[0001] 本发明涉及一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化葡萄糖合成2,3-丁二醇和乳酸的方法，属于基因工程技术领域。

[0002] 2,3-丁二醇作为一种平台化合物，可用于合成甲乙酮和1,3-丁二烯等。除此之外，2,3-丁二醇还可作为燃料添加剂或用于制备油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药及药物手性载体等。乳酸可作为食品的风味添加物，同时起到防腐保鲜的功效；另外乳酸也被广泛应用到化妆品、医药行业中，具有重要的市场价值。2,3-丁二醇和乳酸的混合产品可以作为醋、酒等食品的风味调和物质。目前2,3-丁二醇和乳酸的主要生产方法分为化学合成法和微生物发酵法。随着化石资源的日益枯竭和环境压力的增大，利用微生物转化廉价原料发酵生产大宗化学产品受到越来越多的青睐，因此设计合理的微生物代谢途径，实现微生物全细胞转化葡萄糖直接合成2,3-丁二醇和乳酸具有重要意义和应用价值。

[0003] 本发明提供了一种构建重组钝齿棒杆菌，实现其全细胞转化葡萄糖合成2,3-丁二醇和乳酸的方法。将来源于枯草芽孢杆菌alsSD基因转化到钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SDNN403中(本菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.0890；申报相关专利：ZL 03112896.3)，构建C.crenatum/pXMJ19-alsSD。基于获得的基因工程菌，全细胞转化150g/L葡萄糖可以合成2,3-丁二醇25±1.1g/L，乳酸56±1.5g/L。

[0004] 在发明过程中用到以下研究方法和微生物培养条件：

[0005] 1.培养基和培养条件

[0006] (1)大肠杆菌：

[0007] 培养条件：旋转式摇床37℃，160r/min。

[0008] LB培养基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0；固体LB培养基需添加2％的琼脂；

[0009] (2)钝齿棒杆菌：

[0010] 培养条件：培养温度30℃，转速180r/min。

[0011] 种子培养基为LBG培养基，即LB培养基添加0.5％的葡萄糖；

[0012] 用于电转化的感受态培养基：LB培养基添加3％的甘氨酸，0.1％的吐温80，用于C.crenatum感受态细胞的培养；

[0013] 发酵培养基(g/L)：酵母粉8，(NH4)2SO4 40，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 1，KH2PO4 1.5，MnSO4·H2O 0.02，FeSO4·7H2O 0.02，CaCO3 30；

[0014] 2.染色体基因组DNA的提取和质粒DNA的提取

[0015] C.crenatum和B.subtilis染色体基因组按照细菌染色体基因组DNA提取试剂盒相关操作说明进行提取。E.coli质粒DNA的提取使用试剂盒提取，C.crenatum的重组质粒进行提取时需先加入溶菌酶作用细胞壁一段时间之后，再使用试剂盒提取重组质粒。

[0016] 3.大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

[0017] CaCl2法制备E.coli感受态细胞；42℃热击转化E.coli JM109，经过氨苄青霉素抗性平板筛选获得阳性转化子。

[0018] 4.C.crenatum感受态细胞的制备与电转化方法

[0019] (1)挑取新鲜斜面上的菌株接种于含0.5％葡萄糖的LB培养基中，30℃，200r/min培养12h；(2)按接种量1％转接入感受态培养基于30℃，200r/min培养3-5h至OD562约为0.9；(3)细胞培养结束后，先将菌液冰浴20min，离心10min，4℃，8000r/min；(4)预冷的10％甘油洗涤细胞，最终用500μL的10％甘油重新悬浮细胞，1.5mL离心管分装，每管70μL，感受态细胞可用于电转化；(5)电转时，添加3μL的重组质粒到每管(4)中的感受态细胞，冰上放置
10min，加入预冷的电极杯中电击，电压：1.8kV，时间：5ms；(6)之后，加入含0.5％葡萄糖的LB培养基800μL，并放置于46℃水浴锅中水浴6min，完成后，30℃，200r/min培养2h；(7)后培养结束后，8000r/min，离心10min，去掉大部分上清，留取200μL，悬浮菌液，涂布Km抗性平板或Cm抗性平板，30℃培养箱培养60h，观察转化子生长情况。

[0020] 实施例1重组菌C.crenatum/pXMJ19-alsSD的构建

[0021] 以Bacillus subtilis168染色体为模板，分别以PalsSDF和PalsSDR为引物进行PCR，将PCR得到的基因片段alsSD(SEQ ID NO.1)与质粒pXMJ19用SmaⅠ与SacⅠ双酶切，然后胶回收，用T4DNA连接酶连接pXMJ19与alsSD片段，转化E.coli JM109，构建重组质粒pXMJ19-alsSD。引物序列如下：

[0022] PalsSDF：ACCGCCCGGGAAAGGAGGGAAATCATGACAAAAGCAACAAAAG

[0023] PalsSDR：ACCGGAGCTCTTATTCAGGGCTTCCTTC

[0024] 将构建好的重组质粒pXMJ19-alsSD电击转化C.crenatum，在Km平板上筛选出阳性菌落，即为重组菌C.crenatum/pXMJ19-alsSD。

[0025] 实施例4重组菌C.crenatum/pXMJ19-alsSD转化葡萄糖合成2,3-丁二醇和乳酸[0026] (1)种子活化：将C.crenatum/pXMJ19-alsSD按照1％的接种量接种至10mL LBG培养基中，30℃，180r/min培养大约12h；

[0027] (2)菌体培养：将种子液按照5％的接种量转接至发酵培养基中，30℃，180r/min培养24h左右；

[0028] (3)全细胞转化：将培养24h的C.crenatum/pXMJ19-alsSD发酵液10000r/min离心30min，收集菌体细胞，按照菌体湿重：转化液体积为1：20的比例，将细胞悬浮于全细胞转化培养液(g/L)：KH2PO4 0.5，K2HPO4·3H2O 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 6，MnSO4·H2O4.2，葡萄糖150，转化过程中维持pH在7.0左右。转化60h，可得到25±1.1g/L的2,3-丁二醇和56±1.5g/L的乳酸。

[0029] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。