重组蛋白质、含有该重组蛋白质的医药组成物及该重组蛋白质的制备方法 |
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申请号 | CN201310006604.2 | 申请日 | 2013-01-08 | 公开(公告)号 | CN103911354B | 公开(公告)日 | 2017-05-24 |
申请人 | 简宏坚; | 发明人 | 简宏坚; | ||||
摘要 | 本 发明 提供一种含有 生物 活性胜肽的重组 蛋白质 、含有该重组蛋白质的医药组成物以及该重组蛋白质的制备方法,其将连续多套的生物活性胜肽置换于一个蛋白质中,再由无毒性安全可食用的 酵母 菌大量生产富含连续多套生物活性胜肽的高浓度胜肽蛋白。 | ||||||
权利要求 | 1.一种重组蛋白质,包含有: |
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说明书全文 | 重组蛋白质、含有该重组蛋白质的医药组成物及该重组蛋白质的制备方法 技术领域背景技术[0002] 胜肽大小是介于胺基酸和蛋白质之间。胺基酸的分子最小,蛋白质最大,两个或以上的胺基酸脱水缩合形成若干个胜肽键从而组成一个胜肽,多个胜肽进行多次脱水缩合就组成一个蛋白质分子。相反的,蛋白质可以被蛋白水解酶水解为蛋白质片段,因此蛋白质也被称为「多胜肽」,胜肽可以小至有纳米般大小,肠胃,血管及肌肤皆极容易吸收。 [0003] 胜肽从功能上可以区分为营养性胜肽以及功能性胜肽,营养性胜肽可提供动物或人体所需胺基酸的来源,功能性胜肽又称做生物活性胜肽,能够在动物或人体内造成特定的生理效果,且应用范围相当广泛。 [0004] 目前生物活性胜肽的生产是利用不同的食用性蛋白,透过蛋白水解酶水解而得,又或是在生产少于5个胺基酸的短链胜肽时,用一个胺基酸黏接另一个胺基酸的方式而成。但是这些方式所生产的生物活性胜肽产量很少,造成产量不足而拉高制备成本的现象。所以当这些生物活性胜肽被制成药品、健康食品或化妆品原料的时候,一般厂商在考虑成本及售价下,所使用的浓度也未达到最佳有效剂量,从而无法显示出这些生物活性胜肽在人体中的功能性,亦无法提供预防或治疗疾病的用。 [0005] 事实上,这些生物活性胜肽在起初筛选功能性时,是最有效的。从实验得知,在动物试验上也一样显示出最完美的功能性来,然而到了口服或应用在人体时,就无法显示出强而有力的功能性出来。究其原因,一方面是制造厂商在产品中所下的胜肽浓度太少所致;另一方面是因口服的胜肽在人体的消化道中已经被破坏殆尽。 [0006] 先前,本发明人在中国台湾专利第I315341号「富含降三酸甘油脂的机能性胜肽的蛋白质生成方法」曾发表以淀粉水解酵素(α-amylase)为携带蛋白质,在食用菌中生产,一区插入一套「VVYP」胜肽,六区仅有六套胜肽,携带蛋白质含有胜肽的比例很低,仅有3%,蛋白质回收纯化是用Ni-NTA方法回收,回收过程含有重金属镍,会污染胜肽产物,并且又因为携带蛋白质中所携带的胜肽套数太少,导致产出的胜肽浓度低、生产时间长且仅能小量回收纯化,又有毒性,无法供给人体使用。 [0007] 因此,如何解决胜肽产量太少的问题、提高胜肽的浓度,是目前胜肽产制技术中极重要的课题。 发明内容[0008] 本发明的目的在于提供一种重组蛋白质、含有该蛋白质的医药组成物及该重组蛋白质的制备方法,以能让生物活性胜肽被巨量表现,以生产富含高浓度、高产量的生物活性胜肽蛋白,同时能有效降低其制备成本。 [0009] 为实现上述目的,本发明提供的重组蛋白质,包含有: [0010] 至少一具有连续多套生物活性胜肽的区段,其中各该生物活性胜肽是选自由GHK、SEQ ID NO:2、3、4、5所组成的群组中任一种。 [0011] 所述的重组蛋白质,其中,各该生物活性胜肽之间具有一胃蛋白酶(pepsin)切位。 [0012] 所述的重组蛋白质,其中,各该生物活性胜肽之间具有一胰蛋白酶(trypsin)切位。 [0013] 所述的重组蛋白质,其中,各该生物活性胜肽之间具有一羧肽酶B(carboxypeptidase B)切位。 [0014] 所述的重组蛋白质,其中,该生物活性胜肽的套数为3~25套。 [0015] 本发明提供的医药组成物,包含有如上所述的重组蛋白质。 [0016] 所述的医药组成物,其中,该医药组成物的剂型为选自由乳剂、膏剂、凝胶、涂剂、糊状物、油剂、软化剂、脂肪体剂型、纳米颗粒、化妆水、漱口剂、洗发水、乳液、喷剂、塞剂、胶囊、锭剂、粉末、糖浆、颗粒、溶液、悬浮液、贴片或封闭型敷贴所组成的群组中任一种。 [0017] 本发明提供的重组蛋白质的制备方法,包含有下列步骤: [0018] (a)提供一蛋白质,该蛋白质具有至少一更改置换区段以及一淀粉吸附区段; [0019] (b)将该更改置换区段与一具有连续多套生物活性胜肽的区段置换,其中各该生物活性胜肽系选自由GHK、SEQ ID NO:2、3、4、5所组成的群组中任一种; [0021] (d)以淀粉纯化出该蛋白质。 [0022] 所述的制备方法,其中,该蛋白质为人类酪氨酸羟化酶(human tyrosinehydroxylase)。 [0023] 所述的制备方法,其中,该酵母菌为耶式酵母菌(Yarrowia lipolytica)。 [0024] 所述的制备方法,还包含有下列步骤: [0026] (f)替前述5~7个胺基酸设定一不同于其它胺基酸所设定的密码子核酸序列; [0027] (g)依此不同于其它胺基酸的密码子核酸序列设计一正向引子与一反向引子,且该正向引子与该反向引子于该重迭区段具有约12~20个互补的核酸碱基; [0028] (h)利用聚合酶连锁反应把两段引子个别复制出两段序列;以及 [0029] (i)用重迭式聚合酶连锁反应技术,将两段序列重迭串联。 [0030] 本发明把连续多套生物活性胜肽置换在一个蛋白质中,再由无毒性安全可食用的酵母菌大量生产富含连续多套生物活性胜肽的高浓度胜肽蛋白,除能巨量表现此胜肽蛋白外,并能使生物活性胜肽的两端获得保护,使其可在胃中或小肠中定点切割,完整的生物活性胜肽在十二指肠中或在小肠中被吸收,行使功能性出来。附图说明 [0031] 图1是连续多套胜肽置换设定示意图。 [0032] 图2是帮助睡眠胜肽「YLGYLEQLLR」置换于人体酪氨酸羟化酶中的定序结果。其中黄色表示可更改置换区段,共有5个可更改置换区段,而红色表示原有胺基酸区段,浅蓝色表示结合淀粉的区段。 [0033] 图3是利用中子撞击质谱仪LC-MS-MS确定胜肽胺基酸序列的结果。 [0034] 图4是生物活性胜肽「CDALQEIAR」于胃蛋白酶(pepsin)的切位示意图。 [0035] 图5是生物活性胜肽「VVYP」于胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptide B)的切位示意图。 [0036] 图6是生物活性胜肽「YLGYLEQLLR」于胰蛋白酶(trypsin)的切位示意图。 [0037] 图7是用于帮助睡眠的「YLGYLEQLLR」胜肽蛋白与无保护裸露胜肽经唾液、胃液和肠液分解后的SDS-PAGE电泳示意图。第1和第2道是胜肽蛋白,第3和4道是无保护裸露的胜肽。第2和4道是经唾液、胃液和肠液分解。 [0038] 图8是本发明的制备方法所生成的生物活性胜肽蛋白给SD大鼠口服的生长曲线示意图。大鼠体重水平以平均值表示,并通过单向方差分析(ANOVA)。使用Dunnett′s t-test多重比较方式来评估胜肽蛋白实验组与对照组之间的差异,所有P>0.05是与对照值的比较结果。 具体实施方式[0039] 本发明提供的重组蛋白质,包含有至少一具有连续多套生物活性胜肽的区段,其中各该生物活性胜肽是选自由GHK、SEQ ID NO:2、3、4、5所组成的群组中任一种。由此,把多套生物活性胜肽放在一个蛋白质中,以大量生产富含生物活性胜肽的胜肽蛋白,达到高浓度、高产量的生产,同时降低制备成本。 [0040] 于本发明的一较佳实施例中,各该生物活性胜肽之间可具有一胃蛋白酶(pepsin)或一胰蛋白酶(trypsin)或一羧肽酶B(carboxypeptidase B)切位,让生物活性胜肽的两端获得保护,使其可在胃中或小肠中定点切割、释放、被吸收,以行使其功能性出来。 [0041] 本发明另提供一种医药组成物,包含有如上所述的重组蛋白质,以此应用于医药领域。 [0042] 于本发明的另一较佳实施例中,该医药组成物的剂型可选自由乳剂、膏剂、凝胶、涂剂、糊状物、油剂、软化剂、脂肪体剂型、纳米颗粒、化妆水、漱口剂、洗发水、乳液、喷剂、塞剂、胶囊、锭剂、粉末、糖浆、颗粒、溶液、悬浮液、贴片或封闭型敷贴所组成的群组中任一种,藉此应用于医药领域。 [0043] 本发明再提供一种重组蛋白质的制备方法,包含有下列步骤: [0044] (a)提供一蛋白质,该蛋白质具有至少一更改置换区段以及一淀粉吸附区段; [0045] (b)将该更改置换区段与一具有连续多套生物活性胜肽的区段置换,其中各该生物活性胜肽是选自由GHK、SEQ ID NO:2、3、4、5所组成的群组中任一种; [0046] (c)转殖置换后的该蛋白质至一酵母菌表现系统进行发酵;以及(d)以淀粉纯化出该蛋白质。由此,把连续多套生物活性胜肽放在一个蛋白质中,以大量生产富含生物活性胜肽的胜肽蛋白,达到高浓度、高产量的生产,同时降低制备成本。 [0047] 于本发明的又一较佳实施例中,该蛋白质为人类酪氨酸羟化酶(humantyrosine hydroxylase),以达到安全、无毒、可食用的效果。 [0048] 于本发明的再一较佳实施例中,该酵母菌为耶式酵母菌(Yarrowialipolytica),以达到安全、无毒、可食用的效果。 [0049] 于本发明的其他较佳实施例中,还包含有下列步骤: [0050] (e)选定在该多套生物活性胜肽区段大致中间位置的5~7个胺基酸为一重迭区段; [0051] (f)替前述5~7个胺基酸设定一不同于其它胺基酸所设定的密码子核酸序列; [0052] (g)依此不同于其它胺基酸的密码子核酸序列设计一正向引子与一反向引子,且该正向引子与该反向引子于该重迭区段具有约12~20个互补的核酸碱基; [0053] (h)利用聚合酶连锁反应把两段引子个别复制出两段序列;以及 [0054] (i)用重迭式聚合酶连锁反应技术,将两段序列重迭串联,以此将连续多套生物活性胜肽的核酸序列复制出来,而不会造成胜肽套数的减少。 [0055] 有关本发明的详细构造、特点、组装方式或使用方式,将于后续的详细说明中予以描述。然而,在本发明领域中具有通常知识者应能了解,该些详细说明以及实施本发明所列举的特定实施例或实验例,仅用于说明本发明,并非用以限制本发明的专利申请范围。 [0056] 以下将由所列举的实施例以及实验例,配合附图详细说明本发明的技术内容及特征。 [0057] 实验一:携带蛋白质的筛选 [0058] 首先,需挑选可供携带胜肽的蛋白质,该蛋白质最好是选自人体的蛋白质,因人体的蛋白质最容易在无毒性安全、可食用的酵母菌中被大量表现生产出来,再者该蛋白质的胺基酸序列要含有吸附淀粉的序列区段,供用于将食用级玉米淀粉回收纯化生产胜肽蛋白。 [0059] 由实验数据显示人类的酪氨酸羟化酶(human tyrosine hydroxylase;HTH)在无内毒素、安全可食用酵母菌内进行表现,结果最好最稳定,用淀粉回收纯化1公升的发酵液,可纯化出200公克以上的胜肽蛋白。相较于利用米曲菌(Aspergillus oryzae)的淀粉酶(α-amylase)当携带蛋白质,1公升发酵液,仅能纯化出25公克的胜肽蛋白。 [0060] 故本发明以人类酪氨酸羟化酶作为主要实施例,其含有497个胺基酸(NCBI注册号:AAI43612,SEQ ID NO:1),N端的前20个胺基酸1~20以及淀粉吸附的序列区段314~477,共有163个胺基酸不可更改,使用原有的胺基酸序列。其余有314个胺基酸包括21~70、 81~130、141~190、201~250、261~310等五个区段,可以置换成所要表现的生物活性胜肽的胺基酸序列。 [0061] 实验二:连续多套生物活性胜肽的置换 [0062] 在完成携带蛋白质的选取后,则将生物活性胜肽的胺基酸序列置换于前述蛋白质的胺基酸序列中。由于目前生物活性胜肽的胺基酸数目不会超过50个胺基酸,所以可将50个左右的胺基酸作为一个更改置换区段,两个更改置换区段中间具有10个原有的胺基酸序列,利用10个原有胺基酸序列,将更改置换区段串联起来。 [0063] 314个胺基酸可区分成5个更改置换区段以及4个原有胺基酸区段,每个更改置换区段含有50个左右的胺基酸,并且每个原有胺基酸区段含有10个原有胺基酸。若以含有10个胺基酸的生物活性胜肽为例子,每个可更改置换区段就含有连续5套的胜肽,有5组更改置换区段,总共有25套的该胜肽。而生产一个胜肽蛋白就可含有25套生物活性胜肽,相较于现有以食用蛋白水解产制所得的胜肽增加了25倍的浓度。 [0064] 1、连续多套胜肽的制备 [0065] 更改置换区段含连续多套胜肽的制备,以含有3个胺基酸的生发胜肽「GHK」为例子,每个可更改置换区段就可设定含有连续12套的胜肽。 [0066] 如图1所示,用连续3套、4套以及5套的制备为例,先选定大约在中间位置的5-7个胺基酸为重迭的区段,这5-7个胺基酸所设定的密码子核酸序列,不同于其它胺基酸所设定的密码子核酸序列,且该正向引子与该反向引子于该重迭区段具有约12~20个互补的核酸碱基。再把正向引子设定核酸序列合成制造出来,同样反向引子设定核酸序列合成制造出来,最后再用聚合酶连锁反应技术把两段引子个别复制出来,之后用重迭式聚合酶连锁反应技术,将两段的序列重迭串联起来形成连续3套、连续4套或连续5套胜肽的核酸序列。不管复制连续多少套胜肽的核酸序列,最重要的是在约中间区段的5-7个胺基酸设定为重迭区段,以上的技术就很容易将连续多套胜肽的核酸序列复制出来,不会造成胜肽套数的减少。 [0067] 另以帮助睡眠胜肽「YLGYLEQLLR」(SEQ ID NO:2)的置换为例,依照上述的制备方法设计出连续5套的胜肽序列后,把胜肽的胺基酸序列转换为核酸序列,利用重迭聚合酶链反应(overlap-PCR)一一将每个更改置换区段建立完成,再将两两更改置换区段串连起来,5个更改置换区段和4个原有胺基酸区段完整串连起来,这个过程中每一个更改置换区段建立好之后,皆用核酸定序仪检验核酸序列的正确性,之后将完整正确的胜肽蛋白核酸序列选殖入酵母菌的胞外分泌基因表现系统中,再转型入无毒性安全可食用酵母菌染色体的 5S-rDNA基因上,就可以进行发酵生产。 [0068] 图2所示为帮助睡眠胜肽「YLGYLEQLLR」置换于人体酪氨酸羟化酶中的定序结果,其中共有5个区段,314个胺基酸被更改置换成帮助睡眠胜肽「YLGYLEQLLR」的胺基酸序列,亦即于最终的蛋白质产物中包含有5组连续5套,总和为25套的帮助睡眠胜肽「YLGYLEQLLR」。其他以本方法所生产的生物活性胜肽,例如用于降低高血糖的「CDALQEIAR」(SEQ ID NO:3)及用于降低高三酸甘油脂的「VVYP」(SEQ ID NO:4),其胜肽的核苷酸序列皆可以此方法制备出连续多套的生物活性胜肽序列。 [0069] 2、胜肽保护机制的设计 [0070] 我们也发现生物活性胜肽蛋白吃进体内时,胃中的胃蛋白酶(pepsin),切位是内切在苯丙氨酸(phenylalanine)的N端和C端,如图4所示的用于降低高血糖胜肽「CDALQEIAR」(SEQ ID NO:5),其头尾各加F,形成「FCDALQEIARF」的设计,胃蛋白酶切在F的两端而释出多套「CDALQEIAR」胜肽;在小肠中的胰蛋白酶(trypsin),切位是内切在精胺酸(arginine)和离氨酸(lysine)的C端,如图5所示的用于降低高三酸甘油脂的「VVYP」胜肽,其头尾各加K/R,形成「K/R VVYP K/R」的设计,胰蛋白酶切在K/R的C端而释出多套「VVYP K/R」胜肽,以及小肠中另一内切蛋白酶是羧肽酶B(carboxypeptidase B),切位是内切在脯氨酸(proline)的C端;再将「VVYP R/K」的R/K切掉释出「VVYP」胜肽;如图6的用于帮助睡眠的「YLGYLEQLLR」胜肽,其连续多套胜肽的N端多加R,形成「RYLGYLEQLLRYL......」的设计,胰蛋白酶切在R的C端而释出多套「YLGYLEQLLR」胜肽,以上这三种内切蛋白酶的切位最精准最为有效,可将胜肽蛋白中连续多套胜肽一一切出,最为可靠,在体内完全地释放出该些胜肽的功能性。 [0071] 实验三:胜肽蛋白的转殖与表现 [0072] 在经过将连续多套生物活性胜肽置换于携带蛋白质后,使用YLEX表现套组(YLEX expression kit,益生生技,中国台湾)进一步将该些胜肽蛋白的基因重组转入酵母菌中,该酵母菌是选自具生物安全性,且不会产生内毒素的耶式酵母菌(Yarrowia lipolytica),其是将前述多组胜肽蛋白的基因重组转入该酵母菌染色体的5S-rRNA的基因上。 [0073] 经实验测定出来有82组胜肽蛋白的基因重组转入82套酵母菌的5S-RNA基因上,因此1颗酵母菌基本上可以生产40乘82等于3280个胜肽蛋白的产量,而经发酵后,实际上1公升的酵母菌发酵液可以生产最少200克的胜肽蛋白,其中胜肽占完整胜肽蛋白的比例为60%,因此200克的胜肽蛋白就有120克是属于胜肽的部分。 [0074] 我们将生产出来的帮助睡眠胜肽蛋白,利用胰蛋白酶将胜肽切出来,再利用中子撞击质谱仪LC-MS-MS,将胜肽的胺基酸序列确定出来,如图3所示,结果显示为「YLGYLEQLLR」,完全符合当初的设计。此一帮助睡眠的胜肽蛋白,因当初设计帮助睡眠胜肽蛋白的胜肽部分是有被保护,口服之后一直到小肠内,由胰蛋白酶将胜肽切出,紧接着胜肽就被小肠吸收,行使生物功能性。 [0075] 其他以本方法所生产的胜肽蛋白,如用于降低高血糖的「CDALQEIAR」及用于降低高三酸甘油脂的「VVYP」,其胜肽的胺基酸序列皆可以此方式确定的。 [0076] 据此,由本发明的蛋白质设计与制备方法,确定可以将生物活性胜肽蛋白生产出来,实验结果显示1公升发酵液最少可用淀粉吸附纯化回收到200克,且由于胜肽有被保护,以及连续多套胜肽的设定,一直到十二指肠或小肠吸收的前连续多套胜肽才被切开释放出来,不像食用蛋白经由蛋白脢水解而释出的无保护裸露胜肽一样一天要使用到200~300毫克,也没有立即的效果出现,理由是无保护裸露胜肽在口中或胃中甚至到小肠中就被蛋白外切酶或是酸性破坏殆尽,因此真正吸收进入十二指肠或小肠中几乎微乎其微,这是利用本发明的制备方法设计生产的胜肽蛋白相较于前案技术优越的地方。 [0077] 根据实验,将等量的「YLGYLEQLLR」胜肽蛋白以及裸露胜肽分别由唾液分解5分钟后,紧接着胃液分解30分钟,再由肠液分解30分钟,之后由SDS-PAGE电泳展开显示,如图7所示,发现胜肽蛋白从唾液分解,接着胃液分解,再由肠液分解,仍然有胜肽存在,然而无保护裸露胜肽经由唾液分解,紧接着胃液分解,再由肠液分解,就被完全分解殆尽,在电泳胶上完全消失。 [0078] 实验四:生物安全性测试 [0079] 经过生物安全性试验的评估,促使胜肽蛋白取代无保护裸露胜肽成为可商品化的有效的保健食品以及蛋白性药物。而依据世界卫生组织的指导原则,以急性(单一剂量5000mg/kg)和亚急性(单一剂量1000mg/Kg,连续给30天)的毒性试验设计,给与Sprague-Dawley(SD)大鼠口服胜肽,来观察对生化、造血系统,以及组织病理学的影响。 [0080] 如图8所示,是SD大鼠经过45天口服胜肽蛋白处理的生长曲线。体重水平作为平均值,并通过单向方差分析(ANOVA)测试进行了分析。使用多重比较的Dunnett’t-test来检验含胜肽蛋白和对照组之间并无统计学的差异。 [0081] 且由表一、表二及表三可以发现不论淀粉液化酶(α-amylase)或酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase)当作携带蛋白质所生产出来的胜肽,不论是固态或液态胜肽蛋白以大鼠来探讨使用的剂量,急性(5g/Kg)和亚急性(1g/Kg,连续给30天)毒性试验,在急性毒性试验中没有造成任何的毒性或死亡,在亚急性毒性试验中,利用血液学、免疫学和生化学的参数检验并没有造成体内脏器的伤害。由以上数据显示,运用本发明所产出的生物活性胜肽蛋白确实无毒性无副作用,本发明的胜肽蛋白可作为医药组成物。 [0082] 实验五:生物功能性测试 [0083] 本发明利用无毒性安全可食用酵母菌生产出来的各式各类胜肽蛋白,经过测试后发现完全无毒无过敏现象无副作用,且具有其良好生物功能性出来,如表四至表七。以本发明所生成的降三酸甘油脂胜肽蛋白含VVYP胜肽,和降血糖胜肽蛋白含「CDALQEIAR」胜肽以及帮助睡眠胜肽蛋白含「YLGYLEQLLR」胜肽,并进行功能性测试,其中降三酸甘油脂胜肽「VVYP」给17位自愿者试吃1个月,三酸甘油脂减少了45.3%,体重减少了6.3%。 [0084] 由此可知,生物活性胜肽要显现出生物活性出来,有效浓度是最重要的关键,因此把胜肽置换到蛋白当中,不仅两端有保护,不易被破坏分解,也能在一蛋白分子当中安排连续多套(如25套)胜肽,增加浓度,并且搭配基因表现技术以及多组(如82组)基因插入染色体中同时表现,产量非常惊人。此一创新胜肽蛋白科技,才能促使生物活性胜肽成为有效的蛋白性药物。 [0085] 综上,本发明是利用生物安全系统的酵母菌,也不会产生内毒素的医药等级的下生产胜肽蛋白,简单讲是把连续多套生物活性胜肽置换在一个蛋白质中,再由无毒性安全可食用的酵母菌大量生产富含连续多套生物活性胜肽的高浓度胜肽蛋白,除能巨量表现此胜肽蛋白外,并能使生物活性胜肽的两端获得保护,使其可在胃中或小肠中定点切割,完整的生物活性胜肽在十二指肠中或在小肠中被吸收,行使功能性出来。 [0086] 应用在医药方面,剂型可为乳剂、膏剂、凝胶、涂剂、糊状物、油剂、软化剂、脂肪体剂型、纳米颗粒、化妆水、漱口剂、洗发水、乳液、喷剂、塞剂、胶囊、锭剂、粉末、糖浆、颗粒、溶液、悬浮液、贴片或封闭型敷贴。 [0087] 应用在化妆品、保健品或健康食品等方面时,可将巨量生产出来的生物活性胜肽蛋白,以胃蛋白酶、胰蛋白脢或羧肽酶B水解后制成液体胜肽,或者是添加适当的赋形剂、食品添加剂,可增加产品的附加价值,并提升其经济效益。 [0088] 表一:本发明的制备方法所生成的生物活性胜肽蛋白给SD大鼠口服后造血系统的参数统计表 [0089] [0090] 表里数据是以15只大鼠/每组,所算出来的平均值±标准偏差。a)亚急性毒性试验是以水当对照组和以胜肽蛋白每天给予1000mg/kg大鼠的重量为实验组,进行30天后的结果;b)附属亚急性毒性试验,是以亚急性毒性试验进行30天后,停止给予胜肽蛋白,再15天后的结果。实验组与对照组之间的差异,是用Student’s t-test统计评估过。 [0091] 表二:本发明的制备方法所生成的生物活性胜肽蛋白给SD大鼠口服后血液中生化的参数统计表 [0092] [0093] 表里数据是以15只大鼠/每组,所算出来的平均值±标准偏差。a)亚急性毒性试验是以水当对照组和以胜肽蛋白每天给予1000mg/kg大鼠的重量为实验组,进行30天后的结果;b)附属亚急性毒性试验,是以亚急性毒性试验进行30天后,停止给予胜肽蛋白,再15天后的结果。实验组与对照组之间的差异,是用Student’s t-test统计评估过。 [0094] 表三:本发明的制备方法所生成的生物活性胜肽蛋白给SD大鼠口服后组织与免疫参数统计表 [0095] [0096] 表里数据代表有病变的大鼠只数,所有的P>0.05是与对照值的比对结果。 [0097] 表四:本发明的制备方法的生物活性胜肽「VVYP」的功能性显示降低血中三酸甘油脂、体重和舒张血压统计表 [0098] [0099] 而降血糖胜肽蛋白「CDALQEIAR」给20位自愿者试吃1个月,血糖降低了35.4%,持续吃可以维持血糖在80~100mg/dl之间,有水肿患者也可利尿去水肿。 [0100] 表五:是本发明的制备方法的生物活性胜肽「CDALQEIAR」的功能性显示降低血糖统计表 [0101] [0103] 表六:是本发明的制备方法的生物活性胜肽「YLGYLEQLLR」的功能性显示对睡眠质量不良影响统计表 [0104] [0105] Wilcoxson rank test检验:**P<0.01,***P<0.005(vs DO),Alpha level是使用Bonferroni不等式来调整,IQR:四分位距。 [0106] 表七:是本发明的制备方法的生物活性胜肽「YLGYLEQLLR」的功能性显示对延迟入睡的统计表。 [0107] [0108] Wilcoxson rank test检验:*P<0.05(vs DO),Alpha level是使用Bonferroni不等式来调整,IQR:四分位距。 |