항진균 및 항세균 물질을 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주

申请号 KR1020030062099 申请日 2003-09-05 公开(公告)号 KR1020050024873A 公开(公告)日 2005-03-11
申请人 재단법인한국간연구재단; 发明人 김범준; 김성철; 장기창; 권혁모; 강상헌;
摘要 PURPOSE: An antibacterial and antifungal agent producing Streptomyces sp. is provided, which Streptomyces sp. has a wide range of antimicrobial activity against human pathogenic bacteria and plant pathogenic bacteria and does not cause side effects by residence and accumulation of toxicity in human body. CONSTITUTION: The Streptomyces sp.(KACC 91017) producing an antibacterial and antifungal agent against human pathogenic bacteria and plant pathogenic bacteria is provided, wherein the human pathogenic bacterium is selected from Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Mycobactereium tuberculosis, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium abscessus and Candida albicans; and the plant pathogenic bacterium is selected from Streptomyces scabiei, Streptomyces acidiscabies and Streptomyces turgidiscabies.
权利要求
  • 인체 병원성 균 및 식물 병해균에 대한 항균물질을 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주(KACC 91017).
  • 제 1항에 있어서,
    상기 인체 병원성 균은 스타필로코코스 아우레우스( Staphylococcus aureus ), 스타필로코코스 에피터미디스( Staphylococcus epidermidis ), 마이크로코코스 루테우스( Micrococcus luteus ), 마이코박테리움 튜버쿨로시스( Mycobacterium tuberculosis ), 마이코박테리움 포튜이툼( Mycobacterium fortuitum ), 마이코박테리움 엡세슈스( Mycobacterium abscessus ) 및 칸디다 알비칸스( Candida albicans )로 이루어진 군으로부터 선택되는 스트렙토마이세스 속 균주(KACC 91017).
  • 제 1항에 있어서,
    상기 식물 병해균은 스트렙토마이세스 스카비에이( Streptomyces scabiei ), 스트렙토마이세스 에시디스카비에스( Streptomyces acdiscabies ) 및 스트렙토마이세스 터지디스카비에스( Streptomyces turgidiscabies )로 이루어진 군으로부터 선택되는 스트렙토마이세스 속 균주(KACC 91017).
  • 제 1항의 스트렙토마이세스 속 균주(KACC 91017), 이의 배양액 및 이의 배양여액으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것을 포함하는 항균제 조성물.
  • 제 4항에 있어서, 상기 항균제 조성물은 식품 첨가제, 약제 또는 미생물 농약인 것인 항균제 조성물.
  • 说明书全文

    항진균 및 항세균 물질을 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주{NOVEL STREPTOMYCES SP. PRODUCING ANTIBACTERIAL AND ANTIFUNGAL AGENT}

    [발명이 속하는 기술분야]

    본 발명은 항진균 및 항세균 물질을 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인체 병원성 균 및 식물 병해균에 대하여 항균활성을 가지는 항균물질을 생산하여, 인체 독성 및 잔류 및 축적으로 인한 부작용을 야기하지 않는 환경 친화적 미생물 제제에 관한 것이다.

    [종래기술]

    항생물질은 틴달(Tyndall)에 의해서 미생물 상호간의 길항 작용이 관찰된 후, 1929년 플레밍에 의해 발견된 페니실린을 기초로 하여 1940년에 스트렙토마이세스 안티바이오티커스( Streptomyces antibioticus )에서 엑티노마이신이 분리되었고, 스트렙토마이세스 그리세우스( Streptomyces griseus )에서 스트렙토마이신을 분리하여 폐결핵의 치료약으로 사용하게 되었다. 스트렙토마이신이 발견된 이후로 많은 연구자들에 의해 스트렙토마이세스 속 균주로부터 많은 종류의 항생물질이 발견되고 있으며, 최근에는 재조합기술을 이용하여 항생제를 생산하는 연구로 이루어지고 있다. 이에 스트렙토마이세스 속을 포함한 방선균류(Actinomycetes)는 항생물질의 생산균으로서 산업적 또는 의학적인 측면에서 매우 중요한 미생물로 자리잡게 되었다.

    스트렙토마이세스 속 균주는 다양한 2차 대사산물을 포함하여 생산하는 생리활성도 매우 다양하다. 특히 지금까지 미생물로부터 탐색된 100,000여종의 생리활성 물질 가운데 약 2/3에 해당되는 64 % 정도가 스트렙토마이세스 속 균주로부터 발견되었으며, 세균으로부터는 약 13 %, 곰팡이로부터는 약 23 %가 발견되어 각종 생리활성 물질의 탐색에 있어서 이들 균이 차지하는 비중은 매우 높다.

    최근, 항생물질의 대한 내성균의 잦은 출현으로 인하여 새로운 항생제의 개발이 시급히 요구되고 있다. 특히 스타필로코코스 아우레우스( Staphylococcus aureus )는 그람 양성균 중에서 가장 주된 병원균이나, 메티실린에 대하여 내성을 나타내거나 심지어 최후의 치료약이라고 여겨지는 반코마이신에도 내성을 나타내기도 하여 새로운 항생제의 개발이 매우 시급하다. 또한 결핵을 유발하는 마이코박테리움 튜버쿨로시스( M. tuberculosis ) 역시 다약재 내성 결핵균으로 출현되고 있어, 새로운 항결핵제가 개발에 필요성을 입증하고 있다.

    또한 인체 점막에 칸디다증(candidiasis)을 유발하는 진균인 칸디다 알비칸은 피부질환이나 여성에게서 질염과 외음부염을 유발하는 것으로 알려져 있으나, 부신스테로이드나 항종양제의 사용으로 인한 면역억제 상태에서는 피부 이외의 조직에 기회감염으로 작용하기도 하고, 후천성 면역결핍증환자 같은 면역저하상태의 환자에게서는 전신성 질환을 유발하기도 한다.

    이에, 다양한 병원성 미생물에 대하여 강력한 항균활성을 나타내는 항생제를 생산하는 신규 균주의 개발이 요구된다.

    한편, 생물체로부터 생산되는 대사산물로서의 항생물질은 병원균에 대해서만 항진균 활성을 나타내고 인간, 가축, 식물 등에는 거의 영향을 끼치지 않으며, 환경에 잔류되지 않는 장점이 있다. 따라서, 상기와 같이 생물체로부터 생산되는 항생물질은 환경친화적이고 잔류 독성이 없다는 이점에 의하여 유기합성계 농약의 대안으로 부각되고 있다.

    특히, 감자의 경우 재배시 스트렙토마이세스 스카비에스( Streptomyces scabies )와 스트렙토마이세스 에시디스카비에이( Streptomyces acidisscabies )에 의하여 감자 더뎅이병이 빈번히 발생된다. 감자 더뎅이병이 발생되면 감자의 생육이 잘 이루어지지 않아 감자 생산농가에 경제적인 손실을 미치나 이를 효과적으로 방제할 수 있는 미생물 제제에 대한 연구는 미흡한 실정이다.

    따라서, 본 발명은 인체의 병원성 균에 대한 항균활성을 가지는 신규 방선균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

    또한 본 발명은 감자 더뎅이균에 대하여 항균활성을 가지는 신규 방선균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

    또한 본 발명은 잔류독성이 없으며, 부작용을 야기하지 않는 환경 친화적 항균제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

    상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인체 병원성 균 및 식물 병해균에 대한 항균물질을 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주(KACC 91017)을 제공한다.

    또한 본 발명은 스트렙토마이세스 속 균주(KACC 91017), 이의 배양액 및 이의 배양여액으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것을 포함하는 항균제 조성물을 제공한다.

    이하 본 발명을 상세히 설명한다.

    본 발명은 인체 병원성 균 및 식물 병해균에 대하여 항균활성을 가지는 항균물질을 생산하는 스트렙토마이세스 속 균주, 및 상기 균주를 이용한 미생물 제제에 관한 것이다.

    본 발명의 스트렙토마이세스 속 균주는 토양시료로부터 분리된 균주이며, 형태적 특성(도 1) 및 16S rDNA 염기서열 분석(서열번호 3)으로 동정하였다. 스트렙토마이세스 속 균주는 계통분류학적 위치를 분석하였을 때, 계통수 상에서 스트렙토마이세스 속에 속하지만 다른 스트렙토마이세스 균주와는 모두 1 % 이상의 염기서열상 차이를 가지는 독립적인 가지를 형성하였다(도 2 및 3). 즉, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 균주는 스트렙토마이세스에 속에 속하는 신종 균주이다.

    본 발명의 스트렙토마이세스 속 균주는 스트렙토마이세스 속 2-15로 명명하고, 이를 대한민국 경기도 수원시 권선구에 소재한 농용미생물보존센터에 2002년 12월 5일자로 기탁하여 기탁번호 KACC 91017를 부여받았다.

    본 발명의 스트렙토마이세스 속 2-15는 방선균 배양배지에서 생육시킬 수 있으며, 배양조건은 25 내지 30 ℃에서 7 일 내지 14일간 암배양이다. 대표적인 배양배지로는 벤넷(Benntt's medium)가 있다.

    스트렙토마이세스 속 2-15는 인체 병원성 균 및 식물 병해균에 대하여 항균활성을 가지는 항균물질을 생산한다. 특히 인체 병원성 균으로는 스타필로코코스 속 균주, 마이코박테리아 속 균주 및 진균이며, 바람직하기로는 스트렙토마이세스 속 2-15는 스타필로코코스 아우레우스( Staphylococcus aureus ), 스타필로코코스 에피터미디스( Staphylococcus epidermidis ), 마이크로코코스 루테우스( Micrococcus luteus ), 마이코박테리움 튜버쿨로시스( Mycobacterium tuberculosis ), 마이코박테리움 포튜이툼( Mycobacterium fortuitum ), 마이코박테리움 엡세슈스( Mycobacterium abscessus ) 및 칸디다 알비칸스( Candida albicans )에 대한 항균물질을 생산한다. 상기 식물 병해균으로는 스트렙토마이세스 스카비에이 ( Streptomyces scabiei ), 스트렙토마이세스 에시디스카비에스 ( Streptomyces acdiscabies ) 및 스트렙토마이세스 터지디스카비에스 ( Streptomyces turgidiscabies )가 있으며, 스트렙토마이세스 속 2-15 으로부터 생산되는 항균물질은 상기 3종의 식물 병해균에도 역시 항균활성을 나타낸다.

    스트렙토마이세스 속 2-15으로부터 생산되는 항균물질은 세포외로 분비될 수 있다. 이에 본 발명에서는 스트렙토마이세스 속 2-15, 이의 배양액 및 이의 배양여액으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것을 유효성분으로 포함하는 항균제 조성물을 제공한다. 상기 항균제 조성물중 유효성분의 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절히 선택할 수 있으며, 예를들면 0.01 중량%이상 일 수 있다. 또한 상기 항균제 조성물은 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.

    상기 배양액은 스트렙토마이세스 속 2-15를 액체배양배지상에서 25 내지 30 ℃로 7 내지 14 일 배양하여 수득할 수 있으며, 이를 액상으로 또는 건조시킨 고체상으로 항균제 조성물에 포함될 수 있다.

    상기 배양여액은 상기 배양액에서 균체를 제거한 상청액으로, 원심분리 또는 여과를 통하여 수득할 수 있다. 배양여액은 액상으로 또는 건조시킨 고체상으로 항균제 조성물에 포함될 수 있다.

    본 발명의 항균제 조성물은 상기한 유효성분이외에 사용용도, 목적 및 방법에 따라 담체를 더욱 포함할 수 있다. 항균제 조성물은 식품 첨가제, 약제 또는 미생물 농약제로 사용할 수 있으므로, 상기한 용도에 적절한 통상의 담체가 포함될 수 있다.

    항균제 조성물이 식품 첨가제인 경우, 식품의 항균 및 보존을 위한 목적으로 사용되며, 이의 제형은 액제, 과립제 산제, 에어로졸제, 유제 도는 환제일 수 있다. 식품 첨가제의 사용용량은 식품의 종류 및 사용방법에 따라 적절히 조절하는 것이 좋으며, 일예로 식품중량에 0.01 중량%이상으로 사용할 수 있다.

    항균제 조성물이 약제인 경우, 항균제 조성물은 경구 또는 비경구용으로 사용되며, 담체로는 약리학적으로 허용가능한 부형제를 사용한다. 항균제 조성물의 제형은 환자의 상태 및 사용방법에 따라 적절히 조절하는 것이 좋으며, 제형의 일예인 액제, 과립제, 산제, 시럽제, 에어로솔제, 엑스제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 정제, 주사제, 캅셀제, 크림제 또는 환제로 사용할 수 있다. 항균제 조성물의 투여량은 1일 10 내지 1000 ㎎ 일 수 있으나, 이에 한정되진 않는다.

    항균제 조성물이 미생물 농약제인 경우, 항균제 조성물의 제형은 사용방법에 따라 분제, 입제, 액제, 훈증제, 또는 훈연제일 수 있으며, 농약에 통상적으로 사용되는 증량제 또는 전착제를 담체로 포함할 수 있다. 항균제 조성물의 사용방법은 토양내 투입법 또는 대상작물에 직접 접종하는 방법이다. 그 외 사용량 및 사용시기는 적용작물에 따라 조절하는 것이 좋다. 적용작물은 스트렙토마이세스 스카비에이, 스트렙토마이세스 에시디스카비에스 또는 스트렙토마이세스 터지디스카비에스에 의하여 병반을 나타내는 작물이며, 대표적인 작물은 감자이다. 상기 3종의 균주는 토양에 서식하여 주로 수확기에 감자 더뎅이병을 야기시킨다. 따라서, 감자 더뎅이병은 본 발명의 항균제 조성물을 감자 심기전에 토양에 살포하거나 수확시기, 특히 괴경형성기에서 비대기에 작물 또는 토양에 주기적으로 살포하는 것이 좋다. 항균제 조성물의 살포량은 병반 정도 및 시비시기에 따라 적절히 조절하여 사용할 수 있으나, 토양 또는 작물에 충분히 시비되도록 사용할 수 있다. 이때 물 또는 그밖에 비료, 농약 첨가제에 희석시켜 사용가능하다. 항균제 조성물은 적용 작물의 종류에 따라 공지된 방법을 채택하여 적용하는 것이 가장 바람직하다.

    본 발명의 스트렙토마이세스 속 2-15는 인체 병원성 균 및 식물 병해균에 대하여 항균활성을 가지는 항균물질을 생산하여, 인체 독성 및 잔류 및 축적으로 인한 부작용을 야기하지 않는 환경 친화적 미생물 제제이다.

    이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

    실시예 1: 균주의 분리 및 동정

    1-1. 균주 분리

    제주도 토양시료를 수집하고, 수집한 토양시료로부터 벤넷한천배지(Benntt's agar medium: Glucose 10 g, Yeast extract 1 g, Bactptone 2 g, Beef extract 1 g, Agar 15-20 g, 증류수 1L, 비타민(thimine-HCl, riboflavin, niacin, pyridoxin-HCl, inositol 및 Ca-pantothenate, aminobenzoic acid 각각 0.5 ㎎ 및 biotin 0.25 ㎎), Cycloheximide 50ppmNalidixic acid 10 ppm, pH 7.2) 를 이용하여 스타필로코코스 아우레우스, 칸디다 알비칸스 및 스트렙토미세스 스카비아이에 공통적으로 강한 항균력을 나타내는 가장 우수한 한 균주를 선별하였다.

    1-2. 균주 동정

    상기에서 선별한 균주에 대한 동정을 하기와 같이 실시하였다.

    가. 형태적 특성

    선별한 균주는 벤넷배지에 접종한 후 28 ℃에서 7 일간 배양하고, 색채색차계(CR-300 Chroma, Minolta Camera Co. Ltd., Japan)를 이용하여 균주와 배지의 색상을 관찰하였다. 도 1은 선별한 균주를 배양한 콜로니와 배지 사진이며, 색체색차계를 이용하여 색상을 관찰하는 과정을 나타낸 것이다. 선별한 균주는 어두운 다홍색( 10.0RV 2.1, C 0.5)의 콜로니를 형성시켰으며, 선별한 균주가 생산한 2차 대사산물은 배지에 확산되어 어두운 주황색(2.0YR V 3.1, C 5.9)을 나타내었다.

    나. 16S rDNA 염기서열 분석

    선별한 균주의 계통분류학적인 위치를 확인하기 위하여 전체 16S rDNA 염기서열의 98 % 이상의 염기서열에 해당되는 1519 bp의 염기서열을 분석하였다.

    선별한 균주로부터 16S rDNA 분절을 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트로 PCR하여 증폭시킨 후, 증폭산물을 정제하여 TOPO TA Cloning   키트(Invitrogen)에 삽입(ligation)하고, 이를 대장균에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 추출한 후 자동염기서열 분석장치 (Applied Biosystems model 373A automatic sequencer)와 키트(BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Perkin-Elmer Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 분석하였다.

    선별한 균주의 16S rDNA는 서열번호 3으로 나타내었으며, 유전자은행의 블라스트 프로그램를 이용하여 상동성을 분석하였다. Genbank의 BLAST 프로그람을 이용하였다. 그 결과 선별된 균주는 스트렙토마이세스 속 VTT E-99-1326(GenBank No. 429390)와 가장 높은 98 %의 상동성을 나타내었으며, 16S rDNA 상동성상에서 기존의 분석된 균종들과 모두 1 % 이상의 염기서열 변이를 보이기 때문에 본 발명의 균주는 신규한 스트렙토미세스 속 균주인 것으로 확인되었다.

    다. 16S rDNA 염기서열 계통수 구축

    계통분류학적인 위치를 분석하기 위하여, 기존의 이미 분석된 스트렙토미세스 균주 35 주와 스트렙토마이세스 균주와 계통학적으로 비슷한 키타사토스포라 (Kitasatospora) 13 주 및 마이크로모노스포라(Micromonospora) 1 주, 총 49 주의 16S rDNA의 염기서열을 유전자은행에서 취하여 본 발명에서 분석된 선별 균주의 16S rDNA 1450 bp의 염기서열과 서로 비교분석하였다.

    이들 총 50 주의 16S rDNA 염기서열은 메가린 패키지(Megalign package, Window version 3.12e; DNASTAR, Madison, Wis)의 다중 정렬알고리즘(multiple alignment algorithm)을 사용하여 다정렬하였고, 다정렬된 염기서열은 근린결합분석(Neighbor-Joining, MEGA version 2.1)법으로 계통수를 완성하였다. 계통수의 구조(topology)를 평가하기 위하여 마이크로모노스포라 속(AJ560637)을 외집단 (outgroup)으로 하여 1000회 반복적으로 부트스트랩(bootstrap)을 수행하였다.

    도 2는 본 발명의 선별 균주의 16S rDNA 유전자 염기서열을 근간으로 한 작성한 계통수이다. 본 발명의 선발균주는 계통수 상에서 스트렙토마이세스 속에 속하지만, 다른 스트렙토마이세스 균주와는 모두 1 % 이상의 염기서열상 차이를 가지는 독립적인 가지를 형성하였다. 즉, 상기 계통수 분석으로 본 발명의 선별균주는 스트렙토마이세스에 속에 속하는 신종 균주임을 확인할 수 있다.

    라. 세포벽 지방산 분석

    선별 균주의 종(species) 및 속(genus) 수준으로 동정하기 위하여, 균주의 세포벽의 지방산을 MIDI 자동 미생물 동정 시스템(automated Microbial Identification System: MIS)와 GC(gas chromatography)로 분석하였다. 또한 MIS ACTIN1 library(version 3.8)의 데이터베이스를 사용하였다.

    그 결과는 도 3에 크로마토그래피로 나타내었다. 본 발명의 스트렙토마이세스 속 신규 균주는 지방산 성분 분석을 통한 동정을 수행한 결과, 기존의 데이터베이스에 모두 0.4 미만으로 일치하였다. 특히 S. 아우레오팩시엔스(S. aureofaciens)와 가장 높은 상동계수(similarity indexes) 0.363을 나타내었는데, 이는 MIS ACTIN1 library상에서 같은 균종으로 인정하는 범위 0.400 미만에 해당되어 본 발명의 스트렙토마이세스 속 선별 균주는 신종 균주임을 알 수 있다.

    상기와 같은 동정결과를 토대로, 본 발명의 선별 균주는 스트렙토마이세스 속 2-15로 명명하였고, 이를 대한민국 경기도 수원시 권선구에 소재한 농용미생물보존센터에 2002년 12월 5일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KACC 91017를 부여받았다.

    실시예 2: 스트렙토마이세스 속 2-15의 항균활성 검증

    2-1. 스트렙토마이세스 속 2-15의 배양

    스트렙토마이세스 속 2-15는 벤넷 고체배지에 접종하여 7일간 28 ℃에서 암 배양한 후 하나의 콜로니를 수득하고, 이를 벤넷 액체배지(Yeast extract 1g /L, Beef extract 1 g/ℓ, Tryptone 2 g/ℓ, Glycerol 10 g/ℓ, pH 7.2)에서 접종하였다. 배양은 암조건, 28 ℃에서 2주간 180 rpm으로 교반하여 실시하였다. 배양액은 4 ℃에서 10,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 상등액으로 분리하였고, 이를 길항성 물질 분리에 이용하였다.

    2-2. 인체 병원성 균에 대한 항균활성 검정

    인체 병원성 균인 그람양성균, 그람음성균, 마이코박테리움 속 균종, 및 진균 4 개의 그룹에 해당되는 균종에 대한 항균활성을 확인하였다.

    그람양성균으로는 스타필로코코스 아우레우스, 스타필로코코스 에피터미디스, 마이크로코코스 루테우스, 그람 음성균으로는 에서리키아 콜리, 쉬겔라 디젠테리에, 슈도모나스 에루지노사, 미코박테리움 속 균종으로는 마이코박테리움 튜버쿨로시스, 마이코박테리움 포튜이툼, 마이코박테리움 엡세슈스 및 진균으로는 칸디다 알비칸스으로, 총 10종의 균종을 가지고 생육저지 실험을 실시하였다.

    상기 그람양성균, 그람음성균 및 진균은 모두 서울대학교 의과대학 미생물학교실에서 보관중인 표군 균주를 사용하였으며, 마이코박테리아 속에 속하는 3종은 모두 결핵연구원에서 보관중인 표준 균주를 사용하였다.

    생육저지 실험에 사용한 평판배지는 그람양성균, 그람음성균 및 진균에 대해서는 영양한천배지(Beef extract 3 g/ℓ, peptone 5 g/ℓ, agar 15 g/ℓ)를, 미코박테리움 속 균주에 대해서는 Middlebrook 7H10 한천배지(7H10 agar (Difco): 21 g/ℓ, OADC supplement 10 ㎖/ℓ)를 사용하였다.

    평판배지에 스트렙토마이세스 속 2-15의 배양 상등액 40 ㎕을 올려놓고 30 분간 건조시킨 후 자외선을 약 5분간 쬐어 멸균시켰다. 여기에 각 병원성 균 배양액 50 ㎕을 50 ℃ 항온기에 준비된 3 %의 한천을 포함하는 증류수에 첨가하여 잘 혼합한 후, 상기의 평판배지에 다시 분주하여 항온기에서 배양하였다. 배양은 균주에 따라 달리하였는데, 그람음성균, 그람양성균, 진균, 마이코박테리움 포튜이툼 및 마이코박테리움 엡세슈스를 포함하는 총 9 균주는 37 ℃에서 3일간 배양하였고, 그 외 마이코박테리움 튜버쿨로시스는 성장속도가 느리므로 37 ℃에서 30일간 배양하였다. 배양후 평판배지에 형성된 생육저해환(투명환)을 확인하여 스트렙토마이세스 속 2-15의 항균활성을 확인하였다.

    각 균주별 생육저해환의 직경을 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.

    검정 대상균 활성정도
    그람양성균 스타필로코코스 아우레우스 +++
    스타필로코코스 에피터미디스 ++
    마이크로코코스 루테우스 ++++
    그람음성균 에서리키아 콜리 N
    쉬겔라 디젠테리에 N
    슈도모나스 에루지노사 N
    마이코박테리움 마이코박테리움 튜버쿨로시스 ATCC 27294 ++++
    마이코박테리움 포튜이툼 ATCC 6841 +++
    마이코박테리움 엡세슈스 CAP97E-03 +++
    진균 칸디다 알비칸스 ++++
    * 활성정도++++:25 ㎜이상, +++: 21 - 25 ㎜, ++:16 - 20 ㎜, +:10 - 15 ㎜, N: 0 ㎜

    표 1에서, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 2-15는 병원내 감염의 주요한 원인균인 스타필로코코스 아우레우스를 그람양성균, 결핵의 주요한 원인균인 마이코박테리움 튜버쿨로시스를 비롯한 마이코박테리움 속 균주 및 인체 감염을 일으키는 주요한 진균인 칸디다 알비칸스에 대하여 강력한 항균활성을 나타내었다.

    도 4는 스트렙토마이세스 속 2-15의 칸디다 알비칸스에 대한 항균활성을 나타낸 생육억제환 사진으로, A는 스트렙토마이세스 속 2-15 배양액의 상등액을 사용한 경우이고 B는 스트렙토마이세스 속 2-15 배양액의 상등액을 프로테나제K(PK) 또는 열처리(100 ℃, 5분)한 후 사용한 경우이다.

    도 4에서 스트렙토마이세스 속 2-15가 생산하는 항진균성 물질이 단백질 성분이 아니며, 열에 매우 안정함을 확인할 수 있다.

    2-3. 감자 더뎅이 병원성균에 대한 항균활성 검정

    식물병인 감자 더뎅이 병원성 균으로 스트렙토마이세스 스카비에이, 스트렙토마이세스 에시디스카비에스 및 스트렙토마이세스 터지디스카비에스를 실험대상으로 사용하였다. 상기 균주들은 모두 제주농업시험장이 보유하고 있는 ATCC 표준 균주이며, 벤넷 배지에서 배양하였다.

    생육저지 실험은 상기와 동일하게 실시하였고, 감자 더뎅이 병원성 균들은 각각 28 ℃에서 3일간 배양하였다. 실험결과는 하기 표 2에 나타내었다.

    검정 대상균 활성정도
    감자더뎅이병 스트렙토마이세스 스카비에이 ++++
    스트렙토마이세스 에시디스카비에스 +++
    스트렙토마이세스 터지디스카비에스 +++
    * 활성정도++++:25 ㎜이상, +++: 21 - 25 ㎜, ++:16 - 20 ㎜, +:10 - 15 ㎜, N: 0 ㎜

    표 2에서, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 2-15는 감자 더뎅이 병원성 균들에 대하여 강력한 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

    도 5는 스트렙토마이세스 속 2-15의 스트렙토마이세스 스카베이에 대한 항균활성을 나타낸 생육억제환 사진으로, A는 스트렙토마이세스 속 2-15 배양액의 상등액을 사용한 경우이고 B는 스트렙토마이세스 속 2-15 배양액의 상등액을 프로테나제K(PK) 또는 열처리(100 ℃, 5분)한 후 사용한 경우이다. 상기 결과로, 스트렙토마이세스 속 2-15가 생산하는 항 세균성 물질이 단백질 성분이 아니며, 열에 매우 안정함을 확인할 수 있다.

    이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 2-15(KACC 91017)는 다양한 종류의 인체 병원성 균과 감자 더뎅이 병원성 균에 대하여 광범위한 항균활성을 가지며, 인체 독성 및 잔류 및 축적으로 인한 부작용을 야기하지 않는 환경 친화적 미생물 제제이다.

    도 1은 본 발명의 스트렙토마이세스 속 2-15 균주를 벤넷 한천 배지에서 배양한 사진이다.

    도 2는 본 발명의 스트렙토마이세스 속 2-15 균주의 16S rDNA 유전자를 근간으로 작성한 계통수이다.

    도 3은 본 발명의 스트렙토마이세스 속 2-15 균주의 지방산 성분을 분석한 결과이다.

    도 4는 스트렙토마이세스 속 2-15의 칸디다 알비칸스에 대한 항균활성을 나타낸 생육억제환 사진이다.

    도 5는 스트렙토마이세스 속 2-15의 스트렙토마이세스 스카베이에 대한 항균활성을 나타낸 생육억제환 사진이다.

    <110> LIVER RESEARCH FOUNDATION OF KOREA <120> NOVEL STREPTOMYCES SP. PRODUCING ANTIBACTERIAL AND ANTIFUNGAL AGENT <130> dpp20032312kr <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gagagtttga tcctggctca g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aaggaggtga tccagccgca 20 <210> 3 <211> 1519 <212> DNA <213> 16S rDNA gene sequences of Streptomyces sp. 2-15 <400> 3 agagttttat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60 gatgaagccc ttcggggtgg attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc 120 cttcactctg ggacaagccc tggaaacggg gtctaatacc ggatacgacc cggaagcgca 180 tgcttctggg tggaaagctc cggcggtgaa ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg 240 tggggtaatg gcctaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca 300 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat 360 gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct 420 ctttcagcag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg 480 tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 540 agctcgtagg cggcttgtca cgtcggatgt gaaagcccgg ggcttaaccc cgggtctgca 600 ttcgatacgg gctagctaga gtgtggtagg ggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa 660 atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc attactgacg 720 ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780 acgttgggaa ctaggtgttg gcgacattcc acgtcgtcgg tgccgcagct aacgcattaa 840 gttccccg cc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg 900 cacaagcagc ggagcatgtg gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg 960 acatataccg gaaacggcca gagatggtcg cccccttgtg gtcggtatac aggtggtgca 1020 tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080 tgttctgtgt tgccagcatg cccttcgggg tgatggggac tcacaggaga ctgccggggt 1140 caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca 1200 cacgtgctac aatggccggt acaatgagct gcgatgccgt gaggcggagc gaatctcaaa 1260 aagccggtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagttgctag 1320 taatcgcaga tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380 cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggagggagct 1440 gtcgcaaggt gggactggcg attgggacga agtcgtaaca aggtagccgt accggaaggt 1500 gcggctggat cacctcctt 1519

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