[0001] 本发明涉及具有糖质氧化酶活性的蛋白质。更详言之，涉及作用于大范围的糖的具有糖质氧化酶活性的蛋白质、编码该蛋白质的基因、含有该基因的重组载体、转染体、以及上述蛋白质的制备方法及上述蛋白质的用途。

[0002] 作为对糖质进行氧化的酶的代表，有将葡萄糖氧化的葡萄糖氧化酶，这种葡萄糖氧化酶在各种领域被广泛使用。

[0003] 例如，在制备干燥蛋白的过程中，为了除去蛋白中的葡萄糖(脱糖)而使用葡萄糖氧化酶。干燥蛋白与生蛋白相比能够长期保存，输送成本低，保管空间小，从这些方面考虑，被用作各种食品的原料。该干燥蛋白中的葡萄糖在保存中与鸡蛋蛋白质中的氨基反应，发生美拉德反应，出现褐变，并产生不愉快的气味。为了防止这样的品质下降，采用以除去蛋白中的葡萄糖为目的而使用葡萄糖氧化酶、酵母等的发酵法。

[0004] 但是，因为葡萄糖氧化酶的温度稳定性比较优异，所以产品中有时残留葡萄糖氧化酶活性。例如，在干燥蛋白中残存葡萄糖氧化酶活性时，出现使用干燥蛋白制作点心时原料中的葡萄糖被氧化的问题。另一方面，存在如下问题：在葡萄糖氧化酶失活的条件下进行热处理时，蛋白凝固，导致作为干燥蛋白的商品价值下降。另外，通过酵母发酵而脱去葡萄糖的方法存在干燥蛋白产品中残留发酵味的问题。

[0005] 另外，在面包制作厂、面粉厂中，为了提高小麦粉的烧固性，改善伸缩性，制作具有所希望的强度以及稳定性的面团，使用葡萄糖氧化酶。作为这种效果的背景机制，可以说是将坯料中的葡萄糖氧化，生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢，生成的过氧化氢作为氧化剂起作用，有助于形成面筋S－S键。由此，蛋白质形成更稳定的形态，从而改善面团的品质、烧固产品的容量以及芯构造。

[0006] 具体而言，例如在专利文献1中公开了为了改善面团的流动学特征、焙烧后的面包的纹理以及外观而在谷粉中添加葡萄糖氧化酶的技术。另外，在专利文献2中公开了用于改善含有纤维素分解酶以及葡萄糖氧化酶的面包的性质的制剂。进而，专利文献3中，公开了含有葡萄糖氧化酶以及脂肪酶的面包制作改良剂以及使用其的面包制作方法。

[0007] 像这样地葡萄糖氧化酶被用于各种用途，因为是仅将葡萄糖氧化的酶，所以存在对于不含葡萄糖或者其含量低的物质无法发挥有效的效果的问题。另外，在含有乳糖等其他糖质的情况下，如果不并用例如乳糖酶等能够将其他糖质分解成葡萄糖的酶，就无法得到有效的效果。

[0008] 例如为了使用葡萄糖氧化酶作为对面团以及面包进行改良的添加剂，作为基质，必须存在葡萄糖，一般来说小麦粉中的葡萄糖为0～0.4重量％的低含量，所以限制了葡萄糖氧化酶的有用性。另一方面，已知谷物粉中麦芽糖含量比葡萄糖含量高。

[0009] 为了解决以上的课题，开始关注作用于葡萄糖之外的糖质的糖质氧化酶。例如，专利文献4中公开了涉及对D－葡萄糖、D－乳糖、D－纤维二糖、D－麦芽三糖、D－麦芽四糖、D－麦芽五糖、D－麦芽六糖、D－麦芽七糖各基质显示良好的反应活性的低聚糖氧化酶的技术。另外，在专利文献5中公开了通过使用相比葡萄糖将麦芽糊精或纤维糊精优先氧化的来自属于微结节菌属(Microdochium属)的微生物的糖质氧化酶，改善面坯或面包的特性的技术。

[0010] 现有技术文献

[0011] 专利文献

[0012] 专利文献1:美国专利公开第2783150号

[0013] 专利文献2:加拿大专利第2012723号

[0014] 专利文献3:日本特开平4－84848号公报

[0015] 专利文献4:日本特开平5－84074号公报

[0016] 专利文献5:日本特表2001－526058号公报

[0017] 只要是不仅将葡萄糖这样的单糖类氧化，也将二糖类以上的糖质氧化的酶，与葡萄糖氧化酶相比，就能够期待在更广泛领域中的用途。

[0018] 本发明中，以提供能够应对各种用途的具有糖质氧化酶活性的新型蛋白质作为主要目的。

[0019] 本申请人等对具有糖质氧化酶活性的蛋白质进行深入研究，结果成功地生产出作用于广泛的糖、并且、具有适度的温度稳定性的蛋白质，完成了本发明。

[0020] 即，本发明中提供以下的[1]～[32]。

[0021] [1]

[0022] 一种具有以下理化性质的蛋白质，即，

[0023] (1)作用：将糖氧化而形成糖酸；

[0024] (2)基质特异性：作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维二糖；以及

[0025] (3)[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0026] [2]

[0027] [1]中记载的蛋白质，其中，0.4≤[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0028] [3]

[0029] 一种具有以下理化性质的蛋白质，即，

[0030] (1)作用：将糖氧化而形成糖酸；

[0031] (2)基质特异性：作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维二糖；

[0032] (3)分子质量：约63kDa(通过SDS－PAGE法测定)。

[0033] [4]

[0034] [3]中记载的蛋白质，其中，[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0035] [5]

[0036] [4]中记载的蛋白质，其中，0.4≤[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0037] [6]

[0038] 一种具有以下理化性质的蛋白质，即，

[0039] (1)作用：将糖氧化而形成糖酸；

[0040] (2)基质特异性：作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维二糖；

[0041] (3)最佳pH：5.0～9.0；

[0042] (4)稳定pH范围：5.0～10.5；

[0043] (5)最佳温度：20℃～55℃；

[0044] (6)温度稳定性：在45℃以下稳定；以及

[0045] (7)分子质量：约63kDa(通过SDS－PAGE法测定)。

[0046] [7]

[0047] [6]中记载的蛋白质，其中，[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0048] [8]

[0049] [7]中记载的蛋白质，其中，0.4≤[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0050] [9]

[0051] 具有以下理化性质的来自枝顶孢属(Acremonium属)微生物的蛋白质，即，[0052] (1)作用：将糖氧化成糖酸；

[0053] (2)基质特异性：作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维二糖；以及

[0054] (3)[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0055] [10]

[0056] [9]中记载的蛋白质，其中，0.4≤[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0057] [11]

[0058] 具有以下理化性质的来自枝顶孢属(Acremonium属)微生物的蛋白质，即，[0059] (1)作用：将糖氧化成糖酸；

[0060] (2)基质特异性：作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维二糖；以及

[0061] (3)分子质量：约63kDa(通过SDS－PAGE法测定)。

[0062] [12]

[0063] [11]中记载的蛋白质，其中，[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0064] [13]

[0065] [12]中记载的蛋白质，其中，0.4≤[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0066] [14]

[0067] 具有以下理化性质的来自枝顶孢属(Acremonium属)微生物的蛋白质，即，[0068] (1)作用：将糖氧化成糖酸；

[0069] (2)基质特异性：作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维二糖；

[0070] (3)最佳pH：5.0～9.0；

[0071] (4)稳定pH范围：5.0～10.5；

[0072] (5)最佳温度：20℃～55℃；

[0073] (6)温度稳定性：在45℃以下稳定；以及

[0074] (7)分子质量：约63kDa(通过SDS－PAGE法测定)。

[0075] [15]

[0076] [14]中记载的蛋白质，其中，[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0077] [16]

[0078] [15]中记载的蛋白质，其中，0.4≤[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0079] [17]

[0080] [9]～[16]中记载的蛋白质，其中，上述枝顶孢属(Acremonium属)微生物是顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)。

[0081] [18]

[0082] 以下的(a)、(b)或(c)中记载的蛋白质，即，

[0083] (a)由序列号10所表示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0084] (b)由在序列号10所表示的氨基酸序列中缺失、取代及/或添加1～数个氨基酸而得的氨基酸序列组成的、具有糖质氧化酶活性的蛋白质；

[0085] (c)由与序列号10所表示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸组成的、具有糖质氧化酶活性的蛋白质。

[0086] [19]

[0087] 一种基因，编码[18]中记载的蛋白质。

[0088] [20]

[0089] 一种基因，由以下的(a)、(b)或(c)中记载的DNA组成，即，

[0090] (a)由序列号6所表示的碱基序列组成的DNA；

[0091] (b)由在序列号6所表示的碱基序列中缺失、取代及/或添加1～数个碱基而得的碱基序列组成的、编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质的DNA；以及

[0092] (c)由与序列号6所表示的碱基序列具有90％以上的同源性的碱基组成的、编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质的DNA。

[0093] [21]

[0094] 一种基因，由以下的(a)、(b)或(c)中记载的DNA组成，即，

[0095] (a)由序列号9所表示的碱基序列组成的DNA；

[0096] (b)由在序列号9所表示的碱基序列中缺失、取代及/或添加1～数个碱基而得的碱基序列组成的、编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质的DNA；以及

[0097] (c)由与序列号9所表示的碱基序列具有90％以上的同源性的碱基组成的、编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质的DNA。

[0098] [22]

[0099] 一种重组载体，含有[19]～[21]中的任一项所述的基因。

[0100] [23]

[0101] 一种转染体，通过[22]中记载的重组载体对宿主细胞进行转染而得。

[0102] [24]

[0103] 一种蛋白质的制备方法，从培养物中采集[1]～[18]中的任一项所述的蛋白质，所述培养物是通过在营养培养基中对具有生产[1]～[18]中的任一项所述的蛋白质的能力的微生物进行培养而得到的物质。

[0104] [25]

[0105] 一种蛋白质的制备方法，将[23]所述的转染体在培养基中进行培养，从培养物中收集具有糖质氧化酶活性的蛋白质。

[0106] [26]

[0107] 一种糖酸的制备方法，其中，使用[1]～[18]中的任一项所述的蛋白质，由糖质制备糖酸。

[0108] [27]

[0109] [1]～[18]中的任一项所述的蛋白质在将食品内的糖质氧化中的用途。

[0110] [28]

[0111] 一种蛋白的脱糖方法，至少进行[27]中记载的蛋白质的应用。

[0112] [29]

[0113] 一种脱糖蛋白的制备方法，使用[28]中记载的脱糖方法。

[0114] [30]

[0115] 一种面包的品质及/或面坯的物性的改性方法，至少进行[27]中记载的蛋白质的应用。

[0116] [31]

[0117] 一种面包的制备方法，使用[30]中记载的改性方法。

[0118] [32]

[0119] 一种乳糖酸的制备方法，至少进行[27]中记载的蛋白质的应用。

[0120] 本发明的蛋白质能够作用于广泛的糖，并且具有适度的温度稳定性，所以，在现有的葡萄糖氧化酶、低聚糖氧化酶无法应对的广泛的领域中，能够起到糖质氧化作用。附图说明

[0121] 图1是表示实施例1中的糖质氧化酶的SDS－PAGE的代图图表。条带1：糖质氧化酶。

[0122] 图2是表示实施例3中的相对于pH的相对活性(％)的代图图表。

[0123] 图3是表示实施例4中的相对于pH的相对活性(％)的代图图表。

[0124] 图4是表示实施例5中的相对于温度的相对活性(％)的代图图表。

[0125] 图5是表示实施例6中的相对于温度的相对活性(％)的代图图表。

[0126] 图6是表示实施例9中的脱糖蛋白中的残留葡萄糖量的代图图表。

[0127] 图7是表示实施例10中在54℃进行加热处理时的脱糖蛋白中的残留活性的代图图表。

[0128] 图8是表示实施例10中在56℃进行加热处理时的脱糖蛋白中的残留活性的代图图表。

[0129] 图9是表示实施例10中在58℃进行加热处理时的脱糖蛋白中的残留活性的代图图表。

[0130] 图10是表示实施例11中的面包体积测定结果的代图图表。

[0131] 图11是表示实施例11中的面包硬度测定结果的代图图表。

[0132] 图12是表示实施例13中的以乳糖为基质的乳糖酸生成的色谱结果的代图图表。

[0133] 图13是表示实施例16中构建的表达质粒pCSGOOXG的构建体的概念图。

[0134] 图14是表示实施例16中的丝状菌转染体培养滤液的SDS－PAGE结果的代图图表。条带1：米曲霉BB－56的培养滤液、条带2：丝状菌转染体的培养滤液。

[0135] 以下对用于实施本发明的优选方式进行详细说明。应予说明，以下说明的实施方式表示本发明的代表性实施方式之一例，不应由此对本发明的范围做狭窄的解释。

[0136] ＜1.具有糖质氧化酶活性的蛋白质＞

[0137] 本发明的蛋白质是具有后述的理化性质的蛋白质。

[0138] 本发明中，糖质氧化酶活性的测定方法没有特别限定，可以自由选择公知的方法来进行。本发明中，特别是通过后述的实施例中记载的方法对糖质氧化酶活性进行测定。

[0139] (1)作用

[0140] 本发明的蛋白质在有氧条件下将后述的糖氧化，形成糖酸。更详言之，在有氧条件下，使本发明的蛋白质作用于后述的糖时，生成糖酸和过氧化氢。

[0141] (2)基质特异性

[0142] 本发明的蛋白质对葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维二糖显示活性。本发明的蛋白质对各基质的相对活性在以对葡萄糖的活性为100％的情况下，麦芽三糖：约92％、麦芽糖：约86％、半乳糖：约79％、麦芽四糖：约60％、乳糖：约58％、纤维二糖：约53％(参见后述的实施例2)。

[0143] 应予说明，本发明中，将以葡萄糖为基质时的活性作为基准(100％)时相对活性如果在50％以上，则判断为“本酶良好地起作用的基质”。

[0144] 这样，本发明的蛋白质不仅对葡萄糖这样的单糖类显示活性，对二糖类以上的大范围的糖质也显示活性。因此，在现有的葡萄糖氧化酶、低聚糖氧化酶无法应对的广泛的领域中，能够起到糖质氧化作用。

[0145] (3)Km值

[0146] 本发明中，对蛋白质的Km值(米氏常数)的具体计算方法没有特别限定，可以自由选择公知的方法进行计算。本发明中特别是通过后述实施例8中记载的方法计算Km值。本发明的蛋白质的Km值没有特别限定，优选[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1，更优选0.4≤[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]≤1。

[0147] (4)分子质量

[0148] 本发明的蛋白质通过SDS－PAGE法测定的分子质量约63kDa。

[0149] (5)最佳pH

[0150] 本发明的蛋白质在37℃反应5分钟的条件下在pH5.0～9.0附近糖质氧化酶活性最高。

[0151] (6)稳定pH范围

[0152] 本发明的蛋白质在37℃处理15分钟的条件下在pH5.0～10.5附近是稳定的。

[0153] (7)最佳温度

[0154] 本发明的蛋白质在pH7.0反应5分钟的条件下在20℃～55℃附近糖质氧化酶活性最高。

[0155] (8)温度稳定性

[0156] 本发明的蛋白质在pH7.0处理15分钟的条件下即使于45℃的温度条件下进行处理也维持80％以上的活性。

[0157] (9)关于来源

[0158] 因为以上说明的本发明的蛋白质在前述的理化性质方面具有目前没有的特征，所以只要是以前述的理化性质表征的蛋白质即可，对其来源没有特别限定。本发明中，例如可以举出来源于归属枝顶孢属(Acremonium属)的微生物。这种情况下，作为归属枝顶孢属(Acremonium属)的微生物，可以举出顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)。

[0159] 此处的“来源于顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)的糖质氧化酶”是指分类于顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)的微生物(可以是野生株，也可以是突变株)所生产的糖质氧化酶，或者利用糖质氧化酶基因，通过基因工程方法得到的糖质氧化酶。因此，通过导入了由顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)得到的糖质氧化酶基因(或改变了该基因的基因)的宿主微生物生产的重组体也属于来源于“顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)的糖质氧化酶”。

[0160] 作为本发明的蛋白质的来源的顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)的例子，可以举出顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBR C30055(NITE、日本)、ATCC15006(ATCC、美国)、DSM880(DSMZ、德国)。

[0161] (10)氨基酸序列

[0162] 本发明的蛋白质在前述的理化性质方面具有目前没有的特征，所以只要是以前述的理化性质表征的蛋白质即可，对其氨基酸结构没有限定，如果列举一个例子，则可以用以下的氨基酸序列表征。

[0163] 具体而言，本发明的蛋白质可以用序列号10所表示的氨基酸序列表征。

[0164] 此处，一般而言，对某个蛋白质的氨基酸序列的一部分施加了改变的情况下，改变后的蛋白质有时具有与改变前的蛋白质同等的功能。即，氨基酸序列的改变对蛋白质的功能没有实质影响，蛋白质的功能在改变前后被维持。因此，作为本发明的其他方式，提供由在序列号10所表示的氨基酸序列中缺失、取代及/或添加1～数个氨基酸而得的氨基酸序列组成的、具有糖质氧化酶活性的蛋白质。“构成氨基酸序列的1～数个氨基酸的缺失、取代及/或添加”典型地是指氨基酸序列的部分差异。

[0165] 此处的氨基酸序列的差异只要能够保持糖质氧化酶活性即可(活性可以多少变化)。只要满足该条件，对氨基酸序列差异的位置没有特别限定，另外可以在多个位置产生差异。此处的多个是指例如相当于全部氨基酸序列的大约不足30％的数量，优选为相当于大约不足20％的数量，更优选为相当于大约不足10％的数量，更进一步优选相当于大约不足5％的数量，最优选相当于大约不足1％的数量。

[0166] 即，是指与序列号10的氨基酸序列具有例如约70％以上、优选约80％以上、更优选约90％以上、更进一步优选约95％以上、最优选约99％以上的同源性。

[0167] 另外，优选通过在对于糖质氧化酶活性并非必须的氨基酸残基中发生保守性氨基酸取代而得到蛋白质的方法。此处的“保守性氨基酸取代”是指将某氨基酸残基取代成具有同样性质侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链分类成几个家族，即碱基性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非荷电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性氨基酸取代优选为同一家族内的氨基酸残基间的取代。

[0168] 但是，两个氨基酸序列或两个核酸(以下作为包含这些含义的用语使用“两个序列”)的同源性(％)例如可以按以下顺序决定。首先，排列两个序列以便能够进行最合适的比较。此时，例如可以在第一序列内导入间隙，将与第二序列的比对最佳化。第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二序列中的对应位置的分子相同时，可以称之为该位置的分子相同。两个序列的同源性是该两个序列共同的同一位置的数目的函数(即、同源性(％)＝相同位置的数目/位置的总数×100)，优选还考虑比对的最佳化所需的间隙的数目以及尺寸。

[0169] 另外，两个序列的比较以及同源性的确定可以使用数学算法来实现。作为序列的比较能够利用的数学算法的具体例，记载于Karlin以及Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264－68，在Karlin以及Altschul(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873－77中有被改变的算法，但并不限定于此。这样的算法可以编入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403－10中记载的NBLAST程序以及XBLAST程序(版本2.0)中。为了得到与本发明的核酸分子等价的核苷酸序列，例如只要通过NBLAST程序作为score＝100、wordlength＝12进行BLAST核苷酸检索即可。

[0170] 为了得到与本发明的多肽分子等价的氨基酸序列，例如只要通过XBLAST程序作为score＝50、wordlength＝3进行BLAST多肽检索即可。为了得到用于比较的间隙比对，可利用Altschul等(1997)Amino Acids Research 25(17)：3389－3402中记载的Gapped BLAST。利用BLAST以及Gapped BLAST的情况下，可以使用对应的程序(例如XBLAST以及NBLAST)的缺省参数。详情请参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。

[0171] 作为能够用于序列比较的其他数学算法的例子，有Myers以及Miller(1998)Comput Appl Biosci.4：11－17中记载的算法。这样的算法例如编入GENESTREAM网络服务器(IGH Montpellier、法国)或ISREC服务器中可利用的ALIGN程序中。为了比较氨基酸序列而使用ALIGN程序的情况下，例如可以利用PAM120残基质量表，使间隙长度惩罚项(gap lenth penalty)＝12、间隙惩罚项(gap penalty)＝4。

[0172] 两个氨基酸序列的同源性可以使用GCG软件包的GAP程序，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，以间隙加权＝12、10、8、6或4，间隙长加权＝2、3或4来确定。另外，两个核酸序列的同源度可以使用GCG软件包(http：//www.gcg.com中能够利用)的GAP程序，以间隙加权＝50、间隙长加权＝3来确定。

[0173] 本发明的蛋白质可以是更大的蛋白质(例如融合蛋白质)的一部分。作为融合蛋白质中所添加的序列，例如可以举出多重组氨酸残基这样的有助于精制的序列、确保重组生产时的稳定性的添加序列等。

[0174] 具有上述氨基酸序列的本蛋白质可以通过基因工程方法容易地调制。例如可以用编码本蛋白质的DNA对合适的宿主细胞(例如大肠杆菌)进行转染，回收在转染体内表达的蛋白质，由此进行调制。所回收的蛋白质根据目的进行适当调制。只要由此作为重组蛋白质得到本蛋白质即可，可为各种修饰。例如，若将编码本蛋白质的DNA和其他合适的DNA插入相同的载体中，使用该载体，进行重组蛋白质的生产，则能够得到由连接了任意的肽或蛋白质的重组蛋白质形成的本蛋白质。另外，也可以实施糖链及/或脂质的添加、或者N末端或C末端的处理之类修饰。通过以上的修饰，能够简便地进行重组蛋白质的提取和精制、或者生物学功能的增加等。

[0175] ＜2.基因、重组载体、转染体＞

[0176] (1)基因

[0177] 本发明中提供编码上述蛋白质的基因。一个方案中，本发明的基因包含编码序列号10的氨基酸序列的DNA。该方案的具体例是由序列号6或序列号9的碱基序列组成的DNA。

[0178] 但是，一般而言，对编码某个蛋白质的DNA的一部分施加了改变的情况下，改变后的DNA编码的蛋白质有时具有与改变前的DNA编码的蛋白质同等的功能。即，DNA序列的改变对编码的蛋白质的功能没有实质影响，编码的蛋白质的功能在改变前后被维持。因此，在本发明中，作为其他的方案，提供具有与序列号6或序列号9的碱基序列等价的碱基序列、编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质的DNA(以下也称为“等价DNA”)。此处的“等价碱基序列”是指与序列号6或序列号9所示的核酸部分不同，但其所编码的蛋白质的功能(此处为糖质氧化酶活性)没有因该差异而受到实质影响的碱基序列。

[0179] 等价DNA的具体例是对与序列号6或序列号9的碱基序列互补的碱基序列，在严格条件下进行杂交的DNA。此处的“严格条件”是指形成所谓的特异性杂交、不形成非特异性杂交的条件。这样的严格条件是本领域技术人员公知的，例如可以参照分子克隆(Molecular Cloning)(第三版，冷泉港实验室出版，纽约)、现代分子生物学方法(Current protocols in molecular biology)(Frederick M.Ausubel et al.编，1987)进行设定。作为严格条件，例如可以举出使用杂交液(50％甲酰胺、10×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％葡聚糖硫酸、10μg/ml的改性鲑鱼精DNA、50mM磷酸缓冲液(pH 7.5))，在约42℃～约50℃培养，之后使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃～约70℃进行清洗的条件。作为更优选的严格条件，例如可以举出作为杂交液使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％葡聚糖硫酸、10μg/ml的改性鲑鱼精DNA、50mM磷酸缓冲液(pH 7.5))的条件。

[0180] 作为等价DNA的其他具体例，可以举出由以序列号6或序列号9所示的碱基序列为基准，包含1或多个(优选为1～几个)碱基的取代、缺失、插入、添加或倒位的碱基序列组成的、编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以在多个部位发生。此处的“多个”根据该DNA编码的蛋白质的立体构造中的氨基酸残基的位置、种类而不同，例如为2～40碱基，优选为2～20碱基，更优选为2～10碱基。以上的等价DNA例如可以利用限制酶处理、基于外切酶、DNA连接酶等的处理、基于位置指定突变导入法(分子克隆(Molecular Cloning)，第三版，第13章，冷泉港实验室出版，纽约)、随机突变导入法(分子克隆(Molecular Cloning)，第三版，第13章，冷泉港实验室出版，纽约)的突变导入等，对具有序列号6或序列号9所表示的碱基序列的DNA进行改变，使其包含碱基的取代、缺失、插入、添加及/或倒位而得到。另外，也可以通过紫外线照射等其他方法得到等价DNA。

[0181] 作为等价DNA的其他例，可以举出源于SNP(单核苷酸多态性)所代表的多态性，能够识别上述那样的碱基差异的DNA。

[0182] 本发明的基因可参考本说明书或所附序列表公开的序列信息，使用标准的基因工程方法、分子生物学方法、生化方法等而调制成分离的状态。具体而言，可以由合适的顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)的基因组DNA文库或cDNA文库或顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)的菌体内提取液，适当利用对本发明的基因可特异性杂交的低聚核苷酸探针·引物而调制。低聚核苷酸探针·引物可使用市售的自动化DNA合成装置等容易地合成。应予说明，对于为了调制本发明的基因而使用的文库的制作方法，例如可以参照分子克隆(Molecular Cloning)，第三版，冷泉港实验室出版，纽约。

[0183] 例如，若为具有序列号6或序列号9的碱基序列的基因，则可利用以该碱基序列或其互补序列的整体或一部分为探针的杂交法进行分离。另外，可利用使用以对该碱基序列的一部分特异性杂交的方式设计的合成低聚核苷酸引物的核酸扩增反应(例如PCR)进行扩增以及分离。另外，还可以基于序列号10所示的氨基酸序列、序列号6或序列号9的碱基序列的信息，通过化学合成而得到作为目标的基因(参考文献：Gene，60(1)，115－127(1987))。

[0184] 以下给出本发明的基因的取得方法的具体例。首先，从顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)中分离、精制本酶(糖质氧化酶)，获得涉及该部分氨基酸序列的信息。作为部分氨基酸序列确定方法，例如、将精制的糖质氧化酶直接按照常规方法，通过埃德曼降解法(Journal of Biological Chemistry、第256卷、第7990～7997页(1981))，供氨基酸序列分析(蛋白质序列476A、Applied Biosystems公司制等)。使蛋白质水解酶作用，进行限定水解，对得到的肽片段进行分离、精制，对得到的精制肽片段进行氨基酸序列分析是有效的。

[0185] 基于由此得到的部分氨基酸序列信息，对糖质氧化酶基因进行克隆。例如可利用杂交法或PCR进行克隆。在利用杂交法的情况下，例如可以使用分子克隆(第三版，第13章，冷泉港实验室出版，纽约)中记载的方法。

[0186] 在利用PCR法的情况下，可以使用以下的方法。首先，以产生糖质氧化酶的微生物的基因组DNA为模板，使用基于部分氨基酸序列的信息设计的合成寡核苷酸引物，进行PCR反应，得到目标基因片段。PCR法基于PCR技术〔PCR  Technology、Erlich HA编纂、Stocktonpress公司、1989年发行〕中记载的方法进行。进而，对于该扩增DNA片段，通过通常使用的方法、例如通过双脱氧链终止法确定碱基序列时，所确定的序列中除了合成低聚核苷酸引物的序列之外观察到对应于糖质氧化酶的部分氨基酸序列的序列，能够获得目标糖质氧化酶基因的一部分。以得到的基因片段为探针，进一步进行杂交法等，由此能够将编码糖质氧化酶全长的基因克隆。

[0187] 在后述的实施例中，利用PCR法确定编码顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)所产生的糖质氧化酶的基因的序列。编码来自于顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)的糖质氧化酶的基因的全部碱基序列示于序列号6，编码该酶的cDNA的全部碱基序列示于序列号9。另外，确定了该碱基序列所编码的氨基酸序列(序列号10)。应予说明，对应于序列号10所示的氨基酸序列的碱基序列除了序列号6或序列号9中记载的以外，还存在多个。

[0188] 通过将全部碱基序列都明确了的糖质氧化酶基因(序列号6)的整体或者一部分用作杂交用探针，能够从产生其他糖质氧化酶的微生物的基因组DNA文库或者cDNA文库中选出与序列号6或序列号9的糖质氧化酶基因同源性高的DNA。

[0189] 同样地可设计PCR用引物。通过使用该引物进行PCR反应，能够检测与上述糖质氧化酶基因同源性高的基因片段，进而还能够得到其基因整体。

[0190] 制备如上所述得到的基因的蛋白质，测定其糖质氧化酶活性，由此能够确认是否为编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质的基因。另外，通过将得到的基因的碱基序列(或其所编码的氨基酸序列)与上述糖质氧化酶基因的碱基序列(或其所编码的氨基酸序列)进行比较，可以研究基因构造、同源性，判定是否编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质。

[0191] 因为一次构造以及基因构造确定，所以可通过导入随机突变或者部位特异性而得到改变型糖质氧化酶(实施了1个或多个氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代的基因)。由此，能够得到编码虽然具有糖质氧化酶活性、但最佳温度、稳定温度、最佳pH、稳定pH、基质特异性等性质不同的糖质氧化酶的基因。另外，能够采用基因工程方法制备改变型糖质氧化酶。

[0192] 此处，导入突变时的计划可参考例如基因序列方面的特征序列而进行。特征性序列的参考例如可通过预测该蛋白质的立体构造、考虑与已知蛋白质的同源性来进行。

[0193] 作为导入随机突变的方法，例如可以举出对DNA进行化学处理的方法，即，使亚硫酸氢钠作用，引发将胞嘧啶碱基转换成尿嘧啶碱基的转型突变的方法(Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA、第79卷、第1408～1412页(1982))；生化方法，即在〔α－S〕dNTP存在下合成双链的过程中产生碱基取代的方法(Gene、第64卷、第313～319页(1988))；使用PCR的方法，即在反应体系中加入锰进行PCR，降低核苷酸的导入准确性的方法(Analytical Biochemistry、第224卷、第347～353页(1995))等。

[0194] 作为导入部位特异性突变的方法，例如可以举出利用琥珀突变的方法(gapped duplex法、Nucleic Acids Research、第12卷、第24号、第9441～9456页(1984))、利用限制酶的识别部位的方法(Analytical Biochemistry、第200卷、第81～88页(1992)、GENE、第102卷、第67～70页(1991))、利用dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶DNA糖酶)突变的方法(Kunkel法、Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA、第82卷、第488～
492页(1985))、利用使用DNA聚合酶以及DNA连接酶的琥珀突变的方法(Oligonucleotide－directed Dual Amber(ODA)法、GENE、第152卷、第271～275页(1995)、日本特开平7－
289262号公报)、利用诱导DNA的修复体系的宿主的方法(日本特开平8－70874号公报)、利用催化DNA链交换反应的蛋白质的方法(日本特开平8－140685号公报)、基于使用添加了限制酶的识别部位的2种突变导入用引物的PCR的方法(USP5,512,463)、基于使用具有钝化药剂抗药性基因的双链DNA载体和2种引物的PCR的方法(GENE、第103卷、第73～77页(1991))、基于利用琥珀突变的PCR的方法(国际公开WO98/02535号公报)等。

[0195] 除此之外，还可以通过使用市售的试剂盒，容易地导入部位特异性突变。作为市售的试剂盒，例如可以采用使用gapped duplex法的Mutan(注册商标)－G(宝酒造公司制)、使用Kunkel法的Mutan(注册商标)－K(宝酒造公司制)、使用ODA法的Mutan(注册商标)－ExpressKm(宝酒造公司制)、使用突变导入用引物和来自强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的DNA聚合酶的QuikChangeTM Site－Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE公司制)等，另外，作为利用PCR法的试剂盒，可以使用TaKaRa LA PCR in vitro Mutagenesis Kit(宝酒造公司制)、Mutan(注册商标)－Super Express Km(宝酒造公司制)等。

[0196] 由此，能够根据本发明提供糖质氧化酶的一次构造以及基因构造，由此能够通过廉价且高纯度的基因工程方法制备具有糖质氧化酶活性的蛋白质。

[0197] (2)重组载体

[0198] 本发明的基因能够插入合适的载体中进行使用。本发明中能够使用的载体的种类是能够将插入其中的核酸分子输送到细胞等目标内的核酸性分子，对其种类、形态没有特别限定。因此，本发明的载体可以成为质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体(腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体等)的形态。

[0199] 根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，另外考虑宿主细胞的种类，选择合适的载体。如果列举载体的具体例，则有以大肠杆菌为宿主的载体(M13噬菌体或其改变体、λ噬菌体或其改变体、pBR322或其改变体(pB325、pAT153、pUC8等)等)、以酵母为宿主的载体(pYepSec1、pMFa、pYES2等、以昆虫细胞为宿主的载体(pAc、pVL等)、以哺乳类细胞为宿主的载体(pCDM8、pMT2PC等)等。

[0200] 本发明的重组载体优选为表达载体。“表达载体”是指能够将插入其中的核酸导入目标细胞(宿主细胞)内、且能够使其在该细胞内表达的载体。表达载体通常包括所插入的核酸表达所需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用包含选择标记物的表达载体。使用该表达载体的情况下，可利用选择标记物确认是否导入了表达载体(以及其程度)。

[0201] 本发明的基因向载体的插入、选择标记物基因的插入(根据需要)、启动子的插入(根据需要)等可使用标准的重组DNA技术(例如可参照分子克隆(Molecular Cloning)，第三版，1.84节，冷泉港实验室出版，纽约，使用限制酶以及DNA连接酶的公知方法)进行。

[0202] (3)转染体

[0203] 可通过将本发明的重组载体导入适当的临时宿主来制作转染体。本发明的转染体中，本发明的基因作为外源性的分子存在。本发明的转染体优选通过使用上述本发明的载体的转染或转化来调制。转染、转化可以通过磷酸钙共沉降法、电穿孔法(Potter，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，7161－7165(1984))、脂质体法(Felgner，P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，7413－7417(1984))、显微注射法(Graessmann，M.&Graessmann，A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73，366－370(1976))、Hanahan的方法(Hanahan，D.，J.Mol.Biol.166，557－580(1983))、乙酸锂法(Schiestl，R.H.et al.，Curr.Genet.16，339－346(1989))、原生质体－聚乙二醇法(Yelton，M.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81，1470－1474(1984))等来实施。

[0204] 宿主细胞只要本发明的糖质氧化酶表达即可，没有特别限定，例如可以举出枯草杆菌(Bacillus subtilius)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)等芽孢杆菌(Bacillus)属细菌、乳球菌(Lactococcus)、乳酸菌(Lactobacillus)、链球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、双歧杆菌(Bifidobacterium)等乳酸菌、大肠埃希菌(Escherichia)、链霉菌(Streptomyces)等其他细菌、酵母菌(Saccharomyces)、克鲁维酵母菌(Kluyveromyces)、假丝酵母菌(Candida)、圆酵母(Torula)、球拟酵母菌(Torulopsis)等酵母、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属、青霉菌(Penicillium)属、木霉(Trichoderma)属、镰孢菌(Fusarium)属等丝状菌(真菌)等。作为动物细胞，可以举出杆状病毒系统等。

[0205] ＜3.具有糖质氧化酶活性的蛋白质的制备方法＞

[0206] 本发明的具有糖质氧化酶活性的蛋白质的制备方法没有特别限定，可以自由地采用公知的方法。具体而言，本发明的蛋白质可以通过下述方法来制备，即，在营养培养基中对具有生产本发明的蛋白质的能力的微生物或本发明的转染体进行培养，并从所得到的培养物中收集具有糖质氧化酶活性的蛋白质。

[0207] 在本发明的制备方法中，能够使用的微生物只要是具有前述的理化性质以及具有糖质氧化酶活性的蛋白质生产能力的微生物即可，没有特别限定，可以自由地选择使用公知的微生物。例如可以举出属于枝顶孢属(Acremonium属)的微生物。这种情况下，作为归属枝顶孢属(Acremonium属)的微生物，可以举出顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)。

[0208] 另外，本发明的制备方法中使用的上述微生物不限于野生株，通过使用紫外线、X射线、放射线、各种药品等的人工突变手段对上述野生株实施了突变的突变株只要具有拥有上述糖质氧化酶活性的酶的生产能力，即可使用。

[0209] 本发明的制备方法中的培养可以适当采用公知的方法，例如可以任意使用液体培养以及固体培养中的任一个。

[0210] 本发明的制备方法中的培养时，能够使用的培养基的碳源没有特别限定，可以将公知的培养基中使用的碳源自由选择1种或2种以上进行使用。例如可以举出葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘油、糊精、卵磷脂等。

[0211] 另外，氮源也没有特别限定，可以将公知的培养基中使用的氮源自由选择1种或2种以上进行使用。例如硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、氯化铵等无机氮源、玉米面筋粉、大豆粉、酪蛋白氨基酸、咖啡渣、棉籽油渣、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麦糠、肉提取物、氨基酸、胨等有机氮源等均可使用。

[0212] 进而，无机营养源也没有特别限定，可以将公知的培养基中使用的无机营养源自由选择1种或2种以上进行使用。例如可以举出钠、镁、钾、铁、锌、钙、锰的盐类以及维生素等。

[0213] 本发明的制备方法中进行培养的具体温度没有特别限定，可在无损本发明效果的范围内，自由设定。本发明中特别优选在20～35℃的温度范围进行，更优选在25～30℃的温度范围进行。

[0214] 另外，培养基的pH也没有特别限定，可在无损本发明的效果的范围内自由设定。本发明中特别优选设定为pH5～8，更优选设定为pH6～7。

[0215] 本发明的制备方法中的培养时间也没有特别限定，可在无损本发明效果的范围内，对应于菌体浓度、培养基pH、培养基温度、培养基的构成等自由设定。本发明中特别优选将培养时间设定为3～8日，更优选设定为4～7日。作为培养法，例如可以利用静置培养、振荡培养法、发酵缸等好氧性深部培养法。

[0216] 由此将菌体培养后，对本发明的蛋白质进行精制和回收。蛋白质的精制和回收方法没有特别限定，可以自由选择公知的方法进行。

[0217] 例如从培养液中回收的情况下，例如可以通过对培养上清液进行过滤、离心处理等而除去不溶物，然后适当组合使用超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、渗析、离子交换树脂等各种色谱等进行分离、精制，由此得到本蛋白质。

[0218] 另一方面，从菌体内回收的情况下，例如通过加压处理、超声波处理等将菌体破碎后，与上述同样地进行分离、精制，由此能够得到本蛋白质。应予说明，也可以通过过滤、离心处理等预先从培养液中回收菌体，然后进行上述一系列的工序(菌体的破碎、分离、精制)。

[0219] 另外，表达的确认、表达产物的确认可以使用对糖质氧化酶的抗体简单地进行，但也可以通过测定糖质氧化酶活性来确认表达。

[0220] 在本发明的其他方案中，使用上述转染体制备糖质氧化酶。该方案的制备法中，首先在产生被导入其中的基因编码的蛋白质的条件下对上述转染体进行培养。关于各种载体宿主体系，转染体的培养条件是公知的，只要是本领域技术人员，就能够容易地设定适当的培养条件。接着培养步骤，回收所产生的蛋白质(即、糖质氧化酶)。对于回收以及随后的精制，只要能够与上述方案的情况同样地进行即可。

[0221] ＜4.本发明的蛋白质的使用、其用途＞

[0222] 本发明的蛋白质的具体使用形态没有特别限定，例如可以以酶剂的形态提供。酶剂除了有效成分(本发明的蛋白质)外，还可以自由选择含有1种或2种以上药理学允许的添加剂。例如可以含有赋形剂、缓冲剂、混悬剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可以使用淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、D－葡萄糖、山梨糖醇、D－甘露糖醇、白糖、丙三醇等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄基醇、氯丁醇、甲基对羟基苯甲酸等。作为防腐剂，可以使用乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

[0223] 使用本发明的蛋白质，将能够作为前述基质的糖质氧化，由此能够制备糖酸。本发明的蛋白质只要能够成为前述基质的糖质存在，就能够在所有领域中作为糖质氧化酶起作用。特别是本发明的蛋白质具有对广泛的糖起作用的特征，所以能够在需要将多种糖同时氧化等情况下适当地使用。另外，本发明的蛋白质具有适度的温度稳定性，所以例如在将糖质氧化而制备糖酸后，需要使其酶活性钝化等情况下，能够适当地使用。

[0224] 作为具体的一个例子，例如可以适当地用于将食品内的糖质氧化。利用该使用方法，能够应用于各种用途。例如，可以适当地用于(1)蛋白的脱糖方法、脱糖蛋白的制备方法、(2)面包的品质及/或面坯的物性的改性方法、面包的制备方法、(3)乳糖酸的制备方法等。

[0225] (1)蛋白的脱糖方法、脱糖蛋白的制备方法

[0226] 本发明的蛋白质能够适用于蛋白的脱糖。

[0227] 蛋白内所包含的葡萄糖等糖例如在制备点心等时，存在因美拉德反应而着色的问题。因此，一直以来，在制备点心等时使用脱糖蛋白。

[0228] 蛋白的脱糖目前使用基于葡萄糖氧化酶的处理、使用酵母等的发酵法。但是，基于葡萄糖氧化酶的处理一般温度稳定性高，所以存在脱糖后的蛋白中残留活性的问题。活性残留的葡萄糖氧化酶例如导致点心原料中所包含的葡萄糖氧化而引发甜味减少的问题。另外，发酵法存在脱糖处理后的蛋白带有发酵味的问题，存在蛋白的用途受限的问题。

[0229] 另外，本发明的蛋白质的温度稳定性并不过高，显示适度的温度稳定性，所以有在脱糖后的蛋白中活性降低的特征。因此，能够减少活性残留导致最终食品的甜味减少的问题。

[0230] 进而，使用本发明的蛋白质的脱糖方法是使蛋白中的糖变化为糖酸的方法，不同于发酵法，所以也能够解决发酵味等问题。

[0231] (2)面包的品质及/或面坯的物性的改性方法、面包的制备方法

[0232] 本发明的蛋白质能够适用于面包的品质及/或面坯的物性的改性。

[0233] 具体而言，将面包制作中使用的材料中包含的糖质氧化而产生过氧化氢，由此使面包的坯料(面坯)紧缩，减少制备工序中发粘的情况，容易操作，能够改良物性。

[0234] 一直以来，都是通过在小麦粉中添加糖质氧化酶来进行面包的坯料(面坯)的物性改良。具体而言，期待面包的坯料(面坯)的紧缩效果，将葡萄糖氧化酶单独或者与其他酶并用，用于面包的制备。但是，小麦粉中的葡萄糖的存在量一般为0～0.4重量％的范围，所以仅凭葡萄糖氧化酶实际上难以提高品质，必须与其他酶并用。

[0235] 另一方面，本发明的蛋白质如上所述除了葡萄糖外，还作用于广泛的糖，所以仅凭本发明的蛋白质即可发挥优异的面包品质、面坯物性的改性效果。

[0236] (3)乳糖酸的制备方法

[0237] 本发明的蛋白质也对乳糖起作用，所以可以适用于使乳糖氧化而制备乳糖酸的方法。

[0238] 已知乳糖酸通过与钙、钾、钠、锌等无机阳离子成盐而促进矿物质的吸收。另外，化妆品领域中作为抗氧化剂广泛使用乳糖酸，食品领域中作为稳定剂广泛使用乳糖酸钙。由此，本发明的蛋白质也能够适当地用于被用于众多领域的乳糖酸的制备。

[0239] 目前，乳糖酸采用将乙酸菌等接种在奶中使其发酵等而将奶中的乳糖转化成乳糖酸等方法。

[0240] 但是，通过使用本发明的蛋白质，能够通过酶法制备乳糖酸。

[0241] 实施例

[0242] 以下，基于实施例更详细地说明本发明，并且验证本发明的效果。应予说明，以下说明的实施例给出本发明的代表性实施例之一例，不由此而对本发明的范围做狭窄的解释。

[0243] 应予说明，本实施例中，如无特别说明，糖质氧化酶活性的测定按以下的方法进行。

[0244] ＜糖质氧化酶活性测定方法＞

[0245] 将包含0.15％(W/V)苯酚以及0.15％(W/V)Triton X－100的0.1M磷酸一钾－氢氧化钠缓冲液(pH 7.0)2ml、10％麦芽糖一水合物溶液0.5ml、25U/mL过氧化物酶溶液0.5ml、以及0.4％(W/V)4－氨基安替比林溶液0.1ml混合，在37℃保温10分钟后，添加酶溶液0.1ml，开始反应。因为随着酶反应进行，生成在波长550nm处有吸收的醌亚胺色素，所以通过测定每分钟波长550nm处吸光度的增加来测定糖质氧化活性。应予说明，以1分钟内氧化1μmol麦芽糖一水合物所需的酶量为1单位。

[0246] ＜实施例1：具有糖质氧化酶活性的蛋白质的生产以及精制＞

[0247] 实施例1中，对本发明的具有糖质氧化酶活性的蛋白质进行精制。应予说明，在以下的实施例中，作为本发明的具有蛋白质生产能力的微生物之一例，使用枝顶孢属(Acremonium属)微生物、即顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)。

[0248] (1)培养

[0249] 顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055、ATCC15006、DSM880这3株在前培养后，使用下述表1所示组成的液体培养基，在30℃进行6天振荡培养。培养后，将培养液用No.2的滤纸(ADVANTEC东洋制)进行过滤，由此回收培养滤液。通过上述糖质氧化酶活性测定法测定得到的培养滤液中的糖质氧化酶活性。其结果示于表2。

[0250] [表1]

[0251] 糖质氧化酶活性生产主营养培养基

[0252]  (W/V)
玉米浆 3.0％
D-葡萄糖 1.0％
可溶性淀粉 3.0％
碳酸钙 0.5％

[0253] [表2]

[0254]  活性(U/ml)
NBRC30055 0.014U/ml
ATCC15006 0.014U/ml
DSM880 0.012U/ml

[0255] (2)来自顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055的糖质氧化酶的精制[0256] 将上述得到的培养滤液使用Radiolite Fine Flow A(昭和化学工业制)进行硅藻土过滤，接下来用UF膜(AIP－1013D、旭化成制)浓缩后，添加硫酸铵使饱和浓度为65％，在得到的上清液中添加硫酸铵使饱和浓度为90％。将得到的沉淀部分溶解在包含2M硫酸铵的20mM Tris－盐酸缓冲液(pH 8.0)中。供到用包含2M硫酸铵的20mM Tris－盐酸缓冲液(pH 
8.0)平衡化的HiLoad 16/10Phenyl Sepharose HP柱(GE healthcare制)中，通过2M～0M的硫酸铵直线浓度梯度，使吸附的糖质氧化酶蛋白质洗脱。

[0257] 将收集到的糖质氧化酶部分用UF膜浓缩后，用包含1mM氯化锰、1mM氯化钙、0.5M氯化钠的20mM Tris－盐酸缓冲液(pH 7.4)渗析。将得到的渗析内液供到用包含1mM氯化锰、1mM氯化钙、0.5M氯化钠的20mM Tris－盐酸缓冲液(pH 7.4)平衡化的HiTrap ConA 4B柱(GE healthcare制)中，通过向包含0.5M甲基－α－D－葡萄吡喃糖甙(MDGP)、0.5M氯化钠的
20mM Tris－盐酸缓冲液(pH 7.4)中的阶段洗脱，使吸附的糖质氧化酶蛋白质洗脱。

[0258] 将所收集的糖质氧化酶部分用UF膜浓缩后，用20mM磷酸一钾－氢氧化钠缓冲液(pH 6.0)渗析，将渗析内液供到用20mM磷酸一钾－氢氧化钠缓冲液(pH 6.0)平衡化的Mono Q HR 5/5柱(GE healthcare制)中，通过0M～1M的氯化钠直线浓度梯度，使吸附的糖质氧化酶蛋白质洗脱。

[0259] 进而，将收集的糖质氧化酶部分用UF膜浓缩后，用包含0.3M氯化钠的25mM Tris－盐酸缓冲液(pH 8.0)渗析，将得到的渗析内液供到用包含0.3M氯化钠的25mM Tris－盐酸缓冲液(pH 8.0)平衡化的HiLoad 16/60Superdex 200pg柱(GE healthcare制)中，用相同的缓冲液洗脱。收集糖质氧化酶蛋白质，用超滤膜进行脱盐浓缩，得到精制酶标准品。得到的本精制酶供下述各性质的调查，另外供内部肽氨基酸序列分析。

[0260] 应予说明，各阶段中的精制结果示于下述表3。最终阶段的比活性与粗酶相比约为160倍。图1中给出将最终精制工序中的样品用10％的凝胶实施SDS－PAGE(银染色)所得的结果。

[0261] [表3]

[0262]

[0263] ＜实施例2：基质特异性的调查研究＞

[0264] 实施例2中，调查对各基质的基质特异性。

[0265] 以下述表4中记载的各糖质为基质，在有氧条件下，使上述实施例1中精制的蛋白质在pH 7.0于37℃作用5分钟，基于上述糖质氧化酶活性测定法进行测定。进而，以对葡萄糖的活性为100％，计算对各糖质的相对活性值，由此对基质特异性进行评价。结果示于下述表4。

[0266] [表4]

[0267]基质 相对活性(％)
葡萄糖 100％
麦芽糖一水合物 86％
麦芽三糖 92％
麦芽四糖 60％
麦芽五糖 39％
麦芽六糖 28％
麦芽七糖 24％
半乳糖 79％
乳糖一水合物 58％
D(+)-纤维二糖 53％
D(-)-果糖 0％
蔗糖 0％
バィンデツクス#2(注册商标) 24％

[0268] 如表4所示，良好地作用于葡萄糖、麦芽糖一水合物、麦芽三糖、麦芽四糖、半乳糖、乳糖一水合物、D(+)－纤维二糖。对D(－)－果糖、蔗糖没有作用。

[0269] ＜实施例3：最佳pH的调查研究＞

[0270] 基于上述糖质氧化酶活性测定法，在各缓冲液(甘氨酸－盐酸缓冲液(pH 2.0、pH 3.0)、柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0)、磷酸一钾－磷酸二钾缓冲液(pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0)、Tris－盐酸缓冲液(pH 8.0、pH 9.0)、碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液(pH 9.0、pH 10.0、pH 11.0)、磷酸一钾－氢氧化钠缓冲液(pH 7.0))中，于37℃、5分钟的反应条件下进行测定。另外，以使用磷酸一钾－氢氧化钠缓冲液(pH 7.0)时的活性为
100％，计算各相对活性值。结果示于图2的代图图表。最佳pH为5.0～9.0。

[0271] ＜实施例4：稳定pH范围的调查研究＞

[0272] 将上述实施例1中精制的蛋白质溶液和上述实施例3中使用的各pH缓冲液等量混合，在37℃处理15分钟后，通过上述糖质氧化酶活性测定法测定活性。应予说明，作为基质，使用麦芽糖。另外，以使用磷酸一钾－氢氧化钠缓冲液(pH 7.0)处理时的活性为100％，计算各相对活性值。结果示于图3的代图图表。在pH 5.0～pH 10.5的范围具有85％以上的残留活性，在pH 5.0～pH 10.5的范围是稳定的。

[0273] ＜实施例5：最佳温度的调查研究＞

[0274] 以麦芽糖为基质，在有氧条件下，使上述实施例1中精制的蛋白质为pH 7.0、使反应温度为20℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃以及65℃作用5分钟，生成过氧化氢。在生成的过氧化氢中，在氨基安替比林、TOOS(株式会社同仁化学研究所制)的存在下使过氧化物酶作用，在波长555nm下测定生成的醌亚胺色素呈现的色调，进行定量。另外，以反应温度为37℃时的活性为100％，计算各相对活性值。结果示于图4的代图图表。最佳温度为20℃～55℃。

[0275] ＜实施例6：温度稳定性的调查研究＞

[0276] 将上述实施例1中精制的蛋白质溶液在20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃以及80℃的各温度下进行15分钟热处理后，将残留活性通过上述糖质氧化酶活性方法进行测定。相对于热，以未处理的活性为100％，计算各残留活性值。结果示于图5的代图图表。在45℃、15分钟的热处理中，具有80％以上的残留活性，直至45℃是稳定的。

[0277] ＜实施例7：分子质量的测定＞

[0278] 对于上述实施例1中精制的蛋白质，通过SDS－PAGE法计算分子质量，结果可知为约63kDa。

[0279] ＜实施例8：Km值的测定＞

[0280] 对于上述实施例1中精制的蛋白质，以葡萄糖、麦芽糖为基质，通过上述糖质氧化酶活性方法进行活性测定，由Hanes－Woolf Plot求出各自的米氏常数(Km)。结果，确定对葡萄糖的Km值为8mM，对麦芽糖的Km值为14mM。

[0281] ＜实施例9：蛋白的脱糖＞

[0282] 实施例9中，使用上述实施例1中精制的蛋白质以及葡萄糖氧化酶(“Hyderase 15”天野酶制品株式会社制)，进行蛋白的脱糖。

[0283] (1)蛋白的调制

[0284] 分成蛋白和蛋黄，用打泡器以蛋白不起泡的程度将水溶蛋白和浓厚蛋白混合，使用移液管(Komagome pipette)，每20mL分注到100mL烧瓶中。在分注的各100mL烧瓶中放入搅拌子，用带水槽的搅拌器剧烈搅拌，由此调制蛋白。

[0285] (2)蛋白的脱糖反应

[0286] 在上述调制的蛋白中分别添加上述实施例1中精制的蛋白质6U或者15U、葡萄糖氧化酶6U或者15U，为了防止水分蒸发，盖上铝箔，开始反应。

[0287] 在酶添加前，到反应开始后1～5小时为止每1小时取样500μL。然后，在－30℃冷冻，使反应停止。

[0288] (3)残留葡萄糖量的测定

[0289] 对于上述取样的各蛋白，测定残留的葡萄糖量。葡萄糖量的测定是将处理蛋白溶液中的α‐D‐葡萄糖用变旋酶变成β‐D‐葡萄糖后，在β‐NAD+存在下，用葡萄糖脱氢酶变换成D‐葡萄糖酸‐1，5‐内酯。在波长340nm下测定此时产生的β‐NADH+而进行定量。

[0290] 具体而言，在包含1mM EDTA、0.05％叠氮化钠、0.14％Triton X‐100、0.8mMβ‐NAD+、2U/m1MUT“AMANO”II(天野酶制品株式会社制)、14U/ml GLUCDH“AMANO”II(天野酶制品株式会社制)的100mM BES缓冲液(pH 7.0)3.4ml中添加适当稀释的处理蛋白溶液76μl，在37℃保温10分钟。保温后，测定波长340nm处的吸光度，由此对残留葡萄糖量进行定量。

[0291] (4)结果

[0292] 结果示于图6的代图图表。如图6的代图图表所示，可知与使用葡萄糖氧化酶的情况相比，使用本发明的蛋白质进行脱糖的情况下，脱糖后的蛋白中的残留葡萄糖量优势降低。

[0293] ＜实施例10：蛋白脱糖后的热失活条件的调查研究＞

[0294] 实施例10中，对于蛋白脱糖后的热失活条件进行调查研究。

[0295] 具体而言，在与实施例9同样地调制的蛋白中分别添加15U本发明的蛋白质以及葡萄糖氧化酶，进行5小时脱糖反应。将脱糖反应后的蛋白100μL在54、56、58℃的温度下分别热处理1、3、5、8分钟后进行冰冷却，测定各酶的残留活性。

[0296] 54℃的结果示于图7，56℃的结果示于图8，58℃的结果示于图9。如图7～9的代图图表所示，虽然在54以及56℃进行加热处理的情况下，本发明的蛋白质以及葡萄糖氧化酶均未见活性下降，但是在58℃加热处理5分钟以上的情况下，与葡萄糖氧化酶相比，本发明的蛋白质的活性明显降低。

[0297] ＜实施例11：面包的制备＞

[0298] 实施例11中，使用上述实施例1中精制的蛋白质、葡萄糖氧化酶(“Hyderase 15”天野酶制品株式会社制)以及半纤维素酶(“Hemicellulase“AMANO”90”天野酶制品株式会社制)，进行面包的制备。

[0299] (1)面包的调制方法

[0300] 分别调制山型面包用基本材料(强力粉260g；白砂糖10.9g；食盐5.2g；起酥油7.8g；脱脂奶粉7.8g；干酵母3.1g；精制水192ml)或在这些材料中添加上述实施例1中精制的蛋白质10U而得到的材料、同样地在这些材料中添加上述实施例1中精制的蛋白质10U和半纤维素酶100ppm而得到的材料、添加葡萄糖氧化酶10U而得到的材料，提供到家用面包机SD‐BMS102(松下株式会社制)中。

[0301] (2)物性测定

[0302] 测定烤好的各样品的面包重量、体积(菜籽取代法)。另外，烤好2小时后测定体积(菜籽取代法)，将各样品面包分别放入塑料袋中，用橡皮筋扎口，在25℃保管4天。保管第1日将面包切成2cm的厚度。保管第1日和第4日将面包的中央部切成直径47mm的圆柱状。以使用SUN RHEO METER COMPAC－100II(株式会社Sun科学制)以1mm/秒的压缩速度压缩10mm时的最大荷重测定各样品面包的硬度。

[0303] (3)结果

[0304] 将上述测定的体积示于图10，将面包的硬度示于图11。如图10以及11所示，与葡萄糖氧化酶相比，使用本发明的蛋白质的面包体积缩小，硬度增加。这意味着坯料的紧缩效果强。即，可知如果使用本发明的蛋白质，则与现有的葡萄糖氧化酶相比，少量即可改善面包的物性。另外，通过与半纤维素酶并用能够制成与不添加酶相同程度的体积。还可知与葡萄糖氧化酶相比，使用本发明的蛋白质的面包坯料发粘减少，不易附着于机械，制备时的操作性提高。

[0305] ＜实施例12：面包坯料(面坯)的物性改性＞

[0306] 实施例12中，使用上述实施例1中精制的蛋白质、葡萄糖氧化酶(“Hyderase 15”天野酶制品株式会社制)以及半纤维素酶(“Hemicellulase“AMANO”90”天野酶制品株式会社制)，进行面包的制备。

[0307] (1)面包坯料的调制方法

[0308] 分别调制山型面包用基本材料(强力粉260g；白砂糖10.9g；食盐5.2g；起酥油7.8g；脱脂奶粉7.8g；干酵母3.1g；精制水192ml)或在这些材料中添加上述实施例1中精制的蛋白质17U而得到的材料、同样地在这些材料中添加上述葡萄糖氧化酶17U而得到的材料、添加半纤维素酶50ppm而得到的材料、添加抗坏血酸50ppm而得到的材料，提供到家用面包机SD－BMS102(松下株式会社制)中。以面包坯料进程启动，结束1小时后，取出面包坯料，放入Tosron密闭容器(方型)中，于室温放置30分钟。

[0309] (2)结果

[0310] 上述调制的坯料的操作容易性示于下述表5。

[0311] [表5]

[0312] 面包坯料的操作容易性

[0313]无添加 △
糖质氧化酶 ○
葡萄糖氧化酶 △
半纤维素酶 ×
抗坏血酸 ○

[0314] ○：操作性良好

[0315] △：略难操作

[0316] ×：发粘而难以操作

[0317] 如表5所示，添加了本发明的蛋白质、抗坏血酸的坯料不会粘附于机械，能够顺利地取出。另一方面，可知添加了葡萄糖氧化酶的坯料略粘，添加了半纤维素酶的坯料非常粘，残留在手上，制备时的操作性差。进而，如果用肉眼观察添加了本发明的蛋白质的坯料，则可以确认呈现网格状。

[0318] ＜实施例13：乳糖酸的制备＞

[0319] 实施例13中，使用上述实施例1中精制的蛋白质，制备乳糖酸。

[0320] (1)乳糖酸的制备

[0321] 添加3ml包含乳糖一水合物0.75g、碳酸钙0.225g、上述实施例1中精制的蛋白质3U的溶液，在40℃、160rpm的条件下振荡23小时。

[0322] (2)乳糖酸生成的确认

[0323] 将反应后的样品煮沸10分钟后，以15,000rpm离心10分钟。将得到的上清液用0.45μm的滤纸过滤，供HPLC分析。HPLC分析条件如下述表6所示。

[0324] [表6]

[0325]柱 TSKgel Amide-80 5μm
缓冲液 40mM柠檬酸-柠檬酸钠(pH5.0)/乙腈＝40/60
流速 1mL/min
温度 40℃
进样 10μl
检测 差示折射率检测

[0326] 上述分析的结果示于图12。如图12所示，可以确认乳糖酸的生成。由该结果证明，能够使用本发明的蛋白质基于酶法制备乳糖酸。

[0327] ＜实施例14：编码来自顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055的糖质氧化酶的基因片段的取得＞

[0328] (a)染色体DNA的分离

[0329] 使用放入了下述表7所示的YPD培养基100ml的坂口烧瓶，将顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055在25℃培养3天后，使用布氏漏斗以及Nutsche吸滤瓶对培养液进行过滤，得到菌体。

[0330] [表7]

[0331] YPD营养基

[0332]  (W/V)
酵母提取液 1.00％
胨 2.00％
葡萄糖 2.00％

[0333] 将上述得到的菌体在－80℃冻结后，将冻干得到的重量约0.3g的菌体用药匙1杯的海沙和乳钵、研磨棒进行破碎，混悬到12ml提取缓冲液(1％十六烷基三甲基溴化铵、0.7M氯化钠、50mM Tris‐盐酸(pH8.0)、10mM EDTA、1％巯基乙醇)中。在室温继续旋转搅拌30分钟后，加入等量的苯酚：氯仿：异戊基醇(25：24：1)溶液，进行搅拌、离心分离(1,500g、5分钟、室温)，得到上清液。在得到的上清液中加入氯仿：异戊基醇(24：1)溶液，进行搅拌、离心分离(1，500g、5分钟、室温)，得到上清液。在得到的上清液中缓慢地加入等量的异丙醇。将通过处理而析出的染色体DNA离心分离(20，000rpm、10分钟、4℃)，将得到的沉淀用70％乙醇清洗，进行真空干燥。将由此得到的染色体DNA再溶解到TE 4ml中，加入10mg/ml RNaseA(Sigma-Aldrich株式会社制)200μl后，在37℃培养30分钟。接下来，加入20mg/ml蛋白酶K,重组体,PCR级(罗氏应用科学(Roche·Applied Science)株式会社制)溶液40μl，在37℃培养30分钟后，加入等量的苯酚：氯仿：异戊基醇(25：24：1)溶液。搅拌后，进行离心分离(1,500g、5分钟、室温)，得到上清液。将该清洗操作重复二次后，在得到的上清液中加入氯仿：
异戊基醇(24：1)溶液，进行搅拌、离心分离(1,500g、5分钟、室温)。对得到的上清液加入1/
10容量的3M NaOAc(pH 4.8)和2倍容量的乙醇，在－80℃冷却，由此使染色体DNA析出。将析出的染色体DNA通过离心分离(20,000rpm、10分钟、4℃)回收。将回收的染色体DNA用70％乙醇清洗后，使其真空干燥，最后溶解到400μl的TE溶液中，得到浓度约1mg/ml的染色体DNA。

[0334] (b)部分氨基酸序列的确定

[0335] 将上述实施例1中精制的蛋白质供氨基酸序列解析，确定内部氨基酸序列(序列号1、2、3)。

[0336] (c)基于PCR制作DNA探针

[0337] 基于内部氨基酸序列合成2种混合低聚核苷酸(序列号4、5)，制成PCR引物。使用这些引物，以顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055的染色体DNA为模板，在以下的条件下进行PCR反应。

[0338] ＜PCR反应液＞

[0339] 10×PCR反应缓冲液(TaKaRa公司制)5.0μL

[0340] dNTP混合液(分别2.5mM、TaKaRa公司制)8.0μL

[0341] 25mM MgCl25.0μL

[0342] 50μM正向·引物0.5μL

[0343] 50μM反向引物0.5μL

[0344] 蒸馏水29.5μL

[0345] 染色体DNA溶液(100μg/mL)1.0μL

[0346] La Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司制)0.5μL

[0347] ＜PCR反应条件＞

[0348] 阶段1：变性(94℃、1分钟)1循环

[0349] 阶段2：变性(94℃、30秒)30循环

[0350] 退火(55℃、30秒)

[0351] 延伸(72℃、1.5分钟)

[0352] 阶段3：延伸(72℃、3分钟)1循环

[0353] 将得到的约1kb的DNA片段克隆到pGEM－T easy(Promega公司制)上后，确认了碱基序列时，在正向引物之后和反向引物之前发现了编码上述部分氨基酸序列的碱基序列。将本DNA片段作为用于全长基因克隆的DNA探针。

[0354] (d)基因文库的制作

[0355] 顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055的染色体DNA的Southern杂交解析结果，确认在XbaI分解物中与探针DNA杂交的约3kb的单一条带。为了克隆该约3kb的XbaIDNA片段，如下所述地制作基因文库。

[0356] 进行上述(a)中调制的染色体DNA的XbaI处理。将染色体DNA 50μg、10×M缓冲液40μL、10×BSA缓冲液40μL、蒸馏水302.0μL、以及XbaI 8.0μL混合，在37℃处理15小时。将得到的分解物连接于实施了XbaI处理的pUC19载体(TaKaRa公司制)，得到基因文库。

[0357] (e)基因文库的筛选

[0358] 将上述(c)中得到1kb的DNA片段使用DIG－High Prime(Roche公司制)进行标记。以此为DNA探针，通过菌落·杂交对(d)中得到的基因文库进行筛选。由得到的阳性菌落得到质粒pUCGOOX。

[0359] (f)碱基序列的确定

[0360] 根据常规方法确定上述得到的质粒pUCGOOX的碱基序列。编码来自顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055的糖质氧化酶的碱基序列(1681bp)示于序列号6。

[0361] ＜实施例15：编码来自顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055的糖质氧化酶的cDNA片段的取得＞

[0362] (a)mRNA的分离

[0363] 在上述实施例1中记载的培养条件下将顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055在25℃培养3天后，使用布氏漏斗以及Nutsche吸滤瓶对培养液进行过滤，得到菌体。使用该菌体，通过RNeasy Plant Mini Kit(株式会社QIAGEN制)对总RNA进行提取。将得到的总RNA供于GenElute(注册商标)mRNA Miniprep Kit(Sigma-Aldrich株式会社制)，得到mRNA。

[0364] (b)RT－PCR

[0365] 基于上述实施例14中得到的编码来自顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055的糖质氧化酶的碱基序列(1681bp)(序列号6)，合成2种低聚核苷酸(序列号7、8)，作为PCR引物。以上述(a)中得到的mRNA为模板，使用PrimeScript High Fidelity RT－PCR Kit(TaKaRa公司制)，在以下的条件下进行RT－PCR反应。

[0366] ＜模板RNA的变性、退火反应液＞

[0367] dNTP混合液(分别10mM、TaKaRa公司制)1.0μL

[0368] 2μM反向引物1.0μL

[0369] mRNA溶液4.0μL

[0370] 无RNase dH2O 4.0μL

[0371] ＜模板RNA的变性、退火条件＞

[0372] 阶段1：变性(65℃、5分钟)1循环

[0373] 阶段2：冷却(4℃、∞)1循环

[0374] ＜模板RNA的逆转录反应液＞

[0375] 变性、退火完成的反应液10μL

[0376] 5×PrimeScript缓冲液(TaKaRa公司制)4μL

[0377] RNase抑制剂(40U/μL)(TaKaRa公司制)0.5μL

[0378] PrimeScript RTase(供2步)(TaKaRa公司制)0.5μL

[0379] 无RNase dH2O 5μL

[0380] ＜模板RNA的逆转录反应条件＞

[0381] 阶段1：42℃、30分钟1循环

[0382] 阶段2：95℃、5分钟1循环

[0383] 阶段3：4℃、∞1循环

[0384] ＜PCR反应液＞

[0385] PrimeSTAR Max Premix(2×)(TaKaRa公司制)50μL

[0386] 20μM正向引物1μL

[0387] 20μM反向引物1μL

[0388] 逆转录反应液5μL

[0389] 灭菌水43μL

[0390] ＜PCR反应条件＞

[0391] 阶段1：变性(98℃、10秒)30循环

[0392] 退火(55℃、5秒)

[0393] 延伸(72℃、2分钟)

[0394] (c)碱基序列的确定

[0395] 将得到的约1.5kb的DNA片段克隆到SmaI处理后的pBluescript II KS+载体(Stratagene公司制)中后，根据常规方法，确定得到的质粒pUCcGOOX的碱基序列。编码来自顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055的糖质氧化酶的cDNA(1518bp)示于序列号9。序列号9所编码的氨基酸序列(氨基酸)示于序列号10。在该氨基酸序列中发现前述实施例15(b)中确定的内部氨基酸序列(序列号1、2、3)。

[0396] ＜实施例16：来自顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055的糖质氧化酶在丝状菌中的表达＞

[0397] (a)表达质粒的构建

[0398] 使用上述实施例15中使用的2种低聚核苷酸(序列号7、8)，为了在曲霉宿主细胞中表达而以编码来自顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)NBRC30055的糖质氧化酶的cDNA为模板，在以下的条件下进行PCR反应。

[0399] ＜PCR反应液＞

[0400] PrimeSTAR Max Premix(2×)(TaKaRa公司制)25μL

[0401] 20μM正向引物1μL

[0402] 20μM反向引物1μL

[0403] 质粒pUCcGOOX 1μL

[0404] 灭菌水22μL

[0405] ＜PCR反应条件＞

[0406] 阶段1：变性(98℃、10秒)33循环

[0407] 退火(55℃、5秒)

[0408] 延伸(72℃、15秒)

[0409] 通过琼脂糖凝胶电泳确认得到的DNA片段后，用NucleoSpinExtractII(日本Genetics公司制)进行精制。

[0410] 表达载体pCSFGP作为调节序列含有日本专利第4495904号中记载的改变启动子以及来自米曲霉BB‐56的黄素腺嘌呤二核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶终止子、以及用于真菌转染的来自可选择标记物米曲霉BB‐56的pyrG基因。该表达载体还含有用于在大肠杆菌中进行选择的amp基因。

[0411] 对上述得到的DNA片段进行磷酸化处理，在pCSFGP中克隆化而生成表达质粒pCSGOOXG。构筑的质粒pCSGOOXG示于图13。

[0412] 使表达质粒在大肠杆菌JM109适合细胞(TaKaRa公司制)中转染。分离含有正确的质粒的转染体，得到质粒DNA。

[0413] (b)糖质氧化酶在丝状菌中的表达

[0414] 如下所述地基于上述得到的表达质粒pCSGOOXG进行米曲霉转染。将作为pyrG基因缺损株的米曲霉BB‐56pyrG‐用在上述表7所示的培养基中添加0.2％尿嘧啶核苷、0.1％尿嘧啶而得的培养基于30℃振荡培养一夜后，将得到的菌体混悬在细胞壁溶解液(20mg/ml Yatalase(TaKaRa公司制)、0.3mg/ml Novozym－234(Novozymes公司)、0.8M氯化钠、10mM磷酸缓冲液(pH 6.0))中，于30℃缓慢振荡1～2小时，由此使其原生质体化。将含有原生质体的混悬液用尼龙滤纸过滤，除去残留的菌体。

[0415] 另外，米曲霉BB‐56pyrG‐通过以BB‐56为亲株，根据Mol.Gen.Genet.(1987)210：460－461分离5‐氟乳清酸(5‐FOA)的抗药性株后，筛选尿嘧啶核苷要求性突变株而得到。

[0416] 米曲霉BB‐56如下所述地保藏。

[0417] 保藏机构：NITE生物技术本部专利微生物保藏中心(〒292‐0818日本国千叶县木更津市上总镰足2‐5‐8)

[0418] 保藏日(收到日)：2006年5月17日

[0419] 保藏号：NITE BP‐236

[0420] 接下来使用通过上述方法得到的原生质体，根据Turner等的方法(Gene，36，321－331(1985))进行感受态细胞的调制以及转染，得到几十株在不含尿嘧啶核苷的Czapek-Dox培养基(0.2％NaNO3、0.1％KH2PO4、0.05％KCl、0.05％MgSO4·7H2O、2％葡萄糖(pH 5.5))中能够生育的转染体。

[0421] 将得到的转染体在上述实施例1中记载的培养条件下于30℃培养5天。培养后，将培养液用No.2的滤纸(ADVANTEC东洋制)过滤，由此回收培养滤液。

[0422] (c)糖质氧化酶的表达确认

[0423] 将得到的样品供到SDS‐PAGE中。结果，如图14所示，pCSGOOXG中在约63kDa附近确认有认为是糖质氧化酶的有意义的蛋白质生产。作为对象的米曲霉BB‐56的培养滤液中没有确认有同样的蛋白质的生产，所以认为本蛋白质是糖质氧化酶cDNA所导入的。

[0424] 另外，对于相同的样品，基于上述糖质氧化酶活性测定法进行活性测定而得的结果示于以下的表8。

[0425] [表8]

[0426]糖质氧化酶活性 (U/ml)
pCSGOOXG 4.2
米曲酶BB-56 0

[0427] 如表8所示，通过导入糖质氧化酶cDNA而得到的蛋白质与对照相比检测到明显的糖质氧化酶活性，确认目标糖质氧化酶表达。