[0001] 本发明涉及的是用金属离子沉淀剂制备胰激肽释放酶的方法。以猪胰脏或生产胰岛素后所剩的胰渣作为原料，水性溶液提取，金属离子沉淀剂进行沉淀，制备胰激肽释放酶。

[0002] 胰脏是重要的生化药物原料，从胰脏中提取分离生化制品是生物制药研究的趋势之一。目前由胰脏提取的生化制品达四十余种，主要包括酶、多肽、激素、核酸等制品。胰激肽释放酶是其中一种重要的生化制品，多年的基础实验和临床研究证实，激肽释放酶可用于高血压、心绞痛、动脉硬化症等多种心血管疾病的治疗；也可用于治疗如缺血性脑血管病，糖尿病引起的肾病等多种微循环障碍性疾病。由于人源组织激肽释放酶来源少及基因重组技术制备激肽释放酶成本高的双重限制，目前临床上广泛应用猪胰来源的激肽释放酶。

[0003] 当今工业制备及文献报道的激肽释放酶的制备工艺主要有三种：第一种方法是以胰脏丙酮粉或胰酶为原料，适当处理提取液后使用离子交换层析，再使用丙酮沉淀洗脱液中的激肽释放酶（[J]. 昆明医科大学学报, 2002, 23(1):107-108）；第二种方法是将胰脏匀浆提取液用丙酮分级沉淀，除去部分杂蛋白后将激肽释放酶沉淀出来，再将沉淀溶解后进行层析纯化（[D]. 南昌大学, 2006）；第三种方法是将激肽释放酶的粗品用硫酸铵分级盐析沉淀，再将沉淀进行层析纯化（[D]. 浙江大学材料与化学工程学院 浙江大学, 2008）。以上普遍采用的生产胰激肽释放酶的方法都需要先从新鲜猪胰脏中制备粗品或胰酶粉，操作步骤繁琐，并且制备过程中需要使用大量的丙酮（约投料量7倍）使其成本增加，丙酮不仅对人体具有慢性毒性，对环境容易造成污染，易燃易爆，其储存和应用均存在安全隐患。虽然丙酮对激肽释放酶沉淀有一定专属性，但同时可能使蛋白质发生变性，降低活性回收率。

[0004] 本发明创新性地采用水性溶液提取，金属离子沉淀剂进行沉淀的方法制备胰激肽释放酶，简化了操作步骤，舍弃了丙酮的大量应用，降低成本，减少安全隐患与环境污染。基于激肽释放酶具有重要的临床应用价值和经济价值，且我国胰脏资源丰富，本发明在降低生产成本、简化操作步骤、提高胰脏原料的利用度方面具有重要意义。

[0005] 本发明提供了一种用金属离子沉淀剂制备胰激肽释放酶的方法。以猪胰脏或生产胰岛素后所剩的胰渣为原料，水性溶液搅拌提取，离心，调节提取液pH使其大于胰激肽释放酶的等电点，使激肽释放酶带负电荷，与带正电的金属离子沉淀剂共沉淀，制备胰激肽释放酶。

[0006] 水性溶液主要指水、乙醇浓度小于50%的乙醇溶液以及pH 2～7的酸性水溶液，主要包括磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、盐酸溶液、硫酸溶液。选取的依据为胰激肽释放酶的溶解性、稳定性及对胰蛋白酶水解作用的抑制。pH小于2时，胰激肽释放酶不稳定；pH大于7时，由于胰蛋白酶的水解作用加强，胰激肽释放酶收率和活力降低。

[0007] 金属离子主要指二价金属离子，如Zn2+、Ca2+、Mg2+及其盐类，并使其终浓度为0.05 mol/L～0.30 mol/L，若浓度过低，沉淀不完全，影响收率；若浓度过高，金属离子不易除去，影响酶活力。一价金属离子如Na+、K+沉淀效果不佳，三价金属离子如Fe3+、Al3+对激肽释放酶的活性有强的抑制作用。

[0008] 本发明的特征是以水性溶液进行提取，金属离子沉淀剂进行沉淀。本发明成功建立了一种新型制备胰激肽释放酶的方法，舍弃制备过程中有机溶剂的大量运用、降低生产成本、简化操作步骤、减少环境污染及安全隐患。

[0009] 实例1本实例考察以生产胰岛素后所剩的胰渣为原料，Zn2+作为金属沉淀剂，制备胰激肽释放酶。收集中性乙醇提取胰岛素后的胰渣（胰岛素提取物方法为：称取150～200g的猪胰脏匀浆，加入原料重量2.6倍体积的85%乙醇，1% （W/W）Na2HPO4、1%（W/W）NaCl、1%（W/W）蔗糖，
4mol/L氨水调pH至7.0。室温搅拌提取4h，4000r/min离心15min，上清液用于制备胰岛素），加入其重量5倍体积的0.05mol/L NaAc-HAc缓冲液（pH5.0），室温下搅拌提取约3h，4000r/min离心15min，收集上清液，稀HCl调pH至4.8, 搅拌加入2mol/L ZnCl2溶液，使Zn2+离子终浓度为0.15mol/L，4℃静置过夜，4000r/min离心15min，收集沉淀。沉淀用丙酮脱水两次，乙醚脱脂一次，挥干乙醚，称重，胰激肽释放酶粗酶收率为1.94%，透析48h后测定胰激肽释放酶的活性为0.062U/mg。

[0010] 实例2本实例考察以生产胰岛素后所剩的胰渣为原料，Ca2+作为金属沉淀剂，制备胰激肽释放酶。收集中性乙醇提取胰岛素后的胰渣，加入其重量5倍体积的0.05mol/L NaAc-HAc缓冲液（pH5.0），室温下搅拌提取约3h，4000r/min离心15min，收集上清液，稀HCl调pH至4.8, 搅拌加入2mol/L CaCl2溶液，使Ca2+离子终浓度为0.15mol/L，4℃静置过夜，4000r/min离心
15min，收集沉淀。沉淀用丙酮脱水两次，乙醚脱脂一次，挥干乙醚，称重，胰激肽释放酶粗酶收率为1.15%，透析48h后测定胰激肽释放酶的活性为0.030U/mg。

[0011] 实例3本实例考察以猪胰脏为原料，Zn2+作为金属沉淀剂，制备胰激肽释放酶。称取150～
200g的猪胰脏匀浆，加入胰糜质量3倍体积的0.01mol/L NaAc-HAc缓冲液（pH3.0），室温下搅拌提取4h左右。监测pH，保持溶液的pH值在3.0～3.5之间。将上述提取液以4000r/min离
2+
心，收集上清液，加入4mol/L氨水，调pH至4.6，搅拌加入适量2mol/L ZnCl2溶液，使Zn 终浓度为0.15mol/L，4℃静置过夜沉淀。4000r/min离心，收集沉淀并称量，记为沉淀A，沉淀A 溶解于2～2.5倍体积0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）中，4000r/min离心，取上清液，加入预冷丙酮（-20℃）至丙酮体积比为70%，4℃静置2h，4000r/min离心，取沉淀，丙酮脱水，乙醚脱脂，得胰激肽释放酶收率为2.50%，透析72后测胰激肽释放酶活力为0.26U/mg。

[0012] 实例4本实例考察以猪胰脏为原料，Zn2+作为金属沉淀剂，制备胰激肽释放酶。称取20g的猪胰脏匀浆，加入胰糜质量3倍体积的0.01mol/L NaAc-HAc缓冲液（pH3.0），室温下搅拌提取
4h左右。监测pH，保持溶液的pH值在3.0～3.5之间。将上述提取液以4000r/min离心，收集上清液，加入4mol/L氨水，调pH至4.4，搅拌加入适量2mol/L ZnCl2溶液，使Zn2+终浓度为
0.15mol/L，4℃静置过夜沉淀。4000r/min离心，收集沉淀并称量，记为沉淀A，沉淀A 溶解于
2～2.5倍体积0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）中，4000r/min离心，取上清液，加入预冷丙酮（-20℃）至丙酮体积比为70%，4℃静置2h，4000r/min离心，取沉淀，丙酮脱水，乙醚脱脂，胰激肽释放酶收率为2.85%，透析72后测胰激肽释放酶活力为0.22U/mg。

[0013] 实例5本实例考察以猪胰脏为原料，Zn2+作为金属沉淀剂，制备胰激肽释放酶并进行离子交换层析。称取150～200g的猪胰脏匀浆，加入胰糜质量3倍体积的0.01mol/L NaAc-HAc缓冲液（pH3.0），室温下搅拌提取4h左右。监测pH，保持溶液的pH值在3.0～3.5之间。将上述提取液以4000r/min离心，收集上清液，加入4mol/L氨水，调pH至4.6，搅拌加入适量2mol/L ZnCl2溶液，使Zn2+终浓度为0.15mol/L，4℃静置过夜沉淀。4000r/min离心，收集沉淀并称量，记为沉淀A，沉淀A 溶解于适量0.01mol/L NaAc-HAc缓冲液（pH5.5），用快流速DEAE-琼脂糖进行层析，层析比活为72.5U/mg蛋白。

[0014] 实例6本实例考察以猪胰脏为原料，Ca2+作为金属沉淀剂，制备胰激肽释放酶。称取150～
200g的猪胰脏匀浆，加入其重量5倍体积的纯化水，室温下搅拌提取约3h，4000r/min离心
15min，收集上清液，稀HCl调pH至4.8, 搅拌加入2mol/L CaCl2溶液，使Ca2+离子终浓度为
0.15mol/L，4℃静置过夜，4000r/min离心15min，收集沉淀。沉淀用丙酮脱水两次，乙醚脱脂一次，挥干乙醚，称重，胰激肽释放酶粗酶收率为1.20%，透析48h后测定胰激肽释放酶的活性为0.025U/mg。

[0015] 实例7本实例考察以猪胰脏为原料，Zn2+作为金属沉淀剂，制备胰激肽释放酶。称取150～
200g的猪胰脏匀浆，加入其重量5倍体积的50%乙醇溶液，室温下搅拌提取约3h，4000r/min离心15min，收集上清液，稀HCl调pH至4.8, 搅拌加入2mol/L ZnCl2溶液，使Zn2+离子终浓度为0.15mol/L，4℃静置过夜，4000r/min离心15min，收集沉淀。沉淀用丙酮脱水两次，乙醚脱脂一次，挥干乙醚，称重，胰激肽释放酶粗酶收率为1.05%，透析48h后测定胰激肽释放酶的活性为0.020U/mg。