一种提高肝素酶I活性的工程菌株构建方法 |
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| 申请号 | CN201610943394.3 | 申请日 | 2016-10-26 | 公开(公告)号 | CN106497897A | 公开(公告)日 | 2017-03-15 |
| 申请人 | 天津科技大学; | 发明人 | 罗学刚; 杨宝成; 张同存; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法。依照肝素酶I的空间结构分析对其 氨 基酸序列进行优化，获得比酶活提高48％的Hep169。然后根据密码子偏爱性优化HepI169基因，通过人工合成获得基因DNA，克隆到表达载体中与SUMO等标签进行融合表达，转化宿主细胞、筛选建立了Hep169的可溶性基因工程表达生产体系，分析结果显示目的蛋白获得了高效的可溶性表达，且具有很好的 生物 学活性，能高效的裂解肝素生成低分子量肝素。本发明方法不仅提供了一种高活性的HepI，而且为肝素酶I的高效可溶性基因工程表达生产提供了一种新方法，可有效降低低分子肝素等药物的生产成本，具有广泛的应用前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种高活性的肝素酶I(HepI)及其高效可溶性基因工程表达生产方法，其特征在于： |
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| 说明书全文 | 一种提高肝素酶I活性的工程菌株构建方法技术领域背景技术[0002] 肝素是动物体内一种天然抗凝血物质，一直被用做抗凝血的主要药物，并且研究表明除了抗凝血活性及其相关的抗血栓形成活性以外，肝素还具有抑制平滑肌细胞增殖、抗炎症、抗肿瘤和抗病毒等生物学功能。虽然肝素现仍用于临床治疗，但是其带来的副作用也越来越明显，例如肝素的长期使用容易引起大量出血，诱导血小板减少及血栓形成，影响血小板稳定及过敏反应等症状。而低分子量肝素以其注射吸收好、半衰期长、生物利用度高、出血副作用少等优点在临床上的应用不断扩大。截至目前为止，低分子量肝素已经逐步取代肝素成为了首选的治疗药物。 [0003] 低分子量肝素的生产可以分为化学降解法和酶解法。酶解法相对于化学降解法而言具有其独特的优点，例如作用条件温和，酶的专一性高，环境相对友好等，是较理想的工业生产低分子肝素的方法。但是利用酶解法生产低分子量肝素的缺点在于肝素酶(HepI)的来源有限，其野生菌产量很低并且需要价格昂贵的肝素进行诱导表达，从而导致生产成本过高。另一方面也是由于HepI的重组表达极易形成无活性的包涵体，并且不容易复性。 [0004] 我国是肝素原料的出口大国，但一直未能对低分子量肝素生产技术进行系统的研究。目前低分子量肝素主要来自合资企业生产或者由国外进口，因此，利用酶解法生产低分子量肝素的研究应用前景极为广泛。而HepI作为低分子量肝素酶法生产的原材料，其高效生产技术的研究则受到广泛关注。 [0005] 本研究采用融合表达HepI的形式来克服其容易形成包涵体的难题，同时结合生物信息学分析，对采取定点突变策略提高其酶活性，以达到其高效生产和利用的目的。 发明内容[0006] 本发明的目的在于克服当前肝素酶活性低的而缺点，提供一种高活性HepI及其高效可溶性基因工程表达方法，本发明获得的工程菌可以可溶性表达高活性HepI，因此不但降低了包涵体在变复性过程中的酶活损失、缩短了生产工艺，降低了生产成本，便于更好的大规模工业化生产HepI，更能高效地用于低分子量肝素的工业化生产。 [0007] 本发明实现目的的技术方案如下： [0008] 一种一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法，其特征在于：改造获得一种具有高活性的HepI突变体Hep169，然后利用分子生物学技术建立了它的高效可溶性基因工程表达体系。 [0009] (1)依照HepI的空间结构分析，改造获得一种比酶活较野生型提高48％的高活性169 肝素酶Hep ； [0011] (3)为实现高效可溶性基因工程表达，将Hep169与可促进二硫键形成、空间折叠的融合标签进行融合表达，这些融合标签包括SUMO、泛素、GST、Trx、DsbC、MBP等[0012] (4)为了确保融合标签不影响Hep169的空间结构及活性，在肝素酶I基因的N端引入柔性linker，可用的柔性linker包括(G4S)n(n＝1-4)、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG等。 [0013] (5)为了在后续纯化中切去融合标签，在融合标签与Hep169间引入了蛋白酶切割位点，可用的蛋白酶包括肠激酶、SUMO蛋白酶、凝血酶、TEV酶、Xa因子、3C蛋白酶等； [0014] (6)将重组质粒转化至基因工程宿主菌，所述宿主菌包括大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等。 [0015] (7)重组表达产物Hep169可高效裂解肝素生成低分子量肝素。 [0016] 本发明的有益效果和优点是： [0017] 1、本发明的方法改造获得了一种酶活显著提高的HepI突变体Hep169，该突变体可明显提高低分子肝素的酶解制备效率、并降低成本。 [0018] 2、成功实现了HepI169的高效基因工程表达，避免了包涵体变复性过程中对酶活造成的损失、缩短了HepI的生产工艺流程，降低了生产成本。 [0019] 3、本发明的重组Hep169具有可溶性好，活性高等优点，可以极大地发挥其在工业上高效生产低分子量肝素的目的。 [0021] 图1为本发明重组质粒PCR验证图，泳道1是以pESUMO为模板做的PCR结果，作为阴性对照，泳道2是G4S柔性linker-肠激酶切割位点(DDDDK)-HepI的PCR结果，作为阳性对照，泳道3是以构建的重组质粒pESUMO-HepI为模板做的PCR结果。 [0022] 图2为HepI重组大肠杆菌的质粒提取验证图，泳道1是转入PESUMO空质粒的大肠杆菌；泳道2是转入pESUMO-HepI重组质粒的大肠杆菌，泳道3是转入突变质粒pESUMO-HepI169的大肠杆菌。 [0023] 图3为pESUMO-HepI169的突变位点测序结果。 [0024] 图4为利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测检测肝素酶的表达，泳道1是以导入空载质粒的大肠杆菌做阴性对照，泳道2是未经突变的HepI，泳道3是突变的Hep169。 [0025] 图5为HepI169的酶活检测。 具体实施方式[0026] 下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。 [0027] 本发明提供一种高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表达生产方法。具体内容包括： [0028] (1)依照HepI的空间结构分析，改造获得一种比酶活较野生型提高48％的高活性肝素酶Hep169； [0029] (2)Hep169表达载体的构建：为实现高效可溶性基因工程表达，将Hep169与可促进二硫键形成、空间折叠的融合标签进行融合表达，这些融合标签包括SUMO、泛素、GST、Trx、DsbC、MBP等；为了确保融合标签不影响Hep169的空间结构及活性，在肝素酶I基因的N端引入柔性linker，可用的柔性linker包括(G4S)n(n＝1-4)、GSGGSG、GSGGSGG、GSGGSGGG等；为了在后续纯化中切去融合标签，在融合标签与Hep169间引入了蛋白酶切割位点，可用的蛋白酶包括肠激酶、SUMO蛋白酶、凝血酶、TEV酶、Xa因子、3C蛋白酶等； [0030] (3)将重组质粒转化至基因工程宿主菌，所述宿主菌包括大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等。 [0031] (4)重组表达产物Hep169的活性分析。 [0032] 结果显示：本发明所获得HepI突变体Hep169具有显著高于野生型HepI的酶活，所建169 立的基因工程表达体系可实现Hep 的高效可溶性表达。本发明方法不仅为HepI的生产提供了一种新发方法，而且所获得的高活性HepI-169可以更高效的用于低分子量肝素的工业化生产，这在医药工业方面具有广泛的应用前景。 [0033] 一、高活性HepI的重组工程菌构建方法(以SUMO融合的大肠杆菌表达体系为例)，步骤如下： [0034] 1、构建N端引入G4S柔性linker-肠激酶切割位点(DDDDK)序列的HepI基因[0035] 以下表中引物进行PCR扩增 [0036] [0037] ，以肝素黄杆菌基因组DNA为模板，用P3、P4引物通过PCR扩增后获得HepI基因序列，再以引物P1、P2(引入BsaI和BamHI酶切位点，下划线部分)再次扩增获得G4S柔性linker-肠激酶切割位点(DDDDK)-HepI，然后酶切、纯化、连接到pESUMO质粒中，得到pESUMO-HepI质粒。 [0038] 具体体系及扩增条件如下： [0039] 扩增HepI的PCR反应体系 [0040] [0041] 反应条件： [0042] [0043] [0044] 2、HepI169重组质粒的构建 [0045] 将pESUMO-HepI质粒转化大肠杆菌DH5α，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，培养12h后挑取单克隆，提取质粒进行PCR验证，琼脂糖凝胶电泳检测有1134bp HepI目的片段的重组质粒经测序鉴定正确后，命名为PESUMO-HepI，然后以pESUMO-HepI为模板进行169位氨基酸的定点突变，突变产物转化大肠杆菌DH5α，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，培养12h后挑取单克隆，提取质粒经测序验证后，命名为pESUMO-Hep169(见图2)。 [0046] 构建质粒所需连接体系 [0047] [0048] 3、将HepI169重组质粒分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到基因工程菌株。 [0049] ⑴将-80℃保存的大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞于冰上解冻(切勿开盖，解冻时间大概为2min)。 [0050] ⑵设置4组实验，在无菌条件下，第一组加1μL重组融合质粒到感受态中，第二组加1μL重组融合突变质粒，第三组加1μL空载质粒，第四组做空白对照，不加任何质粒，加完之后冰浴30min。(重组质粒和空载质粒均含有卡那霉素抗性，大肠杆菌Rosetta(DE3)含氯霉素抗性) [0051] ⑶提前准备42℃的水，完成30min冰浴后热击90s。 [0052] ⑷热击之后迅速进行冰浴，时间为2-5min，让细胞开口完全闭合，防止质粒漏出； [0053] ⑸在无菌条件下向含有感受态的EP管中加入900μL LB培养基，37℃培养至OD600＝0.4； [0054] ⑹在培养感受态细胞期间，制备4个无菌的LB固体培养基，均添加0.1‰卡那霉素和氯霉素； [0055] ⑺在无菌条件下，将转化产物取出，8000rpm，离心2min，吸除850μL上清，剩余的培养液用移液枪轻轻吹悬，混匀； [0056] ⑻在无菌条件下进行涂板，用移液枪将上一步混悬的液体转移到LB固体培养基中，涂匀，正置20min； [0057] ⑼在已涂好的LB培养基在37℃恒温培养箱正置培养12-18h，对所长出的阳性克隆进行质粒提取、酶切及测序验证筛选。 [0058] 二、HepI169在重组大肠杆菌中表达产物检测 [0059] 1、将两种重组工程菌及转化pESUMO空质粒的大肠杆菌分别接种到5mL含有抗生素的LB培养基中，37℃，200r/min培养过夜。 [0060] 2、将过夜培养菌液按2％接种量于50mL发酵培养基中(250mL摇瓶)，37℃，200r/min培养至OD600约为0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，在37℃，200r/min条件下诱导培养10h，诱导完测定各菌体的OD600。 [0061] (3)4℃10000r/min离心10min收集菌体，用PBS洗涤菌体三遍。 [0062] (4)超声破碎菌体。 [0063] (5)破碎后样品处理：破碎后取两管40μL样品，其中一管直接加入10μL 5×SDS上样缓冲液，标记为全菌体；另一管12000r/min离心10min，上清转移至新EP管，加入10μL 5×SDS上样缓冲液，标记为上清液；沉淀用40μL PBS重悬，再加入10μL 5×SDS上样缓冲液，标记为沉淀。 [0064] (6)样品煮沸10min后经SDS-PAGE电泳检测，实验结果表明：HepI169在重组大肠杆菌中进行了表达，利用Odyssey成像，图片经quantity one软件分析各样品上清中目的蛋白的百分含量。 [0065] 三、HepI169的酶活测定 [0067] 本实验采用Sigma公司测定此类酶活性的方法来进行测定，其过程如下：取两只试管，设为实验组A和对照组B，都加入375μL反应缓冲液和50μL肝素钠溶液，在实验组A中加75μL肝素酶溶液，对照组B不加，将A和B置于30℃水浴锅中反应10min，然后都加2.5mL盐酸溶液终止反应，最后往对照组B中加75μL肝素酶溶液，将A和B体系都混合均匀，分别在232nm处测量吸光值。 [0068] 实验结果表明，重组表达所获得未经过突变的HepI和本发明构建的高活性肝素酶突变体HepI169都具有活性，且HepI169的酶活较HepI有显著提高。 [0069] 序列表 [0070] (1)HepI169氨基酸序列： [0071] [0072] (2)HepI169核苷酸序列(含G4S linker及肠激酶切割位点) [0073] |
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