包含蛋白质和可生物降解聚酯酰胺的药物递送组合物

申请号 CN201380051351.9 申请日 2013-10-02 公开(公告)号 CN104717962B 公开(公告)日 2017-07-21
申请人 帝斯曼知识产权资产管理有限公司; 发明人 延斯·克里斯托·蒂斯; 乔治·米霍夫; 盖伊·德拉亚斯玛;
摘要 本 发明 涉及包含 蛋白质 和可 生物 降解 聚合物 的药物递送组合物。本发明还涉及用于向生物环境中可控和长期释放蛋白质的药物递送系统。所述药物递送组合物至少包含蛋白质和 可生物降解 聚合物,其中所述聚合物至少具有两个不同的悬挂在聚合物主链上的官能团,其中所述官能团选自羧基‑、酯基‑、胺基‑、酰胺基‑、硫醇基‑、硫酯基‑或羟基基团,其中当所述聚合物被暴露于生理条件下至少20天时,其吸收5‑10%w/w的 水 。本发明还涉及包含所述组合物的用于可控的蛋白质释放的药物递送系统。所述药物递送系统可选自微粒、膜、包衣、 纤维 、小球、圆柱状物、圆盘、 植入物 、微胶囊、微球、纳米球、晶片、微团、脂质体或者织物或非织物。
权利要求

1.药物递送组合物,基于所述组合物的总重量其包含0.1wt%到99.9wt%的蛋白质
99.9wt%到0.1wt%的可生物降解聚合物,其中所述聚合物至少包含两个不同的悬挂在聚合物骨架上的官能团,其中所述至少两个不同官能团是不受保护的亲性官能团和受保护的疏水性官能团,所述至少两个不同官能团为羧基、胺基、羟基、酯基、酰胺基、硫醇基或硫酯基基团,其中所述不受保护的亲水性官能团相对于所述受保护的疏水性官能团的比率从
0.17到3不等,并且其中当所述聚合物被暴露于生理条件下至少20天时,其吸收2-20%w/w的水,并且其中所述可生物降解聚合物是聚酯酰胺无规共聚物。
2.根据权利要求1的药物递送组合物,其中所述两个不同官能团至少包含选自羧基、胺基、硫醇基或羟基基团的不受保护的亲水性官能团和选自酯基、酰胺基或硫酯基基团的受保护的疏水性官能团。
3.根据权利要求2的药物递送组合物,其中所述可生物降解聚合物具有悬挂的羧基和酯基官能团。
4.根据权利要求2的药物递送组合物,其中所述不受保护的亲水性基团和所述受保护的疏水性官能团以所述不受保护的亲水性官能团相对于所述受保护的疏水性官能团的比率为0.3到1而存在。
5.根据权利要求1的药物递送组合物,其中所述聚酯酰胺无规共聚物是根据结构式(I)的聚酯酰胺无规共聚物,
其中m+p从0.9到0.1不等且q从0.1到0.9不等;m+p+q=1,其中m或p可以为0;n从5到300不等,并且其中a为至少0.1,b为至少0.15且a+b=1
且其中:
-R1独立地选自由(C2-C20)亚烷基组成的组;
-分别在单个骨架单元m或p中的R3和R4独立地选自由氢、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C6-C10)芳基、-(CH2)SH、-(CH2)2S(CH3)、-(CH2)4-NH2及其混合物组成的组;
-R5独立地选自由(C2-C20)亚烷基组成的组;
-R6选自结构式(II)的1,4:3,6-双脱水己糖醇的二环片段

-R7独立地选自由(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基或保护基团组成的组;
-R8是–(CH2)4-;
其中m和/或p单元、以及a和b单元在共聚物中无规分布。
6.根据权利要求5的药物递送组合物,其中b为至少0.25。
7.根据权利要求5的药物递送组合物,其中b为至少0.5。
8.根据权利要求5的药物递送组合物,其中p=0且m+q=1,m=0.75,b为0.5且a+b=1,其中R1是(CH2)8,R3是(CH3)2-CH-CH2-,R5是亚己基,R7是苄基,R8是–(CH2)4-。
9.根据权利要求5的药物递送组合物,其中m+p+q=1,q=0.25,p=0.45且m=0.3,b为
0.25且a+b=1,其中R1是-(CH2)8;R3和R4分别是(CH3)2-CH-CH2-,R5选自由(C2-C20)亚烷基组成的组,R7是苄基,R8是–(CH2)4-,R6选自结构式(II)的1,4:3,6-双脱水己糖醇的二环片段。
10.根据权利要求5的药物递送组合物,其中m+p+q=1,q=0.25,p=0.45且m=0.3,b为
0.5且a+b=1,其中R1是-(CH2)8;R4是(CH3)2-CH-CH2-,R7是苄基,R8是–(CH2)4-;R6选自结构式(II)的1,4:3,6-双脱水己糖醇的二环片段。
11.根据权利要求5的药物递送组合物,其中m+p+q=1,q=0.1,p=0.30且m=0.6,b为
0.5且a+b=1,其中R1是-(CH2)4;R3和R4分别是(CH3)2-CH-CH2-;R7是苄基,R8是–(CH2)4-;R5选自由(C2-C20)亚烷基组成的组,R6选自结构式(II)的1,4:3,6-双脱水己糖醇的二环片段。
12.根据权利要求5的药物递送组合物,其中分别在单个骨架单元m或p中的R3和R4独立地选自由(CH3)2-CH-CH2-、-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3、-CH2-C6H5及其混合物组成的组。
13.根据权利要求1-12中任一项的药物递送组合物,其中所述蛋白质选自肽、激素疫苗、酶、抗生素、抗体、神经活性剂、生长因子、细胞因子、抗原或糖蛋白的组。
14.根据权利要求1-12中任一项的药物递送组合物,其中所述组合物包含0.1wt%到
20wt%的所述蛋白质和60wt%和99.9wt%的所述可生物降解聚合物。
15.用于可控的蛋白质释放的药物递送系统,其包含根据权利要求14所述的组合物。
16.根据权利要求15的药物递送系统,其包含微粒、膜、包衣、纤维、小球、圆柱状物、圆盘、植入物、纳米球、晶片、脂质体、织物或非织物。
17.根据权利要求15的药物递送系统,其包含微胶囊、微球或微团。

说明书全文

包含蛋白质和可生物降解聚酯酰胺的药物递送组合物

[0001] 本发明涉及包含蛋白质和可生物降解聚酯酰胺的药物递送组合物。本发明还涉及用于向生物环境中可控和长期释放蛋白质的药物递送系统。
[0002] 因为蛋白质的口服生物利用率欠佳且在体内的半衰期短,所以现有技术中通常通过重复注射或通过输液来施用,从而对病人造成重大的身体负担并造成相关的管理成本。正因为如此,存在对开发和评估控释制剂的巨大兴趣。例如,在Zhao和Topp,Recent Patents on Drug delivery&formulation,2008,vol.2,(3)中给出了关于蛋白质制剂控释发展的概述。控释制剂提供保护免受体内降解和消除、提供降低的毒性,改善病人的依从性以及将蛋白质定位或靶向至特定位点的能,且更有效地利用蛋白质从而导致较低的剂量。尽管存在广泛研究,但许多技术挑战阻碍了蛋白质控释的进展,例如配制过程期间蛋白质变性、延长的体内释放过程中活性损失、突释、不完全释放、蛋白质聚集和相关的免疫原性、低包封率和制剂复杂性。当递送系统在给定时间释放比所需更多的蛋白质时,发生突释。当聚合物基质中最初包含的蛋白质大部分未释放,但从递送系统的蛋白质洗脱已经终止时,发生不完全释放。
[0003] 用于蛋白质释放的聚合物的用途已被广泛检验,大部分基于聚合物的蛋白质释放固体形式确实限制了最初的突释和不必要的将病人暴露于高蛋白质浓度,但由于蛋白质扩散出聚合物基质欠佳,所以遭受不完全释放。蛋白质不完全释放的问题已通过使用基于凝胶的药物递送系统(例如WO0000222中所公开)而被解决。然而,水凝胶不能提供可控的蛋白质释放持续长于几周的时间。
[0004] 可生物降解聚合物(例如基于α-羟基酸的聚酯,如聚乳酸(PLLA)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA))被广泛探索作为蛋白质持续释放用的聚合物基质。然而,由于聚合物降解期间释放酸性副产物,所以PLLA或PLGA面临蛋白质稳定性的问题。这在图4中已被证实。
[0005] 此外,蛋白质的稳定性还受制备蛋白质递送制剂时严苛的制造条件的影响,例如暴露于有机溶剂、气-液界面、剧烈搅动、声波处理等。
[0006] 因此,本发明的目标是提供药物递送组合物和由其制成的药物递送系统,它们二者均安全并以更可控的方式递送蛋白质。此外,本发明的目标是在几个月内延长来自药物递送系统的蛋白质递送。
[0007] 本发明的目标通过提供至少包含蛋白质和可生物降解聚合物的药物递送组合物而实现,其中所述可生物降解聚合物具有至少两个不同的悬挂(pendant)在聚合物骨架上的官能团,其中所述官能团选自羧基-、酯基-、胺基-、酰胺基-、硫醇基-、硫酯基-或羟基基团的组,其中当所述聚合物被暴露于生理条件下20天时,其吸收2-20%w/w的水。
[0008] 出乎意料地,已发现:聚合物骨架中不同的官能团及其相对比率保持聚合物基质与水分子的相互作用并控制蛋白质的持续释放。在本发明中,吸收水分子进入聚合物基质缓慢发生很重要,因为这将导致缓慢打开聚合物基质并在生理条件下在数月至数年的时间内提供蛋白质的持续释放。
[0009] 优选地,当被暴露于生理条件下20天时,聚合物吸收4-15%w/w的水。更优选地,当被暴露于生理条件下20天时,聚合物吸收4-10%w/w的水。
[0010] 水的吸收对于蛋白质分子从聚合物基质的完全解放来说很重要。例如在溶胀的水凝胶中,水的质量分数比聚合物的质量分数高得多。这表示:水吸收显著超过100%(w/w),通常在1000-10000%(w/w)范围内。此外,将聚合物暴露于水性环境之后,水分吸收和水凝胶溶胀分别持续几小时至一周的时间。当被暴露于生理条件下20天时,不像典型的水凝胶,通常吸收多于100%(w/w)的水,根据本发明的组合物仅吸收4-10%w/w的水。生理条件表示:在37℃的水性介质中,pH为7.2-7.4且离子强度等于在水中的0.9%NaCl溶液。
[0011] 优选地,两个不同的官能团至少包含选自羧基-、胺基或羟基基团的不受保护的亲水性官能团和选自酯基、酰胺基-、硫醇基-或硫酯基的受保护的疏水性官能团。“不受保护的”表示游离的羧基或-COOH基团、-NH2基团或-OH基团。“受保护的疏水性官能团”表示–COOR基团、-COSR、-CONHR、–COC(O)R、–CSC(O)R,、NHC(O)R或–SR基团,其中R可以是(C1-C20)烷基基团或(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基基团。
[0012] 不受保护的亲水性官能团相对于受保护的疏水性官能团的比率优选地从0.17到3不等,更优选地从0.3到1不等。
[0013] 更优选地,根据本发明的组合物包含可生物降解聚合物,其中所述聚合物具有悬挂的(pendant)不受保护的羧基-和受保护的酯基官能团。
[0014] 在优选的实施方式中,可生物降解聚合物是根据结构式(I)的可生物降解聚酯酰胺共聚物(PEA),
[0015]
[0016] 其中m+p从0.9到0.1不等且q从0.1到0.9不等;m+p+q=1,其中m或p可以为0;n从5到300不等以及其中a为至少0.1,b为至少0.15且a+b=1
[0017] 以及其中:
[0018] -R1独立地选自由(C2-C20)烷基或(C2-C20)亚烷基组成的组;
[0019] -分别在单个骨架单元m或p中的R3和R4独立地选自由氢、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、(C6-C10)芳基、-(CH2)SH、-(CH2)2S(CH3)、-(CH3)2-CH-CH2-、-CH(CH3)2、-CH(CH3)-CH2-CH3)、-CH2-C6H5、-(CH2)4-NH2及其混合物组成的组;
[0020] -R5独立地选自由(C2-C20)烷基、(C2-C20)亚烷基组成的组;
[0021] -R6选自结构式(II)的1,4:3,6-双脱水己糖醇的二环片段
[0022]
[0023] -R7独立地选自由(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基或保护基团组成的组;
[0024] -R8是–(CH2)4-。
[0025] 已发现:包含根据式(I)的聚酯酰胺的组合物在至少6周内提供蛋白质的均一和持续释放,其中在所述聚酯酰胺中受保护的官能团存在于骨架单元(a)且不受保护的官能团存在于骨架单元(b),其中骨架单元(b)中不受保护的官能团的百分比为至少15%且不受保护和受保护的官能团的总和为100%。此外还观察到:所述组合物降低了每周蛋白质释放的波动。包含至少15%L-赖酸-COOH并且由此包含85%L-赖氨酸-COO-苄基(Bz)的PEA被进一步称为PEA-H/Bz 15%H。
[0026] 因此,本发明涉及包含蛋白质和式(I)的可生物降解聚酯酰胺的药物递送组合物,当被暴露于生理条件下20天时,与经典的水凝胶不同,所述聚酯酰胺不大量吸水,这防止了蛋白质负载的快速释放。出乎意料地,已发现:聚酯酰胺基质通过水分扩散和水解驱动的生物降解过程来缓慢、连续地吸收水分子。这导致聚合物基质的缓慢打开并允许蛋白质缓慢扩散到聚合物的外部,从而在长时间内提供蛋白质的控释。此外,意想不到的是:聚酯酰胺基质及由降解产生的其副产物与蛋白质物种高度兼容且不影响它们的生物活性或稳定性。
[0027] 下列插图中从左至右显示了含有蛋白质的干聚合物基质的释放。最初的水分吸收导致基质的边缘溶胀,从而导致蛋白质的最初释放。经过一段时间,聚合物水解导致不太致密的网络,其逐渐吸收更多的水分。当基质中残留少量蛋白质直至聚合物被完全降解时,最终实现蛋白质的持续释放。
[0028]
[0029] 可生物降解聚酯酰胺在本领域已知,例如WO2008/0299174中所公开。如下列式III中所示,这些PEA至少包含两个连接到两个双(氨基酸)基-二醇-二酯中的线性饱和或不饱和脂肪族二醇残基。存在于骨架单元q中的赖氨酸单元是受保护的(如果R7是苄基)或不受保护的(如果R7是H)。包含不受保护赖氨酸的PEA被进一步表示为PEA-III-H,包含受保护赖氨酸的PEA被进一步表示为PEA-III-Bz。
[0030]
[0031] 在式III中,m从0.01到0.99不等;p从0.2到3不等且q从0.10到1.00不等,其中n为5到100;R1是–(CH2)8;骨架单元m和p中的R3和R4是亮氨酸;-R5是己烷,R6是结构式(II)的1,4:3,6-双脱水己糖醇的二环片段;R7可选自H或苄基基团,R8是–(CH2)4-。
[0032] 已意识到:PEA-III-H显示出高溶胀曲线,这导致任何被装载或被包封的生物活性剂在约24-48小时内快速突释。PEA-III-H的确在第一周内释放全部蛋白质负载。事实上,PEA-III-Bz确实在前几天期间仅释放少部分被装载的蛋白质,然后释放终止。这些性质与溶胀数据相关地很好。然而带有两个不同的悬挂官能团的聚酯酰胺前几周内几乎不溶胀且在20周内不断地释放蛋白质。
[0033] 在下述本发明的实施方式中,式(I)中的n优选地从50到200不等,m、p和q单元在式(I)的聚酯酰胺的骨架中无规分布。
[0034] 在一个优选的实施方式中,根据式(I)的可生物降解聚酯酰胺共聚物包括:p=0且m+q=1,m=0.75,b为0.5且a+b=1,其中R1是(CH2)8,R3是(CH3)2-CH-CH2-,R5是己基,R7是苄基,R8是–(CH2)4-,这种聚酯酰胺被进一步称为PEA-I-H/Bz 50%H。
[0035] 在另一个优选的实施方式中,根据式(I)的可生物降解聚酯酰胺共聚物包括:m+p+q=1,q=0.25,p=0.45且m=0.3,b为0.25且a+b=1,其中R1是-(CH2)8;R3和R4分别是(CH3)2-CH-CH2-,R5选自由(C2-C20)亚烷基组成的组,R7是苄基,R8是–(CH2)4-,R6选自结构式(II)的1,4:3,6-双脱水己糖醇的二环片段,这种聚酯酰胺被称为PEA-III-H/Bz 25%H。
[0036] 在另一个本发明的优选实施方式中,根据式(I)的可生物降解聚酯酰胺共聚物包括:m+p+q=1,q=0.25,p=0.45且m=0.3,b为0.5且a+b=1,其中R1是-(CH2)8;R4是(CH3)2-CH-CH2-,R7是苄基,R8是–(CH2)4-;R6选自结构式(II)的1,4:3,6-双脱水己糖醇的二环片段,这种聚酯酰胺被进一步称为PEA-III-H/Bz 50%H。
[0037] 在另一个实施方式中,根据式(I)的可生物降解聚酯酰胺共聚物包括:m+p+q=1,q=0.1,p=0.30且m=0.6,b为0.5且a+b=1,其中R1是-(CH2)4;R3和R4分别是(CH3)2-CH-CH2-;R7是苄基,R8是–(CH2)4-;R5选自由(C2-C20)亚烷基组成的组,R6选自结构式(II)的1,4:3,6-双脱水己糖醇的二环片段,这种聚酯酰胺被进一步称为PEA-II-H/Bz 50%H。
[0038] 聚酯酰胺共聚物中所使用的α-氨基酸中的至少一种是天然的α-氨基酸。例如,当R3或R4是CH2Ph时,合成中所使用的天然α-氨基酸是L-苯丙氨酸。或者,其中R3或R4是-CH2-CH(CH3)2时,共聚物含有天然氨基酸亮氨酸。通过在如本文所述的两种共单体的变体内独立地改变R3和R4,还可以使用其它天然的α-氨基酸,例如甘氨酸(当R3或R4是H时)、丙氨酸(当R3或R4是CH3时)、缬氨酸(当R3或R4是CH(CH3)2时)、异亮氨酸(当R3或R4是CH(CH3)--CH2--CH3时)、苯丙氨酸(当R3或R4是CH2--C6H5时)、赖氨酸(当R3或R4是(CH2)4--NH2时)或甲硫氨酸(当R3或R4是--(CH2)2S(CH3)时)和它们的混合物。
[0039] 蛋白质的实例是细胞因子&拮抗剂、肽、激素抗体、酶、融合蛋白或凝血因子&抑制剂。细胞因子&拮抗剂的具体实例是复合干扰素α-1(Interferon alfacon-1)、复合干扰素α-2a(Interferon alfacon-2a)、复合干扰素α-2b(Interferon alfacon-2b)、干扰素β-1a(Interferon beta-1a)、干扰素β-1b(Interferon beta-1b)、阿地白介素(Aldesleukin,IL-2)、非格司亭(Filgastim,G-CSF)、来格司亭(Filgastim,G-CSF)、莫拉司亭(Molgramostim,G-CSF)、沙格司亭(Sargramostim,G-CSF)、他索纳明(Tasonermin,TNF-a)、贝卡普明(Becaplermin,PDGF-BB)、Oprevelkin(IL-11)或阿那白滞素(Anakinra,IL-1-RA)。肽和激素的具体实例是胰岛素、依泊汀α、依泊汀β、重组促卵泡素α(Folitropin alfa)、重组促卵泡素β(Folitropin beta)、生长激素、胰高血糖素、特立帕肽(PTH 1-34)、鲑降素、促甲状腺素-α、重组绒促性素A2(Chorigondotropin A2)、成骨蛋白-1、阿法地博特明(Dibotermin alfa)、培维索孟(Pegvisomant,hGH拮抗剂)、奈西立肽(钠尿肽)或促黄体素α。抗体的具体实例是阿昔单抗(Abciximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿伦单抗(Alemtuzumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、吉妥珠单抗(Gemtuzumab)、替伊莫单抗(Ibritumomab)、英利昔单抗(Infliximab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥单抗(Trastuzumab)、奥玛珠单抗(Omalizumab)、依法利珠单抗(Efalizumab)、西妥昔单抗(Catuximab)、达利珠单抗(Daclizumab)、Pantimumab或兰尼单抗(Ranibizumab)。酶的具体实例是阿替普酶(Alteplase,t-PA)、瑞替普酶(Reteplase)、替奈普酶(Tenecteplase,TNK-t-P)、孟替普酶(Monteplase)、链道酶α(Dornase-alfa,RNase)、伊米苷酶(Imiglucerase)、半乳糖苷酶α&β(Agalsidase  alfa&beta)、拉罗尼酶(Laronidase)或拉布立酶(Rasburicase)。凝血因子&抑制剂的具体实例是依他凝血素α(Eptacog alfa)、抗血友病因子(3)、莫罗凝血素α(Moroctocog alfa)、(FVIII突变蛋白质)、地西卢定(Desirudin)、来匹卢定(Lepirudin)、替加色罗-α(Drotrecogin-alfa,活化蛋白质C)或α1蛋白酶抑制剂。融合蛋白的具体实例是地尼白介素(Denileukin diftitox)、依那西普(Etanercept)或阿法赛特(Alefacept)。
[0040] 蛋白质的其它实例是催产素、加压素、促肾上腺皮质激素、表皮生长因子、血小板源生长因子(PDGF)、催乳素、促黄体激素释放激素(LHRH)、LHRH激动剂、LHRH激动剂、生长激素(包括人类、猪和)、生长激素释放因子、胰岛素、红细胞生成素(包括具有红细胞生成活性的所有蛋白质)、生长激素抑制素、胰高血糖素、白介素(其包括IL-2,IL-11,IL-12等)、胃泌素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素、分泌素、降钙素、脑啡肽、内啡肽、血管紧缩素、促甲状腺激素释放激素(TRH)、肿瘤坏死因子(TNF)、甲状旁腺激素(PTH)、神经生长因子(NGF)、粒细胞-集落刺激生长因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激生长因子(GM-CSF)、巨噬细胞-集落刺激生长因子(M-CSF)、肝素酶、血管内皮生长因子(VEG-F)、成骨蛋白(BMP)、hank、胰高血糖素样肽(GLP-1)、肾素、缓激肽、杆菌肽、多粘菌素、黏菌素、短杆菌酪肽、短杆菌肽或环孢菌素。
[0041] 根据本发明的药物递送组合物可例如包含基于组合物的总重量0.1wt%-99.9wt%的蛋白质和99.9wt%-0.1wt%的可生物降解聚合物。优选地,所述组合物包含基于组合物的总重量0.1wt%-20wt%的蛋白质和60wt%-99.9wt%的可生物降解聚合物。
[0042] 当在本文中使用时,术语“烷基”指的是直链的或支化的链基,包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基等。
[0043] 当在本文中使用时,术语“亚烷基”指的是二价支化的或非支化的烃链,包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基等。
[0044] 当在本文中使用时,术语“炔基”指的是具有至少一个-碳三键的直链的或支化的链烃基。
[0045] 当在本文中使用时,术语“可生物降解”指的是当被暴露于体内或体外环境时,能够被完全或实质上降解或腐蚀的材料。当聚合物可通过例如受试者体内的水解、酶解、化、代谢过程、本体(bulk)或表面侵蚀被逐渐分解、再吸收(resorb)、吸收和/或消除时,聚合物便是能够被降解或腐蚀的。术语“可生物吸收”和“可生物降解”在本申请中可交换使用。
[0046] 当在本文中使用时,本文中所使用的术语“无规”指的是式(I)的聚酯酰胺的m、p和q单元的分布为无规分布。
[0047] 当在本文中使用时,术语“蛋白质”旨在包括含有碳、氢、氧、氮和(有时)硫的复杂有机化合物组中的一个。
[0048] 当在本文中使用时,术语“生物环境”将表示其中生物活性可被控制的无论体外或体内的任何环境。
[0049] 聚酯酰胺共聚物的数均分子量(Mn)优选地在15,000到200,000道尔顿的范围内。本文所述的聚酯酰胺共聚物可被制造成具有多种分子量和多种m、p和q单元在骨架中的相对比例。本领域技术人员易于确定用于特定用途的恰当分子量。合适的Mn为约15,000到约
100,000道尔顿,例如约30,000到约80,000道尔顿或约35,000到约75,000道尔顿。Mn经由GPC在THF中以聚苯乙烯作为标准品进行测量。
[0050] 聚 酯 酰 胺的 基 本 聚 合 方 法 基 于由 G .T s i t la n a d z e ,等 人J.Biomater.Sci.Polym.Edn.(2004)15:1-24所描述的方法,但使用不同的结构单元和活化基团。
[0051] 例如,如方案1中所示,通过对-甲苯磺酸酯二胺盐(X1,X2,X3,X4)与活化的二酸(Y1)的溶液缩聚,合成本发明的组合物中所使用的聚酯酰胺。二甲基亚砜或二甲基甲酰胺通常被用作溶剂。通常,加入相对于对-甲苯磺酸酯的量1.1当量的三乙基酰胺作为,反应在60℃的惰性气氛中在连续搅拌条件下进行24-72小时。然后,通过水沉淀以及随后的有机沉淀和过滤来纯化获得的反应混合物。减压干燥得到聚酯酰胺。
[0052]
[0053] 方案1:PEA聚合物过程的示意图,包括一些典型的单体。
[0054] 通常,本发明的药物递送组合物可包含不止一种蛋白质。或者,多种类型的蛋白质可作为单一制剂的一部分存在。例如,可存在第二种蛋白质。
[0055] 本发明的药物递送组合物还可包含不同于蛋白质的另一种生物活性剂。这种生物活性剂可包括小分子药物、糖类、脂质类或全细胞。生物活性剂可具有抗增殖性或抗炎性或者可具有其它性质,例如抗肿瘤性、抗有丝分裂性、抗菌性、抗过敏性或抗氧化性。抗增殖剂的实例包括雷帕霉素(rapamycin)及其功能或结构衍生物、40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素(依维莫司,everolimus)及其功能或结构衍生物、紫杉醇及其功能或结构衍生物。抗肿瘤剂和/或抗有丝分裂剂的实例包括氨甲喋呤、硫唑嘌呤、长春新碱、长春碱、氟尿嘧啶、盐酸阿霉素(例如来自Pharmacia AND Upjohn,Peapack NJ.的亚德里亚霉素(R))和丝裂霉素(例如来自Bristol-Myers Squibb Co.,Stamford,Conn.的突变霉素(R))。抗血小板剂的实例包括肝素钠、低分子量肝素、类肝素、水蛭素、阿加曲班(argatroban)、福斯科林(forskolin)、伐哌前列素(vapiprost)、右旋糖酐、D-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-氯甲盐酸盐(合成的抗凝血酶)、潘生丁(dipyridamole)、糖蛋白Hb/nia血小板膜受体拮抗剂抗体、重组水蛭素、凝血酶抑制剂(如Angiomax(Biogen,Inc.,Cambridge,Mass.))、钙通道阻滞剂(如硝苯地平)、秋水仙碱、纤维细胞生长因子(FGF)拮抗剂、鱼油(ω3-脂肪酸)、组胺拮抗剂、洛伐他汀(lovastatin,HMG-CoA还原酶的抑制剂,一种降低胆固醇的药物,来自Merck AND Co.,Inc.,Whitehouse Station,NJ的品牌Mevacor(R))、单克隆抗体(例如对血小板衍生的生长因子(PDGF)受体具有特异性的那些)、硝普盐(nitroprusside)、磷酸二酯酶抑制剂、前列腺素抑制剂、苏拉明(suramin)、5-羟色胺阻滞剂、类固醇、硫代蛋白酶抑制剂、三唑并嘧啶(PDGF拮抗剂)、超氧化物歧化酶、超氧化物歧化酶模拟物、4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-l-氧基(4-氨基-TEMPO)、雌二醇、抗癌剂、膳食补充剂(如各种维生素)、及其组合。包括类固醇的抗炎剂和非类固醇抗炎剂的例子包括:Biolimus、他克莫司(tacrolimus)、地塞米松(dexamethasone)、氯倍他索(clobetasol)、皮质类固醇或其组合。抑制细胞生长物质的实例包括血管抑肽,血管紧张素转换酶抑制剂,诸如卡托普利(captopril,例如Bristol-Myers Squibb Co.,Stamford,Conn.的Capoten(R)和Capozide(R))、西拉普利(cilazapril)或赖诺普利(lisinopril,例如Merck AND Co.,Inc.,Whitehouse Station,NJ的Prinivil(R)和Prinzide(R)。抗过敏剂的实例是吡嘧司特(permirolast potassium)。
[0056] 除了式I的可生物降解聚酯酰胺之外,药物递送组合物还可包括其它聚合物。它可例如与下述物质混合:聚(原酸酯)、聚(酸酐)、聚(D,L-乳酸)、聚(L-乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸)和乙醇酸的共聚物、聚(L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)、聚(磷酸酯)、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(氧杂-酯)、聚(氧杂-酰胺)、聚(碳酸乙烯酯)、聚(碳酸丙烯酯)、聚(磷酸酯)、聚(磷腈)、聚(酪氨酸衍生碳酸酯)、聚(酪氨酸衍生芳基化物)、聚(酪氨酸衍生亚氨基碳酸酯)、这些聚合物与聚(乙二醇)(PEG)的共聚物、或它们的组合。当然还可以将不止一种式(I)的聚酯酰胺混合在一起或者将式I的的聚酯酰胺与其它聚酯酰胺混合。
[0057] 药物递送组合物还可包含另外的赋形剂,例如填料、抗氧化剂、稳定剂、防结剂、乳化剂、发泡剂、螯合剂或染料。
[0058] 本发明的组合物可被施用至任何生物环境,无论体外或体内的,只要其中需要可控的蛋白质递送。例如,基于治疗各种医学病症的已知参数,可通过施用至黏膜(通过皮下、肌内、腹腔内、皮内、静脉内或动脉内注射和/或植入)或通过原位递送将所述组合物施用至人类或动物以提供期望的蛋白质剂量。
[0059] 本发明的药物递送组合物可被用于下述医疗领域:疼痛管理、肌肉骨骼应用领域(MSK)、眼科学、肿瘤学、皮肤病学、心血管领域、整形外科、脊椎、肠道、部、鼻腔或科领域。
[0060] 本发明还涉及包含本发明所述药物递送组合物的制品。另一方面,本发明提供包含本发明所述药物递送组合物的药物递送系统。在本发明的上下文中,药物递送系统包括但不限于微粒、纳米颗粒、棒(rod)、膜(film)、纤维、小球(pellet)、圆柱状物(cylinder)、圆盘(disc)、包衣、植入物(implant)、微胶囊(microcapsule)、晶片(wafer)、微团(micelle)、脂质体、织物和非织物。
[0061] 附图
[0062] 图1:PEA膜被浸入PBS缓冲液之后随时间的质量增加。
[0063] 图2:利用SDS-PAGE测定的HRP释放。M=蛋白质标记,HRP=辣根过氧化物酶标准品,2-12=2-12周之后取得的缓冲液的HRP释放。
[0064] 图3:一些PEA III释放介质的SEC色谱图叠加(×50)。10分钟时的峰起源于缓冲液,HRP在16分钟时洗脱,小分子在20-25分钟时洗脱。
[0065] 图4:22周内,HRP从聚合物基质的累积释放。
[0066] 图5:聚合物基质中的酶稳定性。
[0067] 图6:蛋白质从PEA基质的释放。图显示:仅具有游离羧基基团或仅具有苄基酯的类似单体组成的PEA聚合物不提供持续的蛋白质释放。相比之下,通过改变侧基在聚合物链中的相对比例,我们能够控制蛋白质物种的释放曲线。
[0068] PEA III 100%H(仅具有–COOH侧基的聚合物)–聚合物纤维在最初几小时内释放全部聚合物负载-典型的突释
[0069] PEA III Ac Bz(仅具有苄基酯侧基的聚合物)–聚合物未释放大量蛋白质且纤维的释放性能不随时间变化。
[0070] PEA III 75%H–聚合物纤维在3周内释放全部蛋白质负载且被释放的酶的活性不随释放变化。
[0071] PEA III 50%H–聚合物纤维在第3周和第11周之间释放蛋白质负载,其中大部分酶在第6周和第10周之间释放。被释放的酶的活性不随释放变化。
[0072] PEA III 25%H–聚合物纤维在第7周实质上开始释放。在实验的11周期间,释放未完成。
[0073] 现在将参考下述非限制性实施例仅以示例的方式详细描述本发明。实施例
[0074] 实施例1:PEA-III-H/Bz共聚物的溶胀性能
[0075] 基于通过溶剂浇铸制成的圆形聚合物膜,评估PEA-III-Ac Bz(沿着聚合物链具有悬挂的酯基)、PEA-III-H/Bz 25%H(既有悬挂的酯基又有悬挂的羟基)、PEA-III-H/Bz 50%H(既有悬挂的酯基又有悬挂的羟基)和PEA-III-H(具有悬挂的羧基)的溶胀性能。将膜浸入含有0.05%NaN3作为杀菌剂的PBS缓冲液中,放置在37℃下并温和搅动。基于聚合物膜的质量增加来评估溶胀性能。在每个时间点更新缓冲液。
[0076] 可根据下式计算质量增加;
[0077]
[0078] Mt=时间点的质量(t)
[0079] M0=初始质量
[0080] PEA-III-Ac Bz膜在试验期间显示出高达5%的边缘溶胀。相比之下,PEA-III-H膜在几天内增加相较于初始质量1000%的质量。出乎意料地,由PEA-III-H/Bz 25%H和PEA-III-H/Bz 50%H制成的膜显示出缓慢、持续的吸水曲线。这被显示于图1。
[0081] 实施例2:HRP的ABTS活性试验
[0082] ABTS(2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)通常被用作关于过氧化物酶活性(例如用于HRP=辣根过氧化物酶)的活性试验。该试验基于能够被光度测定量化的底物的高度着色氧化/自由基形式的形成。高度着色产物的形成是对被测量酶的活性的直接测量。流程图1中显示了ABTS的反应。
[0083]
[0084] 流程图1:ABTS与过氧化物酶(例如HRP)的反应流程。产物被高度着色,其在405nm处具有最大吸光度并能够被光度测定量化。
[0085] 试验方案改编自Pütter,J.和Becker,R.(1983)Methods of Enzymatic Analysis(Bergmeyer,H.U.,编)第三版,III卷,286-293页,Verlug Chemie,Deerfield Beach,FL。
[0086] 在PBS缓冲液中配制浓度为5mg/mL的ABTS储液。配制0.3重量%的在水中的H2O2储液。在参照比色皿中混合1mL ABTS储液和50μL H2O2储液。在样品比色皿中将1mL ABTS储液和50μL H2O2储液与50μL酶溶液混合。将比色皿直接放在分光光度计中,测量1分钟内(时间间隔为0.5秒)405nm处的吸光度增加。吸光度增加的陡度是酶活性的量度,基于分光光度计的数字数据使用Microsoft Excel对其进行测定。最后,基于新鲜配制的HRP溶液的活性,将酶的活性与浓度关联并将其量化。
[0087] 实施例3:SDS-PAGE
[0088] 所有的十二烷基磺酸钠(SDS)试剂和凝胶均获自Life Technologies(NuPAGE系统)。将释放样品与4×SDS上样缓冲液和10×还原剂混合。通过5分钟加热至70℃来使蛋白质变性。通常在凝胶上装载20μl样品。12%Bis-Tris或4-12%Bis-Tris凝胶分别与MOPS或MES缓冲液一起使用。应用考染色(SimplyBlue safestain)以检测HRP(>1ug)。使用SDS-PAGE分析PEA-III-50%H的释放介质。图中显示了一些HRP释放样品。可以观察到:被释放的酶出现在与HRP标准品相同的位点,从而证实了酶的释放。这被显示于图2。
[0089] 实施例4:水性SEC
[0090] 使用配备有TSKgel G2000SWXL 7.8*300mm(TOSOH Bioscience)柱的Agilent 1200LC系统并使用DAD检测分析HRP释放缓冲液。使用1.059mM KH2PO4、2.966mM Na2HPO4、
300mM NaCl、pH=7.4和10%EtOH作为流动相,在流速为0.5mL/min下操作系统。使用10μL的典型样品注射体积。
[0091] 获自PEA III 50%H的一些不同的释放缓冲液的DAD数据被举例说明并被用于酶的量化,作为ABTS活性试验的补充方法。这两种方法显示出良好的相关性(90-110%),这表明被释放的酶保留完全的活性。10分钟时的峰也出现于空白中,其与样品无关。
[0092] 图3说明:一些PEA III释放介质的SEC色谱图叠加(×50)。10分钟时的峰起源于缓冲液,HRP在16分钟时洗脱,小分子在20-25分钟时洗脱。
[0093] 实施例5:辣根过氧化物酶(HRP)从聚合物基质的释放
[0094] 处理和装载
[0095] 向2mg冻干的HRP中加入400μL在CHCl3中10重量%的PLGA 50:50、PEA-III-Ac Bz(沿着聚合物链具有悬挂的酯基)、PEA-III-H/Bz 50%H(既有悬挂的酯基又有悬挂的羧基)和PEA-III-100%H(具有悬挂的羧基)的聚合物溶液。将HRP机械分散在溶液中。在环境温度下,减压干燥所获得的聚合物与HRP的悬浮液。
[0096] HRP的释放
[0097] 将干燥的已装载HRP的膜浸入3mL PBS缓冲液中,放置在37℃下并温和搅动。利用水性SEC和光度测定活性试验(使用ABTS作为试剂)二者来量化随时间释放的HRP。一周后,利用上述两种方法在缓冲液中测定HRP的浓度。来自这两种方法的数据很好地关联,这表明被释放的HRP有活性。PEA-III-100%H在第一周内已释放存在于膜中的全部HRP的大部分,3周后膜完全是空的。事实上,除了在第一周的释放,在试验期间没有观察到来自PEA-III-Ac Bz的释放。PLGA 50:50在5周期间显示出HRP的释放,之后不再释放活性蛋白质。8周后,PLGA 50:50基质完全降解而无任何进一步的释放。出乎意料地,在22周的时间范围内,以相对恒定比率从PEA-III-H/Bz 50%H膜释放活性HRP。
[0098] 已观察到:HRP从PEA膜的释放与附随的聚合物的吸水性能一致。本实验显示了沿聚合物链悬挂的两种类型的官能团的作用。只有包含同时含有悬挂的酯基和羧基的聚酯酰胺(PEA-III-H/Bz 50%H)的组合物允许在长时期内完全和持续释放蛋白质。22周后,聚合物基质的分析显示不存在大量酶,从而证实了蛋白质被完全释放的假说。
[0099] PEA-III-100%H快速溶胀并极其快速地释放HRP,PEA-III-Ac-Bz显示出边缘溶胀且几乎不释放HRP,PEA-III-H/Bz 50%展示出逐渐溶胀同时持续释放HRP,其中超过17周后释放速率增加。这被显示于图4。
[0100] 实施例6:装载HRP的PEA聚合物纤维的制备
[0101] 将PEA-III-25%H聚合物溶解在乙醇、甲醇、氯仿或二氯甲烷中用于测试溶剂影响的实验。对于释放研究,将PEA-III-AcBz和PEA-H/Bz溶解在乙醇中。配制浓度为10%(重量/体积)的聚合物溶液。随后,在Teflon烧杯中,在剧烈搅拌的条件下加入HRP。获得均质溶液之后,允许蒸发溶剂。当聚合物变得足够坚固可以操作时,将它们转移到Teflon板上。然后,通过使聚合物在Teflon板(sheet)和块(block)之间滚动从而手动形成纤维。纤维的直径在0.8-1.2mm之间,长度为3cm。
[0102] 在使用纤维之前,允许其在环境条件下被干燥5天。然后切割用于HRP#P6782释放的纤维以在释放实验中一式三份使用。所使用的HRP是Sigma#P6782。
[0103] HRP的释放
[0104] 在37℃下,在以±100rpm的速率连续摇动的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行释放试验。在实验开始之前,称量装载有HRP的PEA-III-AcBz、PEA-III-25%H、PEA-III-50%H、PEA-III-75%H或PEA-III-100%H并在显微镜下进行分析。所有纤维的质量均为约
50mg(±5mg)。第一天,在2、5和24小时之后更换缓冲液;此后每周更换一次缓冲液。然后,分析旧缓冲液的蛋白质数量和HRP活性。
[0105] 图5显示:在实验的整个11周期间,从聚合物基质释放的酶的活性保持在相同水平。这暗示:聚合物基质和聚合物降解产物均对酶活性和酶稳定性无影响。
[0106] 图6显示:仅具有游离羧基基团或仅具有苄基酯的类似单体组成的PEA聚合物不提供持续的蛋白质释放。相比之下,通过改变侧基在聚合物中的相对比例,我们能够控制蛋白质物种的释放曲线。
[0107] PEA-III-100%H(仅具有–COOH侧基的聚合物)–聚合物纤维在最初几小时内释放全部聚合物负载-典型的突释
[0108] PEA-III-Ac Bz(仅具有苄基酯侧基的聚合物)–聚合物不释放大量蛋白质且纤维的释放性能不随时间变化。
[0109] PEA-III-75%H–聚合物纤维在3周内释放全部蛋白质负载且被释放的酶的活性不随释放变化。
[0110] PEA-III-50%H–聚合物纤维在第3周和第11周之间释放蛋白质负载,其中大部分酶在第6周和第10周之间被释放。被释放的酶的活性不随释放变化。
[0111] PEA-III-25%H–聚合物纤维在第7周实质上开始释放。在实验的11周期间,释放未完成。
[0112] 蛋白质分析
[0113] 量化
[0114] 使用BCA Quantipro试剂(Sigma Aldrich)并根据制造商的说明分析释放样品。作为对照,另外分析来自空纤维(不含HRP)的释放样品,因为PEA降解时能产生少量信号。必要时,从实际释放样品中减去这种信号。利用Multiscan GO酶标仪(Thermo Scientific)测量BCA试验。
[0115] 活性试验:
[0116] 在PBS缓冲液中配制浓度为5mg/mL的ABTS(2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(Sigma#A1888)储液。配制0.3重量%的在水中的H2O2储液。在参照比色皿中混合1mL ABTS储液和50μL H2O2储液。在样品比色皿中将1mL ABTS储液和50μL H2O2储液与50μL样品溶液混合。将比色皿直接放在分光光度计(Shimadzu UV-1800)中,测量1分钟内405nm处的吸光度增加。使用吸光度的斜率来测量酶活性。在室温下进行本试验。
[0117] 溶胀行为
[0118] 制备每种聚合物的膜(厚度为0.5mm)并在减压条件下干燥以将被检测材料的水含量降至低于0.3%(重量/重量)。从膜冲压出直径为4mm且厚度为0.5mm的圆盘(disc)。
[0119] 于PBS缓冲液(2mL)中孵育之前,在Sartorius微量天平上称量样品并记录厚度和直径。将样品浸入5mL pH为7.4的含0.05%(重量/重量)NaN3的PBS缓冲液中。在37℃下孵育所有聚合物样品,通过测量不同时间点的样品重量增加来评估水分吸收。如下所述测量重量增加:将样品从缓冲溶液中取出,然后在无尘吸收纸上干燥(不按压)以除去圆盘中的附着水。接下来,利用Sartorius微量天平分析样品并记录读数。三个一组分析每种聚合物样品。然后将重量与初始重量比较。初始重量被设为100%。在读数时间点,更新缓冲溶液。
[0120] 图显示:在实验的整个11周期间,从聚合物基质释放的酶的活性保持在相同水平。这暗示:聚合物基质和聚合物降解产物均对酶活性和酶稳定性没有影响。
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