞亚集)或是更典型地大于102个细胞以及高达106，高达以及包括108或109个细胞，以及可以大于1010个细胞或任意的列出的至的任意两个端点之间限定的任意的量。 [0215] 细胞的数目如同组合物中包括的细胞的类型一样，将取决于组合物预期的最终用途。例如，如果对具体抗原特异的细胞是希望的，那么群体将含有大于70％，一般大于80％、85％和90-95％的这样的细胞或由任意两个前述的百分比限定的范围内的任意百分比细胞量。 [0216] 对本文提供的用途，细胞一般是以升或更少但大于1nl的体积计，可以是500ml或更少但大于1nl，甚至250ml或100ml或更少但大于1nl，或任意的列出的值的两个端点之间限定的任意体积。 [0217] 因此希望的细胞的密度典型地大于104个细胞/ml，以及一般为大于107个细胞/ml，一般地108个细胞/ml或更大.可以将临床相关数量的免疫细胞分配至多次输注物中，所述输注物累积地等于或超过106、107、108、108、109、1010或1011个细胞或由两个前述的量限定的范围内的任意量的细胞。 [0218] 在一些供选择的方案中，本发明的淋巴细胞可用于向个体提供免疫性。“免疫性”的意思是与对病原体导致的感染或对淋巴细胞应答针对的肿瘤的应答相关的一个或多个身体症状的减少。施用的细胞的量通常在存在于对病原体具有免疫性的正常个体的范围内。因此，通常通过输注施用细胞，每次输注在2个细胞、高达106至3×1010个细胞的范围内，7 9 优选在至少10至10个细胞的范围内或两个前述的量限定的范围内的任意量的细胞。 [0219] 可以通过单次输注或通过在一段时间内的多次输注施用T细胞。然而，因为预计不同个体在应答能力上的变化，输注的细胞的类型和量，以及给予多次输注的输注的数目和时间范围由主治医师确定并可以由常规检查确定。使用如本文例示的本发明的快速扩增方法容易获得充足水平的T淋巴细胞(包括细胞毒性T淋巴细胞和/或辅助T淋巴细胞)的代次。 [0220] 在一些供选择的方案中，将如本文描述的组合物经静脉内、腹腔内、瘤内、骨髓内、淋巴结内和/或脑脊髓液内施用。在一些供选择的方案中，将嵌合受体工程化的组合物递送至肿瘤部位。可供选择地，如本文描述的组合物可以与将细胞靶向至肿瘤或免疫系统隔室(immune system compartments)并避免如肺的部位的化合物组合。 [0221] 在一些供选择的方案中，将如本文描述的组合物与化学治疗剂和/或免疫抑制剂施用。在供选择的方案中，首先用抑制或破坏其他免疫细胞的化学治疗剂治疗患者，随后用本文描述的组合物治疗患者。在一些情况下，可以完全避免化学治疗。在下文阐述的实施例中进一步说明本发明。 [0222] 另外的供选择的方案 [0223] 在一些供选择的方案中，提供了分离多肽，其中分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。 在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽具有SEQ ID NO：17的序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。 [0224] 在一些供选择的方案中，提供了分离多肽，其中分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER，并且其中具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列的HER2多肽的胞外域通过包含氨基酸GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)的序列连接于跨膜域。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽包括如SEQ ID NO：17所述的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。 [0225] 在一些供选择的方案中，提供了分离核酸，其中分离核酸编码多肽。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽具有SEQ ID NO：17的序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、 96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER，并且其中具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列的HER2多肽的胞外域通过包含氨基酸GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)的序列连接于跨膜域。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第 563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽包括如SEQ ID NO：17所述的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括启动子。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括转基因。在一些供选择的方案中，转基因包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括抗原结合域、间隔区、跨膜域和至少一个刺激域。在一些供选择的方案中，编码转基因的多核苷酸通过自切割接头连接于编码HER2多肽的核酸。在一些供选择的方案中，HER2多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少 95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，自切割接头是T2A接头，其具有序列LEGGGEGRGSLLTCG(SEQ ID NO：26)。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。 在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：25(CD20CAR)的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，分离核酸的大小包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、14.9Kb的大小，或任意两个列出的构建体大小之间的任意大小。 [0226] 在一些供选择的方案中，提供了宿主细胞，其中宿主细胞包括分离核酸，其中分离核酸编码多肽。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第 582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽具有SEQ ID NO：17的序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER，并且其中具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列的HER2多肽的胞外域通过包含氨基酸GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)的序列连接于跨膜域。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽包括如SEQ ID NO：17所述的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括启动子。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括转基因。在一些供选择的方案中，转基因包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括抗原结合域、间隔区、跨膜域和至少一个刺激域。在一些供选择的方案中，编码转基因的多核苷酸通过自切割接头连接于编码HER2多肽的核酸。在一些供选择的方案中，HER2多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，自切割接头是具有 LEGGGEGRGSLLTCG(SEQ ID NO：26)的序列的T2A接头。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO： 25(CD20CAR)的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，宿主细胞选自由CD8 T细胞、CD4 T细胞、CD4初始T细胞、CD8初始T细胞、CD8中枢记忆T细胞和CD4中枢记忆T细胞或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，宿主细胞是自体的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是抗原特异性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，分离核酸的大小包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、14.9Kb的大小，或任意两个列出的构建体大小之间的任意大小。 [0227] 在一些供选择的方案中，提供了包含宿主细胞的组合物，其中宿主细胞包括分离核酸，其中分离核酸编码多肽。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽具有SEQ ID NO：17的序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER，并且其中具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列的HER2多肽的胞外域通过包含氨基酸GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)的序列连接于跨膜域。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽包括如SEQ ID NO：17所述的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括启动子。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括转基因。在一些供选择的方案中，转基因包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括抗原结合域、间隔区、跨膜域和至少一个刺激域。在一些供选择的方案中，编码转基因的多核苷酸通过自切割接头连接于编码HER2多肽的核酸。在一些供选择的方案中，HER2多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，自切割接头是具有LEGGGEGRGSLLTCG(SEQ ID NO：26)的序列的T2A接头。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：25(CD20CAR)的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，宿主细胞选自由CD8 T细胞、CD4 T细胞、CD4初始T细胞、CD8初始T细胞、CD8中枢记忆T细胞和CD4中枢记忆T细胞或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，宿主细胞是自体的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是抗原特异性的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是前体T细胞。在一些供选择的方案中，宿主细胞是造血干细胞。在一些供选择的方案中，分离核酸的大小包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、14.9Kb的大小，或任意两个列出的构建体大小之间的任意大小。 [0228] 在一些供选择的方案中，提供了制备组合物的方法，其中方法包括将分离核酸导入宿主细胞以及在包含至少一种生长因子的培养基中培养宿主细胞。在一些供选择的方案中，分离核酸编码多肽。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽具有SEQ ID NO：17的序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER，并且其中具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列的HER2多肽的胞外域通过包含氨基酸GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)的序列连接于跨膜域。在一些供选择的方案中，HER多肽包括SEQ ID NO：23的氨基酸第580位谷氨酸、第582位天冬氨酸、第592位天冬氨酸、第595位苯丙氨酸和第624位谷氨酰胺。在一些供选择的方案中，HER2多肽包括SEQ ID NO：23的第563-652位氨基酸。在一些供选择的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：23的第653-675位氨基酸。在一些供选择的方案中，分离多肽进一步包括提供细胞表面表达的前导肽。在一些供选择的方案中，前导肽包括如SEQ ID NO：17所述的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括启动子。在一些供选择的方案中，分离核酸进一步包括转基因。在一些供选择的方案中，转基因包括编码嵌合抗原受体的多核苷酸。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括抗原结合域、间隔区、跨膜域和至少一个刺激域。在一些供选择的方案中，编码转基因的多核苷酸通过自切割接头连接于编码HER2多肽的核酸。在一些供选择的方案中，HER2多肽与HER2多肽的胞外域的多肽具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，所述HER2多肽的胞外域的多肽具有SEQ ID NO：23的第563至652位氨基酸的序列，所述HER2多肽的胞外域连接于跨膜域，其中分离多肽特异地结合于抗体，所述抗体结合于Her2的域IV中的表位，并且其中分离多肽不包括全长成熟HER2。在一些供选择的方案中，自切割接头是具有LEGGGEGRGSLLTCG(SEQ ID NO：26)的序列的T2A接头。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，嵌合抗原受体包括SEQ ID NO：2(CD20CAR)的氨基酸序列。在一些供选择的方案中，宿主细胞选自由CD8 T细胞、CD4 T细胞、CD4初始T细胞、CD8初始T细胞、CD8中枢记忆细胞和CD4中枢记忆细胞或其组合组成的组。在一些供选择的方案中，宿主细胞是自体的。在一些供选择的方案中，宿主细胞是抗原特异性的。在一些供选择的方案中，生长因子选自IL-15、IL-7、IL-21或IL-2和其组合。在一些供选择的方案中，方法进一步包括选择表达Her2t多肽的细胞。在一些供选择的方案中，在培养基中培养细胞之前选择细胞。在一些供选择的方案中，使用结合于Her2的域IV的抗体选择细胞。在一些供选择的方案中，抗体是曲妥珠单抗。在一些供选择的方案中，方法进一步包括导入连接于第二遗传标签的编码嵌合抗原受体的第二分离核酸。在一些供选择的方案中，方法进一步包括选择表达第二遗传标签的细胞。在一些供选择的方案中，第二遗传标签包括EGFRt. [0229] 下文描述了含有具有her2t标记序列的转导细胞的制剂。 [0230] 抗体和流式细胞术 [0231] 荧光染料缀合的同种型对照、抗CD3、CD4、CD8、CD45、Her2和链霉亲和素获得自BD Biosciences。西妥昔单抗(爱必妥)和曲妥珠单抗(赫赛汀)购买自西雅图儿童医院(Seattle Children’s Hospital)。根据制造商说明，使爱必妥和赫赛汀生物素化(Pierce)或直接缀合于APC(Solulink)。在LSRFortessa(BD Biosciences)上进行数据采集，并且使用FlowJo数据分析软件计算分析区域中细胞的百分比。 [0232] 细胞系 [0233] 所有细胞系维持在补充了2mM L-谷氨酰胺、25mM HEPES(Irvine Scientific)和10％热灭活胎牛血清(Hyclone或Atlas)的RPMI 1640中，除非另有说明。K562红白血病靶细胞系由Stanley Riddell博士(福瑞德哈金森肿瘤研究中心(Fred Hutchinson Cancer Research Center))友好地提供。其他细胞系H9T成淋巴细胞、Raji(人伯基特淋巴瘤(human Burkitt’s lymphoma))和293T(人胚肾293细胞的高度转染性衍生物)由美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)提供。EB病毒转化的类淋巴母细胞细胞系(TM-LCL)如之前描述的(Pelloquin等人1986)由外周血单核细胞(PBMC)制备。将表达GFP：ffluc的细胞系用GFP：ffluc_epHIV7转导并使用BD FACSJazz分选器分选。 [0234] 载体构建和编码Her2t或EGFRt的慢病毒的制剂 [0235] 之前描述了第二代41BB-ζCD19CAR-T2A-EGFRt_epHIV7慢病毒构建体(Hudecek et al.2013)(表1)。 [0236] CD20CAR-T2A-EGFRt_epHIV7含有融合于IgG4的人IgG4铰链-CH3(119个氨基酸)间隔区部分的Leu16(鼠抗人CD20)scFv以及CD19CAR(4-1BB-ζ)的相同的信号传导组件(表9)。 [0237] 通过PCR，使用pDONR223-ErbB2(Addgene)作为模板，epHIV7慢病毒载体作为受体合成Her2t(表6和表8)。终产物Her2t_epHIV7含有框内融合(fused in frame)于Her2的域IV(第563-652位氨基酸)和跨膜跨越组件(第563-675位氨基酸)的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体前导肽(GMCSFRss)。通过PCR和Gibson克隆，Her2t替换了CD19CAR-T2A-EGFRt_epHIV7构建体中的EGFRt。如先前描述的合成EGFRt(Wang等人2011)(表7)。 [0238] 使用包装载体pCHGP-2、pCMV-Rev2和pCMV-G在293T细胞中产生编码CD19CAR-T2A-Her2t、CD19CAR-T2A-EGFRt、CD20CAR-T2A-EGFRt、Her2t和EGFRt的慢病毒。 [0239] 表达CAR、Her2t和/或EGFRt的细胞系的产生 [0240] 为产生CD4或CD8中枢记忆T细胞，在菲可帕克(Ficoll-Paque)(Pharmacia Biotech)上从健康供体(普吉特海湾血液中心(Puget Sound Blood Center))的血液丢弃包(blood discard kits)获得PBMC。将来自每个供体的PBMC分为两组(CD4或CD8中枢记忆T细胞分离物)，随后按照制造商的方案使用CD4或CD8分离试剂盒和抗CD45RA微珠(Miltenyi Biotec)进行AutoMACS贫化。然后使用抗CD62L微珠在AutoMACS上阳性选择贫化的部分，以产生CD4+CD45RO+CD62L+或CD8+CD45RO+CD62L+中枢记忆T细胞。然后用50U/ml白介素-2(IL-2)、2ng/ml白介素-15(IL-15)和抗CD3/CD28珠(Life Technologies)刺激分离的细胞。在激活后第3天使用鱼精蛋白硫酸盐(1∶100稀释)和MOI为1的病毒转导原代T细胞系，然后在32℃下以800×g离心45分子。在低细胞传代数时相似地转导所有其他细胞系。 [0241] 通过用生物素缀合的赫赛汀或爱必妥和抗生物素微珠(Miltenyi)免疫磁性选择，富集每个细胞系的Her2t+或EGFRt+亚集。在50U/ml IL-2和2ng/ml IL-15的存在下，通过用辐射(8000拉德)的TM-LCL以T细胞：TM-LCL的比为1∶7刺激进行的转导后12-18天，扩增选择+的CD19或CD20CAR T细胞。使用生物素化赫赛汀和抗生物素多重分选微珠(Miltenyi)分选CD19CAR-T2A-Her2t+/CD20CAR-T2A-EGFRt+T细胞，然后移除珠，标记爱必妥-APC细胞和抗APC微珠(Miltenyi)。 [0242] 蛋白质分析 [0243] 在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中进行细胞裂解。将细胞裂解物通过BCA测定(Pierce)进行分析，等量地负载在凝胶上，用一抗Her2和磷-Her2(Cell Signaling Technology)、抗CD247(CD3ζ)、生物素化赫赛汀或抗-β-肌动蛋白(负载对照)抗体探测蛋白印迹。按照制造商说明添加二抗IRDye800CW缀合的链霉亲和素或山羊抗小鼠或山羊抗兔(LI-COR)抗体。在Odyssey红外成像系统(LI-COR)上使印迹成像。 [0244] 细胞毒性，细胞因子分泌和增殖测定 [0245] 细胞毒性：如之前描述的进行4小时铬释放测定(Wang等人2011)。使用高达2.5×105个表达具有Her2t标记的CD19CAR，具有EGFRt标记的CD20CAR，CD19CAR-Her2t和CD20CAREGFRt的Tcm细胞，和表达具有EGFRt作为标记序列的CD19CAR的细胞作为效应细胞，在与5×103个表达CD19或CD20的Cr51-标记的K562细胞的共培养物中，确定抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。 [0246] 细胞因子分泌：将T细胞(5×105)一式三份地与靶T细胞以2∶1的E∶T比在96孔板铺板，并根据制造商说明，使用Bio-Plex人细胞因子平板(Bio-Rad)通过细胞计数珠阵列(cytometric bead array)分析上清。 [0247] 增殖：将T细胞用0.2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；Invitrogen)标记、洗涤并一式三份地与刺激细胞在不含外源细胞因子的培养基中铺板。温育72小时后，将细胞用抗CD3和活细胞/死细胞染色(live/dead stain)标记，随后通过流式细胞术分析以评价有生活力的CD3+细胞的细胞分裂。 [0248] T细胞体内移植和ADCC [0249] 所有的小鼠实验由西雅图儿童研究所的动物保护和使用委员会批准。NOD/Scid IL2RγC缺陷型小鼠获得自杰克逊实验室或内部繁殖。 [0250] 移植：在第0天向6至10周龄的NOD/Scid IL2RγC缺陷型小鼠静脉注射107个Her2t/EGFRt阴性(模拟)或Her2t或EGFRt选择的T细胞，并皮下注射5×106个有生活力的NS0-IL15细胞，以提供在体内人IL-15的全身性供应。14天后从处死的动物收获骨髓，并且使用抗CD45、活细胞/死细胞、CD4、CD8、生物素化赫赛汀或爱必妥，和由BD Biosciences提供的链霉亲和素-APC，通过流式细胞术分析细胞悬液。可供选择地，将股骨固定在10％福尔马林中24小时，脱钙2小时(Richard-Allan Scientific)，并包埋在石蜡中，用于用抗CD45(DAKO)，抗EGFR(克隆31G7；Invitrogen)根据制造商说明进行免疫组织化学染色，或用生物素化赫赛汀和SA-AF647进行免疫组织化学染色后用赫斯特(Hoechst)复染色。相似地，使用聚L-赖氨酸使Her2+或Her2t+细胞系粘附在载玻片上，然后使用生物素化赫赛汀和SA-AF647染色。使用Nuance FX生物标记成像系统获得荧光图像。 [0251] 统计分析 [0252] 使用Prism软件(GraphPad)进行统计分析。用95％的置信区间以双尾配对检验进行学生t检验，并且P值小于0.05的结果被认为是显著的。通过对数秩检验完成存活的统计分析，并且P值小于0.05的结果被认为是显著的。 [0253] 基于人ErbB2(Her2)的多功能性表面表位的设计和初始表征 [0254] 同源免疫细胞产物的使用和选择已经是过继治疗策略的临床成功和再现性的限制因素。为此，设计了基于人Her2的非免疫原性的表位(即Her2t)作为候选遗传标签和用于细胞工程的工具(图1图A)。Her2t缺少所有Her2胞内组件，而含有Her2跨膜区，Her2跨膜区是由单克隆抗体曲妥珠单抗(赫赛汀)和GMCSFRss识别的构象完整的表位以促进表面表达(图1图B)。Her2t构建体的三个变体被初始并入慢病毒包装质粒epHIV7中并在CHO细胞中表征，三个变体中一个含有全部Her2域IV，两个的最小构象表位基于与赫赛汀复合的Her2的三维结构而设计(Garrett等人2007；Cho等人2003)。包括图1的图B中描述的第563-652位氨基酸的Her2t构建体，基于使用生物素化赫赛汀和链霉亲和素缀合的荧光基团的流式分析，显示最大的瞬时表面表达，并因此被选择用于进一步的下游表征(未显示数据)。 [0255] Her2t是有生活力的并且功能惰性的遗传标签 [0256] 初始的瞬时表达分析之后，含有Her2t的epHIV7经历VSV-g假分型的自灭活的慢病毒产生。然后将产生的病毒转导至多个细胞类型，获得8.2-65％Her2t+群(未显示数据)，以转导的K562红白血病细胞(13.8％Her2t+)作为典型(图2的图A)。为了评价Her2t作为赋予转基因的细胞群的选择性富集的靶标的使用，转导的K562群经历使用生物素化赫赛汀和抗生物素微珠的两步免疫磁性纯化过程。该过程始终导致细胞群≥95％Her2t+(图2的图B)。之后的滴定实验揭示1.2ng或更低的生物素化赫赛汀足够最大化地标记106个Her2t+细胞(图2的图A)。 [0257] 如我们的分子模型显示的(图1的图A)，Her2t缺少胞外域I-III，并含有对抗体识别必需的域IV结合表位。因此预测Her2t将不能结合于商业Her2抗体，并将被赫赛汀唯一地识别。流式分析证实了赫赛汀能有效识别和染色Her2t和表达完整Her2的K562细胞，然而商业抗体仅能识别完整Her2(图2的图C)。 [0258] 相似地分别对赫赛汀选择的表达Her2t+或完整Her2+的细胞进行Her2t和完整Her2的蛋白印迹分析。如预期的，当使用商业Her2抗体时，仅在来自表达完整Her2的细胞的裂解物中检测到完整的185kDa Her2蛋白。同样地，仅在来自用神经调节蛋白处理的、表达完整+Her2的细胞的裂解物中检测到Her2磷酸化作用。当用生物素化赫赛汀探测时，仅在Her2t细胞裂解物中检测到Her2t的条带(图2的图D)。 [0259] Her2t是对T细胞治疗高度严格和互补的选择表位 [0260] 之前鉴别了用于表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞治疗的高效选择表位，即EGFRt(Wang等人2011)。测试了含有CAR的病毒载体中Her2t的协同表达是否促进体外工程化的宽范围的CAR治疗的临床使用。此外，Her2t使用于CAR重定向的T细胞治疗的所有可用的非免疫原性的选择标记多样化，并可以充当作为EGFRt选择策略的供选择的方案或补充(即给予T细胞对多个候选肿瘤抗原的双特异性)。 [0261] 为评价CAR疗法中Her2t的使用，构建了由先前描述的CD19CAR(Hudecek等人2013)和指导与Her2t共表达的核糖体跳跃T2A序列组成的多域DNA构建体(图1的图C)。随后将产生的CD19CAR-T2A-Her2t构建体并入epHIV7并如早先描述的经历病毒产生。 [0262] 为了评价Her2t作为选择标记相对于EGFRt表达或与EGFRt表达一致的功能性，将CD4+或CD8+中枢记忆(Tcm)细胞(图3的图A)用含有一组CAR-T2A-Her2t和/或CAR-T2A-EGFRt的病毒载体转导(图3的图B)。在用生物素化赫赛汀(Her2t)或爱必妥(EGFRt)和抗生物素微+ + +珠免疫磁性选择之前，用含有单独CAR的载体转导的CD4 或CD8 Tcm是22-72％Her2t 或EGFRt+的，但是在选择后被一致地富集为均一的纯度(＞90％)(图3B)。用多重分选和抗APC珠的组合(材料和方法)将双Her2t+和EGFRt+转导的细胞可供选择地进行免疫磁性分选，得到＞90％的双转基因阳性细胞(图6)。 [0263] 可供选择地，使用游离生物素或链霉亲和素作为珠移除的供选择方案可以分选双转导的细胞系。由于流式平均荧光强度(MFI)分析表明相比于EGFRt选择的群，Her2t选择的Tcm群可表达更低的转基因水平(图3的图B)，我们接下来询问是否Her2t水平直接与较低的CAR表达相关联。为了该目的，将通过Her2t或EGFRt选择的表达CD19CAR的Tcm裂解，并且通过CD3ζ靶向的蛋白印迹分析分析细胞裂解物。结果说明Her2t附加的转基因被选择在比EGFRt附加的转基因更高的表达水平(例如是EGFRt附加的转基因的约2倍)(图3的图C).这些结果表示Her2t使选择过程比EGFRt选择过程更严格。蛋白印迹分析也证实了在双选择的Tcm中CD19CAR和CD20CAR的共表达(图3的图C)。 [0264] 双选择的Tcm保持效应表型和体外靶向特异性 [0265] 多种癌症类型下调靶抗原或使靶抗原突变作为逃逸治疗的手段。多种肿瘤相关抗原的刺激性靶标因此是克服肿瘤逃逸并使T细胞治疗的治疗范围扩大的有希望的治疗途径。为了评价表面标记(Her2t和EGFRt)选择介导的两种CAR(CD19-CAR和CD20-CAR)的共表达是否能提高CAR重定向的T细胞的功能属性，分析了相对于表达单一CAR的Tcm的相对物，表达双重CAR的Tcm的体外功能。每个CAR重定向Tcm亚集(表达CD19-CAR、表达CD20-CAR或表达CD19-CAR和CD20-CAR)提供相似的水平的针对表达CD19、CD20或两者的K562细胞的特异性裂解(图4的图A)，但是不介导CD19-/CD20-亲代K562靶标的识别(图4的图B)。 [0266] 接下来测试了表达双重CAR的Tcm对抗K562靶板的配对功能性(图4的图B)，证实了仅表达双重CAR的Tcm能够提供针对表达所有靶标的K562细胞的特异性裂解。相反地，表达CD19或CD20特异性CAR的Tcm细胞仅能引起针对表达其同类靶抗原的K562细胞的细胞裂解活性(图4的图B)。 [0267] 对K562靶板刺激应答的细胞因子产生的定量分析证实了相似的特异性。虽然不表达CAR的Tcm能应答于与K562亲代细胞共培养而产生细胞因子，表达双重CAR的Tcm应答于与表达所有靶标的细胞的共培养而产生IL2、IFNγ和TNFα，并且对于表达单一CAR的Tcm，细胞因子产生局限于K562/CD19-CD20和K562/CD19或K562/CD20靶细胞(图4的图C)。这些结果表明仅表达双重CAR的Tcm对CD19和CD20是双特异性的，并在与两者中任一抗原单独相遇时介导T细胞的激活和靶向。有趣地，与EGFRt选择的表达CD19CAR的Tcm相比，Her2t选择的表达CD19CAR的Tcm产生更多不同的和提高的细胞因子谱(例如是EGFRt选择的表达CD19CAR的Tcm的约2-3倍)(图3的图D)。这可能是因为Her2t选择的严格性质和Her2t选择的Tcm中总CAR表达得到的提高。 [0268] 由于CAR抗肿瘤活性与转移的T细胞的增殖和存活相关，我们选择进行CFSE稀释测定以分析与它们各自的靶标相遇后CAR修饰的Tcm的增殖。发现了在以相似水平的表达CD19CAR的Tcm刺激之后，双重CAR表达促进Tcm增殖。 [0269] 通过流式细胞术和免疫组织化学追踪过继转移的Her2t+T细胞 [0270] 迄今为止大多数CAR治疗的临床试验依赖于基于PCR的技术以定量治疗给药后基因修饰的细胞存留。治疗特异性的遗传标签如Her2t的使用可以进一步允许多参数表型分析和鉴别输注的、可以与治疗响应相关的CAR T细胞亚集。 [0271] 为了测试Her2t作为体内追踪剂的使用，收获来自用CD19CAR+Her2t+CD4和CD8Tcm移植的NOD/Scid IL-2RγC缺陷型小鼠的骨髓样本，并使处理的样品经历流式细胞分析(图5的图A)。在施用标记阴性、Her2t+和EGFRt+细胞的小鼠中发现相似水平的CD45+T细胞移植+ + (图5的图B)。CD45 T细胞亚集中，11.7-45.7％是对CD8双染色的，表明CD4T细胞的优先扩增。此外，使用生物素化赫赛汀和APC缀合的链霉亲和素对Her2t的共染色使得从Her2t阴性T细胞中分辨出Her2t+T细胞(图5的图C)。这些结果证实了Her2t是用于过继转移的T细胞的有生活力的追踪标记。 [0272] 接下来确定了Her2t是否是针对免疫组织化学(IHC)染色的有活性的靶标。作为初步研究，使Her2t+附着于载玻片，并用生物素化赫赛汀和荧光染料缀合的链霉亲和素染色(图5的图D)。 [0273] 赫赛汀结合于Her2t使人T细胞对ADCC敏感 [0274] 万一在治疗期间发生不良临床事件，在施用的T细胞中并入安全机制是有价值的特征。当与GMCSF刺激的PBMC和赫赛汀或爱必妥共培养时，进行Her2t+或EGFRt+T细胞的体外细胞毒性分析。 [0275] 将H9(T细胞)细胞(5×106个亲代、Her2t+、EGFRt+或Her2t+/EGFRt+)混合在一起，然后经历纯化(图6)。基于生物素化赫赛汀和抗生物素多重分选珠，初始地纯化细胞。然后将多重分选珠移除，随后基于爱必妥APC和抗APC微珠使阳性部分经历纯化。最终的阳性部分对Her2t和EGFRt是双阳性的(图6)。 [0276] 在该系统中，刺激的PBMC将会充当能够在抗体的存在下诱导抗体依赖性细胞毒性的效应物的来源。目标会是当将赫赛汀或爱必妥分别添加至共培养物时，选择性清除Her2t+或EGFRt+细胞。使用共表达Her2t或EGFRt的ffluc+Tcm，将这些测试在体外扩展。采用该设置，将Tcm植入NOD/Scid IL-2RγC缺陷型小鼠，然后施用赫赛汀或爱必妥和新鲜激活的PBMC。通过体内生物光子成像测量转移的Tcm的体内移植和抗体介导的清除。赫赛汀或爱必妥介导的清除应该对表达Her2t、EGFRt或两种标记的Tcm是特异性的。 [0277] 组合的Her2t和EGFRt选择提供体内双重CAR特异性 [0278] 这些实验的目标是显示体内的选择性抗肿瘤活性。将通过皮下注射到NOD/Scid IL-2RγC缺陷型小鼠的左侧腹或右侧腹建立CD19+、CD20+或CD19/CD20+的K562ffluc+肿瘤细胞。建立肿瘤后，静脉注射表达CD19CAR-Her2t、CD19CAR-EGFRt、CD20CAR-EGFRt或CD19CAR-Her2t和CD20CAR的Tcm，并通过生物光子成像确定T细胞特异性。肿瘤荧光素酶活性(总光子通量)的损失表明肿瘤消退。 [0279] 当用表达双CAR的Tcm处理小鼠时，对所有肿瘤靶标应该发生肿瘤消退，而当用表达CD19或CD20的同类CAR处理小鼠时，仅表达CD19或CD20的K562肿瘤应该消退。可供选择地，如上建立CD19+、CD20+或CD19/CD20+K562细胞，并在肿瘤建立后施用ffluc+CAR+Tcm。通过生物光子成像确定基于CAR特异性的Tcm定位。双选择的Her2t+EGFRt+T细胞应该定位在两侧腹不考虑K562肿瘤上的靶抗原，而表达CD19或CD20CAR的细胞应该定位在它们的靶抗原特异性的K562肿瘤。 [0280] 引入Her2域IV和跨膜域之间的接头域(Her2tG)使得与抗体赫赛汀的结合提高[0281] 如图7所示，其是Her2t和Her2tG的一级序列的示意图。Her2tG与Her2的区别在于添加Her2域IV和跨膜域之间的接头序列，并且Her2tG包括序列GGGSGGGS(SEQ ID NO：45)，构建体被称为Her2tG。用具有Her2t或Her2tG的慢病毒以MOI为1转导H9细胞。然后通过生物素化赫赛汀和抗生物素微珠根据制造商方案纯化转导的细胞。然后使用生物素化赫赛汀和链霉亲和素-PE针对Her2t或Her2tG将纯化的群染色。直方图显示与Her2tG更强的结合(图8)。如图9所示，用0.05、0.1、0.25、0.5、1和3μl(从左到右)的慢病毒转导H9细胞，5天后分析赫赛汀的结合。Her2t变体Her2t(CD28铰链)能够以与原始Her2t相似的水平结合赫赛汀(未显示Her2t染色而是基于之前的经验)。相对于Her2t或Her2t(CD28铰链)，Her2t(CD4铰链)提高了赫赛汀结合，然而Her2tG变体具有最大的结合赫赛汀和使转导的H9细胞染色的能力。 [0282] 如实验所显示的，Her2的跨膜域和域IV之间的接头(SEQ ID NO：45)导致产生构建体Her2tG。接头用于诱导蛋白质域之间的柔性。在其他例子中，许多CAR的scFv含有位于CAR的scFv的VH和VL域之间的4个连续G3S亚单位。这使得两个scFv域的折叠具有柔性。这里的合理性是两个G3S接头亚单位将能够足以诱导相同量的Her2tG柔性。 [0283] 两个G3S接头亚单位(SEQ ID NO：45)也用于模仿CD28铰链和IgG4铰链的间隔区长度。CD28铰链和IgG4铰链两者都已用作功能性的CAR中的scFv和跨膜域之间的间隔区。CD28铰链和IgG4铰链两者均含有促进二聚化的半胱氨酸。虽然对CAR有帮助，但这种二聚化作用可以抑制Her2t的柔性，因此不能使得显著识别赫赛汀。使用两个G3S接头(SEQ ID NO：45)相对于三个或四个G3S接头的优势是限制载体净负荷，清除潜在不必要的序列，并且同时获得提高的功能性。 [0284] 描述了指定为Her2t的多目的的细胞表面标记。这种新颖的标记仅含有组成全长Her2的1255个氨基酸中的113个氨基酸，并缺少所有负责于完整Her2细胞信号传导的额外的域或胞内域。造血细胞缺乏Her2表达，使得Her2t成为主要的候选转基因选择标记，通过设计候选转基因选择标记被赋予功能上惰性而但能够将供体T细胞提纯到同源的表达转基因的治疗产品。Her2t的设计包括N-末端Her2t片段与人GM-CSF受体-α链的前导肽的融合。该融合帮助促进Her2t表面表达和使得最小结合表位被药品级的单克隆抗体曲妥珠单抗(赫赛汀)唯一地识别。 [0285] 证实了由于Her2t的最小cDNA足迹，Her2t可以单独被表达或伴随生物活性转基因，即嵌合抗原受体(CAR)协同地并入自失活慢病毒载体。协同转基因表达水平通过经由T2A核糖体跳跃结构将Her2t附加于CAR获得，并通过Her2t-纯化的CD8中枢记忆T细胞的流式和蛋白印迹分析进一步证实。此外，还证实了Her2t是高度严格的选择表位，与EGFRt选择策略相比，Her2t使得能够体外选择具有更高CAR表达和效应细胞因子产生的T细胞。当更高的转基因表达水平是希望的时，该特征可以是有利的，如可以是当将CAR治疗扩展至多肿瘤类型的治疗时的情况。 [0286] 除了用提高的转基因表达水平装备T细胞以外，使个体的T细胞对多个肿瘤抗原双特异性可以改善临床效益。确实，在多种癌症类型中通常观察到靶抗原的下调或突变，所述多癌症类型迫使实施超过单一CAR驱动的治疗的策略。按照这些原则，证明了Her2t是对EGFRt的补充性的选择表位，当每个选择表位被附加至CAR时，其可以促进表达双重CAR的T细胞的多重分选纯化。表达单一CAR的T细胞和表达双重CAR的T细胞之间的相似的细胞毒性活性和效应细胞因子产生说明Her2t和EGFRt的单独表达或协调表达不会导致任何明显的功能性缺损。 [0287] 赫赛汀可接受生物素化和化学缀合。如用于商业用途配制的，使赫赛汀在临床级H2O中重组并且赫赛汀在生物素化后保持Her2特异性的高亲和性结合。与cGMP级抗生物素微珠(Miltenyi Biotec)的可用性组合，这使得能够在CliniMACS装置上选择治疗上相关的+Her2t细胞。证明了低至13.8％的对Her2阳性的T细胞可以被免疫磁性富集到＞90％的纯度。此外，结果证实了生物素化赫赛汀可以与靶向于T细胞标记的抗体偶联以允许多参数表型分析，并追踪治疗的表达CAR的T细胞的体内分布。 [0288] CAR免疫疗法的治疗范围在迅速扩展超越其在血源性肿瘤治疗上的最初成功。明确地需要固有非免疫原性的、对T细胞群唯一的并且可高效选择的可供选择的遗传标签。Her2t涵盖前述的这些特征，并使所有选择表位多样化以用于CAR治疗。此外，Her2t是主要的候选物，用于对配备有多重遗传系统的CAR疗法的协同选择。 [0289] 使用Her2t的优势是其小的尺寸。因此Her2t具有包装效率的优势，具有甚至更大的构建体。为了利用系统，优选具有小于5kb的构建体。在一些供选择的方案中，构建体的大小是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、14.9Kb或任意两个列出的构建体大小之间的任意大小。小的大小是必须的，因为超过15kb的构建体可能具有低滴度的风险。 [0291] 表1 CD19CAR [0292] [0293] [0294] [0295] 表2 Uniprot P10747 CD28(SEQ ID NO：3) [0296] [0297] 1-18 信号肽 [0298] 19-152 胞外域 [0299] 153-179 跨膜域 [0300] 180-220 胞内域 [0301] 第186-187位 LL→GG [0302] 表3 Uniprot Q07011 4-1BB(SEQ ID NO：4) [0303] [0304] 1-23 信号肽 [0305] 24-186 胞外域 [0306] 187-213 跨膜域 [0307] 214-255 胞内域 [0308] 表4 Uniprot P20963人CD3ζ同种型3(SEQ ID NO：5) [0309] [0310] 1-21 信号肽 [0311] 22-30 胞外域 [0312] 31-51 跨膜域 [0313] 52-164 胞内域 [0314] 61-89 ITAM1 [0315] 100-128 ITAM2 [0316] 131-159 ITAM3 [0317] 表5 示例性铰链区序列 [0318] 人IgG1 EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：6) [0319] 人IgG2 ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：7) [0320] 人IgG3 ELKTPLGDTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：8) [0321] 人IgG4 ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：9) [0322] 修饰的人IgG4 ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：10) [0323] 修饰的人IgG4 YGPPCPPCP(SEQ ID NO：11) [0324] 修饰的人IgG4 KYGPPCPPCP(SEQ ID NO：12) [0325] 修饰的人IgG4 EVVKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：13) [0326] 表6 Her2t核酸(SEQ ID NO：14)和氨基酸序列(SEQ ID NO：15) [0327] HER2T(CHP)核苷酸和氨基酸序列 [0328] [0329] 1-MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP-22(GMCSFRss)(SEQ ID NO：17) [0330] 563-C H P E C Q P Q N G S V T C F G P E A D Q C V A C A H Y K D P P F CV A R C P S G V K P D L S Y M P I W K F P D E E G A C Q P C P I N C T H S C V D L D D K G C P A E Q R A S P L T 652 [0331] (黑体的Her2序列-残基被鉴定为与赫赛汀结合)(SEQ ID NO：18) [0332] 653-SIISAVVGILLVVVLGVVFGILII-675(SEQ ID NO：19) [0333] 563-C H P E C Q P Q N G S V T C F G P E A D Q C V A C A H Y K D P P F C V A R C P S G V K P D L S Y M P I W K F P D E E G A C Q P C P I N C T H S C V D L D D K G C P A E Q R A S P L T S I I S A V V G I L L V V V L G V V F G I L I-675(SEQ ID NO：20) [0334] 表7 EGFRt核苷酸(SEQ ID NO：21)和氨基酸(SEQ ID NO：22) [0335] [0336] [0337] 表8 全长Her2同种型1(Uniprot PO4626-1)(SEQ ID NO：23) [0338] [0339] 1-22 信号肽 [0340] 23-652 胞外域 [0341] 653-675 跨膜域 [0342] 676-1255 胞浆域 [0343] 表9 CD20CAR核酸(SEQ ID NO：24)和多肽(SEQ ID No：25) [0344] CD20scFV NA [0345] [0346] IgG4-铰链(SEQ ID NO：47) [0347] Gagagcaagtacggaccgccctgccccccttgccct [0348] CH3(SEQ ID NO：48) [0349] [0350] CD20scFV蛋白(SEQ ID NO：25) [0351] [0352] IgG4-铰链(SEQ ID NO：49) [0353] E S K Y G P P C P P C P [0354] CH3(SEQ ID NO：50) [0355] G Q P R E P Q V Y T L P P S Q E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S R L T V D K S R W Q E G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S L G K [0356] CD20CAR构建体(CD28tm-41BB-ζ-T2A-EGFRt)的剩余部分与CD19CAR-T2A-EGFRt构建体相同. |
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