首页 / 国际专利分类库 / 化学;冶金 / 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程 / 酶 / 用于抑制MASP‑2依赖的补体活化的组合物

用于抑制MASP‑2依赖的补体活化的组合物
申请号 CN201280032866.X 申请日 2012-05-04 公开(公告)号 CN103687620B 公开(公告)日 2017-10-13
申请人 奥默罗斯公司; 发明人 T.杜德勒; W.R.贡博茨; J.B.帕伦特; C.E.特德福德; A.卡夫利; U.B.黑格曼; H.里尔森; S.基普里贾诺夫;
摘要 本 发明 涉及抗MASP‑2抑制性 抗体 和包括该抗体的组合物，用于抑制MASP‑2依赖的补体活化的不良效果。在一方面，本发明提供了分离的人单克隆抗体或其 抗原 结合 片段 ，其结合人MASP‑2，所述抗体包括：（i）包括CDR‑H1、CDR‑H2和CDR‑H3序列的重链可变区；和（ii）包括CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3序列的轻链可变区，其中所述重链可变区CDR‑H3序列包括设置与B因子形成额外的替代途径C3转化酶（C3bBb）的 氨 基酸序列。替代途径C3转化酶通过结合备解素被稳定化。备解素使替代途径C3转化酶的 半衰期 延长六到十倍。向替代途径C3转化酶添加C3b导致替代途径C5转化酶的形成。
权利要求

1.分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合人MASP-2，其中所述抗体或其抗原结合片段包括：
a）重链可变区，其包括3个互补决定区（CDR），该3个互补决定区包括由氨基酸序列SEQ ID NO：28组成的CDR-H1、由氨基酸序列SEQ ID NO：32组成的CDR-H2和由氨基酸序列SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37组成的CDR-H3；和
b）轻链可变区，其包括3个CDR，该3个CDR包括由氨基酸序列SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42组成的CDR-L1、由氨基酸序列SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47组成的CDR-L2，以及由氨基酸序列SEQ ID NO：51组成的CDR-L3；
其中所述抗体或其抗原结合片段结合人MASP-2并且抑制MASP-2依赖的补体活化。
2.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、单链抗体、缺乏铰链区的单价抗体和全抗体。
3.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自IgG2分子，和IgG1分子和IgG4分子。
4.根据权利要求3的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG4分子包括S228P突变。
5.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包括SEQ ID NO:20。
6.分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合人MASP-2，包括SEQ ID NO：18所示重链可变区和SEQ ID NO：22所示轻链可变区；或包括SEQ ID NO：20所示重链可变区和SEQ ID NO：24所示轻链可变区；或包括SEQ ID NO：21所示重链可变区和SEQ ID NO：25所示轻链可变区；或包括SEQ ID NO：21所示重链可变区和SEQ ID NO：27所示轻链可变区。
7.根据权利要求6的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：20所示氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:24中描述的氨基酸序列。
8.分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性结合人MASP-2并包含：
(a) 含有SEQ ID NO：20的重链可变区或其变体，其中残基31是R、残基32是G、残基33是K、残基34是M、残基35是G、残基36是V、残基37是S、残基50是L、残基51是A、残基52是H、残基
53是I、残基54是F、残基55是S、残基56是S、残基57是D、残基58是E、残基59是K、残基60是S、残基61是Y、残基62是R、残基63是T、残基64是S、残基65是L、残基66是K、残基67是S、残基95是Y、残基96是Y、残基97是C、残基98是A、残基99是R、残基100是I、残基101是R、残基102是R或A、残基103是G、残基104是G、残基105是I、残基106是D、并且残基107是Y；和(b) 含有SEQ ID NO：24的轻链可变区或其变体，其中残基23是S、残基24是G、残基25是E或D、残基26是K、残基27是L、残基28是G、残基29是D、残基30是K、残基31是Y或F、残基32是A、残基33是Y、残基49是Q、残基50是D、残基51是K或N、残基52是Q或K、残基53是R、残基54是P、残基55是S、残基56是G、残基88是Q、残基89是A、残基90是W、残基91是D、残基92是S、残基
93是S、残基94是T、残基95是A、残基96是V、并且残基97是F。
9.权利要求8的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包含其中残基102是R的氨基酸序列。
10.权利要求8的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含其中残基25是E、残基31是Y、残基51是K、并且残基52是Q的氨基酸序列。
11.核酸分子，其编码如权利要求1、6、7或8中的单克隆抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。
12.表达盒，其包括编码根据权利要求11的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
13.细胞，其包括根据权利要求11或权利要求12中描述的的核酸分子中至少一种。
14.生成分离的抗MASP-2抗体的方法，其包括在允许编码抗MASP-2抗体的核酸分子表达的条件下培养权利要求13的细胞并分离所述抗MASP-2抗体。
15.组合物，其包括权利要求1、6、7或8中的单克隆抗体或其抗原结合片段和药学可接受的赋形剂。
16.根据权利要求15的组合物，其中所述组合物配制用于动脉内、静脉内、颅内、肌内、吸入、鼻内或皮下施用。
17.如权利要求1、6、7或8中的单克隆抗体或其抗原结合片段用于制造在需要其的受试者中抑制MASP-2依赖的补体活化的药物的用途。
18.制品，其包括适合用于对人受试者的治疗施用的权利要求1、6或7的单克隆抗体或其抗原结合片段的单位剂量，其中所述单位剂量是1mg-1000mg范围。
19.根据权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链包括SEQ ID NO:24。
20.根据权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO：28组成的CDR-H1、由氨基酸序列SEQ ID NO：32组成的CDR-H2和由氨基酸序列SEQ ID NO：37组成的CDR-H3；和其中所述轻链可变区包括由氨基酸序列SEQ ID NO：42组成的CDR-L1、由氨基酸序列SEQ ID NO：47组成的CDR-L2，以及由氨基酸序列SEQ ID NO：51组成的轻链CDR-L3。
21.根据权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中CDR-H3由SEQ ID NO: 
20的氨基酸残基95-107组成。
说明书全文

用于抑制MASP-2依赖的补体活化的组合物

发明领域

[0001] 本发明涉及抗MASP-2抑制性抗体和包括该抗体的组合物，用于抑制MASP-2依赖的补体活化的不良效果。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请请求2011年5月4日提交的美国临时申请号61/482,567的权益，其通过引用整体并入本文。
[0004] 关于序列表的声明
[0005] 本申请相关的序列表以文本格式提供代替纸件拷贝，并且据此通过引用并入说明书。包含序列表的文本文件的名称是MP_1_0115_PCT_SequenceListingasFiled_20120504_ST25。文本文件是158KB，在2012年5月4日创立，并与说明书的提交一起正经由EFS-Web提交。
[0006] 发明背景
[0007] 补体系统为在人和其它脊椎动物中启动、增强并协调对微生物感染和其它急性损伤的免疫应答提供了早期的作用机制(M.K. Liszewski和J.P. Atkinson，1993，载于Fundamental Immunology，第三版，W.E. Paul编辑，Raven Press，Ltd.，New York)。尽管补体活化提供了重要的针对潜在病原体的第一线防御，但是促进保护性免疫应答的补体活性也可以表现出对宿主的潜在威胁(K.R. Kalli等，Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994；B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994)。例如，C3和C5蛋白水解产物募集并活化嗜中性粒细胞。尽管对于宿主防御是必不可少的，但是活化的嗜中性粒细胞在它们破坏性酶的释放中是不加选择的，并可以导致器官损伤。此外，补体活化可以导致溶胞的补体成分沉积在附近的宿主细胞以及微生物靶上，导致宿主细胞裂解。
[0008] 补体系统已经与许多急性和慢性疾病状态的发病机制有牵连，所述疾病包括：心肌梗塞、中风、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、再灌注损伤、败血症性休克、热烧伤之后的毛细血管渗漏、心肺分流术后炎症、移植排斥、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力和阿尔茨海默病。在几乎所有的这些状况中，补体都不是病因，而是发病机制所涉及的若干因素之一。尽管如此，补体活化可以是重要的病理机制，并对许多这类疾病状态中的临床控制表现出有效之处。
[0009] 对各种疾病状态中补体介导的组织损伤的重要性的逐渐增加的认识加强了对有效补体抑制药物的需求。到目前，依库丽单抗（Soliris®），针对C5的抗体，是仅有的已被批准用于人使用的补体靶向药物。然而，C5是位于补体系统“下游”的几个效应物分子之一，并且阻断C5不抑制补体系统的活化。因此，补体活化的起始步骤的抑制剂将具有相对“下游”补体抑制剂的显著优势。
[0010] 目前，普遍接受补体系统可通过三种截然不同的途径被活化：经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径通常是由宿主抗体结合外源颗粒(即抗原)组成的复合物触发的，并且因此需要预先暴露于该抗原来产生特异性抗体应答。因为经典途径的活化取决于先前的宿主的获得性免疫应答，所以经典途径是获得性免疫系统的一部分。相反，凝集素途径和替代途径两者不依赖于获得性免疫，并且是先天性免疫系统的一部分。
[0011] 补体系统的活化导致丝氨酸蛋白酶酶原的顺序活化。经典途径活化的第一步是特异性识别分子C1q与结合了抗原的IgG和IgM复合物的结合。C1q与C1r和C1s丝氨酸蛋白酶酶原结合成称为C1的复合物。当C1q与免疫复合物结合时，C1r的Arg-Ile位点进行自我蛋白水解切割，随后是C1r介导的C1s切割和活化，其从而获得切割C4和C2的能力。C4切割成两个片段，称为C4a和C4b，并且，类似地，C2切割成C2a和C2b。C4b片段能够与邻近的羟基或氨基形成共价键，并且通过与活化C2的C2a片段进行非共价相互作用而生成C3转化酶(C4b2b)。C3转化酶(C4b2b)通过蛋白水解切割成C3a和C3b亚成分而活化C3，导致C5转化酶(C4b2a3b)的生成，其通过切割C5导致可以破坏细胞膜导致细胞裂解的膜攻击复合物(C5b组合C6、C7、C8和C9，也称为“MAC”)的生成。C3和C4的活化形式(C3b和C4b)共价沉积在外源靶表面上，其被多种吞噬细胞上的补体受体所识别。
[0012] 独立地，补体系统通过凝集素途径活化的第一步也是特异性识别分子的结合，其随后是所结合的丝氨酸蛋白酶原的活化。然而，凝集素途径中的识别分子包括一组统称为凝集素的糖结合蛋白(甘露聚糖结合凝集素(MBL)、H-纤维胶凝蛋白(H-ficolin)、M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白和C型凝集素CL-11)，而不是通过C1q来结合免疫复合物。参见J. Lu 等, Biochim. Biophys. Acta 1572:387-400, 2002; Holmskov 等, Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003); Teh 等, Immunology 101:225-232 (2000))。还参见J. Luet 等, Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov等, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh 等, Immunology 101:225-232 (2000); Hansen S. 等, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010)。
[0013] Ikeda等人首先证明，与C1q类似，MBL在与酵母甘露聚糖包被的红细胞结合后可以以依赖C4的方式使补体系统活化(K. Ikeda等，J. Biol. Chem. 262:7451-7454，1987)。MBL是胶原凝集素蛋白家族的成员，是钙依赖的凝集素，其与具有定位于吡喃糖环赤道面上的3-羟基和4-羟基的糖类结合。因此MBL的重要配体是D-甘露糖和N-乙酰-D-葡糖胺，而不符合这种空间要求的糖类则对MBL没有可检测的亲和性(Weis, W.I.等，Nature 360:127-
134，1992)。MBL和单价糖之间的相互作用是相当微弱的，解离常数通常在个位数豪摩尔的范围内。MBL通过亲和力，即通过同时与位置彼此紧密相邻的多个单糖残基相互作用来实现对聚糖配体特异性地紧密结合(Lee, R.T.等，Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136，
1992)。MBL识别通常修饰微生物如细菌、酵母、寄生虫和某些病毒的糖模式。相反，MBL不识别D-半乳糖和唾液酸，即倒数第二位的糖和倒数第一位的糖，它们一般修饰哺乳动物血浆和细胞表面糖蛋白上存在的“成熟”复合糖缀合物。认为这种结合特异性促进“外源”表面的识别和有助于保护免于自身活化。然而，MBL确实以高亲和力结合高甘露糖“前体”聚糖簇，这些簇位于被隔离在哺乳动物细胞内质网和高尔基体内的N-连接的糖蛋白和糖脂上
(Maynard, Y.等，J. Biol. Chem. 257:3788-3794，1982)。因此，受损细胞是经由MBL结合的凝集素途径活化的潜在目标。
[0014] 纤维胶凝蛋白具有与MBL不同类型的的凝集素结构域，称为纤维蛋白原样结构域。纤维胶凝蛋白以不依赖Ca++的方式来结合糖残基。在人中，已经鉴定出纤维胶凝蛋白的三种类型（L-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白）。L-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白这两种血清纤维胶凝蛋白共同对N-乙酰-D-葡糖胺具有特异性；然而，H-纤维胶凝蛋白还结合N-乙酰-D-半乳糖胺。L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白、CL-11和MBL的糖特异性的差异意味着不同的凝集素可是互补的，尽管有重叠，但是可靶向不同的糖缀合物。这个观点得到了最近报道的支持，即在凝集素途径的已知凝集素中，只有L-纤维胶凝蛋白与脂磷壁酸特异性结合，所述脂磷壁酸是一种在所有革兰氏阳性菌上发现的细胞壁糖缀合物(Lynch，N.J.等，J. Immunol. 172:1198-1202，2004)。胶原凝集素(即MBL)和纤维胶凝蛋白在氨基酸序列上没有显著的相似性。然而，两组蛋白质具有类似的结构域组构，且与C1q类似，装配成寡聚结构，这样就使得多位点结合的可能性最大化。
[0015] MBL的血清浓度在健康人群中是高度可变的，这在遗传上是由MBL基因的启动子和编码区二者的多态性/突变所控制的。作为急性期蛋白，MBL的表达在炎症期间进一步上调。L-纤维胶凝蛋白在血清中存在的浓度与MBL的浓度类似。因此，凝集素途径的L-纤维胶凝蛋白分支途径在强度上可能与MBL分支不相上下。MBL和纤维胶凝蛋白也可能作为调理素起作用，其允许吞噬细胞靶向MBL和纤维胶凝蛋白修饰的表面(参见Jack 等, J Leukoc Biol., 
77(3):328-36 (2004); Matsushita和Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 
(2002); Aoyagi 等, J Immunol 174(1):418-25 (2005))。此调理素作用需要这些蛋白与吞噬细胞受体相互作用（Kuhlman，M.等，J. Exp. Med. 169:1733，1989；Matsushita，M.等，J. Biol. Chem. 271:2448-54，1996），这些吞噬细胞受体的身份还未得到确定。。
[0016] 人MBL通过其胶原样结构域与独特的C1r/C1s样丝氨酸蛋白酶形成特异性、高亲和性的相互作用，称为MBL相关的丝氨酸蛋白酶(MASP)。迄今为止已经描述了三种MASP。首先，鉴定出单一的酶“MASP”，并且其特征是作为负责启动补体级联(即切割C2和C4)的酶(Matsushita M和Fujita T., J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992)，Ji, Y.H.等，J. Immunol. 150:571-578，1993)。随后，确定MASP活性实际上是两种蛋白酶MASP-1和MASP-2的混合物(Thiel, S.等，Nature 386:506-510，1997)。然而，证明MBL-MASP-2复合物单独就足以使补体活化(Vorup-Jensen, T.等，J. Immunol. 165:2093-2100，2000)。此外，只有MASP-2以高速切割C2和C4 (Ambrus, G.等，J. Immunol. 170:1374-1382，2003)。因此，MASP-2是负责活化C4和C2以产生C3转化酶C4b2a的蛋白酶。这是不同于经典途径中C1复合物的显著差异，其中两种特异性丝氨酸蛋白酶(C1r和C1s)协同作用导致了补体系统的活化。另外，已经分离出第三种新的蛋白酶MASP-3 (Dahl, M.R.等，Immunity 15:127-35，2001)。MASP-1和MASP-3是同一基因的可变剪接产物。
[0017] MASP与C1复合物的酶成分C1r和C1s共享相同的结构域组构(Sim, R.B.等，Biochem. Soc. Trans. 28:545，2000)。这些结构域包括N末端C1r/C1s/海胆VEGF/骨形成蛋白(CUB)结构域、表皮生长因子样结构域、第二CUB结构域、串联的补体调控蛋白结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。与在C1蛋白酶中一样，MASP-2的活化通过丝氨酸蛋白酶结构域附近的Arg-Ile键裂解而发生，其将酶分成二硫键连接的A链和B链，后者由丝氨酸蛋白酶结构域构成。最近，描述了MASP-2的遗传确定的缺陷(Stengaard-Pedersen, K.等，New Eng. J. Med. 349:554-560，2003)。单个核苷酸的突变导致CUB 1结构域中的Asp-Gly交换，并使得MASP-2不能与MBL结合。
[0018] MBL还与MASP-2的可变剪接形式，称为19 kDa MBL相关蛋白(MAp19) (Stover, C.M.，J. Immunol. 162:3481-90，1999)或者小MBL相关蛋白(sMAP) (Takahashi，M.等，Int. Immunol. 11:859-863，1999)缔合，所述蛋白缺乏MASP-2的催化活性。MAp19包括MASP-2的前两个结构域，其后接4个独特氨基酸的额外序列。MASP 1和MASP 2基因分别位于人3号和1号染色体上(Schwaeble，W.等，Immunobiology 205:455-466，2002)。
[0019] 若干证据表明存在不同的MBL-MASP复合物，且血清中的各种MASP的大部分不与MBL复合(Thiel，S.等，J. Immunol. 165:878-887，2000)。H-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白都与各种MASP结合，并且活化凝集素补体途径，如MBL所为(Dahl, M.R.等，Immunity 15:127-35，2001; Matsushita, M.等，J. Immunol. 168:3502-3506，2002)。凝集素途径和经典途径都形成共同的C3转化酶(C4b2a)，并且这两条途径在这一步会合。
[0020] 普遍认为凝集素途径在幼稚宿主中宿主抵抗感染的防御中具有重要作用。MBL参与宿主防御的强有力证据来自于对功能性MBL血清水平降低的患者的分析(Kilpatrick，D.C.，Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413，2002)。这些患者表现出复发性细菌和真菌感染的易感性。这些症状通常在生命早期在易损表观窗期间是明显的，因为从母体获得的抗体效价降低，但处于完整的抗体应答库发育之前。这种症状经常是由于MBL胶原部分的数个位点突变引起的，其妨碍了MBL寡聚体的正确形成。然而，由于MBL可以作为不依赖于补体的调理素起作用，所以还不知道对感染的易感性增加在多大程度上是由于受损的补体活化所致。
[0021] 与经典途径和凝集素途径相反，没有发现替代途径中完成识别功能的起始因子(initiator)，而在其它两种途径中是C1q和凝集素来完成识别功能的。目前普遍接受的是，替代途径自发经历低水平的周转活化（turnover activation），其可以容易在外来表面或其它异常表面(细菌、酵母、病毒感染的细胞或者受损组织)上放大，其独立保持自发活化受控的适当的分子元件。有四种血浆蛋白直接参与了替代途径的活化：C3、B因子、D因子和备解素。尽管大量证据表明在非感染性人类疾病的发病机制中，经典补体途径和替代补体途径两者都存在，但是对凝集素途径作用的评价才刚刚开始。最近研究提供的证据表明，凝集素途径的活化可能是造成缺血/再灌注损伤中补体活化和相关炎症的原因。Collard等人(2000)报告受到氧化应激的培养的内皮细胞结合MBL，且在暴露于人血清时显示出C3沉积(Collard, C.D.等，Am. J. Pathol. 156:1549-1556，2000)。此外，用封闭性抗MBL单克隆抗体处理人血清抑制了MBL结合和补体活化。将这些发现扩展到心肌缺血-再灌注大鼠模型上，其中比起用对照抗体处理的大鼠，用针对大鼠MBL的封闭性抗体处理的大鼠在冠状动脉闭塞时显示心肌损伤显著较轻(Jordan, J.E.等，Circulation 104:1413-1418，2001)。尚不清楚氧化应激后MBL与血管内皮结合的分子机制；最近的研究表明，氧化应激后凝集素途径的活化可能是由MBL与血管内皮细胞角蛋白结合而介导的，而不是与糖缀合物结合(Collard, C.D.等，Am. J. Pathol. 159:1045-1054，2001)。其它研究已表明出缺血/再灌注损伤发病机制中的经典途径和替代途径以及凝集素途径在这种疾病中的作用仍然存在争议(Riedermann, N.C.等，Am. J. Pathol. 162:363-367，2003)。
[0022] 近期的研究显示需要MASP-1（并且还可能是MASP-3）将替代途径活化酶D因子从其酶原形式转化成其酶活性形式（参见Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1):29-37 (2010)）。此过程的生理重要性通过在MASP-1/3缺陷小鼠的血浆中不存在替代途径功能活性而得以强调。对于替代途径，需要由天然C3蛋白水解生成的C3b发挥作用。由于替代途径C3转化酶(C3bBb)含有C3b作为必需亚基，关于经由替代途径的第一个C3b来源的问题已提出了令人困扰的问题，且促使了相当多的研究工作。
[0023] C3属于含有极少的被称为硫酯键的翻译后修饰的蛋白质家族(与C4和α-2巨球蛋白一起)。硫酯基团由谷氨酰胺组成，其末端羰基基团与三个氨基酸距离的半胱氨酸的巯基基团形成共价硫酯连接。该键不稳定，且亲电子的谷氨酰硫酯可与亲核部分例如羟基或氨基基团反应并从而与其它分子形成共价键。当被隔离在完整C3的疏水口袋内部时，硫酯键是相当稳定的。然而，C3被蛋白水解切割成C3a和C3b，导致C3b上高反应性的硫酯键暴露出来，并随着通过包括羟基或氨基基团的邻近部分的亲核攻击，C3b与靶共价结合。除了有大量文件证明C3b与补体靶共价结合的作用外，还有研究认为C3硫酯具有触发替代途径的关键作用。根据普遍接受的“慢转理论(tick-over theory)”，替代途径是由液相转化酶iC3Bb的生成所启动的，iC3Bb是由C3与水解硫酯(iC3; C3(H2O))和B因子形成的(Lachmann，P.J.等，Springer Semin. Immunopathol. 7:143-162，1984)。C3b样C3(H2O)由天然C3经蛋白质中内部硫酯的缓慢自发水解而产生(Pangburn, M.K.等，J. Exp. Med. 154:856-867，1981)。通过C3(H2O)Bb转化酶的活性，C3b分子沉积在靶表面，从而启动替代途径。
[0024] 对替代途径活化的起始因子的了解甚少。认为活化因子包括酵母细胞壁(酵母聚糖)、许多纯的多糖、兔红细胞、某些免疫球蛋白、病毒、真菌、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫和受损细胞。这些活化因子所共有的唯一特征是糖类的存在，但是糖类结构的复杂性和多样性使得难以确定共享的分子决定子，这是被承认的。广泛接受的是替代途径活化通过此途径的抑制性调节成分之间的精细平衡控制，例如H因子、I因子、DAF、CR1和备解素，其是替代途径仅有的阳性调节因子。参见Schwaeble W.J.和Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999))。
[0025] 除了上文所述的明显的未调节的活化机制，替代途径还可以为凝集素/经典途径C3转化酶（C4b2a）提供强力的放大环，因为任何生成的C3b都可以与B因子参与形成额外的替代途径C3转化酶（C3bBb）。替代途径C3转化酶通过结合备解素被稳定化。备解素使替代途径C3转化酶的半衰期延长六到十倍。向替代途径C3转化酶添加C3b导致替代途径C5转化酶的形成。
[0026] 一直以来认为所有三种途径(即经典、凝集素和替代途径)会合于C5，它被切割形成具有多种促炎作用的产物。会合后的途径被称为末端补体途径。C5a是最有效的过敏毒素，引起平滑肌和血管紧张度以及血管通透性的改变。它也是嗜中性粒细胞和单核细胞两者的强有力的趋化因子和活化因子。C5a介导的细胞活化能够通过诱导释放多种另外的炎症介质来显著放大炎症反应，另外的炎症介质包括细胞因子、水解酶、花生四烯酸代谢物和活性氧类别。C5裂解导致了C5b-9的形成，它也被称为膜攻击复合物(MAC)。目前强有力的证据表明，亚裂解的MAC沉积除了起裂解成孔复合物的作用外，还可能还在炎症中发挥重要作用。
[0027] 除了其在免疫防御中的重要作用，补体系统在很多临床状况中导致组织损伤。因此，对开发治疗有效的补体抑制剂以防止这些不良效果存在紧迫的需要。
[0028] 发明概述
[0029] 提供本概述，从而以简化形式引入概念的选择，其在以下发明详述中进一步描述。本概述既不欲鉴定请求保护的主题的关键特征，也不欲用于协助确定请求保护的主题的范围。
[0030] 在一个方面，本发明提供分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合人MASP-2，包括（i）包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的重链可变区；和（ii）包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变区，其中重链可变区CDR-H3序列包括描述为SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:
90的氨基酸序列，和其保守序列修饰，其中轻链可变区CDR-L3序列包括描述为SEQ ID NO:
51或SEQ ID NO:94的氨基酸序列，和其保守序列修饰，并且其中所述分离的抗体抑制MASP-
2依赖的补体活化。
[0031] 在另一方面，本发明提供结合人MASP-2的人抗体，其中所述抗体包括：I）a）重链可变区，其包括i）包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列31-35的重链CDR-H1；和ii）包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列50-65的重链CDR-H2；和iii）包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列95-102的重链CDR-H3；和b）轻链可变区，其包括i）包括SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的氨基酸序列24-34的轻链CDR-L1；和ii）包括SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的氨基酸序列50-56的轻链CDR-L2；和iii）包括SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的氨基酸序列89-97的轻链CDR-L3；或II）与所述可变结构域在其它方面相同的其变体，除了在所述重链可变区的所述CDR区内至多组合的总共10个氨基酸取代和在所述轻链可变区的所述CDR区内至多组合的总共10个氨基酸取代，其中所述抗体或其变体抑制MASP-2依赖的补体活化。
[0032] 在另一方面，本发明提供结合人MASP-2的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括：I）a）重链可变区，其包括i）包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列31-35的重链CDR-H1；和ii）包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列50-65的重链CDR-H2；和iii）包括SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20的氨基酸序列95-102的重链CDR-H3；和b）轻链可变区，其包括i）包括SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24的氨基酸序列24-34的轻链CDR-L1；和ii）包括SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24的氨基酸序列50-56的轻链CDR-L2；和iii）包括SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24的氨基酸序列89-97的轻链CDR-L3；或II）与所述可变结构域在其它方面相同的其变体，除了在所述重链的所述CDR区内至多组合的总共10个氨基酸取代和在所述轻链可变区的所述CDR区内至多组合的总共10个氨基酸取代，其中所述抗体或其变体抑制MASP-2依赖的补体活化。
[0033] 在另一方面，本发明提供结合人MASP-2的分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，包括重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中描述的任一氨基酸序列。
[0034] 在另一方面，本发明提供结合人MASP-2的分离的单克隆抗体，或其抗原结合片段，包括轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27中描述的任一氨基酸序列。
[0035] 在另一方面，本发明提供编码本发明的抗MASP-2抗体或其片段的氨基酸序列的核酸分子，例如表2中描述的那些。
[0036] 在另一方面，本发明提供至少包括编码本发明的抗MASP-2抗体或其片段的氨基酸序列的核酸分子，例如表2中描述的那些的核酸分子之一的细胞。
[0037] 在另一方面，本发明提供了生成分离的MASP-2抗体的方法，包括在允许编码本发明的抗MASP-2抗体的核酸表达的条件下培养至少包括编码本发明的抗MASP-2抗体的氨基酸序列的核酸分子之一细胞，和分离所述抗MASP-2抗体。
[0038] 在另一方面，本发明提供分离的全人单克隆抗体或其抗原结合片段，其以如通过表面等离子体共振确定的10nM或更低的KD从人MASP-2解离，并在甘露聚糖包被的基质上在1%血清中以10nM或更低的IC50抑制C4活化。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别至少部分的由参照抗体所识别的表位，其中所述参照抗体包括如在SEQ ID NO:
20中描述的重链可变区和如在SEQ ID NO:24中描述的轻链可变区。
[0039] 在另一方面，本发明提供包括本发明的全人单克隆抗MASP-2抗体和药学可接受的赋形剂的组合物。
[0040] 在另一方面，本发明提供在人受试者中抑制MASP-2依赖的补体活化的方法，包括以在所述人受试者中足够抑制MASP-2依赖的补体活化的量施用本发明的人单克隆抗体。
[0041] 在另一方面，本发明提供包括本发明的人单克隆MASP-2抗体的单位剂量的制品，适合用于对人受试者的治疗施用，其中所述单位剂量是1mg-1000mg的范围。附图说明
[0042] 通过参考下面的详细描述连同附图，本发明前述的方面以及许多附带的优点将更容易领会，同样也更好理解，其中：
[0043] 图1A是图解阐释人MASP-2基因组结构的图；
[0044] 图1B是图解阐释人MASP-2蛋白结构域结构的图；
[0045] 图2图解阐释如实施例2所述的在多克隆群体上进行的ELISA测定的结果，所述多克隆群体选自针对各种MASP-2抗原淘选（panned）的scFcv噬菌体文库；
[0046] 图3A和3B显示如实施例3中所述的在补体测定中针对功能活性的45个候选scFv克隆的测试结果；
[0047] 图4图解阐释如实施例4所述进行以比较三种血清（人、大鼠和NHP）中C3c水平的实验的结果；
[0048] 图5A是如实施例4所述的揭示分别属于VH2和VH6基因家族的两个不同组的最有活性的克隆的重链区（残基1-120）的氨基酸序列比对；
[0049] 图5B是如实施例4所述的scFv克隆17D20、17N16、18L16和4D9的氨基酸序列比对；
[0050] 图6图解阐释如实施例5中所述的使用90%人血浆的C3b沉积测定中IgG4转化的母克隆（mother clone）的制备物的抑制活性。
[0051] 图7A图解阐释如实施例6所述的17N16母克隆相对子克隆（daughter clone）对人MASP-2A滴定的ELISA测定的结果；
[0052] 图7B图解阐释如实施例6所述的17D20母克隆相对子克隆对人MASP-2A滴定的ELISA测定的结果；
[0053] 图8是如实施例6中所述的母克隆17N16和17N9子克隆的蛋白序列比对，显示轻链（从SYE起始）在两克隆之间具有17个氨基酸残基的不同；
[0054] 图9是如实施例7中所述的来自相比17D20母克隆的突变的克隆#35、#59和#90的序列的CDR-H3区的蛋白序列比对；
[0055] 图10A是如实施例7在所述的17D20母克隆的CDR3区与链重排克隆17D20md21N11和组合17D20md21N11的VL的图9中显示的突变克隆#35CDR-H3克隆（VH35-VL21N11）的蛋白序列比对；
[0056] 图10B是如实施例7中所述的17D20母克隆和子克隆17D20md21N11的VL和VH区的蛋白序列比对；
[0057] 图11A图解阐释如实施例8中所述的对衍生自人抗MASP-2单克隆抗体母克隆17N16的子克隆同种型变体（MoAb#1-3）进行的C3b沉积测定的结果；
[0058] 图11B图解阐释如实施例8中所述的对衍生自人抗MASP-2单克隆抗体母克隆17D20的子克隆同种型变体（MoAb#4-6）进行的C3b沉积测定的结果；
[0059] 图12A和12B图解阐释如实施例8中所述的在C3b沉积测定中在95%血清中的母克隆和MoAb#1-6的测试；
[0060] 图13图解阐释如实施例8中所述在95%正常人血清中C4b沉积的抑制；
[0061] 图14图解阐释如实施例8中所述在95%非洲绿猴血清中C3b沉积的抑制；
[0062] 图15图解阐释如实施例8中所述通过MoAb#2-6的预组装的MBL-MASP-2复合物的C4切割活性的抑制；
[0063] 图16图解阐释如实施例8中所述MoAb#6相比C1s对人MASP-2的优先结合；
[0064] 图17图解阐释如实施例10中所述的在向非洲绿猴静脉内施用抗人MoAb#OMS646后凝集素途径被完全抑制；
[0065] 图18A是卡普兰一迈耶存活曲线（Kaplan-Meier survival plot ），显示如实施例11中所述在对照小鼠和用抗鼠MASP-2抗体（mAbM11）或抗人MASP-2抗体（mAbOMS646）处理的小鼠中暴露于7.0Gy辐射后随时间的百分比存活；
[0066] 图18B是卡普兰一迈耶存活曲线，显示如实施例11中所述在对照小鼠和用抗鼠MASP-2抗体（mAbM11）或抗人MASP-2抗体（mAbOMS646）处理的小鼠中暴露于6.5Gy辐射后随时间的百分比存活；
[0067] 图18C是卡普兰一迈耶存活曲线，显示如实施例11中所述在对照小鼠和用抗人MASP-2抗体（mAbOMS646）处理的小鼠中暴露于8.0Gy辐射后随时间的百分比存活；
[0068] 图19图解阐释如实施例12中所述在抗MASP-2抗体OMS646（应答单位（结合）相对时间（以秒计））上表面等离子共振（Biacore）分析的结果，显示固定化的OMS646以约1-3x10-4S-1的Koff率和约1.6-3x106M-1S-1的Kon率结合重组MASP-2；
[0069] 图20图解阐释如实施例12中所述的确定抗MASP-2抗体OMS646对固定化的人MASP-2的结合亲和力的ELISA测定的结果，显示OMS646以约100pM的KD结合固定化重组人MASP-2；
[0070] 图21A图解阐释如实施例12中所述的在甘露聚糖包被的表面上在存在或不存在抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下C4活化水平，证明OMS646在甘露聚糖包被的表面上在1%人血清中以约0.5nM的IC50抑制C4活化；
[0071] 图21B图解阐释如实施例12中所述在IgG包被的表面上在存在或不存在抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下C4活化水平，显示OMS646不抑制经典途径依赖的补体成分C4的活化；
[0072] 图22A图解阐释如实施例12中所述在凝集素途径特异性测定条件下，在存在或不存在抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下MAC沉积的水平，证明OMS646以约1nM的IC50值抑制凝集素介导的MAC沉积；
[0073] 图22B图解阐释如实施例12中所述在经典途径特异性测定条件下，在存在或不存在抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下MAC沉积的水平，证明OMS646不抑制经典途径介导的MAC沉积；
[0074] 图22C图解阐释如实施例12中所述在替代途径特异性测定条件下，在存在或不存在抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下MAC沉积的水平，证明OMS646不抑制替代途径介导的MAC沉积；
[0075] 图23A图解阐释如实施例12中所述在凝集素途径特异性条件下，在存在或不存在一系列浓度的抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下在90%人血清中C3沉积的水平，证明OMS646在生理条件下阻断C3沉积；
[0076] 图23B图解阐释如实施例12中所述在凝集素途径特异性条件下，在存在或不存在一系列浓度的抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下在90%人血清中C4沉积的水平，证明OMS646在生理条件下阻断C4沉积；
[0077] 图24A图解阐释如实施例12中所述在凝集素途径特异性条件下，在存在或不存在抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下在90%Cynomuglus猴血清中C4沉积的水平，证明OMS646在Cynomuglus猴血清中以剂量反应性方式抑制C4沉积，具有30-50nM范围的IC50值；和[0078] 图24B图解阐释如实施例12中所述在凝集素途径特异性条件下，在存在或不存在抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下在90%非洲绿猴血清中C4沉积的水平，证明OMS646在非洲绿猴血清中以剂量反应性方式抑制C4沉积，具有15-30nM范围的IC50值。
[0079] 序列表的说明
[0080] SEQ ID NO:1 人MASP-2 cDNA
[0081] SEQ ID NO:2 人MASP-2 蛋白（具有前导肽（leader））
[0082] SEQ ID NO:3 人MASP-2 蛋白（成熟的）
[0083] SEQ ID NO:4 大鼠MASP-2 cDNA
[0084] SEQ ID NO:5 大鼠MASP-2 蛋白（具有前导肽（leader））
[0085] SEQ ID NO:6 大鼠MASP-2 蛋白（成熟的）
[0086] 抗原（关于人MASP-2成熟蛋白）
[0087] SEQ ID NO:7 人MASP-2的CUBI结构域 (氨基酸1-121)
[0088] SEQ ID NO:8 人MASP-2的CUBI/EGF结构域 (氨基酸1-166)
[0089] SEQ ID NO:9 人MASP-2的CUBI/EGF/CUBII结构域 (氨基酸1-277)
[0090] SEQ ID NO:10 人MASP-2的EGF结构域 (氨基酸122-166)
[0091] SEQ ID NO:11 人MASP-2的CCPI/CCPII/SP结构域 (氨基酸278-671)
[0092] SEQ ID NO:12 人MASP-2的CCPI/CCPII结构域 (氨基酸278-429)
[0093] SEQ ID NO:13 人MASP-2的CCPI结构域 (氨基酸278-347)
[0094] SEQ ID NO:14 人MASP-2的CCPII/SP结构域 (氨基酸348-671)
[0095] SEQ ID NO:15 人MASP-2的CCPII结构域 (氨基酸348-429)
[0096] SEQ ID NO:16 人MASP-2的SP结构域 (氨基酸429-671)
[0097] SEQ ID NO:17:丝氨酸蛋白酶失活的突变体（具有突变的Ser618的氨基酸610-625）
[0098] 抗MASP-2单克隆抗体VH链
[0099] SEQ ID NO:18 17D20mc重链可变区(VH)多肽
[0100] SEQ ID NO:19 编码17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)重链可变区(VH)的DNA(无信号肽)
[0101] SEQ ID NO:20 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)重链可变区(VH)多肽
[0102] SEQ ID NO:21 17N16mc重链可变区(VH)多肽
[0103] 抗MASP-2单克隆抗体VL链
[0104] SEQ ID NO:22 17D20mc轻链可变区(VL)多肽
[0105] SEQ ID NO:23 编码17D20_dc21N11VL (OMS644)轻链可变区(VL)的DNA(无信号肽)
[0106] SEQ ID NO:24 17D20_dc21N11VL (OMS644)轻链可变区(VL)多肽
[0107] SEQ ID NO:25 17D16mc轻链可变区(VL)多肽
[0108] SEQ ID NO:26 编码17N16_dc17N9 (OMS641) 轻链可变区(VL)的DNA(无信号肽)[0109] SEQ ID NO:27 17N16_dc17N9 (OMS641)轻链可变区(VL)多肽
[0110] 抗MASP-2单克隆抗体重链CDR
[0111] SEQ ID NOS:28-31 CDR-H1
[0112] SEQ ID NOS:32-35 CDR-H2
[0113] SEQ ID NOS:36-40 CDR-H3
[0114] 抗MASP-2单克隆抗体轻链CDR
[0115] SEQ ID NOS:41-45 CDR-L1
[0116] SEQ ID NOS:46-50 CDR-L2
[0117] SEQ ID NOS:51-54 CDR-L3
[0118] MASP-2抗体序列
[0119] SEQ ID NO:55: scFv母克隆17D20全长多肽
[0120] SEQ ID NO:56: scFv母克隆18L16全长多肽
[0121] SEQ ID NO:57: scFv母克隆4D9全长多肽
[0122] SEQ ID NO:58: scFv母克隆17L20全长多肽
[0123] SEQ ID NO:59: scFv母克隆17N16全长多肽
[0124] SEQ ID NO:60: scFv母克隆3F22全长多肽
[0125] SEQ ID NO:61: scFv母克隆9P13全长多肽
[0126] SEQ ID NO:62:编码野生型IgG4重链恒定区的DNA
[0127] SEQ ID NO:63: 野生型IgG4重链恒定区多肽
[0128] SEQ ID NO:64: 编码具有突变S228P的IgG4重链恒定区的DNA
[0129] SEQ ID NO:65:具有突变S228P的IgG4重链恒定区多肽
[0130] SEQ ID NO:66: scFv子克隆17N16m_d17N9全长多肽
[0131] SEQ ID NO:67: scFv子克隆17D20m_d21N11全长多肽
[0132] SEQ ID NO:68: scFv子克隆17D20m_d3521N11全长多肽
[0133] SEQ ID NO:69:编码野生型IgG2重链恒定区的DNA
[0134] SEQ ID NO:70: 野生型IgG2重链恒定区多肽
[0135] SEQ ID NO:71:17N16m_d17N9轻链基因序列(具有由核苷酸1-57编码的信号肽)[0136] SEQ ID NO:72:17N16m_d17N9轻链蛋白序列(具有信号肽氨基酸1-19)
[0137] SEQ ID NO:73:17N16m_d17N9 IgG2重链基因序列(具有由核苷酸1-57编码的信号肽)
[0138] SEQ ID NO:74:17N16m_d17N9 IgG2重链蛋白序列(具有信号肽氨基酸1-19)
[0139] SEQ ID NO:75:17N16m_d17N9 IgG4重链基因序列(具有由核苷酸1-57编码的信号肽)
[0140] SEQ ID NO:76:17N16m_d17N9 IgG4重链蛋白序列(具有信号肽氨基酸1-19)
[0141] SEQ ID NO:77:17N16m_d17N9 IgG4突变的重链基因序列(具有由核苷酸1-57编码的信号肽)
[0142] SEQ ID NO:78:17N16m_d17N9 IgG4突变的重链蛋白序列(具有信号肽氨基酸1-19)
[0143] SEQ ID NO:79:17D20_3521N11轻链基因序列(具有由核苷酸1-57编码的信号肽)[0144] SEQ ID NO:80:17D20_3521N11轻链蛋白序列(具有信号肽氨基酸1-19)
[0145] SEQ ID NO:81:17D20_3521N11 IgG2重链基因序列(具有由核苷酸1-57编码的信号肽)
[0146] SEQ ID NO:82:17D20_3521N11 IgG2重链蛋白序列(具有信号肽氨基酸1-19)
[0147] SEQ ID NO:83:17D20_3521N11 IgG4重链基因序列(具有由核苷酸1-57编码的信号肽)
[0148] SEQ ID NO:84:17D20_3521N11 IgG4重链蛋白序列(具有信号肽氨基酸1-19)
[0149] SEQ ID NO:85:17D20_3521N11 IgG4突变的重链基因序列(具有由核苷酸1-57编码的信号肽)
[0150] SEQ ID NO:86:17D20_3521N11 IgG4突变的重链蛋白序列(具有信号肽氨基酸1-19)
[0151] SEQ ID NO:87: scFv子克隆17N16m_d17N9编码全长多肽的DNA（无信号肽）
[0152] SEQ ID NO:88: scFv子克隆17D20m_d21N11编码全长多肽的DNA（无信号肽）[0153] SEQ ID NO:89: scFv子克隆17D20m_d3521N11编码全长多肽的DNA（无信号肽）[0154] SEQ ID NO:90:17D20m和d3521N11的共有重链CDR-H3
[0155] SEQ ID NO:91:17D20m和d3521N11的共有轻链CDR-L1
[0156] SEQ ID NO:92:17N16m和d17N9的共有轻链CDR-L1
[0157] SEQ ID NO:93:17D20m、d3521N11、17N16m和d17N9的共有轻链CDR-L2
[0158] SEQ ID NO:94:17N16m和d17N9的共有轻链CDR-L3。
[0159] 发明详述
[0160] 本发明提供结合人MASP-2并抑制凝集素介导的补体活化而同时保持免疫系统经典(C1q依赖的)途径成分的完整的全长人抗体。人抗MASP-2抗体已通过噬菌体展示文库筛选被鉴定，如实施例2-9中所述。如实施例10-12中所述，已鉴定高亲和力MASP-2抗体具有抑制凝集素介导的补体活化的能力，如体外测定和体内测定所证明。所述抗体的可变轻和重链片段已经以scFv格式和全长IgG格式两者分离。人抗MASP-2抗体可用于抑制凝集素介导的补体途径活化相关的细胞损伤，而同时保持免疫系统经典(C1q依赖的)途径成分的完整。
[0161] I. 定义
[0162] 除非本文明确规定，否则本文使用的所有术语都具有如本发明领域的普通技术人员所理解的相同含义。为了明确用于本说明书和所附权利要求书中描述本发明的有关术语，提供下列定义。
[0163] 本文所用术语“MASP-2依赖的补体活化”包括凝集素途径的MASP-2依赖的活化，其在生理条件下发生（即，在存在Ca++的情况下），导致凝集素途径C3转化酶C4b2a的形成，并且在C3切割产物C3b的积累后导致C5转化酶C42a（C3b）n。
[0164] 如本文所用术语“替代途径”是指例如由酵母聚糖触发的补体活化，所述酵母聚糖来自真菌和酵母细胞壁、革兰氏阴性外膜的脂多糖(LPS)和兔红细胞以及来自多种纯的多糖、兔红细胞、病毒、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫和受损细胞，并且其在传统上一直被认为是由来自补体因子C3自发蛋白水解生成的C3b而引起的。
[0165] 如本文所用术语“凝集素途径”是指经由血清和非血清糖结合蛋白(包括甘露聚糖结合凝集素(MBL)、CL-11和纤维胶凝蛋白（H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白）)的特异性结合而发生的补体活化。
[0166] 如本文所用术语“经典途径”是指由抗体与外源颗粒结合而触发的并且需要结合识别分子C1q的补体活化。
[0167] 如本文所用术语“MASP-2抑制性抗体”指任何抗MASP-2抗体或其MASP-2结合片段，其结合或直接与MASP-2相互作用并有效地抑制MASP-2依赖的补体活化。用于本发明方法的MASP-2抑制性抗体可降低MASP-2依赖的补体活化大于20%，例如大于30%，或大于40%，或大于50%，或大于60%，或大于70%，或大于80%，或大于90%，或大于95%。
[0168] 如本文所用术语“MASP-2阻断抗体”指MASP-2抑制性抗体，其降低MASP-2依赖的补体活化大于90%，例如大于95%或大于98%（即导致仅10%的MASP-2补体活化，例如仅9%，或仅8%，或仅7%，或仅6%，例如仅5%或更少，或仅4%，或仅4%，或仅3%，或仅2%或仅1%）。
[0169] 术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中互换使用。这些术语是本领域技术人员充分理解的，并且指由一种或多种特异性结合抗原的多肽组成的蛋白。一种抗体形式构成抗体的基本结构单元。此形式是四聚体并由两对相同的抗体链组成，每对具有一条轻和一条重链。每对中轻和重链可变区一起负责结合抗原，并且恒定区负责抗体效应物功能。
[0170] 如本文所用术语“抗体”包括衍生自产生抗体的任何哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔和包括人在内的灵长类动物)，或衍生自杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达或转基因动物（或其它产生抗体或抗体片段的方法）的抗体及其抗体片段，其与MASP-2多肽或其部分特异性结合。术语“抗体”在抗体来源或其制造的方式（例如，通过杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达、转基因动物、肽合成等）方面意图不是受限制的。示例性抗体包括多克隆、单克隆和重组抗体；多特异性抗体（例如，双特异性抗体）；人源化抗体；鼠抗体；嵌合鼠人、鼠灵长类动物、灵长类动物人单克隆抗体；和抗独特型抗体，并且可以是任何完整分子或其片段。如本文所用术语“抗体”包括不仅完整多克隆或单克隆抗体，还有其片段（例如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv），单链（scFv），其合成变体，天然发生的变体，包括具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的融合蛋白，人源化抗体，嵌合抗体和任何其它包括具有所需特异性的抗原结合位点或片段（表位识别位点）的免疫球蛋白分子的修饰的构型。
[0171] 如本文所用术语“抗原结合片段”指包含至少一个结合人MASP-2的免疫球蛋白重和/或轻链的CDR的多肽片段。就此而言，本文所述抗体的抗原结合片段可以包括来自结合MASP-2的抗体的本文描述的VH和VL序列的1、2、3、4、5或所有6个CDR。本文所述MASP-2特异性抗体的抗原结合片段能够结合MASP-2。在某些实施方案中，抗原结合片段或包括抗原结合片段的抗体介导MASP-2依赖的补体活化的抑制。
[0172] 如本文所用术语“抗MASP-2单克隆抗体”指同源抗体群，其中所述单克隆抗体由在选择结合MASP-2上的表位中涉及的氨基酸组成。抗MASP-2单克隆抗体是对MASP-2靶抗原高度特异性的。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，还有其片段（例如Fab, Fab', F(ab')2, Fv），单链（scFv），其变体，包括抗原结合部分的融合蛋白，人源化单克隆抗体，嵌合单克隆抗体和任何其它包括具有所需特异性和结合表位的能力的抗原结合片段（表位识别位点）的免疫球蛋白分子的修饰的构型。
[0173] 如本文所用，所述修饰词“单克隆的”指示从基本上同源的抗体群获得的抗体的特征，并且不意图在抗体来源或其制造方式（例如通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等）方面受限制。该术语包括在上面的“抗体”定义下描述的整个免疫球蛋白，以及片段等。单克隆抗体可以使用任何技术获得，所述技术提供用于通过培养基中的连续细胞系，例如Kohler, G., 等, Nature 256:495, 1975描述的杂交瘤法产生抗体分子，或者它们可以通过重组DNA法制造（参见，例如授予Cabilly的美国专利号4,816,567）。单克隆抗体还可以使用Clackson, T.，等, Nature 352:624-628, 1991, and Marks, J.D., 等, J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。这些抗体可以是任何免疫球蛋白类型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和任何其亚类。
[0174] 识别的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链，和α、γ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、δ、ε和μ重链或其它物种中的等价物。全长免疫球蛋白“轻链”（约25kDa或约214个氨基酸）包括在NH2末端约110个氨基酸的可变区和在COOH末端的κ或λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”（约50kDa或约446个氨基酸）类似地包括可变区（约116个氨基酸）和上述重链恒定区之一，例如γ（约330个氨基酸）。
[0175] 基本的四链抗体单元是异源四聚体糖蛋白，由两条相同的轻（L）链和两条相同的重（H）链组成。IgM抗体由5个基本异源四聚体单元和额外的多肽称为J链组成，并且从而包含10个抗原结合位点。分泌的IgA抗体可以聚合形成多价集聚，包括2-5个基本4链单元连同J链。每个L链通过一个共价二硫键连接H链，而两条H链通过一个或多个二硫键连接彼此，取决于H链同种型。每条H和L链还具有规律间隔的链内二硫键。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。
[0176] 每条H链在N末端具有可变结构域（VH），然后对于每条α和γ链是三个恒定结构域（CH），对于μ和ε同种型则是四个CH结构域（CH）。
[0177] 每条L链在N末端具有可变结构域（VL），随后在其另一端是恒定结构域（CL）。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一个恒定结构域（CH1）对齐。基于其恒定结构域（CL）的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的L链可以分配到两个截然不同的类型之一，称为卡帕（κ）和拉姆达（λ）。
[0178] 取决于它们重链（CH）的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配到不同类型或同种型。有5种类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM具有分别称为阿尔法(α)、德尔塔(δ)、艾普斯龙 (ε)、伽马(γ)和谬(μ)的重链。基于CH序列中微小的差异和功能，γ和α类型进一步分成亚类，例如人表达下列亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
[0179] 对于不同类型的抗体的结构和性质，参见，例如Basic and  Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr和Tristram G. Parslow 编辑；Appleton and Lange, Norwalk, Conn., 1994，第71页和第6章。
[0180] 术语“可变”指某些V结构域的区段在序列方面在抗体间变化很大的事实。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。但是，可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度中不是平均分布的。更确切地说，V区由被极度可变性的更短的区称为“高变区”（每个长度9-12个氨基酸）隔开的15-30个氨基酸的相对不变段称为框架区（FR）组成。天然重和轻链的可变结构域每个包括四个FR，大部分采取β-折叠构象，通过三个高变区连接，其形成环连接，并且在一些情况下形成部分n-折叠结构。每条链的高变区通过FR紧密接近保持在一起，并且与来自其它链的高变区促成抗体的抗原结合位点的形成（参见Kabat,等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)）。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是展示各种效应物功能，例如抗体在抗体依赖的细胞的细胞毒性（ADCC）中的参与。
[0181] 如本文所用，术语“高变区”指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。高变区通常包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基（即，当根据Kabat编号系统进行编号时，来自轻链可变结构域中残基大约24-34（L1）、50-56（L2）和89-97（L3），和重链可变结构域中大约31-35（H1）、50-65（H2）和95-102（H3），所述编号系统如在Kabat, 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991))中描述）；和/或那些来自“高变环”的残基（即，当根据Chothia编号系统进行编号时，轻链可变结构域中残基24-34（L1）、50-56（L2）和89-97（L3），和重链可变结构域中26-32（H1）、52-56（H2）和95-101（H3），所述编号系统如在Chothia和Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)中描述）；和/或那些来自“高变环”/CDR的残基（例如，当根据IMGT编号系统进行编号时，VL中残基27-38（L1）、56-65（L2）和105-120（L3），和VH中27-38（H1）、56-65（H2）和105-120（H3），所述编号系统如在Lefranc, J.P., 等, Nucleic Acids Res 27:209-212; Ruiz, M., 等, Nucleic Acids Res 28:219-221 (2000)中描述）。
[0182] 如本文所用术语“抗体片段”指衍生自或涉及全长抗MASP-2抗体的部分，通常包括其抗原结合或可变区。抗体片段的阐释性的实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段，scFv片段，双抗体（diabodies），线性抗体，单链抗体分子，抗体片段形成的双特异性抗体和多特异性抗体。
[0183] 当使用双特异性抗体时，这些可以是常规的双特异性抗体，其可以各种方法制造（Holliger, P.和Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)），例如化学制备或来自杂交瘤，或可以是任何上文提及的双特异性抗体片段。
[0184] 如本文所用“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域以单条多肽链存在。通常，Fv多肽进一步包括在VH和VL结构域间的多肽接头，其使得scFv能够形成所希望的结构用于抗体结合。参见Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)中。“Fv”是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由一条重和一条轻链可变区结构域以紧密的非共价连接的二聚体组成。从这两个结构域的折叠发出六个高变环（分别来自H和L链的三个环），其贡献用于抗原结合的氨基酸残基，并赋予抗体以抗原结合特异性。但是，虽然比整个结合位点的亲和力更低，但是即使单可变结构域（或仅包括对抗原特异性的3个CDR的Fv的一半）也具有识别和结合抗原的能力。
[0185] 如本文所用术语“特异性结合”指抗体优先结合存在于不同分析物的均匀混合物中的特定分析物的能力。在某些实施方案中，特异性结合相互作用将辨别样品中所希望的和不希望的分析物，在一些实施方案中，多于10-100倍或更多（例如多于1000或10000倍）。在某些实施方案中，当它们特异性结合在捕获剂/分析物复合物中时，捕获剂和分析物之间的亲和力表征为少于约100nM，或少于约50nM，或少于约25nM，或少于约10nM，或少于约5nM，或少于约1nM的K（D 解离常数）。
[0186] 如本文所用术语“变体”抗MASP-2抗体指通过在亲本抗体序列中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基使其在氨基酸序列方面与“亲本”或参照抗体氨基酸序列不同的分子。在一个实施方案中，变体抗MASP-2抗体指包含与亲本可变结构域相同的可变区的分子，除了在重链可变区的CDR区内组合的总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，和/或至多在轻链可变区的所述CDR区具有组合的总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述氨基酸取代是保守序列修饰。
[0187] 如本文所用术语“亲本抗体”指由用于变体制备的氨基酸序列编码的抗体。优选地，所述亲本抗体具有人框架区和，如果存在，具有一个或多个人抗体恒定区。例如，所述亲本抗体可以是人源化的或全人抗体。
[0188] 如本文所用术语“分离的抗体”指从其天然环境的成分鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染的成分是将干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶质。在优选的实施方案中，所述抗体将被纯化（1）到高于95重量%的抗体，如通过Lowry法确定，并且最优选多于99重量%；（2）到足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个N末端残基或内部氨基酸序列的程度；或（3）到使用考马斯亮蓝或优选银染在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE的同质性。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为将存在抗体的天然环境的至少一种成分。但是通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
[0189] 如本文所用术语“表位”指单克隆抗体特异性结合其上的抗原部分。表位决定簇通常由分子的化学活性表面组群组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有具体的三维结构特征，以及具体的电荷特征。更具体地，如本文所用术语“MASP-2表位”指如通过任何本领域熟知的方法（例如通过免疫测定）确定的，抗体免疫特异性结合的相应多肽的部分。抗原性表位不必需是免疫原性的。这些表位可以实际上线性的，或可以是不连续的表位。因此，如本文所用术语“构象表位”指通过抗原的氨基酸之间的空间关系而非一系列连续的氨基酸形成的不连续的表位。
[0190] 如本文所用术语“甘露聚糖结合凝集素”（“MBL”）等价于甘露聚糖结合蛋白（“MBP”）。
[0191] 如本文所用“膜攻击复合物”（“MAC”）指插入并破坏膜的5种末端补体成分(C5-C9)的复合物。亦称C5b-9。
[0192] 如本文所用的“受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、狗、猫、马、绵羊、山羊、牛、兔、猪和啮齿动物。
[0193] 本文所用的氨基酸残基的缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys;C)、谷氨酸(Glu；E)、谷胺酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和丙氨酸(Val；V)。
[0194] 从最广意义上看，天然存在的氨基酸可根据各个氨基酸侧链的化学特性来分组。“疏水”氨基酸是指Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、Cys或Pro。“亲水”氨基酸是指Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His。氨基酸的这种组别可进一步细分如下。“不带电荷的亲水”氨基酸是指Ser、Thr、Asn或者Gln。“酸性”氨基酸是指Glu或Asp。“碱性”氨基酸是指Lys、Arg或者His。
[0195] 本文所用术语“保守的氨基酸取代”通过下面每组中氨基酸之间的取代来说明：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(3)丝氨酸和苏氨酸；(4)天冬氨酸和谷氨酸；(5)谷胺酰胺和天冬酰胺；(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
[0196] 如本文所用术语“分离的核苷酸”指未整合进生物体的基因组DNA的核酸分子（例如多核苷酸）。例如，编码与细胞的基因组DNA分离的生长因子的DNA分子是分离的DNA分子。分离的核苷酸的另一个实例是指未整合进生物体的基因组的化学合成的核酸分子。分离自特定物种的核酸分子小于来自该物种的染色体的完整DNA分子。
[0197] 如本文所用“核酸分子构建物”是或者单或双链的核酸分子，其通过人干预修饰以包含天然不存在的组合或并列安排的核酸区段。
[0198] 如本文所用“表达载体”是编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。典型地，表达载体包括转录启动子、基因和转录终止子。基因表达通常置于启动子的控制下，并且该基因称为“可操作地连接到”启动子。类似地，如果调节元件调节核心启动子的活性，则调节元件和核心启动子是可操作地连接的。
[0199] 如本文所用涉及数字的术语“近似”或“约”通常采用以包括落入该数字两个方向（大于或小于）5%范围的数字，除非另有说明或从上下文另有证据（除了当该数字将超过可能值的100%时）。当声明范围时，端点包括在范围内，除非另有说明或从上下文另有证据。
[0200] 如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数方面，除非上下文清楚地另外指示。因此，例如提及“一个细胞”包括单个细胞，以及两个或多个细胞，提及“一个试剂”包括一个试剂以及两个或更多个试剂；提及“一个抗体”包括多个这些抗体和提及“一个框架区”包括提及一个或多个框架区和本领域技术人员已知的其等价物，等等。
[0201] 本说明书中每个实施方案将在细节上作必要的修改应用于每个其它实施方案，除非另有说明。
[0202] 对于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化（例如，电转化、脂质转染）可以使用标准技术。酶学反应和纯化技术可以根据制造商的说明进行或者如本领域常规实现的进行，或如本文所述进行。这些和相关的技术和方法通常可以根据本领域熟知的常规方法进行，和如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的引用中描述的进行。参见，例如Sambrook 等, 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY); Current Protocols in Immunology  (Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY)；或其它相关的Current Protocol发表物和其它类似参考文献。除非提供具体定义，本文描述的分子生物学，分析化学，合成有机化学和医学和药物化学的实验室方法和技术和所使用的相关命名法，是本领域技术人员熟知并常规使用的。对于重组技术、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送和患者治疗可以使用标准技术。
[0203] 关于本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物，预期本说明书中讨论的任何实施方案都可以被实施，并且反之亦然。进一步地，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。
[0204] II. 概述
[0205] 凝集素（MBL、M-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白和CL-11）是特异性识别分子，其触发先天性补体系统并且该系统包括凝集素引发途径和相关末端途径放大环，其放大凝集素引发的末端补体效应物分子的活化。C1q是特异性识别分子，其触发获得性补体系统并且该系统包括经典引发途径和相关末端途径放大环，其放大C1q引发的末端补体效应物分子的活化。我们将这两种主要的补体活化系统分别称为凝集素依赖的补体系统和C1q依赖的补体系统。
[0206] 除了其在免疫防御中的重要作用，补体系统在很多临床状况中导致组织损伤。因此，对开发治疗有效的补体抑制剂以防止这些不良效果存在紧迫的需要。
[0207] 如美国专利号7,919,094、共同未决的美国专利申请系列号12/905,972（公开为US 2011/0091450）和共同未决的美国专利申请系列号13/083,441（公开为US2011/0311549）（其每个都属于Omeros Corporation，本申请的受让人，并且其每个在此通过引用并入）中所述，通过使用MASP-2 -/-小鼠模型确定可以抑制凝集素介导的MASP-2途径同时保持经典途径完整。基于可以抑制凝集素介导的MASP-2通路同时保持经典途径完整的认可，则可以认识到，特异性仅抑制导致特定病理的补体活化而不完全关闭补体的免疫防御能力，其将是非常令人想要的。例如在其中补体活化主要通过凝集素依赖的补体系统介导的疾病状态中，特异性仅抑制此系统将是有利的。这将保持C1q依赖的补体活化系统的完整性以处理免疫复合物加工以及帮助宿主防御感染。
[0208] 在特异性抑制凝集素依赖的补体系统的治疗药物的研发中，优选的作为靶标的蛋白成分是MASP-2。在凝集素依赖的补体系统的所有已知蛋白成分(MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白、MASP-2、C2-C9、B因子、D因子和备解素)中，只有MASP-2是凝集素依赖的补体系统所独有并且是这个系统起作用所必需的。凝集素(MBL、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白和CL-11)也是凝集素依赖的补体系统中独有的成分。然而，这些凝集素成分任一种的丧失并不一定抑制系统活化，这是由于凝集素冗余所致。为了保证抑制凝集素依赖的补体活化系统，抑制所有5种凝集素将是必要的。此外，由于还已知MBL和纤维胶凝蛋白具有不依赖于补体的调理活性，因此抑制凝集素功能将导致丧失这种有益的抗感染的宿主防御机制。相反，如果MASP-2是抑制靶标的话，这种不依赖于补体的凝集素调理活性会保持完整。MASP-2作为抑制凝集素依赖的补体活化系统的治疗靶的额外好处是，MASP-2的血浆浓度是所有补体蛋白中最低的(约500 ng/ml)；因此，为得到完全抑制可能只需要相对低浓度的高亲和性MASP-2抑制剂，如本文实施例中所证明的。
[0209] 根据前述，如本文所述，本发明提供以高亲和力结合人MASP-2并且能够抑制凝集素介导的补体途径活化的单克隆全人抗MASP-2抗体。
[0210] III. MASP-2抑制性抗体
[0211] 在一方面，本发明提供单克隆全人抗MASP-2抗体，或其抗原结合片段，其特异性结合人MASP-2并抑制或阻断MASP-2依赖的补体活化。MASP-2抑制性抗体可以通过抑制或阻断MASP-2的生物学功能，有效地抑制或有效地阻断MASP-2依赖的补体活化系统。例如，抑制性抗体可以有效地抑制或阻断MASP-2蛋白-蛋白相互作用，干扰MASP-2二聚化或组装，阻断Ca2+结合，或干扰MASP-2丝氨酸蛋白酶活化位点。
[0212] MASP-2表位
[0213] 本发明提供特异性结合人MASP-2的全人抗体。MASP-2多肽展示类似于MASP-1、MASP-3和C1r和C1s（C1补体系统的蛋白酶）的分子结构。SEQ ID NO:1中描述的cDNA分子编码MASP-2代表性的实例（由SEQ ID NO:2中描述的氨基酸序列组成）并提供具有前导序列（1-15个氨基酸）的人MASP-2多肽，所述前导序列在分泌后被切割产生成熟形式的人MASP-2（SEQ ID NO:3）。如图1A所示，人MASP-2基因包括12个外显子。人MASP-2cDNA由外显子B、C、D、F、G、H、I、J、K和L编码。SEQ ID NO:4中描述的cDNA分子编码大鼠MASP-2（由SEQ ID NO:5中描述的氨基酸序列组成）并提供具有前导序列的大鼠MASP-2多肽，所述前导序列在分泌后被切割产生成熟形式的大鼠MASP-2（SEQ ID NO:6）。
[0214] 本领域技术人员将认识到SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4中公开的序列分别表示人和大鼠MASP-2的单个等位基因，并且预期发生等位基因变异和选择性剪接。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4中显示的核苷酸序列的等位基因变体，包括那些包含沉默突变和那些其中的突变导致氨基酸序列改变的变体，在本发明的范围之内。MASP-2序列的等位基因变体可以根据标准方法通过探针cDNA或基因组文库从不同个体中克隆。
[0215] 人MASP-2蛋白（SEQ ID NO:3）的结构域显示于图1B和下表1中，并且包括N末端C1r/C1s/海胆VEGF/骨形成蛋白(CUBI)结构域、表皮生长因子样结构域、第二CUB结构域（CUBII），以及串联的补体调控蛋白结构域CCP1和CCP2，和丝氨酸蛋白酶结构域。MASP-2基因的选择性剪接产生MAp19。MAp19是包含MASP-2的N末端CUB1-EGF区和四个额外残基（EQSL）的非酶蛋白。
[0216] 已显示多个蛋白通过蛋白-蛋白相互作用与MASP-2结合或相互作用。例如已知MASP-2结合并与凝集素蛋白MBL、H纤维胶凝蛋白和L纤维胶凝蛋白形成Ca2+依赖的复合物。已显示每个MASP-2/凝集素复合物通过MASP-2依赖的蛋白C4和C2的切割活化补体（Ikeda, K., 等, J. Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., 等, J. Exp. 
Med.176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., 等, J. Immunol. 168:3502-3506, 
2002）。研究已经显示MASP-2的CUB1-EGF结构域对于MASP-2与MBL的连接是必需的
（Thielens, N.M., et al., J. Immunol. 166:5068, 2001）。还已经显示CUB1EGFCUBII结构域介导MASP-2的二聚化，其是形成有活性的MBL复合物所需要的（Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000）。因此，可以鉴定与已知对于MASP-2依赖的补体活化重要的MASP-2靶区域结合或相互作用的MASP-2抑制性抗体。
[0217] 表1：MASP-2多肽结构域
[0218]
[0219] 在一个实施方案中，本发明的抗MASP-2抑制性抗体结合全长人MASP-2蛋白（SEQ ID NO:3）的部分例如MASP-2的CUBI、EGF、CUBII、CCPI、CCPII或SP。在一些实施方案中，本发明的抗MASP-2抑制性抗体结合CCP1结构域的表位（SEQ ID NO:13（SEQ ID NO:3的氨基酸278-347））。例如，如实施例9中所述，抗MASP-2抗体（例如OMS646）已被鉴定为仅结合包含CCP1结构域的MASP-2片段并抑制MASP-2依赖的补体活化。
[0220] MASP-2抑制性抗体的结合亲和力
[0221] 抗MASP-2抑制性抗体特异性结合人MASP-2（如SEQ ID NO:3所描述，由SEQ ID NO:1编码），具有比补体系统中其它抗原高至少10倍的亲和力。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体特异性结合人MASP-2，具有比补体系统中其它抗原高至少100倍的亲和力。
[0222] 在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体特异性结合人MASP-2，具有K（D 解离常数）少于约100nM，或少于约50nM，或少于约25nM，或少于约10nM，或少于约5nM，或少于或等于约1nM，或少于或等于0.1nM。如本文实施例3-5中所述，MASP-2抑制性抗体的结合亲和力可以使用本领域已知的合适的结合测定，例如ELISA测定来确定。
[0223] MASP-2抑制性抗体的效价
[0224] 在一个实施方案中，当在1%血清中测量时，MASP-2抑制性抗体足以有效抑制MASP-2依赖的补体活化，以IC50 ≤ 30 nM，优选少于或约20nM，或少于约10nM或少于约5nM，或少于或等于约3nM，或少于或等于约1nM。
[0225] 在一个实施方案中，当在90%血清中测量时，MASP-2抑制性抗体足以有效抑制MASP-2依赖的补体活化，以IC50 ≤ 30 nM，优选少于或约20nM，或少于约10nM或少于约5nM，或少于或等于约3nM，或少于或等于约1nM。
[0226] MASP-2依赖的补体活化的抑制表征为作为施用MASP-2抑制性抗体的结果发生的，在补体系统成分中至少下列改变之一：MASP-2依赖的补体活化系统产物C4a、C3a、C5a和/或C5b9（MAC）（例如，如美国专利号7,919,094的实施例2中所述测量），以及它们的分解代谢降解产物（例如，C3desArg）的生成或产生的抑制，C4切割和C4b沉积（例如，如实施例5中所述测量），和其后续分解代谢降解产物（例如，C4bc或C4d）的减少，或C3切割和C3b沉积（例如，如实施例5中所述测量），或其后续分解代谢降解产物（例如，C3bc或C3d等）的减少。
[0227] 在一些实施方案中，本发明的MASP-2抑制性抗体能够在全血清中抑制C3沉积到对照C3沉积的少于80%，例如少于70%，例如少于60%，例如少于50%，例如少于40%，例如少于30%，例如少于20%，例如少于15%，例如少于10%。
[0228] 在一些实施方案中，本发明的MASP-2抑制性抗体能够在全血清中抑制C4沉积到对照C4沉积的少于80%，例如少于70%，例如少于60%，例如少于50%，例如少于40%，例如少于30%，例如少于20%，例如少于15%，例如少于10%。
[0229] 在一些实施方案中，抗MASP-2抑制性抗体选择性抑制MASP-2补体活化（即，以比C1r或C1s至少100倍或更高的亲和力结合MASP-2），而保持C1q依赖的补体活化系统功能完整（即保留至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少98%，或至少100%的经典途径活性）。
[0230] 在一些实施方案中，主题抗MASP-2抑制性抗体具有下列特征：（a）对人MASP-2的高亲和力（例如10nM或更低的KD，优选1nM或更低的KD），和（b）在90%的人血清中以30nM或更低的IC50，优选10nM或更低的IC50抑制MASP-2依赖的补体活化。
[0231] 如实施例2-12中所述，已鉴定了以高亲和力结合MASP-2并抑制凝集素介导的补体活化而同时保持免疫系统的经典(C1q依赖的)途径成分的完整的全长人抗体。所述抗体的可变轻和重链片段已经以scFv格式和全长IgG格式两者测序、分离并分析。图5A是七个scFv抗MASP-2克隆的氨基酸序列比对，所述克隆鉴定为对MASP-2具有结合亲和力并具有抑制MASP-2依赖的活性的能力。图5B是四个scFv母克隆17D20、17N16、18L16和4D9的氨基酸序列比对，显示框架区和CDR区。如实施例6和7中所述，scFv母克隆17D20和17N16接受亲和力成熟，导致相比母克隆具有更高亲和力和效价增加的子克隆的生成。图5A和5B中所示scFv克隆和所产生的子克隆的重链可变区（VH）（氨基酸1-120）和轻链可变区（VL）（氨基酸148-250）的氨基酸序列显示在下表2中。
[0232] 通过比对上面讨论的抗MASP-2抑制性抗体的重和轻链氨基酸序列，并确定那些抗体的哪个位置发生哪个氨基酸，揭示了人抗MASP-2抑制性抗体的取代位置，以及可以取代入那些位置的氨基酸的选择。在一个示例性实施方案中，比对了图5A和5B的重和轻链氨基酸序列，并确定了示例性抗体的每个位置的氨基酸身份。如在图5A和5B中所阐释的（阐释示例性MASP-2抑制性抗体的重和轻链的每个位置存在的氨基酸），容易地鉴定了几个可以取代的位置，以及可以被取代入这些位置的氨基酸残基。在另一个示例性实施方案中，比对了母和子克隆的轻链氨基酸序列，并确定了示例性抗体的每个位置的氨基酸身份，以确定可以取代的位置，以及可以被取代入这些位置的氨基酸残基。
[0233] 表2：代表性抗MASP-2抗体的序列
[0234]
[0235] 在某些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有与表2中描述的任一重链可变结构域序列基本上相同（例如，至少约70%，至少75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%，或至少约96%相同，或至少约97%相同，或至少约98%相同，或至少99%相同）的重链可变结构域。
[0236] 在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有与SEQ ID NO:18中描述的17D20（VH）基本上相同（例如，至少约70%，至少75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%，或至少约96%相同，或至少约97%相同，或至少约98%相同，或至少99%相同）的重链可变结构域。在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成的重链可变结构域。
[0237] 在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有与SEQ ID NO:20中描述的17D20_cd35VH2N11（VH）基本上相同（例如，至少约70%，至少75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%，至少约96%相同，至少约97%相同，至少约98%相同，或至少99%相同）的重链可变结构域。在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有包含SEQ ID NO:20或由SEQ ID NO:20组成的重链可变结构域。
[0238] 在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有与SEQ ID NO:21中描述的17N16（VH）基本上相同（例如，至少约70%，至少75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%，或至少约96%相同，或至少约97%相同，或至少约98%相同，或至少99%相同）的重链可变结构域。在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有包含SEQ ID NO:21或由SEQ ID NO:20组成的重链可变结构域。
[0239] 在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有与表2中描述的任一轻链可变结构域序列基本上相同（例如，至少约70%，至少75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%，或至少约96%相同，或至少约97%相同，或至少约98%相同，或至少99%相同）的轻链可变结构域。
[0240] 在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有与SEQ ID NO:22中描述的17D20（VL）基本上相同（例如，至少约70%，至少75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%，或至少约96%相同，或至少约97%相同，或至少约98%相同，或至少99%相同）的轻链可变结构域。在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有包含SEQ ID NO:22或由SEQ ID NO:22组成的轻链。
[0241] 在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有与SEQ ID NO:24中描述的17D20_35VH-21N11VL（VL）基本上相同（例如，至少约70%，至少75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%，或至少约96%相同，或至少约97%相同，或至少约98%相同，或至少99%相同）的轻链可变结构域。在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有包含SEQ ID NO:24或由SEQ ID NO:24组成的轻链。
[0242] 在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有与SEQ ID NO:25中描述的17N16（VL）基本上相同（例如，至少约70%，至少75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%，或至少约96%相同，或至少约97%相同，或至少约98%相同，或至少99%相同）的轻链可变结构域。在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有包含SEQ ID NO:25或由SEQ ID NO:25组成的轻链。
[0243] 在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有与SEQ ID NO:27中描述的17N16_17N9 （VL）基本上相同（例如，至少约70%，至少75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%，或至少约96%相同，或至少约97%相同，或至少约98%相同，或至少99%相同）的轻链可变结构域。在一些实施方案中，主题人抗MASP-2单克隆抑制性抗体具有包含SEQ ID NO:27或由SEQ ID NO:27组成的轻链。
[0244] 在一些实施方案中，本发明的抗MASP-2抗体包含重或轻链，其由在高度严谨条件下与编码如表2所描述的重或轻链的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。高度严谨条件包括在50℃或更高在0.1xSSC（15mM盐水/0.15mM柠檬酸钠）中孵育。
[0245] 在一些实施方案中，本发明的抗MASP-2抑制性抗体具有包括一个或多个CDR（CDR1、CDR2和/或CDR3）的重链可变区，所述CDR相比图5A或5B中显示或在下文表3A-F和表4中描述的任何重链可变序列的CDR的氨基酸序列基本上相同（例如，至少约70%，至少75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%，或至少约96%相同，或至少约97%相同，或至少约98%相同，或至少99%相同），或包括相同序列或由相同序列组成。
[0246] 在一些实施方案中，本发明的抗MASP-2抑制性抗体具有包括一个或多个CDR（CDR1、CDR2和/或CDR3）的轻链可变区，所述CDR相比图5A或5B中显示或在表4和表5A-F中描述的任何轻链可变序列的CDR的氨基酸序列基本上相同（例如，至少约70%，至少75%，至少约
80%，至少约85%，至少约90%，至少约95%，或至少约96%相同，或至少约97%相同，或至少约98%相同，或至少99%相同），或包括相同序列或由相同序列组成。
[0247] 重链可变区
[0248] 表3A：重链（氨基酸1-20）
[0249]
[0250] 表3B：重链（氨基酸21-40）
[0251]
[0252] 表3C：重链（氨基酸41-60）
[0253]
[0254] 表3D：重链（氨基酸61-80）
[0255]
[0256] 表3E：重链（氨基酸81-100）
[0257]
[0258] 表3F：重链（氨基酸101-118）
[0259]
[0260] 下面显示的是上文表2和表3A-F中列举的母克隆和子克隆的重链可变区（VH）序列。
[0261] Kabat CDR(31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102 (H3))为黑体；并且Chothia CDR(26-32 (H1)、52-56 (H2)和95-101 (H3))加下划线。
[0262] 17D20重链可变区(VH) (SEQ ID NO:18):
[0263]
[0264] 17D20_35VH-21N11VL重链可变区(VH) (SEQ ID NO:20):
[0265]
[0266] 17N16重链可变区(VH) (SEQ ID NO:21):
[0267]
[0268] 表4：重链CDR
[0269]
[0270]
[0271] 轻链可变区
[0272] 表5A：轻链（氨基酸1-20）
[0273]
[0274] 表5B：轻链（氨基酸21-40）
[0275]
[0276] 表5C：轻链（氨基酸41-60）
[0277]
[0278] 表5D：轻链（氨基酸61-80）
[0279]
[0280]
[0281] 表5E：轻链（氨基酸81-100）
[0282]
[0283] 表5F：轻链（氨基酸101-120）
[0284]
[0285] 下面显示的是上文表2和表5A-F中列举的母克隆和子克隆的轻链可变区（VL）序列。
[0286] Kabat CDR(24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3))为黑体；并且Chothia CDR(24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3))加下划线。这些区无论通过Kabat还是Chothia系统编号都是相同的。
[0287] 17D20m轻链可变区(VL) (SEQ ID NO:22):
[0288]
[0289] 17D20m_d3521N11轻链可变区(VL) (SEQ ID NO:24)
[0290]
[0291] 17N16m轻链可变区(VL) (SEQ ID NO:25)
[0292]
[0293] 17N16m_d17N9轻链可变区(VL) (SEQ ID NO:27)
[0294]
[0295] 表6：轻链CDR（Kabat/chothia）
[0296]
[0297]
[0298]
[0299] 在一方面，本发明提供结合人MASP-2的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，包括：
[0300] （i）包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的重链可变区；和（ii）包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的轻链可变区，其中重链可变区CDR-H3序列包括描述为SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:90的氨基酸序列，和其保守序列修饰，其中轻链可变区CDR-L3序列包括描述为SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:94的氨基酸序列，和其保守序列修饰，并且其中所述分离的抗体抑制MASP-2依赖的补体活化。
[0301] 在一个实施方案中，所述重链可变区CDR-H2序列包括描述为SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列，和其保守序列修饰。在一个实施方案中，所述重链可变区CDR-H1序列包括描述为SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和其保守修饰。在一个实施方案中，所述轻链可变区CDR-L2序列包括描述为SEQ ID NO:93的氨基酸序列，和其保守修饰。在一个实施方案中，所述轻链可变区CDR-L1序列包括描述为SEQ ID NO:91或SEQ ID NO:92的氨基酸序列，和其保守修饰。在一个实施方案中，所述重链可变区的CDR-H1包括SEQ ID NO：28。
[0302] 在一个实施方案中，所述重链可变区的CDR-H2包括SEQ ID NO：32。在一个实施方案中，所述重链可变区的CDR-H3包括SEQ ID NO：90（如表4中所示）。在一个实施方案中，SEQ ID NO:90中描述的氨基酸序列在位置8包含R（Arg）。
[0303] 在一个实施方案中，所述轻链可变区的CDR-L1包括SEQ ID NO：91（如表6中所示）。在一个实施方案中，SEQ ID NO:91中描述的氨基酸在位置2包含E（Glu）。在一个实施方案中，SEQ ID NO:91中描述的氨基酸序列在位置8包含Y（Tyr）。
[0304] 在一个实施方案中，所述轻链可变区的CDR-L2包括SEQ ID NO：93（如表6中所示），并且其中SEQ ID NO:93中描述的氨基酸序列在位置2包含K（Lys）。在一个实施方案中，SEQ ID NO:93中描述的氨基酸序列在位置3包含Q（Gln）。
[0305] 在一个实施方案中，所述轻链可变区的CDR-L3包括SEQ ID NO：51。
[0306] 在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合人MASP-2，具有10nM或更低的KD。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段在体外测定中在1%人血清中以10nM或更低的IC50抑制C4活化。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段在90%人血清中以30nM或更低的IC50抑制C4活化。在一个实施方案中，其保守序列修饰包括或由这样的分子组成，所述分子包含与所述的一个或多个可变结构域相同的可变区，除了在重链可变区的CDR区内组合的总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，和/或至多在轻链可变区的所述CDR区具有组合的总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。
[0307] 在另一方面，本发明提供结合人MASP-2的分离的人抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括：I）a）重链可变区，其包括i）包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列31-35的重链CDR-H1；和ii）包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列50-65的重链CDR-H2；和iii）包括SEQ ID NO：21的氨基酸序列95-102的重链CDR-H3；和b）轻链可变区，其包括i）包括SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的氨基酸序列24-34的轻链CDR-L1；和ii）包括SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的氨基酸序列50-56的轻链CDR-L2；和iii）包括SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的氨基酸序列89-97的轻链CDR-L3；或II）与所述可变结构域在其它方面相同的其变体，除了在所述重链可变区的所述CDR区内至多组合的总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代和在所述轻链可变区的所述CDR区内至多组合的总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，其中所述抗体或其变体抑制MASP-2依赖的补体活化。在一个实施方案中，所述变体在一个或多个选自下列的位置包括氨基酸取代：所述重链可变区的位置31、32、33、34、35、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、95、96、97、98、99、100或102。在一个实施方案中，所述变体在一个或多个选自下列的位置包括氨基酸取代：所述轻链可变区的位置25、26、27、
29、31、32、33、51、52、89、92、93、95、96或97。在一个实施方案中，所述抗体的重链包括SEQ ID NO:21。在一个实施方案中，所述抗体的轻链包括SEQ ID NO:25。在一个实施方案中，所述抗体的轻链包括SEQ ID NO:27。
[0308] 在另一方面，本发明提供结合人MASP-2的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体包括：I）a）重链可变区，其包括i）包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列31-35的重链CDR-H1；和ii）包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列50-65的重链CDR-H2；和iii）包括SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20的氨基酸序列95-102的重链CDR-H3；和b）轻链可变区，其包括i）包括SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24的氨基酸序列24-34的轻链CDR-L1；和ii）包括SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24的氨基酸序列50-56的轻链CDR-L2；和iii）包括SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24的氨基酸序列89-97的轻链CDR-L3；或II）与所述可变结构域在其它方面相同的其变体，除了在所述重链可变区的所述CDR区内至多组合的总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代和在所述轻链可变区的所述CDR区内至多组合的总共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代，其中所述抗体或其变体抑制MASP-2依赖的补体活化。在一个实施方案中，所述变体在一个或多个选自下列的位置包括氨基酸取代：所述重链可变区的位置31、32、33、34、35、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、95、96、97、98、99、100或102。在一个实施方案中，所述变体在一个或多个选自下列的位置包括氨基酸取代：所述轻链可变区的位置25、26、27、
29、31、32、33、51、52、89、92、93、95、96或97。在一个实施方案中，所述抗体的重链包括SEQ ID NO：20，或对SEQ ID NO：20包括至少80%（例如，对SEQ ID NO：20至少85%，至少90%，至少
95%或至少98%的同一性）同一性的其变体。在一个实施方案中，所述抗体的重链包括SEQ ID NO：18，或对SEQ ID NO：18包括至少80%（例如，对SEQ ID NO：18至少85%，至少90%，至少95%或至少98%的同一性）同一性的其变体。在一个实施方案中，所述抗体的轻链包括SEQ ID NO：22，或对SEQ ID NO：22包括至少80%（例如，对SEQ ID NO：22至少85%，至少90%，至少95%或至少98%的同一性）同一性的其变体。在一个实施方案中，所述抗体的轻链包括SEQ ID NO：24，或对SEQ ID NO：24包括至少80%（例如，对SEQ ID NO：24至少85%，至少90%，至少95%或至少98%的同一性）同一性的其变体。
[0309] 在一个实施方案中，所述抗体结合MASP-2的CCP1结构域中的表位。
[0310] 在一个实施方案中，所述抗体结合人MASP-2，具有10nM或更低的KD。在一个实施方案中，所述抗体在体外测定中在1%人血清中以10nM或更低的IC50抑制C3b沉积。在一个实施方案中，所述抗体在90%人血清中以30nM或更低的IC50抑制C3b沉积。
[0311] 在一个实施方案中，所述抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2的抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体是单链分子。在一个实施方案中，所述抗体是IgG2分子。在一个实施方案中，所述抗体是IgG1分子。在一个实施方案中，所述抗体是IgG4分子。在一个实施方案中，所述IgG4分子包括S228P突变。
[0312] 在一个实施方案中，所述抗体基本上不抑制经典途径（即，经典途径的活性至少80%，或至少90%或至少95%，或至少95%完整）。
[0313] 在另一方面，本发明提供分离的全人单克隆抗体或其抗原结合片段，其以如通过表面等离子体共振确定的10nM或更低的KD从人MASP-2解离，并在甘露聚糖包被的基质上在1%血清中以10nM或更低的IC50抑制C4活化。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别至少部分的由参照抗体所识别的表位，其中所述参照抗体包括如在SEQ ID NO:
20中描述的重链可变区和如在SEQ ID NO:24中描述的轻链可变区，例如参照抗体OMS646（参见表22）。根据前述，根据某些本申请的优选实施方案的抗体或其抗原结合片段可以是一种与本文所述任何抗体竞争结合人MASP-2的抗体或其抗原结合片段，其既（i）特异性结合抗原，又（ii）包括本文公开的VH和/或VL结构域，或包括本文公开的CDR-H3，或这些抗体的任何变体。结合构件间的竞争可以在体外容易地测定，例如使用ELISA和/或通过对一个结合构件加特异性报告分子作为标签，其可以在存在一个或多个其它未加标签的结合构件的情况下被检测，以能够鉴定结合相同表位或重叠表位的特异性结合构件。因此，当前提供了特异性抗体或其抗原结合片段，包括人抗体抗原结合位点，其与本文所述结合人MASP-2的抗体（例如如表24中描述的OMS641-OMS646的任一个）竞争结合人MASP-2。
[0314] MASP-2抑制性抗体的变体
[0315] 上述人单克隆抗体可以被修饰以提供抑制MASP-2依赖的补体活化的变体抗体。变体抗体可以通过取代、添加或缺失上述人单克隆抗体的至少一个氨基酸制成。通常，这些变体抗体具有上述人抗体的一般特征，并且包含至少上述人抗体的CDR，或在某些实施方案中，与上述人抗体的CDR非常类似的CDR。
[0316] 在优选的实施方案中，所述变体包括在亲本抗体的一个或多个高变区内一个或多个氨基酸取代。例如，所述变体可以在亲本抗体的一个或多个CDR区中包括至少一个，例如从约一到约十，例如至少1，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9或至少10个取代，并且优选地从约二到约六个取代。在一个实施方案中，所述变体在一个或多个选自下列的位置包括氨基酸取代：所述重链可变区的位置31、32、33、34、35、51、52、53、54、55、
56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、95、96、97、98、99、100或102。在一个实施方案中，所述变体在一个或多个选自下列的位置包括氨基酸取代：所述轻链可变区的位置25、26、27、29、
31、32、33、51、52、89、92、93、95、96或97。
[0317] 在一些实施方案中，所述变体抗体具有与表2中描述的主题抗体的可变结构域在其它方面相同的氨基酸序列，除了在所述重链可变区的所述CDR区内至多组合的总共1、2、3、4、5或6个氨基酸取代和/或在所述轻链可变区的所述CDR区内至多组合的总共1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，其中所述抗体或其变体抑制MASP-2依赖的补体活化。
[0318] 通常，所述变体将具有与亲本抗体重或轻链可变结构域序列具有至少75%氨基酸序列同一性的氨基酸序列，更优选地至少80%，更优选地至少85%，更优选地至少90%，并且最优选地至少95%，或至少96%，或至少97%，或至少98%，至少99%同一性。关于此序列的同一性或同源性本文定义为在比对序列和引入缺口（如果必要），以实现最大化的百分比序列同一性后，候选序列中与亲本抗体残基相同的氨基酸残基的百分比。N末端、C末端或内部延伸、缺失，或插入抗体序列（例如，如信号肽序列、接头序列或标签，例如HIS标签）均不应当被理解为影响序列同一性或同源性。变体保留结合人MASP-2的能力并优选具有比亲本抗体的那些性质更优良的性质。例如，变体可以具有更强的结合亲和力和/或增强的抑制或阻断MASP-2依赖的补体活化的能力。
[0319] 为了分析这些性质，应当比较变体的Fab形式和亲本抗体的Fab形式或变体的全长形式和亲本抗体的全长形式，例如，由于已经发现抗MASP-2抗体的格式在本文公开的生物活性测定中影响其活性。本文特定目的变体抗体是一种当与亲本抗体相比显示至少约10倍、优选至少约20倍，并且最优选至少约50倍增强的生物活性的抗体。
[0320] 本发明的抗体可以修饰以增强所希望的性质，例如 其可以是令人希望的控制抗体的血清半衰期。通常，完整的抗体分子具有非常长的血清持续性，而片段（<60-80 kDa）经由肾脏非常快速地过滤。因此，如果希望MASP-2抗体的长期作用，则MASP-2抗体优选是完整的全长IgG抗体（例如IgG2或IgG4），而如果希望MASP-2更短的作用，则优选抗体片段。如实施例5所述，已确定在IgG4铰链区的S228P取代增加血清稳定性。因此，在一些实施方案中，主题MASP-2抗体是具有S228P取代的全长IgG4抗体。
[0321] 单链抗体
[0322] 在本发明的一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体是单链抗体，定义为包含轻链可变区、重链可变区由合适的多肽接头连接为遗传融合的单链分子的遗传改造的分子。这些单链抗体还称为“单链Fv”或“scFv”抗体片段。通常，Fv多肽进一步包括在VH和VL结构域间的多肽接头，其使得scFv能够形成所希望的结构用于抗原结合。结合MASP-2的scFv抗体可以用可变重区的氨基末端或其羧基末端的可变轻区定向。本发明的示例性scFv抗体描述为SEQ ID NO: 55-61和SEQ ID NO: 66-68。
[0323] 产生抗体的方法
[0324] 在很多实施方案中，编码主题单克隆抗体的核酸直接导入宿主细胞，并且细胞在足以诱导所编码的抗体表达的条件下孵育。
[0325] 在一些实施方案中，本发明提供编码本发明的抗MASP-2抗体或其片段的核酸分子，例如表2中描述的抗体或其片段。在一些实施方案中，本发明提供包括选自下列的核酸序列的核酸分子：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89。
[0326] 在一些实施方案中，本发明提供包括编码本发明的抗MASP-2抗体的核酸分子的细胞。
[0327] 在一些实施方案中，本发明提供包括编码本发明的抗MASP-2抗体的核酸分子的表达盒。
[0328] 在一些实施方案中，本发明提供产生抗MASP-2抗体的方法，包括培养包括编码本发明的抗MASP-2抗体的核酸分子的细胞。
[0329] 根据某些相关实施方案，提供包括如本文所述一种或多种构建体的重组宿主细胞；编码任何抗体、CDR、VH或VL结构域，或其抗原结合片段的核酸；产生所编码的产物的方法，所述方法从而包括从编码核酸的表达。可以通过在适当的条件下培养包含核酸的重组宿主细胞方便地实现表达。通过表达产生后，可以使用任何合适的技术分离和/或纯化抗体或其抗原结合片段，并然后如所希望地使用。
[0330] 例如，任何适合用于表达盒的表达的细胞都可以用作宿主细胞，例如，酵母、昆虫、植物等细胞。在很多实施方案中，使用通常不产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，其实例如下：猴肾脏细胞（COS细胞）、通过SV40转化的猴肾脏CVI细胞（COS-7，ATCC CRL 165 1）；人胚肾细胞（HEK-293，Graham 等, J. Gen Virol. 36:59 (1977)）；幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL 10）；中国仓鼠卵巢细胞（CHO，Urlaub和Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980)）；小鼠睾丸支持细胞（TM4，Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；
猴肾细胞（CVI ATCC CCL 70）；非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCC CRL-1587）；人宫颈癌细胞（HELA，ATCC CCL 2）；犬肾细胞（MDCK，ATCC CCL 34）；布法罗大鼠肝细胞（BRL 3A，ATCC CRL 
1442）；人肺细胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝细胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺肿瘤（MMT 
060562，ATCC CCL 51）；TRI细胞（Mather等，Annals N.Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982)）；
NIH/3T3细胞（ATCC CRL-1658）和小鼠L细胞（ATCC CCL-1）。对于那些本领域技术人员，额外的细胞系将变得显而易见的。各种各样的细胞系可从美国模式培养物保藏所，10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209获得。
[0331] 将核酸导入细胞的方法是本领域熟知的。合适的方法包括电转化、基因枪技术（particle gun technology）、磷酸钙沉淀、直接微注射等。方法的选择通常取决于被转化的细胞类型和转化发生的环境（即，体外、先体外后体内或体内）。这些方法的一般讨论可以见于Ausubel, 等, Short Protocols in Molecular Biology, 3d ed., Wiley & Sons, 1995。在一些实施方案中，使用脂质体和钙介导的基因转移技术。
[0332] 主题核酸已导入细胞后，细胞典型地孵育，通常在37℃，有时在选择下，进行合适的时间以允许抗体表达。在大多数实施方案中，抗体典型地分泌到细胞在其中生长的培养基的上清液。
[0333] 在哺乳动物宿主细胞中，可以利用一些基于病毒的表达系统以表达主题抗体。在腺病毒用作表达载体的情况下，编码目的序列的抗体可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联体前导序列。此嵌合基因可以然后通过体外和体内重组插入腺病毒基因组。病毒基因组非必需区的插入（例如E1或E3区）将获得有活力并且能够在感染的宿主内表达抗体分子的重组病毒。(参见，例如Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984))。表达效率可以通过包括适当的转录增强子元件、转录终止子等加以增强（参见Bittner等, Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)）。
[0334] 对于重组抗体的长期、高产量产生，可以使用稳定的表达。例如，可以改造稳定表达抗体分子的细胞系。宿主细胞可以用免疫球蛋白表达盒和可选择的标志物转化，而非使用包含病毒复制起始的表达载体。导入外源DNA后，可以允许改造的细胞在富集培养基中生长1-2天，并然后转到选择性培养基。重组质粒中的可选的标志物赋予选择抗性，并且允许细胞稳定地将质粒整合到染色体并生长形成集落，其然后可以被克隆并扩展成细胞系。该改造的细胞系可以具体可用于筛选和评价与抗体分子直接或间接相互作用的化合物。
[0335] 一旦本发明的抗体分子已产生，其可以通过任何本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的方法，例如通过层析（例如，离子交换、亲和力、具体通过蛋白A后的特异性抗原的亲和力，和大小排阻柱层析（sizing column chromatography））、离心、溶解性差异，或通过任何其它用于纯化蛋白的标准技术纯化。在很多实施方案中，抗体从细胞分泌到培养基中并从培养基中收获。例如，在抗体或片段的编码区的邻近可以包括编码信号肽的核酸序列，例如提供于SEQ ID NO:71的核苷酸1-57，编码如SEQ ID NO:72的氨基酸1-19中提供的信号肽。该信号肽可以整合到邻近主题抗体的本文描述的氨基酸序列的5'端，以帮助主题抗体的产生。
[0336] 药学载体和递送媒介物
[0337] 另一方面，本发明提供用于抑制MASP-2依赖的补体活化的不良效果的组合物，所述组合物包括治疗有效量的人抗MASP-2抑制性抗体和药学上可接受的载体。
[0338] 通常，组合有任何其它选择的治疗剂的本发明的人MASP-2抑制性抗体组合物适合包含在药学可接受的载体中。载体是无毒的、生物相容的并且是选择的以便不会有害影响MASP-2抑制性抗体（和其中组合的任何其它治疗剂）的生物学活性。用于多肽的示例性药学可接受的载体描述于授予Yamada的美国专利号5,211,657。抗MASP-2抗体可以配制成固体、半固体、凝胶、液体或气体形式的制备物，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂(depositories)、吸入剂和注射剂，供口服、胃肠外或外科手术施用。本发明还包括通过将组合物涂敷在医疗装置上进行局部施用等。
[0339] 用于经由注射、输注或冲洗和局部递送的胃肠外递送的合适载体包括蒸馏水、磷酸缓冲生理盐水、标准林格氏液或乳酸盐林格氏液、葡萄糖溶液、Hank氏溶液或丙二醇。此外，无菌不挥发油可用作溶剂或悬浮介质。对于此目的，可采用任何生物相容性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(例如油酸)可用于注射剂的制备中。可将载体和试剂配制成为液体制剂、混悬剂、可聚合或不可聚合的凝胶剂、糊剂或药膏。
[0340] 载体也可包括递送媒介物以使一种或多种试剂的递送持续(即延长、延缓或调节)，或者增强一种或多种治疗剂的递送、吸收、稳定性或药代动力学特征。这种递送载体可包括，通过非限制性实例的方式：由蛋白质、脂质体、糖类、合成有机化合物、无机化合物、聚合水凝胶、共聚水凝胶和聚合物胶束组成的微粒、微球、纳米球、纳米粒。合适的水凝胶和胶束递送系统包括WO 2004/009664 A2中公开的PEO:PHB:PEO共聚物和共聚物/环糊精复合物以及美国专利申请公开号2002/0019369 A1中公开的PEO和PEO/环糊精复合物。这些水凝胶可局部注射到既定起效部位，或者皮下或肌内注射以形成缓释贮库（depot）。
[0341] 对于关节内递药，MASP-2抑制性抗体可被装载于上述可注射的液体或凝胶载体、上述可注射的缓释递药媒介物、或者透明质酸或透明质酸衍生物中。
[0342] 对鞘内(IT)或脑室内(ICV)递药，合适的无菌递送系统(例如液体制剂；凝胶剂、混悬剂等)可用来施用本发明的药物。
[0343] 本发明的组合物还可包括生物相容性赋形剂，例如分散剂或润湿剂、悬浮剂、稀释剂、缓冲剂、渗透促进剂、乳化剂、粘合剂、增稠剂、矫味剂(用于口服施用)。
[0344] 为了获得用于局部递送的高浓度的抗MASP-2抗体，抗体可以配制为在溶液中的沉淀或晶体的悬浮液用于后续的注射，例如用于贮库的肌内注射。
[0345] 至于抗MASP-2抗体，更具体地，可以按注射剂量的所述化合物的溶液剂或混悬剂经胃肠外施用示例性制剂，所述化合物在生理上可接受的稀释剂与药物载体内，药物载体可以是无菌液体，例如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外，包含抗MASP-2抗体的组合物中可存在例如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等辅助物质。药物组合物的额外成分包括原油（petroleum）(例如动物、植物或合成来源的)，例如大豆油和矿物油。一般而言，二元醇例如丙二醇或聚乙二醇是优选的注射溶液剂的液体载体。
[0346] 还能以贮库注射剂或植入制备物的形式施用抗MASP-2抗体，所述制剂可按允许活性剂缓释或脉冲释放的方式来配制。
[0347] 可以多种方式施用包括MASP-2抑制性抗体的药物组合物，这取决于局部或全身性施用模式是否最适于待治疗的疾病。此外，本文上面所述的关于体外再灌注方法，可通过将本发明的组合物引入再循环血液或血浆来施用MASP-2抑制性抗体。而且，本发明的组合物可通过将组合物涂布或掺入可植入的医疗装置上面或里面而递送。
[0348] 全身递送
[0349] 如本文所用术语“全身性递送”和“全身性施用”预期包括但不限于口服和胃肠外途径，包括肌内(IM)、皮下、静脉内(IV)、动脉内、吸入、舌下、口腔、局部、经皮、经鼻、直肠、阴道和其它施用途径，它们将所递送的抗体有效地分散到预期治疗作用的一个或多个部位。用于本组合物的全身性递送的优选途径包括静脉内、肌内、皮下和吸入。应当理解的是，对于用于本发明具体组合物中所选用的试剂，确切的全身性施用途径将部分地考虑试剂对与特定施用途径相关的代谢转化途径的敏感性加以确定。
[0350] MASP-2抑制性抗体和多肽可以通过任何合适的方法递送到需要其的受试者中。递送MASP-2抗体和多肽的方法包括通过口服、肺部、胃肠外(例如肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、吸入(例如经由微细粉末制剂)、经皮、经鼻、阴道、直肠或者舌下施用途径，并可将其配制成适于各自给药途径的剂型。
[0351] 举例来说，可以通过将MASP-2抑制抗体和肽应用到能够吸收多肽的身体膜上，例如鼻膜、胃肠膜和直肠膜，而将其引入活体内。通常将多肽和渗透促进剂一起应用到可吸收膜上。(参见，例如Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5:69, 1988; Lee, V.H.L., J. Controlled Release13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G., 等, J. Controlled Release 13:241, 1990。)例如，STDHF是梭链孢酸的合成衍生物，是结构上类似于胆盐的甾类表面活性剂，并已被用作经鼻递药的渗透促进剂。(Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dec. 1990。)
[0352] 可以引入与另一分子(例如脂质)缔合的MASP-2抑制性抗体和多肽，以保护多肽不被酶降解。例如，共价结合的聚合物、尤其是聚乙二醇(PEG)已被用来保护某些蛋白质不被体内的酶水解，从而延长半衰期(Fuertges, F.等，J. Controlled Release 11:139，1990)。已经报道了许多用于蛋白质递送的聚合物系统(Bae, Y.H.等，J. Controlled Release 9:271，1989；Hori, R.等，Pharm. Res. 6:813，1989；Yamakawa, I.等，J. Pharm. Sci. 79:505，1990；Yoshihiro, I.等，J. Controlled Release 10:195，1989；Asano, M.等，J. Controlled Release 9:111，1989；Rosenblatt, J.等，J. Controlled Release 9:
195，1989；Makino, K.，J. Controlled Release 12:235，1990；Takakura, Y.等，J. Pharm. Sci. 78:117，1989；Takakura, Y.等，J. Pharm. Sci. 78:219，1989)。
[0353] 最近，已开发出血清稳定性和循环半衰期得到改进的脂质体(参见例如Webb的美国专利号5,741,516)。而且，对脂质体和脂质体样制备物作为可能的药物载体的各种方法进行了综述(参见例如Szoka的美国专利号5,567,434；Yagi的美国专利号5,552,157；Nakamori的美国专利号5,565,213；Shinkarenko的美国专利号5,738,868以及Gao的美国专利号5,795,587)。
[0354] 对于经皮应用，可将MASP-2抑制抗体和多肽与其它合适的成分(例如载体和/或佐剂)组合。对这些其它成分的性质没有限制，只是对于其预期施用来说必须是药学上可接受的，并且不能降低组合物中活性成分的活性。合适载体的实例包括含或不含纯化胶原的软膏、乳膏、凝胶或悬浮液。MASP-2抑制抗体和多肽也可被浸渍到透皮贴剂、膏药和绷带中，优选液体或半液体形式。
[0355] 可以在为维持治疗效果所需水平而确定的间隔的周期性基础上，全身性施用本发明的组合物。例如，可按每2-4周或者以更低频率的间隔施用组合物(例如经皮下注射)。给药方案将由医师考虑可能影响试剂联用的作用的各种因素来确定。这些因素将包括待治疗状况的进展程度、患者年龄、性别和体重以及其它临床因素。对于每个个别试剂的剂量将作为组合物中包含的MASP-2抑制性抗体以及任何药物递送媒介物(例如缓释递送媒介物)的存在和性质的函数而变化。此外，可在考虑施用频率和所递送的一种或多种试剂的药代动力学行为频率的变化后对剂量进行调整。
[0356] 局部递送
[0357] 如本文所用，术语“局部”包括药物在预期的局部作用部位上或其周围的应用，并可包括例如局部递送到皮肤或其它受累组织、眼递药、鞘内(IT)、脑室内(ICV)、关节内、腔内、颅内或肺泡内施用、安置或冲洗。可优选能够施用较低剂量的局部施用以避免全身性副作用，以及更精确地控制递送时间和局部递送部位的活性剂浓度。不论患者之间在新陈代谢、血流等方面的变化，局部施用都在靶部位提供已知浓度。通过直接递送模式还使剂量控制得到改善。
[0358] MASP-2抑制性抗体的局部递送可在用手术方法治疗疾病或状况的外科手术的过程中实现，例如在诸如动脉旁路术、动脉粥样硬化斑切除术、激光手术、超声波手术、球囊血管成形术以及支架安置等手术期间。例如，可将MASP-2抑制剂与球囊血管成形手术结合施用受试者。球囊血管成形手术包括将连有已排气球囊的导管插入动脉内。将已排气球囊置于动脉粥样硬化斑块附近，并给气囊充气使得斑块向血管壁挤压。结果，球囊表面与血管表面的血管内皮细胞层接触。可以按允许试剂在动脉粥样硬化斑块部位释放的方式，将MASP-2抑制性抗体附着到球囊血管成形术导管上。可按照本领域已知标准方法将试剂附着在球囊导管上。例如，可将试剂保存在球囊导管的隔室中直到球囊充气，此时药物被释放到局部环境中。或者，可将试剂浸渍在球囊表面，从而当球囊充气时，试剂就接触到动脉壁的细胞。
也可在多孔球囊导管中递送试剂，参见例如Flugelman, M.Y.等，Circulation 85:1110-
1117，1992。另参见已公开的PCT申请WO 95/23161中对于将治疗蛋白附着到球囊血管成形术导管上的示例性方法。同样地，也可将MASP-2抑制性抗体包入应用于支架上的凝胶或聚合涂层材料中，或者可将MASP-2抑制性抗体掺入支架材料中，从而支架在血管安置之后便将MASP-2抑制性抗体洗脱出来。
[0359] 治疗方案
[0360] 用于治疗关节炎和其它肌肉骨骼疾病的MASP-2抑制性抗体组合物可通过关节内注射来局部递送。这些组合物可适当地包括缓释递送载体。作为其中可能需要局部递送的另一个实例，用于治疗泌尿生殖系统疾病的MASP-2抑制性抗体组合物可适当地滴入膀胱内或者其它泌尿生殖结构中。
[0361] 在预防应用中，所述药物组合物以足以消除或减少状况症状的发生风险的量施用于对MASP-2依赖的补体活化相关的状况易感或者另外具有风险的受试者。在治疗应用中，所述药物组合物以足以缓解或至少部分减少状况症状的治疗有效量施用于怀疑或者早已患有MASP-2依赖的补体活化相关的状况的受试者。在预防和治疗方案中，包括MASP-2抑制性抗体的组合物可以以几个剂量施用，直至在受试者中获得足够的治疗结果。本发明的MASP-2抑制性抗体组合物的应用可以通过组合物的单次施用，或有限的施用顺序进行，用于急性状况的治疗，例如再灌注损伤或其它外伤。或者，可在较长一段时间内按定期间隔施用组合物，用于治疗慢性状况，例如关节炎或银屑病。
[0362] 本发明中使用的MASP-2抑制性组合物可以在导致凝集素途径活化的急性事件后立即或很快递送，例如在缺血性事件和缺血组织的再灌注后。实例包括心肌缺血再灌注、肾脏缺血再灌注、大脑缺血再灌注、器官移植和指趾/肢体再附着。其它急性实例包括败血症。本发明的MASP-2抑制性组合物可以在活化凝集素途径的急性事件之后尽快施用，优选在12小时内，并且更优选地在触发事件的2-3小时内，例如通过MASP-2抑制性组合物的全身递送。
[0363] 本发明的方法和组合物可以用于抑制通常由于诊断和治疗性药物和手术方法导致的炎症和相关过程。为了抑制这些过程，本发明的MASP-2抑制性组合物可以围手术期应用。如本文所用“围手术期”指抑制性组合物的手术前和/或手术中和/或手术后施用，即在手术之前，手术之前和期间，手术前后，手术前、期间和之后，手术期间，手术期间和之后，或手术后。围手术期应用可以通过向手术（surgical）或手术（procedural）部位局部施用所述组合物进行，例如通过注射或部位的连续或间歇灌注或通过全身施用。用于MASP-2抑制性抗体溶液的局部围手术期递送的合适的方法公开于授予Demopulos的美国专利号6,420,432和授予Demopulos的美国专利号6,645,168。用于包括MASP-2抑制性抗体的软骨保护组合物的局部递送的合适的方法公开于国际PCT专利申请WO 01/07067 A2。用于包括MASP-2抑制性抗体的软骨保护组合物的靶向全身递送的合适的方法和组合物公开于国际PCT专利申请WO 03/063799 A2。
[0364] 剂量
[0365] MASP-2抑制性抗体可以以治疗有效剂量施用于需要其的受试者，以治疗或缓解MASP-2依赖的补体活化相关的状况。治疗有效剂量指MASP-2抑制性抗体的量足以导致状况的症状缓解。
[0366] MASP-2抑制性抗体的毒性和治疗效力可以通过标准的药学方法确定，采用实验动物模型，例如非洲绿猴，如本文所述。使用这些动物模型，可以使用标准方法确定NOAEL（无观察的不良效果水平）和MED（最低有效水平）。NOAEL和MED效果的剂量比例是治疗比例，其表示为NOAEL/MED比例。展示大治疗比例或指数的MASP-2抑制性抗体是最优选的。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列剂量以在人中使用。MASP-2抑制性抗体的剂量优选处于包括MED的一系列循环浓度内，具有很少或无毒性的。取决于所采用的剂量和所利用的施用途径，剂量可以在此范围内变化。
[0367] 对于任何化合物制剂，可以使用动物模型估计治疗有效剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量以获得包括MED的循环血浆浓度范围。还可以测量MASP-2抑制性抗体在血浆中的定量水平，例如通过高效液相层析。
[0368] 除了毒性研究之外，还可以基于活的受试者中存在的MASP-2蛋白的量和MASP-2抑制性抗体的结合亲和力估计有效剂量。已显示正常人受试者中MASP-2水平以500 ng/ml范围的低水平存在于血清，并且特定受试者中的MASP-2水平可以使用用于MASP-2的定量测定来确定，所述定量测定描述于Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol. Methods 282:159-167, 2003，在此通过引用并入本文。
[0369] 通常，包括MASP-2抑制性抗体的所施用的组合物的剂量取决于下列因素而变化：受试者年龄、体重、身高、性别、一般医疗状况和先前医疗史。作为例证，MASP-2抑制性抗体可以以从约0.010-10.0mg/kg，优选0.010-1.0mg/kg，更优选0.010-0.1mg/kg受试者体重的剂量范围施用。
[0370] 本发明的MASP-2抑制性组合物和方法在给定受试者中的治疗效力，和适当的剂量可以根据本领域技术人员熟知的补体测定来确定。补体生成很多特异性产物。对于大部分这些活化产物，包括小的活化片段C3a、C4a和C5a以及大的活化片段iC3b、C4d、Bb和sC5b9，在过去的十年间，已经开发了敏感的和特异性的测定并且是可商购获得的。大部分这些测定利用与片段上而非它们形成来自的天然蛋白上暴露的新抗原（neoantigen）反应的抗体，使这些测定非常简单和特异。大部分依赖ELISA技术，尽管对于C3a和C5a仍然有时候使用辐射性免疫测定。这些后来的测定测量未处理的片段和它们“desArg”片段，其是循环中发现的主要形式。未处理的片段和C5adesArg通过结合细胞表面受体快速清除并且从而以非常低的浓度存在，而C3adesArg不结合细胞并在血浆中积累。C3a的测量提供了补体活化的敏感的、途径依赖的指示物。可以通过测量Bb片段评价替代途径活化。膜攻击途径活化的流体相（fluid-phase）产物，sC5b9的检测提供补体活化完成的证据。因为凝集素和经典途径生成同样的活化产物，C4a和C4d，这两个片段的测量不提供任何关于这两个途径哪个生成活化产物的信息。
[0371] MASP-2依赖的补体活化的抑制表征为补体系统成分的至少一种下列变化，其作为施用根据本发明的抗MASP-2抗体的结果发生：MASP-2依赖的补体活化系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b9（MAC）的生成或产生的抑制，C4切割和C4b沉积的减少，或C3切割和C3b沉积的减少。
[0372] 制品
[0373] 在另一方面，本发明提供包含人MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段的制造物品，如本文所述以适于对人受试者治疗施用的单位剂量形式，例如，如1mg-5000mg范围中的单位剂量，例如1mg-2000mg，例如1mg-1000mg，例如5mg、10mg、50mg、100mg、200mg、500mg或1000mg。在一些实施方案中，所述制品包括容器和容器上或相关的标签或药品说明书。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器等。所述容器可以从各种材料例如玻璃或塑料形成。容器容纳对治疗状况有效的组合物，并可以具有无菌出入口（例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针贯穿的塞子的小瓶）。组合物中至少一种活性剂是本发明的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段。标签或药品说明书指示所述组合物用于治疗特定状况。标签或药品说明书将进一步包括向患者施用抗体组合物的说明。还预期本文所述的包括组合治疗的制品和试剂盒。
[0374] 抗MASP-2抑制性抗体的治疗用途
[0375] 在另一方面，本发明提供在人受试者中抑制MASP-2依赖的补体活化的方法，包括以在所述人受试者中足够抑制MASP-2依赖的补体活化的量施用本发明的人单克隆抗MASP-2抑制性抗体。
[0376] 根据本发明的此方面，如实施例10中所述，本发明的抗MASP-2抑制性抗体在静脉内施用后能够抑制非洲绿猴中凝集素途径。如表24，实施例8中所示，发现本研究中使用的抗体OMS646在人血清中更有效。如本领域技术人员所知晓，非人灵长类动物经常用作评价抗体治疗的模型。
[0377] 如在美国专利号7,919,094、共同未决的美国专利申请系列号13/083,441和共同未决的美国专利申请系列号12/905,972（其每个均分配给Omeros Corporation，本申请的受让人）中所述，其每个均通过引用并入，MASP-2依赖的补体活化已被指示为促进很多急性和慢性疾病状态的发病机制，包括MASP-2依赖的补体介导的血管状况、缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、炎性胃肠道病症、肺部状况、体外再灌注过程、骨骼肌状况、肾状况、皮肤状况、器官或组织移植、神经系统病症或损伤、血液病症、泌尿生殖道状况、糖尿病、化疗或辐射治疗、恶性肿瘤、内分泌紊乱、凝血障碍，或眼科状况。因此，本发明的MASP-2抑制性抗体可以用于治疗上述疾病和状况。
[0378] 如实施例11中进一步所述，本发明的MASP-2抑制性抗体在治疗具有急性辐射综合征不利影响的风险或遭受急性辐射综合征不利影响的哺乳动物受试者中是有效的，由此证明体内的治疗效力。
[0379] 下列实施例仅阐释目前预期用于实践本发明的最佳模式，但不应解释为限制本发明。
[0380] 实施例1
[0381] 本实施例描述了重组全长人、大鼠和小鼠MASP-2、MASP-2衍生多肽以及无催化活性的MASP-2突变形式的重组表达和蛋白产生。
[0382] 全长人和大鼠MASP-2的表达：
[0383] 将编码人MASP-2多肽的具有前导序列（SEQ ID NO:2）的人MASP-2全长cDNA序列(SEQ ID NO:1)亚克隆到哺乳动物表达载体pCI-Neo (Promega)中，其在CMV增强子/启动子区控制下驱动真核表达(描述于Kaufman R.J.等，Nucleic Acids Research 19:4485-90，1991；Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991))。将编码大鼠MASP-2多肽的具有前导序列（SEQ ID NO:5）的大鼠MASP-2全长cDNA(SEQ ID NO:4)亚克隆到pED表达载体中。然后使用标准磷酸钙转染方法(描述于Maniatis等，1989)，将MASP-2表达载体转染到贴壁的中国仓鼠卵巢细胞系DXB1中。用这些构建体转染的细胞生长得非常缓慢，表明所编码的蛋白酶有细胞毒性。人MASP-2蛋白的成熟形式（SEQ ID NO:3）和大鼠MASP-2蛋白的成熟形式（SEQ ID NO:6）被分泌到培养基中，并如下述进行分离。
[0384] 全长无催化活性的MASP-2的表达：
[0385] 基本原理：
[0386] 在识别亚成分MBL、C型凝集素CL-11或纤维胶凝蛋白(L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白或M-纤维胶凝蛋白)（统称为凝集素）结合它们各自的糖类模式之后，MASP-2通过自催化切割活化。导致MASP-2活化的自催化裂解经常发生在从血清分离MASP-2的过程中，或者在重组表达后的纯化期间。为获得更稳定的蛋白质制备物用作抗原，通过用丙氨酸残基置换蛋白酶结构域催化三联体中存在的丝氨酸残基，产生无催化活性形式的MASP-2，称为MASP-2A，在成熟大鼠MASP-2蛋白中(SEQ ID NO:6 Ser617到Ala617)；或在成熟人MASP-2蛋白中(SEQ ID NO:3 Ser618到Ala618)。
[0387] 为生成无催化活性的人和大鼠MASP-2A蛋白，使用US2007/0172483（通过引用并入本文）中所述进行定点诱变。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳和条带制备后被纯化，并使用标准加尾方法产生单腺苷重叠。然后将加腺苷尾的MASP-2A克隆到pGEM-T easy载体中，再转化到大肠杆菌中。进一步将人和大鼠MASP-2A每个进一步亚克隆到哺乳动物表达载体pED或pCI-Neo并转染到如下所述中国仓鼠卵巢细胞系DXB1中。
[0388] 包含衍生自人MASP-2的多肽区的表达质粒的构建
[0389] 采用MASP-2信号肽(SEQ ID NO:2的残基1-15)来产生下面的构建体以分泌不同的MASP-2结构域。通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:3)残基1-121的区域(相当于N端CUB1结构域)来制备表达人MASP-2 CUBI结构域(SEQ ID NO:7)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:3)残基1-166的区域(相当于N端CUB1/EGF结构域)来制备表达人MASP-2 CUBI/EGF结构域(SEQ ID NO:8)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:3)残基
1-277的区域(相当于N端CUB1/EGF/CUBII结构域)来制备表达人MASP-2 CUBI/EGF/CUBII结构域(SEQ ID NO:9)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:3)残基122-166的区域(相当于EGF结构域)来制备表达人MASP-2 EGF结构域(SEQ ID NO:10)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:3)残基278-671的区域(相当于CCPI/CCPII/SP结构域)来制备表达人MASP-2 CCPI/CCPII/SP结构域(SEQ ID NO:11)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-
2 (SEQ ID NO:3)残基278-429的区域(相当于CCPI/CCPII 结构域)来制备表达人MASP-2 CCPI/CCPII结构域(SEQ ID NO:12)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:3)残基278-347的区域(相当于CCPI结构域)来制备表达MASP-2 CCPI结构域(SEQ ID NO:13)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:3)残基348-671的区域(相当于CCPII/SP结构域)来制备表达MASP-2 CCPII/SP结构域(SEQ ID NO:14)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:3)残基348-429的区域(相当于CCPII结构域)来制备表达MASP-2 CCPII结构域(SEQ ID NO:15)的构建体。通过PCR扩增编码MASP-2 (SEQ ID NO:3)残基429-
671的区域(相当于SP结构域)来制备表达MASP-2 SP结构域(SEQ ID NO:16)的构建体。
[0390] 使用VentR聚合酶且pBS-MASP-2作为模板，根据上面建立的PCR方法，通过PCR扩增上面提及的MASP-2结构域。有义引物的5'引物序列在PCR产物的5'端引入BamHI限制性位点（下划线）。每个MASP-2结构域的反义引物设计为在每个PCR产物的末端引入终止密码子并随后是EcoRI位点。一旦扩增，DNA片段用BamHI和EcoRI消化并克隆到pFastBac1载体的相应位点。通过限制性酶切作图表征所获得的构建体，并通过dsDNA测序证实。
[0391] MASP-2的重组真核表达，以及无酶活性的大鼠和人MASP-2A的蛋白产生。
[0392] 上述MASP-2和MASP-2A表达构建体使用标准磷酸钙转染法（Maniatis 等, 1989）转染入DXB1细胞。在无血清培养基中产生MASP-2A以保证制备物不被其它血清蛋白污染。每第二天从汇合细胞收获培养基（总共四次）。对于两个物种各自，重组MASP-2A的水平平均约1.5mg/升培养基。
[0393] MASP-2A蛋白纯化：MASP-2A（上述Ser-Ala突变体）通过亲和层析在MBP琼脂糖柱上纯化。此策略能够不使用外来标签而快速纯化。MASP-2A（用等体积上样缓冲液（50 mM Tris-Cl，pH 7.5，包含150 mM NaCl和25 mM CaCl2）稀释的100-200ml培养基）加载到用10ml上样缓冲液预平衡的MBP琼脂糖亲和柱（4ml）上。用另外10ml上样缓冲液清洗后，蛋白用50mM TrisCl（pH7.5，包含1.25M NaCl和10mM EDTA）洗脱到1ml级分中。包含MASP-2A的级分通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。必要时，MASP-2A通过离子交换层析在MonoQ柱（HR5/
5）上进一步纯化。蛋白用含50mM NaCl的50mM TrisCl，pH7.5透析并加载到同样的缓冲液平衡的柱上。清洗后，结合的MASP-2A用10ml的0.05-1M NaCl梯度洗脱。
[0394] 结果：从200ml培养基获得0.25-0.5mgMASP-2A蛋白产量。由于糖基化，通过MALDIMS确定的77.5kDa的分子量大于未修饰的多肽的计算值（73.5kDa）。所观察的质量是由于每个N糖基化位点处的聚糖附着。MASP-2A在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上以单条带迁移，证明其在生物合成过程中没有被蛋白水解处理。通过平衡超离心确定的重均分子量符合糖基化多肽的同源二聚体的计算值。
[0395] 实施例2
[0396] 本实施例描述用于鉴定阻断MASP-2功能活性的高亲和力全人抗MASP-2scFv抗体候选物以进展到亲和力成熟的筛选方法。
[0397] 背景和基本原理：
[0398] MASP-2是具有很多单独的功能结构域的复合蛋白，包括：一个或多个MBL和纤维胶凝蛋白的结合位点、丝氨酸蛋白酶催化位点、蛋白水解底物C2结合位点、蛋白水解底物C4结合位点、用于MASP-2酶原自活化的MASP-2切割位点和两个Ca++结合位点。scFv抗体片段鉴定为以高亲和力结合MASP-2，并且鉴定的Fab2片段在功能测定中测试以确定它们是否能够阻断MASP-2功能活性。
[0399] 为了阻断MASP-2功能活性，抗体或scFv或Fab2抗体片段必须结合并干扰对于MASP-2功能活性所需的MASP-2上的结构表位。因此，很多或所有的高亲和力结合的抗MASP-2scFv或Fab2不能抑制MASP-2功能活性，除非它们结合直接涉及MASP-2功能活性的MASP-2上的结构表位。
[0400] 测量凝集素途径C3转化酶形成抑制的功能测定用于评价抗MASP-2scFv的“阻断活性”。已知MASP-2在凝集素途径中的基本生理作用是生成凝集素介导的补体途径的下一个功能成分，即凝集素途径C3转化酶。凝集素途径C3转化酶是关键的酶复合物（C4b2a），其蛋白水解切割C3成C3a和C3b。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶（C4b2a）的结构成分；但是，需要MASP-2功能活性以生成两种蛋白成分（C4b、C2a），其组成凝集素途径C3转化酶。并且，对于MASP-2似乎需要上面列举的MASP-2的所有单独的功能活性以生成凝集素途径C3转化酶。由于这些原因，认为用于评价抗MASP-2Fab2和scFv抗体片段的优选的测定是功能测定，其测量凝集素途径C3转化酶形成的抑制。
[0401] 对于治疗性抗MASP-2抗体预测为向人体内施用1mg/kg后获得>90%凝集素途径消除的靶概况是在90%血浆中IC50 <5nM。这些测定格式中体外药学活性和体内药效学之间的关系使用抗啮齿动物MASP-2抗体进行实验验证。
[0402] 选择用于治疗性用途的第一代MASP-2阻断抗体的标准如下：对MASP-2高亲和力并且功能IC50 值至多达~25 nM。另外，筛选对于与非人灵长类动物血清和大鼠血清有交叉反应性的候选物。
[0403] 方法：
[0404] 针对MASP-2抗原的scFv噬菌体文库的筛选。
[0405] 抗原：
[0406] 具有N末端5X 组氨酸标签的人MASP-2A和具有N末端6X组氨酸标签的大鼠MASP-2A使用实施例1中描述的试剂生成并如先前所述（Chen等, J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001)）通过镍亲和层析从培养物上清液中纯化。
[0407] 以Fab2格式的人抗MASP-2抗体OMS100用作结合MASP-2的阳性对照。
[0408] 噬菌体文库描述：
[0409] 人免疫球蛋白轻和重链可变区序列的噬菌体展示文库进行抗原淘选（antigen panning）然后是自动抗体筛选和选择，以鉴定针对大鼠MASP-2蛋白和人MASP-2蛋白的高亲和力scFv抗体。
[0410] 淘选方法：
[0411] 概述：在总共3轮淘选中，使用两种淘选策略以从噬菌体文库中分离结合MASP-2的噬菌体。两种策略涉及在溶液中淘选和钓出结合MASP-2的噬菌体。MASP-2固定化在磁性小珠上，经由靶上的组氨酸标签（使用NiNAT小珠）或经由靶上的生物素（使用链霉亲和素小珠）。
[0412] 前两轮淘选涉及碱性洗脱（TEA），并且第三轮淘选在常规碱性（TEA）洗脱步骤之前首先用MBL竞争性洗脱。在第2和3轮之前进行阴性选择，并且这是针对功能类似物，经典补体途径的C1s和C1r。淘选后，监测具有针对MASP-2A的scFv片段的噬菌体的特异性富集，并且确定淘选策略已成功（数据未显示）。
[0413] 来自第3轮淘选的scFv基因克隆进pHOG表达载体，并进行小规模滤器筛选（filter screening）以寻找针对MASP-2A的特异性克隆，如下进一步所述：
[0414] 表7：噬菌体淘选方法（生物素/链霉亲和素）淘选轮次 抗原(μg) 磁性小珠 阻断 预淘选 洗脱
1 生物素人MASP-2A（10μg） 链霉亲和素 4%斑点阻断 无 TEA（碱性）
2 生物素大鼠MASP-2A (10 μg) 链霉亲和素 4%斑点阻断 C1s/C1r TEA（碱性）
3 生物素人MASP-2A (1 μg) 链霉亲和素 4%斑点阻断 C1s/C1r w/MBL竞争（comp），随后是TEA（碱性）[0415] 表8：噬菌体淘选方法（HIS/NiNTA） 
淘选轮次 抗原(μg) 磁性小珠 阻断 预淘选 洗脱
1 人MASP-2A 加组氨酸标签 (10 μg) NiNTA PBS中4%乳 无 TEA（碱性）
2 大鼠MASP-2A 加组氨酸标签 (10 μg) NiNTA PBS中4%乳 C1s/C1r TEA（碱性）
3 生物素人MASP-2A (10 μg) NiNTA PBS中4%乳 C1s/C1r 用MBL竞争(comp)+TEA（碱性）[0416] 淘选试剂：
[0417] 人MASP-2A
[0418] OMS100抗体（阳性对照）
[0419] 山羊抗人IgG（H+L）（Pierce #31412）
[0420] NiNTA小珠(Qiagen #LB13267)
[0421] Dynabeads® M-280链霉亲和素，10 mg/ml (LB12321)
[0422] 正常人血清（LB13294)
[0423] 多克隆兔抗人C3c（LB13137）
[0424] 山羊抗兔IgG，HRP（American Qualex #A102PU）。
[0425] 为了测试加标签的MASP-2抗原，进行实验以捕获阳性对照OMS100抗体（200ng/ml)，所述OMS100抗体分别与生物素标签的MASP-2A或组氨酸标签的MASP-2A抗原（10 μg）（50μl在4%乳PBS中的NiNTA小珠或200μl链霉亲和素小珠）预孵育。用山羊抗人IgG（H+L）HRP（1：5000）和TMB（3,3',5,5'- 四甲基联苯胺）底物检测结合的MASP-2A-OMS100抗体。
[0426] NiNTA小珠ELISA测定
[0427] 50 μlNiNTA小珠用1ml磷酸缓冲盐水（PBS）中4%乳封闭并在旋转轮（rotator wheel）上在室温孵育1小时。平行地，10μg MASP-2A和OMS100抗体（在4%乳-PBS中稀释到200ng/ml）预孵育一小时。小珠然后用1ml PBS-T清洗三次，在每个步骤间使用磁铁。将与OMS100抗体预孵育的MASP-2A添加到清洗的小珠。混合物在旋转轮上室温孵育1小时，然后如上述使用磁铁用1ml PBS-T清洗3次。试管用1：5000稀释在PBS中4%乳的山羊抗人IgG（H+L）HRP室温孵育1小时。对于阴性对照，在单独的试管中将山羊抗人IgG（H+L）HRP（1：5000）添加到清洗并封闭的NiNTA小珠。
[0428] 样品在旋转轮上室温孵育1小时，然后如上述使用磁铁用1 ml PBS-T清洗3次并用1xPBS清洗1次。添加100μl TMB底物并在室温孵育3分钟。试管置于磁力架上2分钟以浓缩小珠，然后将TMB溶液转移到微量滴定板并且反应用100μl 2M H2SO4终止。在ELISA读数器上读取450nm处的吸收。
[0429] 链霉亲和素小珠ELISA测定
[0430] 本测定如上述对NiNTA小珠的ELISA测定进行，但是使用每个样品200μl链霉亲和素小珠替代和非生物素化的抗原。
[0431] 结果：与阳性对照OMS100抗体预孵育的加组氨酸标签和生物素标签的MASP-2A抗原每个都分别用NiNTA小珠或链霉亲和素小珠成功捕获。
[0432] 淘选
[0433] 分别如表7或表8所示针对组氨酸标签或生物素标签MASP-2A对scFv噬菌体文库进行三轮淘选。第三轮淘选首先用MBL洗脱，然后用TEA（碱性）。为了监测针对靶MASP-2A的展示scFv片段的噬菌体的特异性富集，如下所述进行针对固定化的MASP-2A的多克隆噬菌体ELISA。
[0434] 淘选后富集的多克隆噬菌体上的MASP-2A ELISA
[0435] 如上述对针对人MASP-2的scFv噬菌体文库进行三轮淘选后，通过进行ELISA测定对具有针对靶MASP-2的scFv片段的噬菌体的特异性富集进行监测，所述ELISA在通过针对固定化的MASP-2淘选生成的富集的多克隆噬菌体群体上进行，如下所述。
[0436] 方法：
[0437] 5ng/ml MASP-2A固定化在PBS中的maxisorpELISA板上在4℃过夜。来自所有三轮淘选的包装的噬菌体1：3稀释在4%乳-PBS中，并用3倍稀释液滴定。阴性对照是M13辅助噬菌体。
[0438] 封闭是PBS中的4%乳。每个步骤之间，板在200μl PBS-吐温0.05%（v/v）中清洗3次。一抗是兔α-fd（M13外壳蛋白），1：5000在4%乳-PBS（w/v）中。缀合物是兔α-山羊-HRP以1：
10000在4%乳-PBS（w/v）中。底物是ABTS。所有体积，除了清洗和封闭，是100μl/孔。所有孵育是在室温摇动1小时。
[0439] 结果：
[0440] 噬菌体ELISA的结果显示对于两种淘选策略针对MASP-2A的scFv的特异性富集。参见图2。如图2所示，策略涉及通过NiNTA磁性小珠捕获，经过两轮淘选后获得针对MASP-2的噬菌体上的scFv富集，而在第三轮淘选后两种策略在竞争性和TEA洗脱中均具有良好的富集。阴性对照噬菌体是M13辅助噬菌体，其在其最低稀释下显示针对MASP-2A无交叉反应。这些结果证明所观察的信号是由于scFv特异性结合MASP-2。
[0441] 滤器筛选：
[0442] 挑选来自第三轮淘选的包含编码scFv片段的质粒的细菌克隆，网格化到硝酸纤维素膜上并在非诱导培养基上生长过夜以产生主平板（master plate）。从第三轮淘选总共挑选18000个克隆并分析，一半来自于竞争性洗脱并且一半来自于随后的TEA洗脱。
[0443] 具有细菌克隆的硝酸纤维素膜用IPTG诱导以表达和分泌可溶的scFv蛋白，并使其接触用MASP-2A抗原包被的第二硝酸纤维素膜，一起接触的还有用PBS中4%乳（封闭液）包被的平行进行的膜。
[0444] 结合MASP-2A的scFv经由它们的c-Myc标签用小鼠α-cMyc mAb和兔α-小鼠HRP检测。选择对应对MASP-2A阳性和对乳-PBS阴性的scFv克隆的命中用于进一步表达和后续的ELISA分析。
[0445] 结果：针对MASP-2A的scFv噬菌粒文库的淘选接着scFv转化和滤器筛选获得137个阳性克隆。使用NiNTA和链霉亲和素策略两者，大部分阳性克隆来自于用MBL的竞争性洗脱。所有阳性克隆继续进行微表达（200 μl规模）和后续提取。通过用蔗糖裂解缓冲液和溶菌酶孵育细菌悬浮液（之后上清液通过离心步骤分离）将scFv从细菌周质分离。包含与周质的内容物一起分泌到培养基中的scFv的上清液通过两种测定分析：使用物理吸附的MASP-2A的ELISA和使用胺偶联的MASP-2A的CM5芯片在Biocore上的结合分析，如下面更详细所述。
[0446] 在通过淘选/scFv转化和滤器筛选鉴定的scFv候选克隆上的MASP-2A ELISA
[0447] 方法：
[0448] 4μg/ml MASP-2A固定化在PBS中的maxisorpELISA板（Nunc）上在4℃过夜。第二天，板通过用PBS-吐温（0.05%）清洗3次进行封闭。来自137个scFv候选（如上述生成）的每一个的粗scFv材料（100μl培养基-周质提取物）添加到板的每个孔。接下来，添加抗cMyc并在最终步骤中应用HRP缀合的兔抗小鼠抗体以检测结合的scFv。反应在过氧化物酶底物1-步ABTS（Calbiochem）中显色。阳性对照是在PBS-吐温0.05%中稀释到10μg/ml的OMS100（以Fab2格式的抗MASP-2抗体）。阴性对照是来自XL1-蓝不含质粒的培养基-周质。
[0449] 在每个步骤之间用3x200 μl PBS-吐温0.05% (v/v) 进行清洗。
[0450] 一抗是鼠α-cMyc，1:5000在PBS-吐温0.05% (w/v)中。
[0451] 缀合物是以1:5000在PBS-吐温0.05% (w/v)中的山羊抗人IgG (H+L, Pierce 31412)。底物是ABTS，在室温孵育15分钟。所有体积，除了清洗和封闭，是100μl/孔。所有孵育是在室温摇动1小时。
[0452] 结果：在此ELISA测定中108/137克隆是阳性的（数据未显示），其中45个克隆如下所述进一步分析。阳性对照是在PBS-吐温中稀释到10μg/ml的OMS100 Fab2，并且此克隆是阳性的。阴性对照是来自XL1-蓝不含质粒的培养基-周质，其是阴性的。
[0453] 实施例3
[0454] 此实施例描述用于分析高亲和力全人抗MASP-2 scFv抗体候选在正常人血清中阻断MASP-2活性能力的MASP-2功能筛选方法。
[0455] 基本原理/背景
[0456] 测量凝集素途径C3转化酶形成的抑制的测定
[0457] 测量凝集素途径C3转化酶形成抑制的功能测定用于评价抗MASP-2 scFv候选克隆的“阻断活性”。凝集素途径C3转化酶是酶复合物（C4b2a），其蛋白水解切割C3成两个强效促炎性片段，过敏毒素C3a和调理性的C3b。在介导炎症方面，C3转化酶的形成似乎是凝集素途径的关键步骤。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶（C4b2a）的结构成分；因此抗MASP-2抗体（或Fab2）将不会直接抑制已经存在的C3转化酶的活性。但是需要MASP-2丝氨酸蛋白酶活性以生成两种蛋白成分（C4b，C2a），其组成凝集素途径C3转化酶。因此，抑制MASP-2功能活性的抗MASP-2 scFv（即阻断性的抗MASP-2 scFv）将抑制凝集素途径C3转化酶的从头形成。C3包含不寻常的和高度反应性的硫酯基作为其结构的部分。在此测定中通过C3转化酶切割C3后，C3b上的硫酯基可以与固定化在塑料孔底部的大分子上的羟基或氨基经由酯或酰胺键形成共价键，从而促成C3b在ELISA测定中的检测。
[0458] 酵母甘露聚糖是已知的凝集素途径的活化剂。在下面的测量C3转化酶形成的方法中，包被甘露聚糖的塑料孔与稀释的人血清一起孵育以活化凝集素途径。然后清洗孔并使用标准ELISA方法测定固定化在孔上的C3b。此测定中生成的C3b的量直接反映了凝集素途径C3转化酶的从头形成。测定中测试了在所选浓度的抗MASP-2scFv抑制C3转化酶形成和随后C3b生成的能力。
[0459] 方法：
[0460] 如实施例2中所述鉴定的45个候选克隆表达、纯化并稀释到相同的储存浓度，其再次稀释在包含Ca++和Mg++的GVB缓冲液（4.0 mM巴比妥，141 mM NaCl，1.0 mM MgCl2，2.0 mM CaCl2，0.1%明胶，pH 7.4）中以保证所有克隆具有相同量的缓冲液。scFv克隆每个以2 μg/ml的浓度一式三份进行测试。阳性对照是OMS100Fab2并以0.4μg/ml进行测试。在存在和不存在scFv/IgG克隆的情况下监测C3c形成。
[0461] 甘露聚糖在50mM碳酸盐缓冲液，pH9.5(15mM Na2CO3 + 35mM NaHCO3 + 1.5 mM NaN3)中稀释到20 μg/ml (1 μg/孔)的浓度，并包被在ELISA板上在4℃过夜。次日，甘露聚糖包被的板用200μl PBS清洗3次。然后将100μl 1%HSA封闭液添加到孔中并在室温孵育1小时。板用200μl PBS清洗3次并与200μl PBS储存在冰上直至添加样品。
[0462] 正常人血清在CaMgGVB缓冲液中稀释到0.5%，并且scFv克隆或OMS100 Fab2阳性对照以0.01 μg/ml,1 μg/ml(仅OMS100对照)和10 μg/ml一式三份添加到此缓冲液中，并且在添加到封闭的ELISA板之前在冰上预孵育45分钟。通过在37℃孵育1小时引发反应并通过将板转移到冰浴终止。用兔α-小鼠C3c抗体随后山羊α-兔HRP检测C3b沉积。阴性对照是不含抗体（无OMS100 = 最大C3b沉积）的缓冲液，并且阳性对照是具有EDTA（无C3b沉积）的缓冲液。通过进行相同的测定来确定背景，但是在甘露聚糖阴性的孔中。针对无甘露聚糖的板的背景信号从甘露聚糖阳性信号中减去。截止标准设置在不相关scFv克隆（VZV）和仅缓冲液的活性的一半。
[0463] 结果：基于截止标准，如图3A和3B显示，发现总共13个克隆阻断MASP-2的活性。选择所有产生> 50%途径抑制的13个克隆并测序，获得10个独特的克隆，如下表9中所示。发现表9中显示的10个不同的克隆在补体测定中造成可接受的功能活性。发现所有10个克隆具有相同的轻链亚类，λ3，但是三个不同的重链亚类，VH2、VH3和VH6。这些克隆的种系序列的序列同一性也显示在表9中。
[0464] 表9：具有功能性抗MASP-2活性的10个独特的克隆
[0465]
[0466] 如上文表9中所示，选择具有可接受的功能活性和独特序列的10个不同克隆进行进一步的分析。如表9中所提到的，基于相同序列，一些克隆被检测到两或三次（参见表9具有克隆名称的第一列）。
[0467] 十个svFv候选克隆的表达和纯化
[0468] 表9中所示的十个候选克隆以一升的规模表达并经由离子交换在镍层析中纯化。在那之后，每个克隆的样品在大小排阻层析柱上运行以评价单体和二聚体含量。如下表10中所示，几乎所有scFv克隆以单体形式存在，并且分离此单体级分用于进一步测试和评级。
[0469] 表10：单体含量分析
[0470]
[0471] 测试单体级分的结合和功能活性
[0472] 表10中显示的克隆以1L规模表达，在金属层析和离子交换上纯化，通过大小排阻层析（SEC）分离单体级分，并且重复功能测定以确定IC50 值和交叉反应性。
[0473] 单体级分的功能测定
[0474] 纯化表10中显示的前十个克隆的单体级分并在系列稀释中测试功能IC50 nM，其中每个克隆接受相同浓度的含钙和镁的GVB缓冲液和人血清。scFv克隆在12个稀释中一式三份进行测试。阳性克隆是OMS100 Fab2。在存在或不存在抗体的情况下监测C3b沉积。结果示于下表11中。
[0475] 结合测定:
[0476] 以两种不同方法确定十个候选scFv克隆的纯化的单体级分的结合亲和力KD。MASP-2A或者通过胺偶联固定化到CM5芯片上，或者固体浓度的scFv（50nM）首先用胺偶联的高亲和力α-cMyc抗体捕获，并且然后使溶液中的MASP-2A的浓度系列经过芯片。结果示于下表11中。
[0477] 结果：
[0478] 表11：对于以单体状态测定的十个候选scFv克隆的功能抑制活性（IC50）和MASP-2结合亲和力（KD）的总结
[0479]
[0480]
[0481] 结果讨论
[0482] 如表11所示，在功能测定中，10个候选scFv中的5个使用0.5%人血清给出了低于25nM靶标准的IC50 nM值。如下面所述，这些克隆在存在非人灵长类动物血清和大鼠血清的情况下进一步测试以确定在其它物种中的功能活性。关于结合亲和力，在溶液中所有结合亲和力都在低nM的范围或更好，而使用固定化的MASP-2的常规测定中，仅两个克隆（4D9和
17D20）在低nM范围具有亲和力。在基于溶液的测定中更高亲和力的观察结果可能是当在溶液中抗原多聚化的事实造成的。并且，当靶固定化在芯片上（经由定向偶联）时，表位可能被遮蔽，从而减少在固定化测定中观察到的亲和力。
[0483] 实施例4
[0484] 此实施例描述测试十个候选人抗MASP-2scFv克隆与大鼠MASP-2的交叉反应性的结果和在功能测定中确定这些scFv克隆的IC50值的结果，所述功能测定确定它们在人血清、非人灵长类动物血清和大鼠血清中抑制MASP-2依赖的补体活化的能力。
[0485] 方法：
[0486] 与大鼠MASP-2的交叉反应性
[0487] 在针对吸附的大鼠MASP-2A的常规ELISA测定中测试了实施例3的表9中显示的十个候选scFv克隆针对大鼠MASP-2A的交叉反应性。大鼠MASP-2A在PBS中稀释到4μg/ml并包被在Maxisorp ELISA板（Nunc）上在4℃过夜。第二天，板通过在PBS-吐温（0.05%）中清洗3次进行封闭。在PBS-吐温中稀释到20μg/ml的scFv克隆（100μl）添加到板，并进一步用4倍稀释液滴定三次。用抗cMyc和兔抗小鼠HRP第二抗体检测MASP-2A特异性scFv克隆（包含结合的scFv的孔）。反应在过氧化物酶底物TMB（Pierce）中显色。阳性对照是在PBS-吐温中稀释到10μg/ml的OMS100 Fab2。所有测试的克隆显示与大鼠MASP-2A的交叉反应，其是预期的，因为第二轮淘选用大鼠MASP-2（数据未显示）。
[0488] 十个候选scFv克隆在人血清、非人灵长类动物（NHP）血清和大鼠血清中的功能表征
[0489] 在不同血清中基线C3c水平的确定
[0490] 首先，如下进行实验以比较在三种血清（人、大鼠和NHP）中基线C3b水平。
[0491] 甘露聚糖稀释到20μg/ml并包被在ELISA板上在4℃过夜。第二天孔用1%HSA封闭。正常人、大鼠和非洲绿猴血清（非人灵长类动物“NHP”）血清从2%开始用2倍稀释法稀释到CaMgGVB缓冲液中。通过在37℃孵育1小时引发反应并通过将板转移到冰浴终止。用兔抗小鼠C3c抗体随后山羊抗兔HRP检测C3b沉积。阴性对照是不含抗体（无OMS100导致最大C3b沉积）的缓冲液，并且抑制的阳性对照是具有EDTA（无C3b沉积）的缓冲液。
[0492] 图4图解阐释了三种血清（人、大鼠和NHP）中C3c水平的基线。如图4所示，在所测试的不同血清中C3c水平非常不同。当比较C3c水平时，似乎1%人血清给出如0.2%NHP和0.375%大鼠血清等效的水平。基于这些结果，血清的浓度进行归一化使得scFv结果可以在三种不同类型的血清中直接比较。
[0493] 在不同血清中的scFv克隆的功能测定
[0494] 然后测试十个候选scFv克隆的纯化的单体级分在人血清、大鼠血清和非洲绿猴血清（非人灵长类动物“NHP”）中功能 IC50 nM。如实施例3中所述进行测定，使用1000nMscFv纯化的蛋白和任一的在CaMgGVB缓冲液中稀释到0.9%的正常人血清，或在CaMgGVB缓冲液中稀释到0.2%的非洲绿猴血清，或在CaMgGVB缓冲液中稀释到0.375%的大鼠血清。所有十个scFv克隆在稀释系列中进行测试，其中它们接受相同浓度的含有钙和镁的GVB缓冲液和血清。scFv克隆在12个稀释中一式三份进行测试。阳性对照是在100ng/ml的OMS100 Fab2或向反应添加EDTA。阴性对照是不相关的scFv对照或不含scFv的PBS。在存在或不存在scFv或Fab2抗体的情况下监测C3b沉积。在100ng/ml的OMS100的背景信号从所有信号中减去。表12总结了在所有三种血清中功能测定的结果。
[0495] 表：12：在三种不同类型的血清中scFv克隆的功能IC50 (nM)活性。
[0496]
[0497]
[0498] 注意：* 在人血清（实验#1）上的第一组数据在未浓缩的scFv样品上完成，因此，具有低浓度的克隆无法充分滴定。在剩余的实验中，所有克隆被浓缩并且滴定在相同浓度开始。
[0499] 在不同血清中scFv候选克隆的功能活性的结果总结：
[0500] 在血清以关于C3b沉积水平进行归一化之后，在人和非人灵长类动物（NHP）血清中所有十个scFv克隆均显示功能。在人血清中的六个最有活性的克隆是：当从最好到最差排列时，9P13>17N16>17D20>4D9>3F22>18L16。在NHP血清中，克隆排列为（最好到最差）：17L20>17N16>17D20>9P13>18L16>3F22。17N16和17D20在人和NHP血清中均排在前三。17D20还在大鼠血清中显示一些活性。
[0501] 基于这些结果，前三scFv克隆确定为：18L16、17D20和17N16。如下表13中所示，这三个克隆进一步在稀释的人血清（1%血清）中分析。
[0502] 表13：三个候选克隆的C3测定：稀释血清（1%）中的(IC50 nM)
[0503]
[0504] 图5A是全长scFv克隆17D20、18L16、4D9、17L20、17N16、3F22和9P13的氨基酸序列比对。scFv克隆包括重链可变区（氨基酸1-120）、接头区（氨基酸121-145）和轻链可变区（氨基酸146-250）。如图5A所示，最有活性的克隆的重链区（残基1-120）的氨基酸序列比对揭示两个不同组分别属于VH2和VH6基因家族。如图5A所示，关于VH2类的克隆：17D20、18L16和4D9的VH区在总共120个氨基酸区中20个氨基酸位置具有变异（即83%同一性）。
[0505] 如图5A进一步所示，关于VH6类的克隆：17L20、17N16、3F22和9P13的VH区在总共120个氨基酸区中18个氨基酸位置具有变异（即85%同一性）。
[0506] 图5B是scFv克隆17D20、17N16、18L16和4D9的序列比对。
[0507] 表14：图5A和5B中显示的scFv候选克隆的序列
[0508]
[0509] 排列次序为（1）人血清功能效价和全阻断；（2）NHP交叉反应性和（3）序列多样性。选择17D20和17N16作为来自每个基因家族的最佳代表。选择18L16作为具有可评估的CDR3序列多样性的第三候选。
[0510] 由于完全的功能阻断，17N16和17D20是前两个选择，具有最好的针对人的功能效价；可评估的猴交叉反应性和不同的VH基因家族。由于VH序列几乎与17N16相同，所以除去3F22和9P13。由于温和的效价，所以除去18P15、4J9和21B17。17L20没有继续，因为其仅部分阻断。
[0511] 相比17D20，18L16和4D9具有类似的活性和可评估的多样性。选择18L16因为比4D9更高的灵长类动物交叉反应性。
[0512] 因此，基于这些标准：下列三个母克隆：17D20、17N16和18L16进入如下进一步描述的亲和力成熟。
[0513] 实施例5
[0514] 此实施例描述了三个母克隆17D20、17N16和18L16（如实施例2-4中所述鉴定）克隆成野生型IgG4格式和评价三个母克隆作为全长IgG的功能性。
[0515] 基本原理：
[0516] 如实施例2-4中所述使用噬菌体展示鉴定具有中等功能效价的全长人抗MASP-2scFv抗体。选择这三个母克隆17D20、17N16和18L16用于亲和力成熟。为了评价这些母克隆作为全长IgG的功能性，产生了这些抗体的IgG4野生型和S228P铰链区IgG4突变形式。包括了S228P铰链区突变体以增加血清稳定性（参见Labrijn A.F. 等, Nature Biotechnology 
27:767 (2009)）。
[0517] IgG4野生型的氨基酸序列描述为SEQ ID NO:63，由SEQ ID NO:62编码。
[0518] IgG4 S228P的氨基酸序列描述为SEQ ID NO:65，由SEQ ID NO:64编码。
[0519] 还用胃蛋白酶消化将IgG4分子切割为F(ab')2格式，并通过大小排阻层析分级以使母克隆与OMS100对照抗体直接比较，后者是F（ab）2分子。
[0520] 方法：
[0521] 使克隆生成全长格式
[0522] 三个母克隆转化为野生型IgG4格式和IgG4突变体S228P格式。这通过如下实现：将适当的VH和VL区域从上面引用的母克隆PCR分离并将它们克隆入含有适当的重链恒定区的pcDNA3表达载体以创造框架内融合以产生所希望的抗体。以突变IgG4格式的三个母克隆然后用胃蛋白酶切割以产生F(ab')2片段，并且后者通过在大小排阻层析柱上分级进行纯化。
[0523] 结合测定
[0524] 转化成IgG4格式的候选母克隆瞬时转染进HEK293细胞并且来自瞬时转染的上清液在ELISA测定中滴定。克隆显示与物理吸附的人MASP-2A优秀的反应性并以下列顺序排列：17N16>17D20>18L16 (数据未显示)。
[0525] 然后纯化克隆并在如下的ELISA和活性测定中再测试。人MASP-2A以3 μg/ml在PBS中包被在maxisorp板上，IgG（45g/ml）和Fab'2 (30 μg/ml) 在PBS-吐温中稀释到300nM的开始浓度并进一步3倍稀释。用HRP缀合的山羊α-人IgG（Southern Biotech）检测IgG，并且用HRP缀合的山羊α-人IgG H+L（Pierce 31412）检测F(ab')2。反应用TMB底物显色并用2MH2SO4终止。结果示于下表15中。
[0526] 表15：对人MASP-2的结合亲和力
[0527]
[0528] 功能测定
[0529] 使用如实施例4中所述使用1%正常人血清（NHS）的C3转化酶测定以比较母克隆scFv克隆和在1%NHS中的全长IgG4对应物的功能活性。甘露聚糖稀释到20μg/ml的浓度并包被在ELISA板上在4℃过夜。第二天孔用1%人血清封闭。人血清在CaMgGVB缓冲液和纯化的抗体中稀释到1%，scFv (900 nM)、F(ab')2 (300 nM)、IgG (300 nM)一式两份以不同稀释度系列添加到相同量的缓冲液，并且在添加到封闭的ELISA板之前在冰上预孵育45分钟。通过在37℃孵育1小时引发反应并通过将板置于冰上终止。用兔α-小鼠C3c抗体随后山羊α-兔HRP确定C3b沉积。在甘露聚糖阳性板上以50nM的OMS100的背景从曲线中减去。此分析的结果的总结显示在下表16中。
[0530] 表16：使用1%人血清的C3转化酶测定（IC50 nM）
[0531]
[0532] 注意：表16的2-4列中显示的两个值指两个单独的实验的结果。
[0533] 对每个克隆，IgG4母克隆的功能效价也与IgG4铰链突变体（S228P）相比。使用1%NHS的C3b沉积测定的数字IC50值显示在下表17中。
[0534] 表17：在1%人血清（IC50）中的C3b沉积中野生型（IgG4）相对铰链突变体格式（S228P）
[0535]
[0536] 如上表17中所述，在一些情况下，对于衍生自拮抗性的scFv的 IgG'注意到未预期的激动剂药理学。对此观察结果的机理基础尚未理解。
[0537] 在1%NHS中具有抑制功能的IgG4转化的母克隆的活性在更严谨的测定条件（更接近模拟生理条件）下进行了进一步的评价。为了在生理条件下评估抗体活性，在严谨的测定条件下，使用最低稀释的（90%）人血浆，对母克隆IgG4制备物测试其抑制凝集素途径（LP）依赖的C3b沉积到甘露聚糖包被的板的能力。
[0538] 在90%人血浆中的C3b沉积测定的结果显示在图6中。由于MASP-2和其底物以比在稀释血浆测定中使用1%正常人血清中高约100倍的浓度存在于测定混合物中，通常预期拮抗剂剂量-应答曲线右移。如图6中所示，对OMS100和所有测试的MASP-2抗体观察到如预期的向更低表观效价的右移。然而，令人惊讶地，对于17D20的铰链区突变体（S228P）没有观察到表观效价的减少，并且此格式中的效价与在1%血浆中所测量的相当（参见表17）。在90%NHS测定格式中，发现17D20 IgG4（S228）的功能效价比OMS100Fab2略低，这与在1%NHS中的测定结果相反，其中OMS100比17D20IgG4 S228P效力高50到100倍（数据未显示）。17N16的野生型IgG4形式在90%NHS中也显示完全的抑制，但是在此测定格式中稍微效价较低（IC50 ≈ 15nM），而18L16的野生型IgG4形式效价较低并且仅部分抑制，如图6所示。
[0539] 基于这些发现，IgG4转化的母克隆的活性通过在严谨测定条件下（90%NHS）检查C4b沉积进一步评价。此测定格式对关于由MASP-2催化的酶反应的抗体活性提供直接的测量。
[0540] 测量MASP-2依赖的C4切割的抑制的测定
[0541] 背景：MASP-2的丝氨酸蛋白酶活性是高度特异性的，并且已鉴定了仅两个MASP-2的蛋白底物，C2和C4。C4的切割生成C4a和C4b。抗MASP-2 Fab2可以结合MASP-2上的结构表位，该表位直接涉及C4切割（例如，MASP-2对C4的结合位点；MASP-2丝氨酸蛋白酶催化位点）并由此抑制MASP-2的C4切割功能活性。
[0542] 酵母甘露聚糖是已知的凝集素途径的活化剂。在下面的测量MASP-2的C4切割活性形成的方法中，包被甘露聚糖的塑料孔在4℃与90%的人血清一起孵育90分钟以活化凝集素途径。然后清洗孔并使用标准ELISA方法测定固定化在孔上的人C4b。此测定中生成的C4b的量是MASP-2依赖的C4切割活性的量度。此测定中测试了在所选浓度的抗MASP-2抗体它们抑制C4切割的能力。
[0543] 方法：96孔Costar中结合力板与稀释在50mM碳酸盐缓冲液，pH9.5中1.0 µg/50 µL/孔的甘露聚糖在5℃孵育过夜。每孔用200µL PBS清洗3次。孔然后用100µL/孔的PBS中的1%牛血清白蛋白封闭并在室温温和混合孵育1小时。每孔用200µL PBS清洗3次。抗MASP-2抗体样品在含Ca++和Mg++的GVB缓冲液（4.0 mM barbital、141 mM NaCl、1.0 mM MgCl2、2.0 mM CaCl2、0.1%明胶，pH 7.4）中在5℃稀释到选择的浓度。在5℃将90%人血清添加到上述样品中，并且向每孔转移100µL。板覆盖并在冰水浴中孵育90分钟以允许补体活化。通过向反应混合物添加EDTA终止反应。每孔用PBS吐温20（在PBS中0.05%吐温20）清洗5 x 200 µL，然后每孔用200µLPBS清洗2次。100µL/孔生物素缀合的鸡抗人C4c(Immunsystem AB, Uppsala, Sweden) 的1：700稀释添加到包含2.0mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的PBS中并在室温下温和混合孵育1小时。每孔用PBS清洗5 x 200 µL。100µL/孔0.1 µg/ml的过氧化物酶缀合的链霉亲和素(Pierce Chemical #21126) 添加到包含2.0mg/mlBSA的PBS中并在室温下在摇床上温和混合孵育1小时。每孔用PBS清洗5 x 200 µL。添加100 µL/孔的过氧化物酶底物TMB（Kirkegaard & Perry Laboratories)并在室温孵育16分钟。过氧化物酶反应通过添加100 µL/孔的1.0 M H3PO4终止并测量OD450。
[0544] 结果：
[0545] 在此格式中，17D20的两种IgG4形式均抑制凝集素途径驱动的C4b沉积，尽管IC50值比C3b沉积测定高约3倍。有趣的是，此测定中17N16 IgG4野生型显示良好的活性，具有与C3b沉积测定相当的IC50值和剂量-应答概况。18L16明显效价更低并且在此格式中没有实现完全的抑制（数据未显示）。
[0546] 讨论：
[0547] 如实施例2-5中所述，具有功能阻断活性的全人抗MASP-2scFv抗体使用噬菌体展示进行鉴定。选择这三个克隆，17N16、17D20和18L16用于亲和力成熟和进一步的测试。为了评价这些母克隆作为全长IgG的功能性，产生了这些抗体的IgG4野生型和IgG4 S228P铰链区突变形式。如此实施例中所述，当在用1%人血浆的标准功能测定格式中测试时，大部分全长IgG与它们的scFv对应物相比具有改善的功能活性。为了估计生理条件下的抗体活性，在使用90%人血浆的严谨测定条件下进行母克隆IgG4制备物的测试。在这些条件下，基于在标准（1%）血浆功能测定中它们的性能，几个抗体揭示了基本上好于预期的功能效价。
[0548] 实施例6
[0549] 此实施例描述了母克隆17D20、17N16和18L16的链重排和亲和力成熟，以及所获得的子克隆的分析。
[0550] 方法：
[0551] 为了鉴定具有改善的效价的抗体，如实施例2-5中所述鉴定的三个母scFv克隆17D20、17N16和18L16进行轻链重排。此过程涉及由每个母克隆的VH配对来自六个健康供体的幼稚，人类λ轻链（VL）的文库组成的组合文库的生成。然后筛选此文库具有改善的结合亲和力和/或功能性的scFv克隆。
[0552] 每个母克隆分析了9000个轻链重排的子克隆，总共27000个克隆。每个子克隆诱导表达和分泌可溶的scFv并筛选结合人MASP-2A的能力。结合人MASP-2A的scFv经由它们的c-Myc标签检测。此初始筛选获得总共119个克隆的选择，其包括来自17N16文库的107个子克隆，来自17D20文库的8个子克隆和来自18L16文库的4个子克隆。
[0553] 119个克隆以小规模表达，在NiNTA柱上纯化并在ELISA测定中测试针对物理吸附的人MASP-2A的结合亲和力。
[0554] 结果：
[0555] 关于119个子克隆的代表性子集的ELISA测定结果显示在图7A和B中。图7A图解阐释了关于17N16母克隆相对子克隆对人MASP-2A滴定的ELISA测定的结果。图7B图解阐释了关于17D20母克隆相对子克隆对人MASP-2A滴定的ELISA测定的结果。
[0556] 如图7A所示，衍生自17N16母克隆的子克隆17N16m_d16E12 and 17N16m_d17N9具有高于母克隆的亲和力。并且，如图7B所示，一个衍生自17D20母克隆的克隆17D20m_d18M24具有比母克隆更高的亲和力。这三个克隆和额外的三个克隆：具有低表达水平的17N16m_d13L12、17N16m_d16K5、17N16m_d1G5和17D20m_d1824以0.5L规模表达，通过大小排阻层析纯化成单体级分并且在ELISA和功能测定中再测试。18L16文库不产生任何具有所希望的结合亲和力的子克隆。
[0557] 纯化后，在补体测定中测试6个子克隆的抑制活性。结果示于表18中。
[0558] 表18：母克隆和子克隆的补体测定
[0559]
[0560] 如上表18所示，这些克隆中仅一个17N16m_d17N9具有如母克隆相同范围的亲和力和活性。
[0561] 图8是全长scFv母克隆17N16 (SEQ ID NO:59)和17N16m_d17N9子克隆(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列比对，显示这两个克隆之间轻链（从SYE开始）具有17个氨基酸残基不同。
[0562] 对17N16λ文库的再筛选获得了几个额外的候选子克隆，其中在ELISA和补体测定中鉴定了17N16m_d27E13，并且包括在候选子克隆的集合中用于进一步的分析。
[0563] 在不同血清中测定子克隆
[0564] 如下在不同血清中分析候选子克隆。甘露聚糖稀释到20μg/ml并包被在ELISA板上在4℃过夜。第二天孔用1%HSA封闭。在CaMgGVB缓冲液中非洲绿猴血清稀释到0.2%，大鼠血清稀释到0.375%并且人血清稀释到1%。来自候选子克隆的每一个的纯化的scFv一式两份以不同浓度系列添加到相同量的缓冲液中，并在添加到封闭的ELISA板之前在冰上预孵育45分钟。通过在37℃孵育1小时引发反应并通过将板转移到冰浴终止。用兔α-小鼠C3c抗体随后山羊α-兔HRP检测C3c释放。在甘露聚糖阴性板上以0.1μg/ml的OMS100的背景从这些曲线中减去。结果总结在下表19中。
[0565] 表19：母克隆17N16和子克隆17N16m_d17N9和17N16m_d27E13在不同血清中的IC50值
[0566]
[0567] 注意：表19的2-4列中显示的两个值指两个单独的实验的结果。
[0568] 结果讨论:
[0569] 如表19所示，子克隆17N16m_d17N9具有比母克隆更高的功能活性。除了与母克隆相比在轻链中17个氨基酸序列的差异之外，大鼠血清中改善的功能使得此克隆是阳性候选。基于此数据，选择子克隆17N16m_d17N9用于进一步分析。
[0570] 实施例7
[0571] 此实施例描述衍生自母克隆17D20的子克隆17D20m_d3521N11的生成和分析。
[0572] 背景/基本原理：
[0573] 为了改善母克隆候选17D20mc的亲和力，在重链的CDR3的前三个氨基酸中进行了额外的“浏览突变”。这是与17D20mc的正常轻链重排平行的突变活动。因此，通过PCR构建三个不同的scFv文库，其中使用简并密码子将氨基酸位置1、2和3对所有可能的20种氨基酸的集合进行随机化。克隆文库后，进行微规模表达并且在包被MASP-2A的CM5芯片上监测scFv结合（未显示）。在包被MASP-2A的芯片上对在位置1、2和3随机化的三个不同的文库进行微规模表达的BIAcore分析，并鉴定潜在有意思的子克隆。
[0574] 观察到对于CDR-H3的氨基酸位置1、2和3，没有发现克隆相比母候选克隆17D20m具有改善的解离率。但是在CDR-H3的氨基酸位置3具有突变的一些候选展示了相比母候选克隆17D20m改善的解离率。这些克隆（#35、#59和#90）测序以鉴定突变。两个衍生自“浏览突变”的克隆的序列与17D20mc（原始序列）相比。有意思的是，所有测序的克隆除了一个（#90）相比母候选包含Ala-Arg取代。
[0575] 图9是scFv母克隆17D20m的重链区的氨基酸序列(SEQ ID NO:18的氨基酸61-119）与CDR-H3中具有突变的scFv克隆：克隆#35（SEQ ID NO:20的氨基酸61-119，在SEQ ID NO:18的位置102具有R对A的取代）、克隆#59（与克隆#35相同的序列）、和克隆#90（SEQ ID NO:
18的位置102具有P对A的取代）的CDR-H3区的氨基酸序列的序列比较。
[0576] 突变体克隆#35和#59的分析
[0577] 突变体克隆#35和#59以小规模表达并进一步测试，在固定化MASP-2A（10 μg/ml）的滴定ELISA中与母候选克隆17D20比较。scFv从20μg/ml开始5倍系列稀释并且使用抗Myc（小鼠）/抗小鼠HRP进行检测。对于候选克隆#35和#59相比母候选克隆17D20在ELISA测定中观察到轻微改善的结合（数据未显示）。
[0578] 改善的克隆#35与最佳轻链重排的克隆17D20m_d21N11组合。候选17D20md35 (Ala-Arg)的VH中的突变与候选17D20m_d21N11的轻链组合，从而获得称为VH35-VL21N11的克隆，否则称为3521N11。
[0579] 图10A是母克隆17D20的CDR3区的序列（SEQ ID NO:18的氨基酸61-119）、具有相同序列的子克隆17D20m_d21N11相同区域和组合17D20m_d21N11的VL的突变克隆#35（称为“3521N11”）的相同区域(SEQ ID NO:20的氨基酸61-119)的氨基酸序列比对。高亮的VH序列区域包括CDRH3，并且突变的靶残基区域加下划线。
[0580] 图10B是包括17D20母克隆的VL和VH区的全长scFv(SEQ ID NO:55)和子克隆17D20m_d21N11 (SEQ ID NO:67)的蛋白序列比对。scFv子克隆17D20m_d3521N11描述为SEQ ID NO:68。注意：已经确定图10B中在位置220的X残基是“E”，如SEQ ID NO:68中所述。
[0581] 图10B中显示的scFv的集合的滴定ELISA测定在MASP-2（10 μg/ml）上运行。结果示于表20中。
[0582] 表20：在人MASP-2上的ELISA
[0583]
[0584] 如下文实施例8中所述进一步分析17D20m_d3521N11子克隆的功能活性。
[0585] 实施例8
[0586] 此实施例描述候选克隆17N16m_d17N9和17D20m_d3521N11向IgG4、IgG4/S228P和IgG2格式的转化和分析。
[0587] 基本原理/背景
[0588] 实施例2-7中所述的抗体筛选方法已经鉴定了具有合适的功能性的母克隆17N16和17D20。这些母克隆的亲和力成熟已获得了在替代功能测定中在scFv水平相比母克隆显示约2倍效价改善的子克隆。具有最佳活性的子克隆是17N16m_d17N9和17D20m_d3521N11。如实施例6中所述，在17N16母克隆与轻链重排的子克隆（scFv格式，1%NHS测定）的功能活性的比较中，确定17N16m_d17N9比母克隆效价稍微更高并且在此测定中所有测试的子克隆中具有最佳的功能效价。
[0589] 方法：
[0590] 在如实施例5中所述进行的C3转化测定（1%人血清和90%人血清）中和C4转化测定（90%人血清）中进行候选scFv克隆的功能效价的比较。
[0591] 结果示于下表21中。
[0592] 表21：领先的子克隆和它们各自的母克隆（所有以scFv格式）以IC50 (nM)的功能效价的比较
[0593]
[0594] 如上表21中所示，在C3测定中当在90%正常人血清（NHS）中测定时，17N16m_d17N9具有良好的活性，并且比以此格式的其它子克隆效价更高。
[0595] 候选克隆向IgG4、IgG4/S228P和IgG2格式的转化
[0596] 所有这些候选克隆都转化成IgG4、IgG4/S228P和IgG2格式用于进一步分析。
[0597] SEQ ID NO:62: 编码野生型IgG4的cDNA
[0598] SEQ ID NO:63: 野生型IgG4多肽
[0599] SEQ ID NO:64: 编码IgG4突变体S228P的cDNA
[0600] SEQ ID NO:65:IgG4突变体S228P多肽
[0601] SEQ ID NO:69: 编码野生型IgG2的cDNA
[0602] SEQ ID NO:70: 野生型IgG2多肽。
[0603] 表22：候选克隆的总结：
[0604]
[0605] 测试单克隆抗体#1-6与非人MASP-2蛋白（非洲绿猴（AG））在C3测定中交叉反应的能力，以确定是否这些抗体可以用于在动物模型（其对于人将是可预测的）中测试毒性。还在C3b沉积测定和C4测定中在90%人血清中测试单克隆抗体#1-6。结果示于下表23中。
[0606] 表23：在90%人血清中人抗MASP-2MoAb（IC50 nM）
[0607]
[0608] 图11A图解阐释对衍生自人抗MASP-2单克隆抗体母克隆17N16的子克隆同种型变体（MoAb#1-3）进行的C3b沉积测定的结果。
[0609] 图11B图解阐释对衍生自人抗MASP-2单克隆抗体母克隆17D20的子克隆同种型变体（MoAb#4-6）进行的C3b沉积测定的结果；
[0610] 如表23和图11A和11B所示，人抗MASP-2单克隆抗体（MoAb#1-6）以高亲和力结合MASP-2，并且在90%人血清中抑制C3和C4活性的功能。还注意到人抗MASP-2MoAb与非人MASP-2蛋白（非洲绿猴）交叉反应，其提供用于毒性研究的动物模型（其对于人将是可预测的）。
[0611] 在95%人血清和95%非洲绿猴血清中进一步分析MoAb#1-6。结果总结在下表24中。
[0612] 表24
[0613]
[0614] 图12A和12B图解阐释在C3b沉积测定中在95%正常人血清中的母克隆和MoAb#1-6的测试。
[0615] 图13图解阐释在95%正常人血清中C4b沉积的抑制。
[0616] 图14图解阐释在95%非洲绿猴血清中C3b沉积的抑制。
[0617] 进一步测试MoAb#1-6选择性抑制凝集素途径的能力，通过测定大鼠C3b的抑制，预组装的MBL-MASP-2复合物的抑制，经典途径抑制和对C1s的选择性。结果总结在表25中。
[0618] 表25：功能测定结果的总结
[0619]
[0620] 图15图解阐释通过MoAb#2、3、5和6的预组装的MBL-MASP-2复合物的C4切割活性的抑制。
[0621] 图16图解阐释MoAb#6相比C1s对人MASP-2的优先结合。
[0622] 表26以各种格式的子克隆的序列的总结： 克隆ID 描述 SEQ ID NO:
17N16m_d17N9 轻链基因序列 71
17N16m_d17N9 轻链蛋白序列 72
17N16m_d17N9 IgG2重链基因序列 73
17N16m_d17N9 IgG2重链蛋白序列 74
17N16m_d17N9 IgG4重链基因序列 75
17N16m_d17N9 IgG4重链蛋白序列 76
17N16m_d17N9 IgG4突变的重链基因序列 77
17N17m_d17N9 IgG4突变的重链蛋白序列 78
17D20_3521N11 轻链基因序列 79
17D20_3521N11 轻链蛋白序列 80
17D20_3521N11 IgG2重链基因序列 81
17D20_3521N11 IgG2重链蛋白序列 82
17D20_3521N11 IgG4重链基因序列 83
17D20_3521N11 IgG4重链蛋白序列 84
17D20_3521N11 IgG4突变的重链基因序列 85
17D20_3521N11 IgG4突变的重链蛋白序列 86
17N16m_d17N9 编码全长scFv多肽的cDNA 87
17D20m_d21N11 编码全长scFv多肽的cDNA 88
17D20m_d3521N11 编码全长scFv多肽的cDNA 89
[0623] 实施例9
[0624] 此实施例描述对几个阻断性人抗MASP-2MoAb进行的表位作图。
[0625] 方法：
[0626] 如实施例1中所述产生下列重组蛋白：
[0627] 人MAp19
[0628] 人MASP-2A
[0629] 人MASP-2 SP
[0630] 人MASP-2 CCP2-SP
[0631] 人MASP-2 CCP1-CCP2-SP
[0632] 人MASP-1/3 CUB1-EGF-CUB2
[0633] 人MASP-1 CCP1-CCP2-SP。
[0634] 通过斑点杂交分析，关于表位结合，分析抗MASP-2抗体OMS100和MoAb#6（35VH-21N11VL），其两者均已证明以高亲和力结合人MASP-2并具有阻断功能性补体活性的能力（参见实施例6-8）。
[0635] 斑点杂交分析
[0636] 将上述重组MASP-2多肽的连续稀释点样到硝酸纤维素膜上。点样的蛋白的量从50ng到5pg，以10倍步骤。在后来的实验中，点样的蛋白的量的范围从50ng降到16 pg，再次以5倍步骤。膜用在TBS中的5%脱脂乳粉（封闭缓冲液）封闭，然后与1.0μg/ml抗MASP-2Fab2在封闭缓冲液（含5.0mMCa2+）中孵育。使用HRP缀合的抗人Fab（AbD/Serotec; 1/10,000稀释）和ECL检测试剂盒（Amersham）检测结合的Fab2。一张膜与多克隆兔抗人MASP-2 Ab（描述于Stover等, J Immunol 163:6848-59 (1999)）孵育作为阳性对照。在此情况下，使用HRP缀合的山羊抗兔IgG（Dako; 1/2,000稀释）检测结合的Ab。
[0637] 结果：
[0638] 结果总结在表27中。
[0639] 表27：表位作图
[0640]
[0641] 结果显示MoAb#6和OMS100抗体对于MASP-2高度特异性并且不结合MASP-1或MASP-3。没有抗体结合Map19和不含MASP-2的CCP1结构域的MASP-2片段，导致结论是结合位点包括CCP1结构域。
[0642] 实施例10
[0643] 此实施例证明静脉内施用后，人抗MASP-2MoAb#6抑制非洲绿猴中的凝集素途径。
[0644] 方法：
[0645] MoAb#6以1mg/kg的剂量静脉内施用给三只非洲绿猴的第一组和以3mg/kg的剂量施用给三只非洲绿猴的第二组。施用2、4、8、10、24、48、72和98小时后获得血液样品并测试是否存在凝集素途径活性。
[0646] 如图17所示，静脉内施用抗人MoAb#6后凝集素途径被完全抑制。
[0647] 实施例11
[0648] 此实施例证明MASP-2抑制剂，例如抗MASP-2抗体，对于辐射暴露的治疗和/或对于急性辐射综合征的治疗、改善或预防是有效的。
[0649] 基本原理：
[0650] 对高剂量的电离辐射的暴露通过两个主要机制导致死亡：骨髓毒性和胃肠综合征。骨髓毒性导致所有的血液细胞下降，通过感染和出血诱发机体死亡。胃肠综合征更严重并且通过由于肠道上皮细胞层解体的肠屏障功能丧失和肠内分泌功能丧失驱动。这导致败血症及相关全身炎症应答综合征，其可导致死亡。
[0651] 补体的凝集素途径是引发响应组织损伤和暴露于外表面（即细菌）的炎症的先天免疫机制。此途径的阻断在缺血性肠组织损伤或败血性休克的小鼠模型中导致更好的结果。据推测，凝集素途径可以触发响应于辐射诱导的组织损伤的过度的和有害的炎症。因此，凝集素途径的阻断可以减少继发性损伤，并增加急性辐射暴露的生存。
[0652] 如此实施例中所述进行的本研究的目标是通过施用抗鼠MASP-2抗体在辐射损伤的小鼠模型中评价凝集素途径阻断对存活的效果。
[0653] 研究#1
[0654] 方法和材料：
[0655] 材料在本研究中使用的测试品是（i）高亲和力的抗鼠MASP-2抗体（mAbM11）及（ii）高亲和力的抗人MASP-2抗体（mAbOMS646），其阻断转染的哺乳动物细胞中产生的凝集素补体途径的MASP-2蛋白成分。给药浓度是1mg/kg的抗鼠MASP-2抗体（mAbM11），5mg/kg的抗人MASP-2抗体（mAbOMS646）或无菌盐水。对于每个给药期，制备足够体积的新鲜给药溶液。
[0656] 动物。从Harlan Laboratories (Houston, TX)获得年轻的成体雄性Swiss-Webster小鼠。动物饲养在具有Alpha-Dri基床的固底笼中并提供认证的PMI5002啮齿类动物饲料（Animal Specialties, Inc., Hubbard OR）和自由饮水。监测温度并且容纳动物的房间允许12小时光照/12小时黑暗光照循环。
[0657] 辐射。在设施中驯化2周后，10组小鼠通过全身暴露以0.78Gy/分钟的剂量率辐射6.5，7.0和8.0Gy，使用配备320-kV高稳定性X射线发生器、金属陶瓷X射线管、变量x射线束准直器和过滤器（Precision X-ray Incorporated, East Haven, CT）的Therapax X-RAD 
320系统。
[0658] 药物配制和施用。根据方案，适当体积的浓缩的原液溶液用冰冷盐水稀释以制备0.2mg/ml抗鼠MASP-2抗体（mAbM11）或0.5mg/ml抗人MASP-2抗体（mAbOMS646）。基于动物体重使用25号针头经由IP注射施用抗MASP-2抗体mAbM11和mAbOMS646，以递送1 mg/kg mAbM11、5mg/kg mAbOMS646或盐水媒介物。
[0659] 研究设计。如表28中所述将小鼠随机分配到组中。每天测量并记录体重和体温。组7、11和13中的小鼠在辐射后第7天处死并且在深度麻醉下通过心脏穿刺收集血液。辐射后第30天存活的动物以同样的方式处死并收集血液。根据方案从收集的血液样品制备血浆并返给赞助者用于分析。
[0660] 表28：研究组
[0661]
[0662] 统计分析。生成卡普兰一迈耶存活曲线并用于比较处理组间平均存活时间，使用log-排序和Wilcoxon法。报告具有标准偏差的平均或具有平均的标准误差的平均值。使用双尾未配对的t检验在受控的辐射动物和个别处理组间进行统计学比较。
[0663] 研究#1的结果
[0664] 在图18A、18B和18C中分别提供了对于6.5、7.0和8.0Gy暴露组的卡普兰一迈耶存活绘图，并总结在下表29中。总体上，相比媒介物处理的辐射的对照动物，在6.5（20%增加）和7.0Gy（30%增加）暴露水平上，辐射前用抗鼠MASP-2 Ab（mAbM11）处理增加了辐射小鼠的存活。在6.5Gy暴露水平，用抗鼠MASP-2 Ab辐射后处理导致相比媒介物对照辐射动物的存活率的略有增加（15%）。
[0665] 相比之下，在7.0Gy和8.0Gy暴露水平的所有处理的动物显示相比媒介物处理的辐射的对照动物的存活增加。存活最大的变化发生在接受mAbOMS646的动物中，相比7.0Gy暴露水平的对照动物存活增加45%，并且在8.0Gy暴露水平存活增加12%。并且，在7.0Gy暴露水平，mAbOMS646处理组中的死亡首先发生在辐射后第15天，相比媒介物处理的辐射的对照动物在辐射后第8天，比对照动物增加了7天。在7.0Gy暴露水平，对于接受mAbOMS646 (27.3 ± 1.3天)的小鼠死亡的平均时间相比对照动物（20.7 ± 2.0天）显著增加（p = 0.0087）。
[0666] 在整个研究期间记录相比辐射前天（第-1天）体重的百分比变化。在所有辐射的动物中发生短暂的重量丧失，相比对照没有由于mAbM11或mAbOMS646处理的差异变化的证据（数据未显示）。在研究结束时，所有纯化的动物显示从起始（第-1天）体重的体重增加。
[0667] 表29：暴露于辐射的测试动物的存活率
[0668]
[0669] *P=0.0087，通过双尾未配对的t检验，在对照辐射的动物和在相同辐射暴露水平的处理组之间。
[0670] 讨论
[0671] 急性辐射综合征由三个确定的子症状组成：造血、胃肠道、脑血管。观察的症状取决于辐射剂量，具有在人中观察到的显著的局部或全身辐射暴露超过1Gy的造血效应。造血综合征的特征在于骨髓功能的严重抑制导致全血细胞减少，具有与对免疫系统的损害同时发生的在血细胞计数、红和白血细胞，以及血小板中的变化。当最低点发生时，有少量中性粒细胞和血小板存在于外周血中，中性粒细胞减少、发热、败血症的并发症和不可控出血导致死亡。
[0672] 在本研究中，发现在以7.0Gy辐射的Swiss-Webster雄性小鼠中施用mAbH6增加全身x射线辐射的生存性。值得注意的是，在7.0Gy暴露水平，80%的接受mAbOMS646的动物存活至30天，相比35%的媒介物处理的对照辐射动物。重要的是，在此处理组中死亡的第一天没有发生，直至辐射后第15天，相比在媒介物处理的对照辐射动物中观察的增加7天。好奇地，在更低的X射线暴露（6.5Gy）， mAbOMS646的施用相比媒介物处理的对照辐射的动物似乎不影响存活或延迟死亡。对于此在暴露水平之间的应答的差异可以是多方面原因，尽管任何假设的验证可以需要额外研究，包括用于微生物培养的中期样品采集和血液学参数。一个解释可以仅是分配到各组的动物数可以已经排除看到任何细微的处理相关的差异。例如，对于n=20的组大小，在65%（mAbOMS646，在6.5Gy暴露）和80%（mAbH6，在7.0Gy暴露）之间的存活的差异是3只动物。另一方面，35%（媒介物对照，在7.0Gy暴露）和80%（mAbOMS646，在7.0Gy暴露）之间的差异是9只动物，并且提供了处理相关的差异的可靠证据。
[0673] 这些结果证明，抗MASP-2抗体在治疗具有急性辐射综合征有害影响的风险或遭受急性辐射综合征有害影响的哺乳动物受试者中是有效的。
[0674] 研究#2
[0675] Swiss Webster小鼠（n=50）暴露于电离辐射（8.0Gy）。评价了辐射暴露前18小时和之后2小时施用并且之后每周施用的抗MASP-2抗体治疗（OMS646 5mg/kg）对死亡率的效果。
[0676] 研究#2的结果
[0677] 确定为施用抗MASP-2抗体OMS646增加暴露于8.0Gy小鼠的存活，相比接受媒介物对照的小鼠具有从4到6天的调整的中位存活率，并且当与接受媒介物对照的小鼠相比时死亡减少12%（log-排序检验，p=0.040）。
[0678] 研究#3
[0679] 下列组中Swiss Webster小鼠（n=50）暴露于电离辐射（8.0Gy）：（I：媒介物）盐水对照；在辐射前18小时和辐射后2小时施用（II：低）抗MASP-2抗体OMS646（5mg/kg)，辐射前18小时和辐射后2小时施用（III：高）OMS646（10mg/kg)并且仅在辐射后2小时施用（IV:高后）OMS646（10mg/kg)。
[0680] 研究#3的结果
[0681] 确定了辐射前和后施用抗MASP-2抗体与接受媒介物对照的动物相比调节平均存活4-5天。抗MASP-2抗体处理的小鼠中死亡与媒介物对照小鼠相比减少6-12%。进一步注意到没有观察到显著的有害处理效果。
[0682] 总之，本实施例中的结果证明，本发明的抗MASP-2抗体在治疗具有急性辐射综合征有害影响的风险或遭受急性辐射综合征有害影响的哺乳动物受试者中是有效的。
[0683] 实施例12
[0684] 此实施例进一步描述OMS646抗体（17D20m_d3521N11），即在铰链区具有突变的全人抗人MASP-2 IgG4抗体的表征。
[0685] 方法：
[0686] 如上文实施例2-8中所述生成在铰链区具有突变的全人抗人MASP-2 IgG4抗体，OMS646抗体（17D20m_d3521N11）。从用编码表达OMS646重和轻链的表达构建体转染的CHO表达细胞系的培养物上清液纯化OMS646抗体。细胞在PF-CHO培养基中生长培养16到20天并且当细胞生存力下降低于50%时收集无细胞上清液。通过蛋白A亲和力层析随后是离子交换浓缩和缓冲液交换到PBS纯化OMS646。
[0687] 1. OMS646以高亲和力结合人MASP-2
[0688] 固定化的OMS646结合重组人MASP-2的表面等离子体共振（Biocore）分析
[0689] 方法：
[0690] OMS646以不同密度通过胺偶联到CM5芯片固定化，并且随时间记录以9nM、3nM、1nM或0.3nM溶解的重组人MASP-2的结合和解离以确定结合（Kon）和解离（Koff）率常数。基于实验性Kon和Koff值计算平衡结合常数（KD）。
[0691] 结果：
[0692] 图19图解阐释表面等离子共振（Biacore）分析的结果，显示固定化的OMS646以约1-3x10-4S-1的Koff率和约1.6-3x106M-1S-1的Kon率结合重组MASP-2，指示在这些实验条件下亲和力（约92pM的KD）。取决于固定化的OMS646的密度和溶液中MASP-2的浓度，确定50-250pM范围的实验KD值。
[0693] OMS646结合固定化的重组人MASP-2的ELISA测定
[0694] 方法：进行ELISA测定以评价OMS646结合固定化的重组MASP-2的剂量应答。重组人MASP-2（50ng/孔）固定化在PBS中的maxisorpELISA板（Nunc）上在4℃过夜。第二天，板通过用PBS-吐温（0.05%）清洗3次进行封闭。然后向MASP-2包被的孔添加在封闭缓冲液中系列稀释的OMS646系列（浓度范围0.001-10nM）。经过1小时孵育以允许OMS646结合固定化的抗原后，清洗孔以去除未结合的OMS646。使用HRP标记的山羊抗人IgG抗体（Qualex；1:5000稀释在封闭缓冲液中）随后用TMB过氧化物酶底物（Kirkegaard & Perry Laboratories）显色检测结合的OMS646。通过添加100 µl/孔1.0 M H3PO4终止过氧化物酶反应并且底物转化使用96孔板读数器（Spectramax）在450nM光度学定量。使用单个结合位点的曲线拟合算法（Graphpad）来计算KD值。
[0695] 结果：
[0696] 图20图解阐释ELISA测定的结果以确定OMS646对固定化的人MASP-2的结合亲和力。如图20所示，确定了OMS646以85±5 pM的KD结合固定化的重组人MASP-2，其与如图19所示的Biocore分析中获得的结果一致。这些结果证明OMS646对人MASP-2具有高亲和力，具有约100pM的KD。
[0697] 2. OMS646在甘露聚糖包被的表面上抑制C4活化但免疫复合物包被的表面上不抑制
[0698] 方法：
[0699] 分别在甘露聚糖包被的表面或免疫复合物包被的表面在存在或不存在OMS646的情况下在图21A和21B所示的浓度范围测量C4活化。
[0700] 在下面的测量MASP-2的C4切割活性形成的方法中，包被甘露聚糖的塑料孔在37℃与1%的人血清一起孵育60分钟以活化凝集素途径。然后清洗孔并使用标准ELISA方法测定固定化在孔上的人C4b。此测定中生成的C4b的量是MASP-2依赖的C4切割活性的量度。此测定中测试了在所选浓度的抗MASP-2抗体它们抑制C4切割的能力。
[0701] 方法：
[0702] 在甘露聚糖包被的表面上的C4活化：
[0703] 为了确定OMS646对凝集素途径的效果，96孔Costar中结合力板用甘露聚糖包被，通过在5℃与50µL 40 µg/mL稀释在50mM碳酸盐缓冲液（pH9.5）中的甘露聚糖孵育过夜。每孔用200µL PBS清洗3次。孔然后用100µL/孔的PBS中的1%牛血清白蛋白封闭并在室温温和混合孵育1小时。每孔用200µL PBS清洗3次。在单独的96孔板中，MASP-2抗体（OMS646）的系列稀释与1%人血清在含Ca++和Mg++的GVB缓冲液（4.0 mM 巴比妥、141 mM NaCl、1.0 mM MgCl2、2.0 mM CaCl2、0.1%明胶，pH 7.4）中在5℃预孵育1小时。这些抗体-血清预孵育混合物随后转移到甘露聚糖包被的测定板的相应孔中。通过将测定板转移到37℃水浴引发补体活化。经过60分钟孵育后，通过向反应混合物添加EDTA终止反应。每孔用PBS吐温20（在PBS中0.05%吐温20）清洗5 x 200 µL，然后每孔用200µLPBS清洗2次。100µL/孔生物素缀合的鸡抗人C4c(Immunsystem AB, Uppsala, Sweden) 的1：100稀释添加到包含2.0mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的PBS中并在室温下温和混合孵育1小时。每孔用PBS清洗5 x 200 µL。100µL/孔0.1 µg/ml的过氧化物酶缀合的链霉亲和素(Pierce Chemical #21126) 添加到包含2.0mg/mlBSA的PBS中并在室温下在摇床上温和混合孵育1小时。每孔用PBS清洗5 x 200 µL。添加100 µL/孔的过氧化物酶底物TMB（Kirkegaard & Perry Laboratories)并在室温孵育10分钟。过氧化物酶反应通过添加100 µL/孔的1.0 M H3PO4终止并测量OD450。
[0704] 在免疫复合物包被的表面上的C4活化：
[0705] 为了测量OMS646对经典途径的效果，上述测定修改为使用免疫复合物包被的板。如对于上述凝集素途径详细所述进行测定，区别在于孔用纯化的绵羊IgG包被用于经由经典途径刺激C4活化。
[0706] 结果：
[0707] 图21A图解阐释在甘露聚糖包被的表面上存在或不存在OMS646的情况下C4活化水平。图21B图解阐释在IgG包被的表面上存在或不存在OMS646的情况下C4活化水平。如图21A中所示，OMS646在甘露聚糖包被的表面上在1%人血清中以约0.5nM的IC50抑制C4活化。在10个独立的实验中获得的IC50值是0.52±0.28 nM (平均值±SD)。相反，如图21B所示，OMS646在IgG包被的表面上不抑制C4活化。这些结果证明OMS646阻断补体成分C4的凝集素依赖的，但非经典途径依赖的活化。
[0708] 3. OMS646特异性阻断末端补体成分的凝集素依赖的活化
[0709] 方法：
[0710] 使用对于凝集素途径、经典途径和替代途径的途径特异性的条件分析OMS646对膜攻击复合物（MAC）沉积的效果。对于此目的，按照制造商的说明使用Wieslab Comp300 补体筛选试剂盒(Wieslab, Lund, Sweden)。
[0711] 结果：
[0712] 图22A图解阐释在凝集素途径特异性测定条件下存在或不存在抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下MAC沉积的水平。图22B图解阐释在经典途径特异性测定条件下存在或不存在抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下MAC沉积的水平。图22C图解阐释在替代途径特异性测定条件下存在或不存在抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下MAC沉积的水平。
[0713] 如图22A所示，OMS646阻断MAC沉积的凝集素途径介导的活化，具有约1nM的IC50值。但是OMS646对从经典途径介导的活化（图22B）或从替代途径介导的活化（图22C）生成的MAC沉积没有效果。
[0714] 4. OMS646在生理条件下有效抑制凝集素途径活化
[0715] 方法：
[0716] 在90%人血清中存在或不存在如下不同浓度的OMS646的情况下评价凝集素依赖的C3和C4活化：
[0717] C4活化测定
[0718] 为了评价OMS646对凝集素依赖的C4活化的效果，96孔Costar中结合力板用2 µg甘露聚糖（50µL 40 µg/mL在50mM碳酸盐缓冲液（pH9.5）中的溶液）包被。板然后用200µLPBS清洗3次并用100µL/孔的PBS中的1%牛血清白蛋白在室温温和混合封闭1小时。在单独的预孵育板中，选择浓度的OMS646与90%人血清混合并在冰上孵育1小时。这些抗体-血清预孵育混合物随后转移到冰上的甘露聚糖包被的测定板的孔中。测定板然后在冰水浴中孵育90分钟以允许补体活化。通过向反应混合物添加EDTA终止反应。每孔用200 µLPBS吐温20（在PBS中0.05%吐温20）清洗5次，然后每孔用200µLPBS清洗2次。100µL/孔生物素缀合的鸡抗人C4c(Immunsystem AB, Uppsala, Sweden) 的1：1000稀释添加到包含2.0 mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的PBS中并在室温下温和混合孵育1小时。每孔用200µL PBS清洗5次。100µL/孔0.1 µg/mL的过氧化物酶缀合的链霉亲和素(Pierce Chemical #21126) 添加到包含2.0mg/mlBSA的PBS中并在室温下在摇床上温和混合孵育1小时。每孔用200µL PBS清洗5次。添加
100 µL/孔的过氧化物酶底物TMB（Kirkegaard & Perry Laboratories)并在室温孵育16分钟。过氧化物酶反应通过添加100 µL/孔的1.0 M H3PO4终止并测量OD450。
[0719] C4活化测定
[0720] 为了评价OMS646对凝集素依赖的C3活化的效果，以与上述C4活化测定相同的方式进行测定，除了C3沉积作为端点评价。C3沉积如下定量。
[0721] 在补体沉积反应的结束，板如上述清洗并随后用100 µL/孔的含2.0mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的PBS中的兔抗人C3c抗体（Dako）1:5000稀释孵育1小时。每板用200µL PBS清洗5次，并然后在室温与100µL/孔的含2.0mg/ml BSA的PBS中HRP标记的山羊抗兔IgG（American Qualex Antibodies）孵育1小时。板用200µLPBS清洗5次并然后添加100 µL/孔的过氧化物酶底物TMB（Kirkegaard & Perry Laboratories)并在室温孵育10分钟。过氧化物酶反应通过添加100 µL/孔的1.0 M H3PO4终止并测量OD450。通过对实验数据集应用S形剂量-应答曲线拟合算法（GraphPad）衍生IC50值。
[0722] 结果：
[0723] 图23A图解阐释在凝集素途径特异性条件下，在存在或不存在一系列浓度抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下在90%人血清中C3沉积的水平。图23B图解阐释在凝集素途径特异性条件下，在存在或不存在一系列浓度抗MASP-2抗体（OMS646）的情况下在90%人血清中C4沉积的水平。如图23A所示，在90%人血清中OMS646阻断C3沉积，具有IC50 = 3±1.5 nM (n=
6)。如图23B所示，OMS646阻断C4沉积，具有IC50 = 2.8±1.3 nM (n=6)。
[0724] 这些结果证明OMS646提供在生理条件下对凝集素途径活化的强力、有效的阻断，由此对OMS646的低治疗剂量的使用提供支持。基于这些数据，预期以20 nM (3µg/mL)或更低的血浆浓度的OMS646将阻断患者循环中>90%的凝集素途径。基于约3L的典型的人血浆体积，和所施用的大量抗体材料保留在血浆中的知识（Lin  Y.S. 等, JPET 288:371 (1999)），预期静脉内施用低如10mg的OMS646的剂量将在急性时期期间（即短暂的时期，例如1-3天）阻断凝集素途径时是有效的。在慢性病的情况下，在延长的时间周期里阻断凝集素途径对于实现最大的治疗利益可以是有利的。因此，对于这些慢性状况，可以优选100mg的OMS646剂量，预期其在成年人受试者中阻断凝集素途径至少一周或更长时是有效的。鉴于在人中对于抗体通常观察到的缓慢清除和长半衰期，可能100mg剂量的OMS646对于长于1周，例如2周，或甚至4周可以是有效的。预期抗体的更高剂量（即，高于100mg，例如200mg，500mg或更高，例如700mg或1000mg）将具有更长的作用持续时间（例如，多于2周）。
[0725] 5. OMS646阻断猴子中的凝集素途径活化
[0726] 如上文实施例10中所述和图17所示，确定了在向非洲绿猴静脉内施用OMS646（3mg/kg)后，OMS646消除了全身凝集素途径活性约72小时的时期，随后凝集素途径活性恢复。
[0727] 此实施例描述了随访研究，其中在90%非洲绿猴血清中或90%Cynomoglus猴血清中对一系列OMS646和不存在OMS646的情况下评价凝集素依赖的C4活性，如下：
[0728] 为了评价OMS646在不同非人灵长类动物物种中对凝集素依赖的C4活化的效果，96孔Costar中结合力板用2 µg甘露聚糖（50µL 40 µg/mL在50mM碳酸盐缓冲液（pH9.5）中的溶液）包被。板然后用200µLPBS清洗3次并用100µL/孔的PBS中的1%牛血清白蛋白在室温温和混合封闭1小时。在单独的预孵育板中，选择浓度的OMS646与从非洲绿猴或Cynomoglus猴收集的90%血清混合并在冰上孵育1小时。这些抗体-血清预孵育混合物随后转移到冰上的甘露聚糖包被的测定板的孔中。测定板然后在冰水浴中孵育90分钟以允许补体活化。通过向反应混合物添加EDTA终止反应。每孔用200 µLPBS-吐温20（在PBS中0.05%吐温20）清洗5次，然后每孔用200µLPBS清洗2次。100µL/孔生物素缀合的鸡抗人C4c(Immunsystem AB, Uppsala, Sweden) 的1：1000稀释添加到包含2.0mg/ml BSA的PBS中并在室温下温和混合孵育1小时。每孔用200µL PBS清洗5次。100µL/孔0.1 µg/mL的过氧化物酶缀合的链霉亲和素(Pierce Chemical #21126) 添加到包含2.0mg/mlBSA的PBS中并在室温下在摇床上温和混合孵育1小时。每孔用200µL PBS清洗5次。添加100 µL/孔的过氧化物酶底物TMB（Kirkegaard & Perry Laboratories)并在室温孵育10分钟。过氧化物酶反应通过添加100 µL/孔的1.0 M H3PO4终止并测量OD450。通过对实验数据集应用S形剂量-应答曲线拟合算法（GraphPad）衍生IC50值。
[0729] 结果：
[0730] 在90%Cynomoglus猴血清（图24A）和90%非洲绿猴血清（图24B）中观察到凝集素途径抑制的剂量应答，分别具有30nM-50nM和15 nM-30 nM范围的IC50值。
[0731] 总之，观察到OMS646，全人抗人MASP-2 IGG4抗体（在铰链区中具有突变）具有下列有利性质：结合人MASP-2的高亲和力（50-250 pM范围的KD，1-3X10-4 S-1范围的Koff率和1.6-3X106M-1S-1范围的Kon率；人血清中的功能效价对于C4沉积的抑制，在1%人血清中具有0.52±0.28 nM (N=10)的IC50；并且在90%血清中具有3±1.5nM的IC50）；和在猴子中的交叉反应性，显示C4沉积的抑制，具有15-50nM范围的IC50（90%猴血清）。.
[0732] 如上所述，预期低如10mg OMS646的剂量（对于平均人对应0.15mg/kg）在急性阻断人循环中的凝集素途径时（例如对于至少1-3天的时期）是有效的，而预期100mg OMS646的剂量（对于平均人对应1.5mg/kg）阻断患者循环中的凝集素途径至少1周或更长。可以采用更大剂量的OMS646（例如，高于100mg的剂量，例如至少200mg，至少300mg，至少400mg，至少500mg或更高）并优选皮下（sc）或肌内（im）施用途径以进一步延长有效的凝集素途径消除的时间窗口至2周并优选4周。
[0733] 例如，如本文实验数据所示，在灵长类动物中，OMS646的1mg/kg剂量造成凝集素途径抑制1天，并且OMS646的3mg/kg剂量造成凝集素途径的抑制约3天（72小时）。因此，估计7-10mg/kg的更高剂量将有效抑制凝集素途径约7天的时期。如本文所示，OMS646相比猴MASP-
2针对人MASP-2具有5-10倍更高的效价。假定相当的药代动力学，在人中实现有效的凝集素途径消除的预期剂量范围在下表30中所示。
[0734] 表30：抑制体内凝集素途径的OMS646剂量   1天 3天 7天
猴子 1 mg/kg 3 mg/kg 10 mg/kg
人（估计） 0.1-0.2 mg/kg 0.3-0.6 mg/kg 1-2 mg/kg
[0735] 虽然已经阐释并描述了本发明的优选实施方案，将意识到其中可以进行各种改变而不偏离本发明的精神和范围。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈
提交反馈
使用该功能遇到问题

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：

购买VIP 申请VIP试用
您也可以联系官方QQ: 2157717237     电话: 13264338900
关于PatentHub
关于我们 使命宗旨 加入我们 联系我们 帮助中心
PatentHub产品
专利百科 专利交易 业务平台 专利交易大厅 专利需求大厅
 
API接口 数据定制 专利资讯 最新中国发明专利 最新美国发明专利 看视频学检索 技术领域 专利库 专利分类库 国际专利分类库
 
历年真题 模拟考试 资料库 问答专区 专栏文章 知识分享 求职 招聘 代理所排行榜 代理人排行榜 代理所地域排行榜 找代理所 找代理人
PatentHub联系方式
官方Q群：924368187 官方Q群：931673531 官方Q群：529775260 商务QQ：2157717237 运营QQ：3307693423 电话：13264338900