[0001] 手性是自然界的本质属性之一，构成生命有机体的分子都属于不对称的手性分子。在制药行业中，把具有药理活性作用的对映纯化合物称作手性药物。不同构型的药物作用于生物体时，其所发挥的作用截然不同，在药物活性，代谢过程及毒性等方面也存在着显著差异，20世纪60年代中期在欧洲爆发的“反应停事件”已经充分表明研究单一对映体形式的药物是非常必要的。

[0002] L-正缬氨酸(L-norvaline)是一种非蛋白质支链氨基酸，作为许多药物合成的前体物质，其在制药行业具有非常广泛的应用。培哚普利，作为一种治疗高血压和心力衰竭的有效药物，就是通过以L-正缬氨酸为重要中间体而合成。当前主要通过化学方法合成L-正缬氨酸。化学方法存在较多缺陷，例如工艺路线复杂，收率低，产品手性纯度低等缺点。随着生物技术的快速发展，生物转化方法正广泛应用于医药和食品等相关领域。由于酶本身作为一种手性催化剂，且酶法转化具有选择性大，区域选择性和对映异构选择性高，反应条件温和，环境污染小等优点，因此，利用酶法转化合成L-正缬氨酸具有非常广泛的应用前景。

[0003] D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO,E.C.1.4.3.3)是一种以黄素腺嘌呤(FAD)为辅基的典型黄素蛋白酶类，可氧化D-氨基酸的氨基生成相应的酮酸，氨和过氧化氢(H2O2)。该酶可应用于D氨基酸的定性定量分析，生物传感器，L氨基酸和α-酮酸的生产，目前DAAO主要应用于两部酶法生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。由于7-ACA是合成头孢菌素的重要原料，且头孢菌素市场需求量大，因此DAAO越来越受人们关注。亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase,LeuDH,E.C.1.4.1.9)是一种NAD+依赖型的氧化还原酶，其能可逆催化L-亮氨酸和一些支链L-氨基酸反应生成对应的酮酸及其类似物，该酶在芽孢杆菌中有较高表达水平，主要参与体内L-氨基酸的代谢。Sanwal和Zink于1961年首次在芽孢杆菌Bacillus cereus中发现该酶并将其纯化出来；Hermier等人研究发现该酶在芽孢杆菌的芽孢形成过程中发挥重要作用。LeuDH还可用于支链脂肪酸及其酮酸类似物的测定。近年来，不同来源的LeuDH基因工程菌已经被成功构建，实现了LeuDH的高密度表达和规模化制备，然而，LeuDH的大规模应用需要添加NADH作为辅酶，NADH价格昂贵，不适合工业上大规模使用，因此，构建高效的NADH再生系统是解决LeuDH规模化应用的关键。NAD+依赖型的甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase,FDH,E.C.1.2.1.2)属于D-2羟基酸脱氢酶类，可以将甲酸氧化为CO2的同时将NAD+还原为NADH,因此该酶被广泛应用于NADH再生，且该酶的适宜pH值范围广，产物CO2可直接从反应体系中分离出去，有利于后续目的产物分离，因此FDH已成为辅酶再生领域中的研究热点之一。基于DAAO，LeuDH和FDH的不同催化功能，本发明成功构建了利用粗酶液将D-正缬氨酸转化为L-正缬氨酸的方法，首先利用DAAO将D-正缬氨酸氧化成2-氧代戊酸，然后通过LeuDH将2-氧代戊酸转化成L-正缬氨酸，同时将NADH氧化为NAD+,最后利用FDH将NAD+重新转化成NADH,实现NADH的再生，另外，D-正缬氨酸被DAAO氧化的过程中会产生过氧化氢(H2O2),通过外源添加过氧化氢酶来除去生成的H2O2。

[0004] 本发明通过表达载体pXMJ19实现了将来源于Trigonopsis variabilis的DAAO基因daao成功在谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032中进行高效表达；通过表达载体pET-28a(+)实现了将分别来源于Bacillus cereus的LeuDH基因leudh和来源于Candida boidinii的FDH基因fdh成功在大肠杆菌Escherichia coli BL21中进行高效表达，并利用这三株基因工程菌的粗酶液作为生物催化剂，以混合型DL-正缬氨酸(纯度>99％，D型和L型比例为1:1)为底物，实现L-正缬氨酸的高效生产。

[0005] 本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了来自Trigonopsis variabilis的D-氨基酸氧化酶基因daao，构建重组表达载体pXMJ19-daao，并通过电转化方法将其转化至C.glutamicum ATCC13032中，成功构建了基因工程菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao；又成功克隆了分别来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶基因leudh和来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶基因fdh，构建重组表达载体pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh，并通过化学转化方法将其转化至E.coli BL21中，成功构建基因工程菌E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh。酶活力测定结果发现DAAO，LeuDH和FDH的酶活分别为0.30U/mL，8.13U/mL和0.22U/mL。基于获得的基因工程菌，通过细胞破碎获得每株工程菌的粗酶液，用于转化D-正缬氨酸生产L-正缬氨酸进行了初步研究，在25h内，L-正缬氨酸的产量为54.09g/L，摩尔转化率达到96.3％。

[0006] 本发明采取的技术方案：

[0007] 酶液转化D-正缬氨酸生产L-正缬氨酸，是通过构建C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao，E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh三株基因工程菌，并通过细胞破碎获得三个酶的粗酶液，以混合型DL-正缬氨酸为底物，构建转化化法生产L-正缬氨酸的最佳转化体系，实现高效生产L-正缬氨酸的方法。

[0008] 1.D-氨基酸氧化酶，亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶引物设计

[0009] 根据NCBI中Trigonopsis variabilis全基因组核酸序列中daao基因序列，设计daao基因的PCR引物P1和P2。

[0010] F：5’-GGGGTACCAAAGGAGGGAAATCATGGGATCCCAAAAGAGGGTT-3’(Kpn Ⅰ)[0011] R：5’-CGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGCTTAGACTCGCGGGC-3’(EcoR I)[0012] 根据NCBI中Bacillus cereus全基因组核酸序列中leudh基因序列，设计leudh基因的PCR引物P3和P4。

[0013] F：5’-ACCGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamH Ⅰ)

[0014] R：5’-CGCGTCGACTTAGCGACGGCTAATAATATC-3’(Sal Ⅰ)

[0015] 根据NCBI中Candida boidinii全基因组核酸序列中fdh基因序列，设计fdh基因的PCR引物P5和P6。

[0016] F：5’-ACCGGGATCCATGAAGATCGTTTTAGTC-3’(BamH Ⅰ)

[0017] R：5’-CGCGTCGACTTATTTCTTATCGTGTTTAC-3’(Sal Ⅰ)

[0018] 2.重组表达载体pXMJ19-daao，pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh的构建[0019] 参照博大泰克公司胶回收试剂盒说明书回收daao，leudh和fdh的PCR产物，胶回收产物分别按一定比例与pMD18-T vector过夜连接，转化E.coli JM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，第一种重组质粒经Kpn Ⅰ/EcoR I酶切释放出大小为2.7kb和1107bp的基因条带，表明重组质粒构建成功，命名为pMD18-T-daao；第二种重组质粒经BamH Ⅰ/Sal Ⅰ酶切释放出大小为2.7kb和(1098)bp的基因条带，表明重组质粒构建成功，命名为pMD18-T-leudh；第三种重组质粒经BamH Ⅰ/Sal Ⅰ酶切释放出大小为2.7kb和(1095)bp的基因条带，表明重组质粒构建成功，命名为pMD18-T-fdh。

[0020] 提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18-T-daao和pXMJ19，质粒pMD18-T-daao和pXMJ19经Kpn Ⅰ/EcoR I双酶切，胶回收纯化，16℃过夜连接，将连接物热击转化E.coli JM109感受态细胞，用氯霉素抗性平板筛选阳性转化子，提取转化子质粒，重组质粒经Kpn Ⅰ/EcoR I双酶切后释放出大小为6.6kb和1107bp的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pXMJ19-daao。

[0021] 提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18-T-leudh，pMD18-T-fdh和载体pET-28a(+)，质粒和载体经BamH Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切，胶回收纯化，16℃过夜连接，将连接物热击转化E.coli JM109感受态细胞，用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，提取转化子质粒，重组质粒pET-28a(+)-leudh经BamH Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切后释放出大小为6.6kb和1098bp的基因片段，重组质粒pET-28a(+)-fdh经BamH Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切后释放出大小为6.6kb和1095bp的基因片段，证明重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh构建成功。

[0022] 3.基因工程菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao，E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh的构建及验证

[0023] 将经验证构建成功的重组质粒pMA5-daao通过电击转化法转化至菌株C.glutamicum ATCC13032中；挑取在具有氯霉素抗性平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证；将重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh通过化学转化法转化至E.coli BL21中，挑取在具有卡那霉素抗性平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证。

[0024] 4.重组菌株酶活力测定

[0025] DAAO酶活测定方法：配制0.1M底物D-正缬氨酸(0.1M磷酸盐缓冲液，pH 8.0)，取磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)1mL，加入0.1M的D-正缬氨酸0.1mL，400U/mL的过氧化氢酶0.1mL和适量粗酶液，于37℃水浴15min后加入2mg/mL的对二硝基苯肼0.48mL，重新放入37℃水浴10min后加入3M的NaOH 1.7mL显色，然后检测在550nm处的吸光值。

[0026] 酶活定义单位为每分钟氧化D-正缬氨酸生成1umol 2-氧代戊酸所需的酶量。

[0027] LeuDH酶活测定方法：配置84.7mM戊酮酸溶液，3mg/mL NADH溶液及900mM氯化铵溶液(pH 9.5)，取1.2mL氯化铵溶液置于石英比色皿中，再依次加入120μL NADH溶液，10μL戊酮酸溶液及2μL粗酶液，在340nm下检测每分钟的吸光值变化，酶活定义单位为1min催化1umol NADH转化成NAD+所需的酶量。

[0028] FDH酶活测定方法：配制17mg/mL的甲酸钠溶液(pH 7.5)，3mg/mL的NAD+溶液,取+1.48mL的甲酸钠溶液置于石英比色皿中，依次加入80μL NAD溶液和10μL粗酶液，在340nm下检测每分钟的吸光值变化，酶活定义单位为1min催化1umol NAD+转化成NADH所需的酶量。

[0029] 5.DAAO，LeuDH和FDH粗酶液转化生产L-正缬氨酸

[0030] 以重组菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao，E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh的粗酶液为生物催化剂。以一定浓度的混合型DL-正缬氨酸为底物，在最佳转化体系下进行转化生产L-正缬氨酸。用高效液相色谱法测定转化液中D-正缬氨酸和L-正缬氨酸的含量。

[0031] 氨基酸分析色谱条件：

[0032] (a)色谱柱：Chiralcel OD-3R色谱柱150*4.6*3

[0033] (b)柱温：40℃

[0034] (c)流动相：A相：量取1毫升H3PO4，加入至1000毫升水中，配成0.1％的H3PO4溶液。

[0035] B相：100％乙腈

[0036] (d)检测器：紫外检测器338nm

[0037] 本发明的优点和积极效果是：

[0038] (1)本发明首次在C.glutamicum ATCC13032中克隆表达了来源于Trigonopsis variabilis的D-氨基酸氧化酶基因daao，重组菌中DAAO的酶活的达到0.3U/mL。

[0039] (2)本发明基于DAAO基因在C.glutamicum ATCC13032中的高效表达，LeuDH和FDH在E.coli BL21中的高效表达，研究了酶法转化产L-正缬氨酸，并在25h内获得了80.09g/L的L-正缬氨酸，D-正缬氨酸摩尔转化率达到98.3％。本次发明采用酶法转化生产L-正缬氨酸，具有产物专一性强、转化效率高等优点。

[0040] 实施例1：D-氨基酸氧化酶，亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶引物设计

[0041] 根据NCBI中Trigonopsis variabilis全基因组核酸序列中daao基因序列，设计daao基因的PCR引物P1和P2。

[0042] F：5’-GGGGTACCAAAGGAGGGAAATCATGGGATCCCAAAAGAGGGTT-3’(Kpn Ⅰ)[0043] R：5’-CGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAGCTTAGACTCGCGGGC-3’(EcoR I)[0044] 根据NCBI中Bacillus cereus全基因组核酸序列中leudh基因序列，设计leudh基因的PCR引物P3和P4。

[0045] F：5’-ACCGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3’(BamH Ⅰ)

[0046] R：5’-CGCGTCGACTTAGCGACGGCTAATAATATC-3’(Sal Ⅰ)

[0047] 根据NCBI中Candida boidinii全基因组核酸序列中fdh基因序列，设计fdh基因的PCR引物P5和P6。

[0048] F：5’-ACCGGGATCCATGAAGATCGTTTTAGTC-3’(BamH Ⅰ)

[0049] R：5’-CGCGTCGACTTATTTCTTATCGTGTTTAC-3’(Sal Ⅰ)

[0050] 实施例2：D-氨基酸氧化酶基因daao的克隆

[0051] 以Trigonopsis variabilis总DNA为模板，利用上面提供的引物做PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，90s，34个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各0.4μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5ml的离心管中，-20℃冰箱保存备用。回收产物与pMD18-T Vector连接，连接产物转化E.coil JM109，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-daao，经酶切验证连接成功后，加入甘油至终浓度
15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏。

[0052] 实施例3：亮氨酸脱氢酶基因leudh和甲酸脱氢酶基因fdh的克隆

[0053] 分别以Bacillus cereus和Candida boidinii的总DNA为模板，利用上面提供的引物做PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，90s，34个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各0.4μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在
1.5ml的离心管中，-20℃冰箱保存备用。回收产物与pMD18-T Vector连接，连接产物转化E.coil JM109，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，分别命名为pMD18-T-leudh和pMD18-T-fdh，经酶切验证连接成功后，加入甘油至终浓度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏。实施例3：重组质粒pXMJ19-daao的构建

[0054] 提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18-T-daao和pXMJ19，并分别用KpnⅠ/EcoR I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系：目的基因酶切产物7μL，pXMJ19酶切产物1μL，T4DNA连接酶buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pXMJ9-daao转化到感受态E.coil JM109，用LB氯霉素抗性培养基，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pXMJ9-daao，酶切验证正确后，加入甘油至终浓度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏备用。

[0055] 实施例4：重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh的构建

[0056] 提取保存于E.coli JM109中的质粒pMD18-T-leudh，pMD18-T-fdh和pET-28a(+)，并分别用BamHⅠ/SalⅠ进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系：目的基因酶切产物7μL，pET-28a(+)酶切产物1μL，T4DNA连接酶buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh转化到感受态E.coil JM109，用LB卡那霉素抗性培养基，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh，酶切验证正确后，加入甘油至终浓度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏备用。

[0057] 实施例4：重组质粒pXMJ9-daao转化C.glutamicum ATCC13032

[0058] 感受态制备：挑取C.glutamicum ATCC13032接种于一支10ml LBG(LB+0.5％葡萄糖)液体培养基，30℃摇床培养过夜，取500μL过夜培养的菌液转接入含3％甘氨酸和0.1％吐温-80的50ml液体LB培养基中，使得初始细胞OD600达到0.3于30℃，200r/min培养到细胞OD600达到0.9。细胞培养结束后将菌液预冷15min，然后离心收集菌体。用预冷的10％甘油洗涤菌体4次，最后用0.2ml 10％甘油重悬细胞，用1.5ml管分装，每管80ul直接用于电转化。

[0059] 电转：1800V电转5ms，电转后加入800ul LB培养基30℃培养2-3h

[0060] 重组菌获得：涂布于氯霉素抗性LBG培养基，30℃培养，挑取阳性菌落，提取质粒酶切验证，得到重组菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao。

[0061] 实施例5：C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao D-氨基酸氧化酶活力测定[0062] 将实施例4构建的重组菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao，与出发菌株C.glutamicum ATCC13032分别接种于10ml含氯霉素的LBG培养基中，30℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接于50ml LBG培养基中，30℃培养4h后至OD600为0.8时加入终浓度为0.8mM的IPTG，30℃诱导12h，取发酵液于4℃，10000r/min离心10min，pH 7.5的磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4)清洗2次，最后用5ml pH 7.5磷酸盐缓冲液悬浮。超声波破碎处理制备粗酶液。

[0063] 取磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)1mL，加入0.1M的D-正缬氨酸0.1mL，400U/mL的过氧化氢酶0.1mL和适量粗酶液，于37℃水浴15min后加入2mg/mL的对二硝基苯肼0.48mL，重新放入37℃水浴10min后加入3M的NaOH 1.7mL显色，然后检测在550nm处的吸光值。

[0064] 酶活定义单位为每分钟氧化D-正缬氨酸生成1umol 2-氧代戊酸所需的酶量。

[0065] 结果表明重组菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-daao表达的DAAO酶活为0.3U/mL，而原始菌C.glutamicum ATCC13032并没有检测到DAAO的酶活，从而实现了在C.glutamicum ATCC13032中DAAO酶活力的从无到有。

[0066] 实施例6：重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh转化E.coli BL21[0067] E.coli BL21感受态制备：(1)从LB平板上挑取新活化的单菌落，接种于10mL的LB液体培养基中培养12h左右，再将该菌悬液以1％的接种量接种于50mL的LB液体培养基培养2-3h，直至OD600达到0.5左右。(2)将菌液置于冰水浴中15min，使菌液迅速冷却。(3)分装菌液于若干个1.5mL离心管中，8000rpm离心1min后弃去上清，用0.1M的CaCl2溶液洗细胞2-3次。(4)经过清洗的菌液用80μL CaCl2和40μL50％的甘油悬浮后，于-40℃长期保存。

[0068] 转化：将10μL重组质粒pET-28a(+)-leudh和pET-28a(+)-fdh各加入到两管E.coli BL21感受态细胞中，轻轻混匀后置于冰上45min，然后42℃水浴热激90s后再置于冰上5min，然后加入800μLLB液体培养基后置于37℃培养1h后，8000rpm离心1min弃去上清，将剩余菌液涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养后挑取阳性菌落，提取质粒酶切验证，得到重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh和E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh。

[0069] 实施例7：E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh亮氨酸脱氢酶活力测定

[0070] 将实施例4构建的重组菌E.coli  BL21/pET-28a(+)-leudh与出发菌株E.coliBL21/pET-28a(+)分别接种于10ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接于50ml LB培养基中，37℃培养2h后至OD600为0.8时加入终浓度为
0.8mM的IPTG，28℃诱导9h后将菌液于4℃，10000r/min离心10min，pH 7.5的磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4)清洗2次，最后用5ml pH 7.5磷酸盐缓冲液悬浮。超声波破碎处理制备粗酶液。

[0071] 配置84.7mM戊酮酸溶液，3mg/mL NADH溶液及900mM氯化铵溶液(pH 9.5)，取1.2mL氯化铵溶液置于石英比色皿中，再依次加入120μL NADH溶液，10μL戊酮酸溶液及2μL粗酶液，在340nm下检测每分钟的吸光值变化，酶活定义单位为1min催化1umol NADH转化成NAD+所需的酶量。

[0072] 结果表明重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-leudh的酶活为8.13U/mL，而原始菌E.coli BL21/pET-28a(+)并没有检测到亮氨酸脱氢酶的酶活，从而实现了在E.coli BL21中亮氨酸脱氢酶酶活力的从无到有。

[0073] 实施例8：E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh甲酸脱氢酶活力测定

[0074] 将实施例4构建的重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh与出发菌株E.coli BL21/pET-28a(+)分别接种于10ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接于50ml LB培养基中，37℃培养2h后至OD600为0.8时加入终浓度为0.8mM的IPTG，28℃诱导9h后将菌液于4℃，10000r/min离心10min，pH 7.5的磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4)清洗2次，最后用5ml pH 7.5磷酸盐缓冲液悬浮。超声波破碎处理制备粗酶液。

[0075] 配制17mg/mL的甲酸钠溶液(pH 7.5)，3mg/mL的NAD+溶液,取1.48mL的甲酸钠溶液置于石英比色皿中，依次加入80μL NAD+溶液和10μL粗酶液，在340nm下检测每分钟的吸光值变化，酶活定义单位为1min催化1umol NAD+转化成NADH所需的酶量。

[0076] 结果表明重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh的酶活为0.22U/mL，而原始菌E.coli BL21/pET-28a(+)并没有检测到甲酸脱氢酶的酶活，从而实现了在E.coli BL21中甲酸脱氢酶酶活力的从无到有。

[0077] 实施例9：利用D-氨基酸氧化酶，亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶通过动力学拆分生产L-正缬氨酸。

[0078] 将通过超声破碎所获得的D-氨基酸氧化酶，亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶粗酶液按照酶活添加量为2:1:0.5的比例加入到2L底物缓冲液中(0.1M磷酸盐缓冲液)，初始DL-正缬氨酸底物浓度为5g/L，通过分批补料策略依次向反应体系中补料，30℃转化25h，结果表明，转化25后，转化液中的L-正缬氨酸的含量为80.09g/L，L-正缬氨酸产率为98.3％。