糖脂质的制造方法 |
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| 申请号 | CN201380054186.2 | 申请日 | 2013-10-03 | 公开(公告)号 | CN104736705B | 公开(公告)日 | 2017-12-22 |
| 申请人 | 花王株式会社; | 发明人 | 高桥史员; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供下述(a)～(c)中任一种 蛋白质 、编码该蛋白质的基因、该基因缺失、变异或者表达抑制的转化体、以及使用该转化体的糖脂质的制造方法，其中，(a)由序列号1所表示的 氨 基酸序列构成的蛋白质；(b)由与序列号1所表示的氨基酸序列具有50％以上的同一性的氨基酸序列构成，并且具有醇 氧 化酶 活性的蛋白质；(c)由在序列号1所表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换、插入、或者附加而成的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种转化体，其中， |
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| 说明书全文 | 糖脂质的制造方法技术领域背景技术[0003] 烷基葡萄糖苷或者槐糖脂的工业生产主要是以糖和醇作为原料通过化学合成来进行，但是存在需要大量原料醇，并且由于进行高温·高压下的反应而原料葡萄糖会改性等的问题。 [0004] 从这样的实际情况出发，寻求更高效率的生产方法，探讨了使用微生物的糖脂质的制造技术。例如，已知如果在含有糖和醇的培养基中培养作为酵母的1种的假丝酵母菌(Candida bombicola)，则作为产物可以得到烷基槐糖苷(alkyl sophoroside)或者槐糖脂(参照专利文献1和非专利文献1)。 [0005] 现有技术文献 [0007] 非专利文献1：Biotechnology Letters,Volume 20,No.3,1998,pp.215-218发明内容 [0008] 然而，使用上述微生物的制造方法虽然能够进行常温·常压下的糖脂质制造，但是存在糖脂质相对于原料醇的收率非常低的问题。 [0009] 在此，本发明的课题在于，提供在常温·常压下能够生产率良好地制造糖脂质的微生物转化体、以及使用该转化体的糖脂质的制造方法。 [0010] 本发明者们针对使用微生物的糖脂质的制造技术进行了专门探讨，结果发现：在假丝酵母菌(Candida bombicola)的醇代谢路径中，有新型的醇氧化酶参与。进一步发现，用使该醇氧化酶基因的功能降低的转化体会显著提高糖脂质的生产率。本发明是基于这些发现完成的。 [0011] 即，本发明涉及一种转化体(以下也称为“本发明的转化体”)，其在具有编码下述(a)～(c)中任一种蛋白质的基因的宿主中，该基因缺失、变异或者表达抑制，并且与该宿主相比醇氧化酶活性降低。 [0012] (a)由序列号1所表示的氨基酸序列构成的蛋白质； [0013] (b)由与序列号1所表示的氨基酸序列具有50％以上的同一性的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质； [0014] (c)由在序列号1所表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换、插入、或者附加而成的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质。 [0015] 另外，本发明涉及包括下述(1)和(2)的工序的糖脂质的制造方法(以下也称为“本发明的糖脂质的制造方法”)。 [0016] (1)在含有醇和糖的培养基中培养上述转化体的工序；以及 [0017] (2)从所得到的培养物中采集糖脂质的工序。 [0018] 另外，本发明涉及编码上述(a)～(c)中任一种蛋白质的基因(以下也称为“本发明的基因”)。 [0019] 另外，本发明涉及上述(a)～(c)中任一种蛋白质(以下也称为“本发明的蛋白质”)。 [0020] 根据本发明，可以提供对糖脂质的高效生产有用的新型醇氧化酶以及编码该醇氧化酶的基因。另外，根据本发明，可以提供糖脂质的生产能优异的转化体。进一步，根据本发明，可以提供生产率优异且对糖脂质的工业生产有用的糖脂质的制造方法。 附图说明[0022] [图1]是将实施例中制作的KSM36株、NBRC10243株、KSMΔura3株中ura3基因区域的序列的一部分进行比较的图。 [0024] [图3]是表示在实施例中制作的KSMΔura-ura株和KSMΔAOX株中醇氧化酶活性的图。 [0025] [图4]是表示在实施例中制作的BL21(DE3)-pET-AOX株和BL21(DE3)-pET株中，表达蛋白质的检测结果的图。 [0026] [图5]是表示在BL21(DE3)-pET-AOX株和BL21(DE3)-pET株中醇氧化酶活性的图。 [0027] [图6]是表示将在实施例中制作的KSMΔura-ura株和KSMΔAOX株用1-十四醇作为基质进行培养的培养液的GC分析结果的图。 具体实施方式[0028] 1.醇氧化酶 [0029] 本发明的蛋白质是以下的(a)～(c)中任一种蛋白质(以下也称为“本发明的醇氧化酶”)。 [0030] (a)由序列号1所表示的氨基酸序列构成的蛋白质； [0031] (b)由与序列号1所表示的氨基酸序列具有50％以上的同一性的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质； [0032] (c)由在序列号1所表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、置换、插入、或者附加而成的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质。 [0033] 由上述(a)的序列号1所表示的氨基酸序列构成的蛋白质是来自假丝酵母菌(Candida bombicola)的新型醇氧化酶。 [0034] 在微生物的醇氧化酶中，有醇氧化酶(alcohol oxidase)(以下，也简记为“AOX”)或醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)(ADH)，并且催化将醇氧化为醛的反应。对于假丝酵母菌(Candida bombicola)的醇氧化酶，至今没有详细了解，本次由本发明者们首次鉴定了醇氧化酶及其基因。该蛋白质如后述的实施例所示，具有醇氧化酶活性。将假丝酵母菌(Candida bombicola)的醇氧化酶的氨基酸序列示于序列号1中，将基因的碱基序列示于序列号2中。 [0035] 本发明的蛋白质中，在上述(a)的蛋白质之外，作为与该蛋白质功能均等的蛋白质包含上述(b)和(c)的蛋白质。 [0036] 在上述(b)中，氨基酸序列的同一性从糖脂质的生产率提高的观点出发，优选为80％以上，进一步优选为90％以上，更加优选为95％以上。 [0037] 在本发明中，氨基酸序列的同一性是指将比较的2个氨基酸序列根据需要导入间隙来进行排列(比对(alignment))，所得到的最大的氨基酸序列的同一性(％)。氨基酸序列的同一性可以通过通常的方法进行分析，例如可以通过安装有BLAST算法的NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)的blastp或者安装有Genetyx Win的Homology search等来计算。 [0038] 另外，上述(c)中，从糖脂质的生产率提高的观点出发，“1个或者多个氨基酸”优选为1～10个氨基酸，进一步优选为1～5个氨基酸，更加优选为1～3个氨基酸。 [0039] 另外，这些蛋白质具有醇氧化酶活性，这可以通过破坏编码该蛋白质的基因来测定菌体内的醇氧化酶活性的方法、或者用大肠杆菌等生产该蛋白质，并且测定该醇氧化酶活性的方法等来确认。在醇氧化酶活性的测定中，可以使用在后述的实施例中使用的方法等。 [0040] 对于本发明的蛋白质的获取方法不特别限定，可以通过通常进行的化学或者基因工程的方法等来获得。例如，可以通过从假丝酵母菌(Candida bombicola)等的微生物中分离、精制等获得来自天然产物的蛋白质。另外，还可以基于序列号1所示的氨基酸序列信息进行人工合成等，也可以通过化学合成来进行蛋白质合成，也可以通过基因重组技术制作重组蛋白质。在制作重组蛋白质的情况下，可以使用后述的本发明的醇氧化酶基因。 [0041] 2.醇氧化酶基因 [0042] 本发明的基因是编码上述(a)～(c)中任一种蛋白质的基因(以下也称为“本发明的醇氧化酶基因”)。 [0043] 作为编码上述(a)～(c)中任一种蛋白质的基因的具体例子，可以列举由下述(d)～(f)中任一种DNA构成的基因。 [0044] (d)由序列号2所表示的碱基序列构成的DNA； [0045] (e)由与序列号2所表示的碱基序列具有50％以上的同一性的碱基序列构成，并且编码具有醇氧化酶活性的蛋白质的DNA； [0046] (f)与由序列号2所表示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件(stringent condition)下进行杂交的DNA，并且编码具有醇氧化酶活性的蛋白质的DNA。 [0047] 在上述(e)中，从糖脂质的生产率提高的观点出发，碱基序列的同一性优选为80％以上，进一步优选为90％以上，更加优选为95％以上。 [0048] 在本发明中，碱基序列的同一性是指将比较的2个碱基序列根据需要导入间隙来进行排列(比对)，所得到的最大的碱基序列的同一性(％)。碱基序列的同一性可以通过通常的方法进行分析，例如可以通过安装有BLAST算法的NCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)的blastp或者安装有Genetyx Win的Homology search等来计算。 [0049] 另外，在上述(f)中，作为“严格的条件”，可以列举Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook，David W.Russell.，美国冷泉港实验室出版社]中记载的Southern杂交法等，例如可以列举在含有6×SSC(1×SSC的组成为：0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt溶液以及100mg/mL鲱鱼精子DNA的溶液中，以探针且在42℃下恒温8～16小时使杂交进行的条件。 [0050] 作为本发明的醇氧化酶基因的获取方法，不特别限定，可以通过通常的基因工程的方法获得。例如，可以基于序列号1所示的氨基酸序列或者序列号2所示的碱基序列，通过人工合成获得本发明的醇氧化酶基因。基因的人工合成例如可以利用Invitrogen公司等的服务。另外，也可以通过从假丝酵母菌(Candida bombicola)等的微生物克隆来获得，例如，可以通过Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook，David W.Russell，美国冷泉港实验室出版社(2001)]中记载的方法等来进行。 [0051] 在序列号1所示的氨基酸序列或者序列号2所表示的碱基序列中导入变异的情况下，例如可以列举部位特异性变异导入法。作为具体的部位特异性变异的导入方法，可以列举利用重叠延伸(SOE)PCR反应(Horton et al.,Gene 77,61-68,1989)的方法、ODA法(Hashimoto-Gotoh et al.,Gene,152,271-276,1995)、Kunkel法(Kunkel,T.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,82,488)等。另外，可以利用Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km试剂盒(TAKARA BIO INC.)、Transformer TM Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Clonetech公司)、KOD-Plus-Mutagenesis试剂盒(TOYOBO CO.,LTD)等市售的试剂盒。另外，在施以无规的基因变异之后，通过适当的方法进行酶活性的评价和基因分析可以获得靶标基因。具体而言，通过使用无规克隆的DNA片段引起同源重组的方法或者照射γ射线等可以进行无规的基因变异。 [0052] 3.转化体 [0053] 本发明的转化体是在具有编码上述(a)～(c)中任一种蛋白质的基因的宿主中，该基因缺失、变异或者表达抑制，并且与该宿主相比，醇氧化酶活性降低的转化体。通过该基因缺失、变异或者表达抑制，从而本发明的转化体与转化前的宿主相比，醇氧化酶活性降低。其结果推测为，转化体内的醇代谢路径被阻碍，成为糖脂质合成的原料的醇不在醇代谢路径中被消耗而被有效利用于糖脂质合成中，因此糖脂质的生产率提高。 [0054] 本发明的转化体可以通过使宿主中的上述醇氧化酶基因缺失、变异或者表达抑制来得到。 [0055] 作为转化体的宿主，可以是具有编码上述(a)～(c)中任一种蛋白质的基因的物质。从糖脂质的生产率提高的观点出发，作为宿主优选具有编码上述(a)～(c)中任一种蛋白质的基因的微生物。 [0056] 作为该微生物，从操作性的提高、糖脂质的生产率提高的观点出发，优选为酵母。作为酵母，可以列举属于假丝酵母(Candida)属的菌类、属于红酵母(Rhodotorula)属的菌类、属于毕赤酵母(Pichia)属的菌类、属于拟威克酵母(Wickerhamiella)属的菌类、或者属于Starmerella属的菌类等。 [0057] 作为属于上述假丝酵母(Candida)属的菌类，可以列举假丝酵母菌(Candida bombicola)(别名：Starmerella bombicola)、蜂生假丝酵母菌(Candida apicola)、假丝酵母菌(Candida batistae)、假丝酵母菌(Candida floricola)、假丝酵母菌(Candida riodocensis)或者星形假丝酵母菌(Candida stellata)等。 [0058] 作为属于红酵母(Rhodotorula)属的菌类、属于毕赤酵母(Pichia)属的菌类、属于拟威克酵母(Wickerhamiella)属的菌类、或者属于Starmerella属的菌类，可以列举Rhodotorula bogoriensis、异常毕赤酵母(Pichia anomala)PY1、或者拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae)等。 [0059] 其中，从糖脂质的生产率提高的观点出发，优选属于假丝酵母(Candida)属的菌类，进一步优选为假丝酵母菌(Candida bombicola)、蜂生假丝酵母菌(Candida apicola)、假丝酵母菌(Candida batistae)、假丝酵母菌(Candida floricola)、假丝酵母菌(Candida riodocensis)或者星形假丝酵母菌(Candida stellata)，更加优选为假丝酵母菌(Candida bombicola)。 [0060] 另外，上述宿主微生物可以从ATCC(美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection))、NBRC(日本技术评价研究所生物资源中心(Biological Resource Center,NITE))等的生物遗传资源保藏中心等获得。 [0061] 作为从宿主基因组使本发明的醇氧化酶基因缺失、变异或者表达抑制的方法，可以通过从基因组中除去靶标基因的一部分或者全部、或者将其与其它基因置换、在该基因中插入其它的DNA片段、在该基因的转录·翻译开始区域中赋予变异等的方法来进行。其中，在本发明中，优选使本发明的醇氧化酶基因从宿主基因组中物理地缺失而成的转化体。 [0062] 上述缺失·变异·表达抑制方法可以使用同源重组来进行。例如，通过PCR等的方法构筑包括靶标基因的上游、下游区域但是不包含靶标基因的直链状DNA片段，并将其整合至宿主细胞内而使得在靶标基因上游侧、下游侧引起双交换(double crossover)的同源重组，从而使基因组上的靶标基因缺失或者和其它基因片段置换。另外，通过PCR等方法来构筑导入有碱基置换或者碱基插入等变异的靶标基因，并且将其整合至宿主细胞内从而在宿主基因组的靶标基因内的变异位点的外侧的两处引起双交换的同源重组，从而使基因组上的靶标基因的功能降低或者消失。另外，将包含靶标基因的一部分的DNA片段克隆于适当的质粒载体中，使由此得到的环状重组质粒整合至宿主细胞内，通过在靶标基因的一部分区域中同源重组而将宿主基因组上的靶标基因切割，从而能使其功能降低或消失。 [0063] 通过这样的同源重组引发的靶标基因的缺失·变异·表达抑制方法例如可以参考Besher et al.,Methods in molecular biology 47,p.291-302,1995等的文献进行。 [0064] 对于在宿主中导入同源重组用的DNA片段或者质粒的方法，可以列举电脉冲法、原生质体法、醋酸锂法、以及它们的改变方法等在酵母的转化中通常使用的方法。 [0065] 例如通过电脉冲法进行的情况下，可以使增殖到对数增殖期的宿主细胞与同源重组用的DNA片断或者质粒悬浊于山梨糖醇溶液等中，施加电脉冲。在使同源重组用的DNA片断或者质粒与宿主细胞相接触的时候，还优选通过添加鲑鱼精DNA等的载体DNA或聚乙二醇等来提高转化频率。电脉冲的条件优选为时间常数值(time constant)(电压衰减至最大值的约37％的时间)约为10到20毫秒，脉冲后的活菌率约为10～40％的条件。在施加电脉冲之后，将菌液洒入含有山梨糖醇溶液的培养基中选择转化体。 [0066] 靶标基因缺失的转化体的选择可以通过从转化体中提取基因组DNA，以包含靶标基因部位的区域为对象进行PCR的方法；或者使用了结合于靶标基因区域的DNA探针的DNA印迹技术(Southern blotting)法等来进行。 [0067] 在本发明的转化体中，与宿主(即转化前的状态)相比，醇氧化酶活性降低。从糖脂质的生产率提高的观点出发，转化体的醇氧化酶活性相对于宿主的醇氧化酶活性优选为70％以下，进一步优选为50％以下，更加优选为30％以下，更进一步优选为20％以下，更加进一步优选为10％以下。在此，上述醇氧化酶活性可以通过实施例中记载的方法来测定。 [0068] 4.糖脂质的制造方法 [0069] 本发明的糖脂质的制造方法可以使用上述转化体来进行，并且包括下述(1)和(2)的工序。 [0070] (1)在含有醇和糖的培养基中培养上述转化体的工序、 [0071] (2)从得到的培养物中采集糖脂质的工序 [0073] 培养转化体的培养基中作为糖脂质合成的原料含有醇和糖。 [0074] 从将得到的糖脂质作为表面活性剂使用的观点出发，上述醇优选为碳原子数为10以上且22以下的醇，进一步优选为碳原子数为12以上且18以下的醇，更加优选为碳原子数为12以上且14以下的醇。另外，上述醇从同样的观点出发，优选为伯醇或者仲醇。 [0075] 作为优选的醇的具体例子，可以列举1-癸醇、1-十一烷醇、1-十二烷醇、1-十三烷醇、1-十四烷醇、1-十五烷醇、1-十六烷醇、1-十七烷醇、1-十八烷醇、1-油醇、1-二十烷醇、1-二十二烷醇等的伯直链饱和或者不饱和醇；2-癸醇、2-十一烷醇、2-十二烷醇、2-十三烷醇、2-十四烷醇、2-十五烷醇、2-十六烷醇、2-十七烷醇、2-十八烷醇等的仲饱和或者不饱和醇等。其中，优选1-十一烷醇、1-十二烷醇、1-十三烷醇、1-十四烷醇、1-十五烷醇、1-十六烷醇、2-十一烷醇、2-十二烷醇、2-十三烷醇、2-十四烷醇、2-十五烷醇、2-十六烷醇，进一步优选为1-十二烷醇、1-十三烷醇、1-十四烷醇、2-十二烷醇、2-十三烷醇、2-十四烷醇、2-十五烷醇，更加优选为1-十四烷醇。 [0076] 从获取性以及处理性提高的观点出发，上述糖优选为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉水解物(淀粉糖浆)、纤维素水解物、或者糖蜜(molasses)。其中从将得到的糖脂质作为表面活性剂使用的观点出发，进一步优选为葡萄糖、麦芽糖、或者糖蜜，更加优选为葡萄糖。 [0077] 醇和糖以外的培养成份可以根据宿主的种类适当选择。 [0078] 例如，在宿主为微生物的情况下，作为碳源可以使用山梨糖醇或甘油等糖醇类、柠檬酸等的有机酸类等，作为氮源可以使用酵母提取物、氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、氨水、尿素、大豆蛋白质、麦芽提取物、氨基酸、蛋白胨、玉米浆等，作为无机盐类可以使用锰盐、镁盐、钙盐、钠盐、铁离子、铜离子、硫酸盐、磷酸盐等，作为维生素类可以使用生物素、肌醇等。 [0080] 转化体的培养条件可以根据宿主的种类选择适当优选的培养条件。 [0081] 例如，在宿主为微生物的情况下，培养基的pH优选调节到2.5～9.0左右。pH的调节可以使用无机或者有机的酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等来进行。培养温度优选为15～35℃左右，进一步优选为25～32℃左右。培养时间优选为6～200小时左右，进一步优选为24～148小时左右。还可以根据必要加入通气或搅拌。 [0082] 特别地，在宿主为酵母的情况下，培养基的pH优选调节到使用的酵母能够繁殖的范围，例如pH3.0～8.0左右。培养温度优选为15～35℃左右，进一步优选为28～32℃左右。培养时间优选为48～148小时左右，优选振荡或者通气搅拌培养。 [0083] 在培养转化体并产生糖脂质之后，从培养物(培养体或培养液等)中将糖脂质分离、精制等而将其回收。 [0084] 作为分离、回收糖脂质的方法不特别限定，可以通过从通常微生物的培养上清液中分离糖脂质成分而使用的方法来进行。例如，可以使用通过疏水或离子交换树脂进行的吸附与解吸、通过结晶进行的固液分离、膜处理等的方法。 [0085] 本发明的制造方法，可以通过适当选择转化体的宿主、以及培养基中含有的醇和糖的种类来制造各种糖脂质。作为通过本发明的方法制造的糖脂质，可以列举烷基葡萄糖苷、槐糖脂、纤维二糖脂等。其中优选适合作为表面活性剂使用的烷基葡萄糖苷(进一步优选为烷基葡萄糖苷或者烷基槐糖苷)或者槐糖脂。 [0087] 关于上述实施方式，本发明进一步公开以下的蛋白质、基因、方法、转化体。 [0088] <1>一种转化体，其中，在具有编码下述(a)～(c)中任一种蛋白质的基因的宿主中，该基因缺失、变异或者表达抑制，并且与该宿主相比醇氧化酶活性降低，[0089] (a)由序列号1所表示的氨基酸序列构成的蛋白质； [0090] (b)由与序列号1所表示的氨基酸序列具有50％以上、优选为80％以上、进一步优选为90％以上、更加优选为95％以上的同一性的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质； [0091] (c)由在序列号1所表示的氨基酸序列中1个或多个、优选为1～10个、进一步优选为1～5个、更加优选为1～3个的氨基酸缺失、置换、插入、或者附加而成的氨基酸序列构成，并且具有醇氧化酶活性的蛋白质。 [0092] <2>如<1>项所述的转化体，其中，上述宿主为微生物。 [0093] <3>如<2>项所述的转化体，其中，上述微生物为酵母。 [0094] <4>如<3>项所述的转化体，其中，上述酵母为属于假丝酵母(Candida)属的菌类。 [0095] <5>如<4>项所述的转化体，其中，上述属于假丝酵母(Candida)属的菌类选自假丝酵母菌(Candida bombicola)、蜂生假丝酵母菌(Candida apicola)、假丝酵母菌(Candida batistae)、假丝酵母菌(Candida floricola)、假丝酵母菌(Candida riodocensis)或者星形假丝酵母菌(Candida stellata)。 [0096] <6>如<5>项所述的转化体，其中，上述属于假丝酵母(Candida)属的菌类为假丝酵母菌(Candida bombicola)。 [0097] <7>如<1>～<6>中任一项所述的转化体，其中，转化体的醇氧化酶活性相对于宿主的醇氧化酶活性为70％以下，优选为50％以下，进一步优选为30％以下，更加优选为20％以下，进一步更优选为10％以下。 [0098] <8>一种包括下述(1)和(2)的工序的糖脂质的制造方法，其中， [0099] (1)在含有醇和糖的培养基中培养<1>～<7>中任一项所述的转化体的工序；以及[0100] (2)从所得到的培养物中采集糖脂质的工序。 [0101] <9>如<8>项所述的制造方法，其中，上述醇是碳原子数为10以上、优选为碳原子数为12以上、并且碳原子数为22以下、优选为碳原子数为18以下、进一步优选为14以下的伯醇或者仲醇。 [0102] <10>如<8>或<9>所述的制造方法，上述糖脂质为烷基葡萄糖苷或者槐糖脂。 [0103] <11>一种编码上述(a)～(c)中任一种蛋白质的基因。 [0104] <12>如<11>项所述的基因，其中，所述基因由下述(d)～(f)中任一种DNA构成。 [0105] (d)由序列号2所表示的碱基序列构成的DNA； [0106] (e)由与序列号2所表示的碱基序列具有50％以上、优选为80％以上、进一步优选为90％以上、更加优选为95％以上的同一性的碱基序列构成，并且编码具有醇氧化酶活性的蛋白质的DNA； [0107] (f)与由序列号2所表示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下进行杂交的DNA，并且编码具有醇氧化酶活性的蛋白质的DNA。 [0108] <13>一种上述(a)～(c)中任一种蛋白质。 [0109] <14>如<1>～<7>中任一项所述的转化体在用于制造糖脂质中的用途。 [0110] <15>如<14>项所述的用途，其中，上述糖脂质通过包括下述(1)和(2)的工序的方法制造， [0111] (1)在含有醇和糖的培养基中培养<1>～<7>中任一项所述的转化体的工序；以及[0112] (2)从所得到的培养物中采集糖脂质的工序。 [0113] <16>如<15>项所述的用途，其中，上述醇是碳原子数为10以上、优选为碳原子数为12以上、并且碳原子数为22以下、优选为碳原子数为18以下、进一步优选为14以下的伯醇或者仲醇。 [0114] <17>如<14>～<16>中任一项所述的制造方法，其中，上述糖脂质为烷基葡萄糖苷或者槐糖脂。 [0115] 实施例 [0116] 以下，基于实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限定于此。 [0117] [培养基、培养条件] [0118] 在假丝酵母(Candida)属酵母的培养中使用了以下的培养基。各培养基在121℃的高压釜中20分钟之后混合使用。 [0119] 另外，将在φ24mm×200mm大型试管(YPD培养基，加入5mL)中在30℃、250rpm下振荡培养了48小时进行预培养而得到的菌种培养液接种2％(v/v)至φ24mm×200mm大型试管(AG生产培养基，加入5mL)，并在30℃、250rpm下振荡培养。 [0120] YPD培养基：1％的D-葡萄糖、1％的BactoTM酵母提取物(日本BD公司制造)、1％的BactoTM蛋白胨(日本BD公司制造) [0121] AG生产培养基：15％的D-葡萄糖、0.41％柠檬酸三钠(无水)、0.4％的BactoTM酵母提取物、0.154％的氯化铵、0.07％的七水硫酸镁、0.05％的氯化钠、0.027％的二水氯化钙、0.1％的磷酸二氢钾、0.012％的磷酸氢二钾(用1M HCl调节至pH5.8) [0122] 最小培养基：0.68％无氨基酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acids)(日本BD公司制造)、2％的D-葡萄糖 [0123] 醇同化培养基(alcohol utilizing medium)：0.68％的无氨基酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acids)(日本BD公司制造)、0.05％的BactoTM酵母提取物、2％的碳源 [0124] [基因组DNA提取] [0125] 假丝酵母菌(Candida bombicola)的基因组DNA是通过将φ24mm×200mm大型试管(YPD培养基，加入5mL)中在30℃、250rpm下振荡培养48小时而得到的培养液在4℃、15000rpm下离心分离1分钟并收集菌体，从该菌体中用Dr.GenTLE(酵母用)High Recovery(Takara Bio公司制造)来提取。 [0126] [PCR] [0127] 在PCR反应中使用PrimeStar Max DNA Polymelase(Takara Bio公司制造)，按照所附的实验计划进行操作。 [0128] 实施例 [0129] 1.假丝酵母菌(Candida bombicola)的EST分析 [0130] 将从NBRC(日本技术评价研究所生物资源中心，NITE)购得的假丝酵母菌(Candida bombicola)NBRC10243株接种1铂环至加入了5mL的50g/L YP肉汤(YPD Broth)(日本BD公司制造)的100mL容积的试管中，在30℃、250rpm下培养48小时。将得到的预培养液接种2％至5mL的SL培养基(10％的D-葡萄糖、10％的棕榈酸乙酯(东京化成工业公司制造)、1％的尿素、0.5％的BactoTM酵母提取物(日本BD公司制造)、用盐酸调节至pH5.0)。培养器使用100mL试管，在30℃、250rpm下进行培养。作为制作cDNA的RNA源，使用培养48小时的培养菌体。 [0131] RNA的提取是从取样后的菌体中用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司制造)，方法为将所附的实验计划改变一部分。在添加1mL缓冲液Y1并在30℃下振动30分钟时，向缓冲液中添加酵母裂解酶(zymolyase)-20T至100U/mL，溶解细胞壁。由得到的RNA使用SMARTer cDNA synthesis kit(Clontech公司制造)来合成全长cDNA文库。将EST分析委托给Genaris,Inc.，并得到cDNA序列信息以及注解数据。 [0132] 基于得到的DNA序列，寻找醇氧化酶的同源基因(homolog)。虽然没有发现与已知的醇氧化酶同一性高的序列，但发现了作为氨基酸序列显示与来自热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)的AOX 2(基因库：AAS46880.1)有35％同一性的弱同一性的序列。将该碱基序列示于序列号2，将由该碱基序列构成的基因命名为900c 0002基因。另外，将该基因编码的氨基酸序列示于序列号1。 [0133] 接下来，从假丝酵母菌(Candida bombicola)KSM36株(FERM-BP799)中寻找900c 0002基因。其结果发现KSM36株也具有和序列号1的碱基序列完全相同序列的基因。 [0134] 2.900c 0002基因的缺失 [0135] (1)假丝酵母菌(Candida bombicola)尿嘧啶基因变异株的获得 [0136] 通过I.V.Bogaert等，Yeast(2008)，25，p.273－278.中记载的方法，从假丝酵母菌(Candida bombicola)KSM36株中选取尿嘧啶缺陷型株(uracil auxotrophic strain)。进一步，从尿嘧啶缺陷型株中选取在ura3基因区域中插入了变异的株，作为KSMΔura3株。 [0137] 接下来，分析了KSM36株、NBRC10243株、KSMΔura3株的ura3基因区域的序列，结果是KSM36株的ura3基因序列与NBRC10243株的ura3基因序列(基因库登录号No.DQ916828)相同。然而，在KSMΔura3株中，通过一个碱基变异，从而54位的半胱氨酸(Cys)变为酪氨酸(Tyr)(图1)。 [0138] KSMΔura3株在最小培养基中不能繁殖，在添加有5-氟乳清酸的YPD培养基、以及添加有尿嘧啶的最小培养基中可以繁殖。另外，在通过上述IAN Van Bogaert等的方法将来自NBRC10243株的野生型ura3基因导入到KSMΔura3株，结果是在最小培养基中能够繁殖。另外，本菌株在向培养基中添加了尿嘧啶的情况下，槐糖脂生产能与作为亲株的KSM36株相等同。 [0139] (2)900c 0002基因缺失用质粒的构筑 [0140] 用下述方法构筑900c 0002基因缺失用质粒pUC-ΔAOX。 [0141] 将pUC-ΔAOX设计为具有与900c 0002基因的上游约1000bp、以及下游约1000bp的区域互补的序列，并在该区域之间插入ura3基因。 [0142] 将假丝酵母菌(Candida bombicola)KSM36株中提取的基因组DNA作为模板，作为PCR引物使用AOX1 US in F1(5’-AGCTTGCATGCCTGCTTTAAATCCAGAAAGAACTG-3’)(序列号3)以及AOX1 US-ura R(5’-CGAAAAATATGTACTGATAACTGCGTCAGTCATTG-3’)(序列号4)、Pura3F(5’-AGTACATATTTTTCGAAACAGCTCGCAA-3’)(序列号5)以及ura3R(5’-CTAAGAAACTCATCTTGACTGAACTTTTC-3’)(序列号6)、ura-AOX1 LS F(5’- AGATGAGTTTCTTAGAAGCCTTATATCGAATACAC-3’)(序列号7)、AOX1 LS in R1(5’-ATTCGAGCTCGGTACGACACTTCTCAGGAACCCTC-3’)(序列号8)，扩增了900c 0002基因的上游约 1000bp的区域、ura3基因、900c 0002基因的下游约1000bp的区域的DNA片段。 [0143] 接下来，将质粒pUC118作为模板，使用PCR引物pUC in F2(5’-GTACCGAGCTCGAATTCGT-3’)(序列号9)以及pUC in R2(5’-GCAGGCATGCAAGCTTGGC-3’)(序列号10)扩增质粒区域，并将其用Infusion HD Cloning Kit(Clontech公司制造)结合于上述DNA片段。将得到的质粒导入至大肠杆菌DH5α，并且在含有100ppm的氨苄青霉素钠盐的LB琼脂培养基上进行培养、繁殖，将由此得到的菌落作为转化体分离，从得到的转化体中提取质粒，得到标靶的900c 0002基因缺失用质粒pUC-ΔAOX。 [0144] (3)假丝酵母菌(Candida bombicola)900c 0002基因缺失株的构筑 [0145] 根据M.D.DE.Backer等，Yeast(1999)，15，p.1609－1618.的方法，使用pUC-ΔAOX将KSMΔura3株进行转化。具体而言，将KSMΔura3株接种至5mL的添加有300ppm的尿嘧啶的YPD培养基中，并且在30℃、250rpm下进行预培养48小时。将0.5mL培养液接种至50mL的添加有300ppm的尿嘧啶的YPD培养基中，在30℃、120rpm下培养约6小时。将繁殖的菌体收集之后，用20mL冰冻的灭菌水清洗2次。将菌体悬浊于冰冻的1mL的1M山梨糖醇溶液中，在5000rpm下离心5分钟，去除上清液之后，加入400μL的1M山梨糖醇进行悬浊。将菌体悬浊液以每份50μL进行分配，并加入2.5μg pUC-ΔAOX。将菌体悬浊液使用BIO-RAD GENE PULSER II(Bio-Rad公司制造)进行电穿孔之后，散布至含有1M山梨糖醇的最小培养基中，在30℃下培养1周。 [0146] 从得到的转化体中，通过PCR法选出了由900c 0002基因的上游和下游区域中的双交换而产生同源重组的菌株。从得到的转化体提取基因组DNA，并使用引物AOX1 US in F1(5’-AGCTTGCATGCCTGCTTTAAATCCAGAAAGAACTG-3’)(序列号3)以及AOX1 LS in R1(5’-ATTCGAGCTCGGTACGACACTTCTCAGGAACCCTC-3’)(序列号8)进行了PCR。其结果以每得到的转化体70％的概率进行双交换得到同源重组菌株，并将其作为KSMΔAOX株。 [0147] (4)假丝酵母菌(Candida bombicola)尿嘧啶基因导入株的构筑 [0148] 将900c 0002基因缺失株作为对照菌株，以在KSMΔura株中不缺失900c 0002基因的方式制作了在KSMΔura株的变异ura3区域中导入了野生型ura3基因的菌株。 [0149] 将从假丝酵母菌(Candida bombicola)KSM36株中提取的基因组DNA作为模板，使用引物Pura3F(5’-AGTACATATTTTTCGAAACAGCTCGCAA-3’)(序列号5)、以及ura3R2(5’-TTCATCATCGTCACTATA-3’)(序列号11)，通过PCR法扩增ura3区域的DNA片段。将得到的DNA片段使用Mighty Cloning Reagent Set Blunt End(TAKAR A BIO INC.制造)插入到pUC118DNA HincII/BAP(TAKARA BIO I NC.制造)，并得到了质粒pUC-ura3。 [0150] 使用质粒pUC-ura3，用与上述(3)同样的方法导入至KSMΔura株中。从得到的转化体提取基因组DNA，并使用在质粒区域中设计过的引物pUC seq 1(5’-GGCGAAAGGGGGATGTGC-3’)(序列号12)以及pUC seq 2(5’-GCACCCCAGGCTTTACAC-3’)(序列号13)，通过PCR进行了重组的确认。其结果以每得到的转化体11％的概率进行双交换得到同源重组菌株，并将其作为KSMΔura-ura株。 [0151] 3.KSMΔAOX株的醇同化能(utilizing ability) [0152] 将假丝酵母菌(Candida bombicola)KSMΔura-ura株以及KSMΔAOX株在YPD培养基中在30℃、250rpm下进行预培养48小时。将预培养液分别接种0.01％至作为碳源含有D-葡萄糖、1-十四烷醇、1-十六烷醇以及2-十四烷醇中任一种的醇同化培养基、或者不含碳源的培养基中，在30℃、250rpm下进行培养，测定了活菌数。在图2中示出培养时间和活菌数的关系。在图2中分别是，glc表示使用了D-葡萄糖作为碳源，C14ol表示使用了1-十四烷醇作为碳源，C16ol表示使用了1-十六烷醇作为碳源，2-C14ol表示使用了2-十四烷醇作为碳源。 [0153] 从图2中可知，KSMΔura-ura株和KSMΔAOX株均在不含碳源的培养基中不繁殖，而在添加葡萄糖的培养基中繁殖。这表示KSMΔura-ura株和KSMΔAOX株这两者都能够利用葡萄糖作为碳源。 [0154] 在使用醇作为碳源的情况下，KSMΔura-ura株的情况下，在含有1-十四烷醇、1-十六烷醇或者2-十四烷醇的培养基中繁殖。然而，在KSMΔAOX株的情况下，在含有1-十四烷醇、1-十六烷醇以及2-十四烷醇中任一种的培养基中都不繁殖。 [0155] 从该结果可知，KSMΔura-ura株能够将醇氧化为醛作为碳源来利用，但是KSMΔAOX不能将醇作为碳源利用，醇同化能消失了。 [0156] 4.醇氧化酶活性的测定 [0157] 将假丝酵母菌(Candida bombicola)KSMΔura-ura株以及KSMΔAOX株在YPD培养基中在30℃、250rpm下进行预培养48小时。将预培养液分别接种1％至作为碳源分别添加了10g/L的D-葡萄糖、以及1-十六烷醇的醇同化培养基中，在30℃、250rpm下进行培养48小时。 从培养后的菌体中调制微粒体膜蛋白质成分，并测定醇氧化酶活性(AOX活性)。另外，已知微生物的醇氧化酶局部存在于膜蛋白质成分中。 [0158] 微粒体膜蛋白质成分的调制、以及醇氧化酶活性的测定按照文献G.D.Kemp等，Appl.Microbiol.Biotechnol.(1988)，29，p.370-374中记载的方法来进行。 [0159] [微粒体膜蛋白质成分的调制] [0160] 将20mL培养后的菌体在8000rpm、4℃下离心10min收集菌体之后，将菌体用10mL的生理盐水清洗2次。将菌体加入500μL的1/15M磷酸缓冲液(pH7.4)悬浊，并用多珠振荡器(Multi-beads Shocker)(安井器械公司制造)以及媒介使用0.5mm玻璃珠进行破碎。添加500μL的1/15M磷酸缓冲液(pH7.4)并混合，将破碎液在4℃、3000g下离心5分钟，除去了未破碎的菌体。将上清液在4℃、20000g下离心60分钟，并除去线粒体和过氧物酶体成分。回收残留的上清液，在4℃、100000g下离心分离90分钟，回收沉淀并添加200μL的1/15M磷酸缓冲液(pH7.4)悬浊。将该悬浊液作为微粒体膜蛋白质成分用于以下的醇氧化酶活性的测定中。 [0161] [醇氧化酶活性的测定] [0162] 将100μL的0.1M的磷酸缓冲液(pH7.4)、50μL的2.8g/L的2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)溶液、30μL的辣根过氧化物酶47units/mL溶液、以及10μL的微粒体膜蛋白质成分，在30℃下培养5分钟。之后，添加10μL的5mM的1-十二烷醇DMSO溶液，并测定了0分钟、以及5分钟之后的405nm下的吸光度。醇氧化酶氧化1μmol的醇并产生2μmol的自由基离子。1mM的自由基离子型ABTS在405nm下显示18.4的吸光度，这与0.5mM的氧化后的基质为相同含义。在此，将1分钟内0.0368的吸光度变化定义为醇氧化酶活性的1U。 [0163] 将每1g微粒体膜蛋白质的醇氧化酶活性示于图3中。 [0164] 从图3可知，缺失了900c 0002基因的KSMΔAOX株与KSMΔura-ura株相比，醇氧化酶活性大幅度降低。由该结果可知，上述1.中分离的900c 0002基因是作用于长链醇的新型醇氧化酶基因。 [0165] 5.由900c 0002基因的异源表达进行的酶活性的确认 [0166] 将从假丝酵母菌(Candida bombicola)KSM36株中提取的基因组DNA作为模板，使用引物AOX F(5’-gaaggagatatacatatgactgacgcagttatcctc-3’)(序列号14)、以及AOX R(5’-agtgcggccgcaagctagcttagtttgaagcttag-3’)(序列号15)，用PCR法扩增900c 0002基因的DNA片段。另外，将质粒pET21a(Novagen公司制造)作为模板，并使用引物pET21F(5’-gcttgcggccgcactcgag-3’)(序列号16)、以及pET21R(5’-atgtatatctccttcttaaag-3’)(序列号17)，用PCR法扩增了DNA片段。将得到的两个DNA片段使用In-Fusion HD Cloning Kit(TAKARA BIO INC.制造)进行融合，得到质粒pET-AOX。 [0167] 将质粒pET-AOX导入到大肠杆菌BL21(DE3)(Funakoshi Corp oration制造)，得到BL21(DE3)-pET-AOX株。另外，作为对照菌株，制作了将质粒pET21a导入到大肠杆菌BL21(DE3)而得到的BL21(DE3)-pET株。 [0168] 将这些重组菌株在含有100ppm的氨苄青霉素钠盐的LB培养基(和光纯药工业公司制造)中37℃、250rpm下培养12小时之后，接种1％至含有100ppm的氨苄青霉素钠盐的LB培养基中，在37℃、250rpm下培养2.5小时。接下来，添加1M IPTG溶液至最终浓度为0.1mM，并在25℃、250rpm下培养16小时。将5mL培养后的菌体在15000rpm、4℃下离心2min收集菌体之后，用1mL的生理盐水清洗2次菌体。向菌体中加入500μL的1/15M磷酸缓冲液(pH7.4)悬浊，并用多珠振荡器(安井器械公司制造)以及0.1mm玻璃珠进行破碎。将破碎液在4℃、15000rpm下离心5分钟，除去了未破碎的菌体。回收残留的上清液，进行蛋白质浓度分析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)和醇氧化酶活性的测定。 [0169] 蛋白质浓度分析使用Bio-Rad蛋白定量试剂盒(Bio-Rad Protein Assay Kit)(Bio-Rad公司制造)，且作为标准物质使用牛血清白蛋白(Bio-Rad公司制造)，SDS-PAGE使用Mini-PROTEAN TGX GEL Anyk D(Bio-Rad公司制造)在Mini-PROTEAN 3Ready Gel Cell(Bio-Rad公司制造)中进行。样品使用Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad公司制造)稀释成3倍，在100℃下保持5分钟时间使之热改性之后，提供给凝胶。将预混缓冲液(10×Tris-甘氨酸-SDS(Bio-Rad公司制造))用脱离子水稀释至10倍并做成电泳液，并且对每片凝胶以200V的恒电压进行约30分钟电泳。将电泳之后的凝胶用Bio-Safe CBB G-250着色剂(Bio-Rad公司制造)进行了染色。 [0170] 电泳的结果示于图4。在图4中，分别是第1泳道(lane 1)显示作为对照菌株的BL21(DE3)-pET株，第2泳道(lane 2)显示导入了900c 0002基因的BL21(DE3)-pET-AOX株。 [0171] 醇氧化酶活性的测定和上述4.同样来进行。另外，作为活性测定的基质是用了1-十二烷醇。结果示于图5中。 [0172] 从图4可知，在导入了900c 0002基因的BL21(DE3)-pET-AOX株中，在75kDa的位置检测出条带(band)，确认了900c 0002基因的表达。另一方面，在未导入900c 0002基因的BL21(DE3)-pET株中，在该位置没有确认到条带。 [0173] 另外，从图5可知，在导入并表达了900c 0002基因的BL21(DE3)-pET-AOX株中，确认到醇氧化酶活性。但在BL21(DE3)-pET株中，没有确认到醇氧化酶活性。 [0174] 从这些结果可知，在上述1.中分离的900c 0002基因为作用于长链醇的新型醇氧化酶基因。 [0175] 6.KSMΔAOX株的糖脂质生产率 [0176] 用YPD培养基，在30℃、250rpm下预培养KSMΔura-ura株和KSMΔAOX株5分钟。将预培养液接种2％至加入了30mLAG生产培养基的500mL坂口烧瓶(Sakaguchi flask)，并在30℃、120rpm下培养48小时之后，作为基质添加1-十四烷醇至10g/L。 [0177] 将从添加基质开始培养72小时之后的培养液提供给下述的LC-MS分析和GC分析。 [0178] [LC-MS分析] [0179] 装置使用UFLC 20A-LCMS 2020(岛津制作所公司制造)，作为柱使用L-column ODS 4.6×150mm，5μm(化学物质评价研究机构)。在洗脱液A中使用0.01M醋酸铵水溶液、在洗脱液B中使用0.01M醋酸铵甲醇溶液，以流量1mL/分、柱温箱温度40℃，进行时间程序50％(5分钟)→20％/min→90％→95％(5分钟)→100％(30分钟)。检测在负离子模式下进行。 [0180] LC-MS分析的结果，在KSMΔura-ura株中没有确认到与十二烷基麦芽糖苷相近迁移率(mobility)的峰(10.06分)。另一方面，在KSMΔAOX株中在与十二烷基麦芽糖苷相近的迁移率处确认有峰(10.06分)，在负模式下10.068分的峰的分子量为579.5[M-H]，11.275分的峰的分子量为621.5[M-H]。 [0181] 这些峰认为是，乙酰基十四烷基麦芽糖苷的分子量为580.3、2-乙酰基十四烷基麦芽糖苷的分子量为622.5，以及由S.Fleurackers等Eur.J.Lipid Sci.Technol.(2010)，112，p.655-662判断10.068分的峰为下述结构式所表示的乙酰基十四烷基槐糖苷(1-O-十四烷基-(2’-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷)6’醋酸酯)、11.275分的峰为下述结构式所表示的乙酰基十四烷基槐糖苷(1-O-十四烷基-(2’-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷)6’,6”二醋酸酯)。 [0182] [0183] [GC分析] [0184] 从5mL培养液中用添加有0.05％1-十八烷醇作为内部标准的1-丁醇2.5mL进行了2次提取。然后用离心蒸发器干燥固化，添加1M的NaOH水溶液，在100℃下进行4小时处理。接下来，用2.5mL1-丁醇进行了2次提取之后，用离心蒸发器干燥固化，使用三甲基硅烷基(TMS)化试剂进行了衍生物化。将TMS化的样品用以下的GC-FID法进行分析，并得到了糖脂质生产量、以及残留基质量。 [0185] GC在作为装置使用7890A(Agilent Technologies,Inc.制造)，作为柱使用DB-1ms 25m×0.20mm×330μm(J&W scientific公司制造)，流动相使用高纯度氦，流量为1mL/min，升温程序为100℃(1分钟)→10℃/分→300℃(10分钟)的条件下进行。作为标准物质使用正十二烷基麦芽糖苷(CALBIOCHEM公司制造)，累计计算从18分钟到19.5分钟检测出的来自烷基葡萄糖苷的峰，并作为烷基葡萄糖苷量来计算。 [0186] GC分析的结果示于图6中。另外，在图6中，1-C14ol表示1-十四烷醇的峰；IS表示作为内部标准使用的1-十八烷醇的峰；AG表示烷基葡萄糖苷的峰。 [0187] GC分析的结果为，在KSMΔura-ura株中没有发现与十二烷基麦芽糖苷相近迁移率的峰(18.509分)。另一方面，在KSMΔAOX株中在19.063分处有新的峰出现。本峰用十二烷基麦芽糖苷换算为3.7g/L的生产率。 [0188] 从该结果可知，在KSMΔura-ura株中，即便加入醇和糖作为基质也基本不产生烷基葡萄糖苷，而KSMΔAOX株从醇和糖产生烷基葡萄糖苷。 [0189] 由以上结果可知，KSMΔAOX株以葡萄糖和1-十四烷醇作为基质，可以以高收率生产烷基葡萄糖苷和十四烷基槐糖苷。 [0191] 本申请基于2012年10月18日在日本申请专利的特愿2012-230994主张优先权，在此参照该申请并将其内容作为本说明书记载的一部分引入。 |
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