一种淡紫灰链霉菌和生防菌剂及其应用 |
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| 申请号 | CN201510000555.0 | 申请日 | 2015-01-04 | 公开(公告)号 | CN104560826A | 公开(公告)日 | 2015-04-29 |
| 申请人 | 辽东学院; | 发明人 | 李娟; 王旭; 刘丹梅; 孙书伟; 季长波; 刘晓红; 韦月平; 李莉; 姜路路; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一株保藏编号为CGMCC No.9972的淡紫灰链霉菌DTJ-24和含有此菌的生防菌剂及其在防治草莓 炭疽病 中的应用。将淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24活化后以20%接种量接种于 种子 培养基中，25℃，120r/min，培养3d，获得种子液。种子液以4%的接种量接种于 发酵 培养基中， 发酵罐 培养基装量70%，发酵条件为 温度 25℃，通气量18%，搅拌速度120r/min，发酵3d，发酵液与基质等量混合均匀并干燥，制备得到生防菌剂。本发明的生防菌剂直接叶面喷施或移栽时灌根处理能够有效防治草莓炭疽病，防效达78.3%。本发明制备工艺简单，成本低，使用方便，可以降低草莓栽培过程中化学 农药 的使用和果实农药残留，具有安全环保的优点。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24，该菌株于2014年11月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.9972。 |
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| 说明书全文 | 一种淡紫灰链霉菌和生防菌剂及其应用技术领域背景技术[0002] 草莓炭疽病是我国草莓产区的重要病害。该病在草莓苗期和移栽定植期危害最重，常侵染匍匐茎、叶柄、叶片和根冠，产生局部炭疽病斑，造成根冠腐烂和全株萎蔫枯死。湿度高时病部可见桔红色黏质孢子堆，死病株根冠部横切面可见明显褐变。该病病原菌主要有草莓炭疽菌、胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌三种。该病尤其易感草莓品种“红颜”，造成大批死苗，严重影响草莓生产。 发明内容[0005] 本发明的目的就是为了解决化学农药防治草莓炭疽病带来的环境污染和果实农药残留，提供一种能够高效拮抗草莓炭疽病的菌株和其生防菌剂，应用于草莓炭疽病的生物防治。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案。 [0006] 本发明的淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24于2014年11月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.9972。 [0007] 本发明的淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24，其特征在于其拮抗草莓炭疽病病原菌。 [0008] 本发明的生防菌剂含有保藏号为CGMCC No.9972的淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24。 [0009] 本发明的生防菌剂中的总活菌数达1×109cfu/ml。 [0010] 本发明的生防菌剂制备方法如下：将淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24的种子液以4%（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐培养基装量70%，发酵条件为温度25℃，通气量18%，搅拌速度120r/min，发酵3d，获得发酵液；发酵液与基质等量混合均匀并干燥，得到生防菌剂。 [0011] 本发明的生防菌剂制备方法中所述的种子液通过下述方法获得：将斜面低温保存的淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24划线接种到高氏一号平板中，25℃，培养48 h进行活化，活化后的菌株以20%接种量接种于种子培养基中，25℃，120r/min，摇床振荡培养3d进行种子扩大培养，获得种子液。 [0013] 本发明的生防菌剂制备方法中所述的发酵培养基为：麸皮20g/L、豆饼粉10 g/L、氯化钠1g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L和硫酸亚铁0.01g/L，初始pH值7.5 。 [0015] 本发明的淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24，是分离筛选的全新的菌株，通过形态学、生理生化方法和16SrDNA序列分析将该菌株鉴定为淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）。该菌株已于2014年11月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.9972；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编9 100101。用本发明的新菌株所生产的生防菌剂中含1×10cfu/ml以上的淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24、相应培养基和基质，可用于防治草莓炭疽病。 有益效果： 本发明是专门针对草莓炭疽病开发的生防制剂。该菌剂中含有能够高效拮抗草莓炭疽 9 病菌生长的淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24，菌剂中该菌株的活菌数达到1×10cfu/ml以上，该菌剂喷施于草莓叶片或移栽时灌根处理能够有效抑制草莓炭疽病的发生。温室盆栽试验表明该菌剂对草莓炭疽病的防效可达78.3%。该生防菌剂是由淡紫灰链霉菌、代谢产物和和基质组成，无任何有毒有害成份，在草莓栽培过程中使用具有无毒、无环境污染、无果实农药残留的优点。 附图说明 [0016] 图1显示了本发明筛选的保藏号为CGMCC No.9972的淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24的菌落形态。 [0017] 图2显示了本发明筛选的保藏号为CGMCC No.9972的淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24的菌体显微形态。 具体实施方式[0018] 以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。 [0019] 实施例1 草莓炭疽病拮抗菌株的分离、筛选2013年6月，采用五点取样法自辽宁省东港市草莓栽培基地采集土壤样品，自然风干。 取土样10g，置于装有90ml无菌水的三角瓶中，在摇床上震荡20min。置30s后，依次稀释-4 -4 10倍，制备10 稀释液。微量移液器吸取10 稀释液0.1ml至高氏一号培养基固体平板上，无菌涂布器涂布均匀。25℃恒温培养箱倒置培养3-5天。挑取平板上不同菌落形态的菌株转接至高氏一号培养基上获得纯培养，灭菌石蜡油封藏，4℃保藏备用。高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，氯化钠0.5g，K2 HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20.0g，水1000ml，调整pH值到7.2。 [0020] 以草莓炭疽病病原菌胶孢炭疽菌为指示菌，采用平板对峙法进行拮抗菌初筛。指示菌活化后，用直径0.6cm的无菌打孔器制备菌块。将病原菌接种于PDA平板中央，25℃培养24h。在距离病原菌3cm处对称接种待测菌株，以不接待测菌株为对照，每个处理重复3次。置于25℃培养箱中培养，至对照长满整个平板，测量抑菌带宽度，挑选抑菌较明显的菌株进行复筛。PDA培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖10.0g，琼脂20.0g，水1000ml，自然pH。 [0021] 以草莓炭疽病病原菌胶孢炭疽菌为指示菌，采用发酵液生长速率法进行拮抗菌复筛：初筛获得的拮抗菌接种于高氏一号液体培养基中，25℃、转速160r/min，恒温振荡器中培养3天，发酵液离心去菌体，无菌滤膜过滤后滤液备用。取滤液10ml与90ml冷却至60℃的PDA混合均匀后倒平板，用直径0.6cm打孔器制备病原菌菌块，接种于培养皿中心，以无菌水处理为对照。每个处理重复3次，25℃培养至对照菌落长满整个平板，测量处理菌落直径，求出抑菌率。筛选出了对草莓炭疽病病菌拮抗作用最强的菌株DTJ-24。 [0022] 实施例2 拮抗菌株的鉴定1、形态学鉴定及生化特征 菌落形态：菌株DTJ-24在高氏一号培养基上气生菌丝紫丁香色、基内菌丝无色，无可溶色素，见图1； 显微形态：在显微镜下基内菌丝无隔膜，不断裂；气生菌丝多分枝，且分枝较短，孢子丝长，螺旋形，孢子椭圆形至柱形，表面光滑，见图2； 生化特征：菌株DTJ-24能够使明胶液化，淀粉水解弱。产生硫化氢、能分解纤维素、牛奶胨化、不凝固。可以利用葡萄糖、果糖，不利用蔗糖、肌醇、甘露醇，棉子糖、D-木糖。 [0023] 2、16SrDNA序列分析将菌株DTJ-24接种于高氏一号液体培养基，25℃摇床培养3d，离心收集菌体。采用生工生物工程（上海）有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组DNA。采用通用引物（27f: 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’；1492r:5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）进行16SrDNA的PCR扩增，扩增体系（50ul）：1×Taq PCR Master Mix 25μL，DNA模板1μL（0.1-10ng），引物(10μmol/L)各2 µL，ddH2O 20μL。PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min，4℃终止反应。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，于-20℃冰箱保存，送至生工生物工程（上海）有限公司进行纯化，双向测序并拼接输出全序列。 [0024] 将获得的DNA序列（见Seq1），通过NCBI数据库中的Blast检测并下载已测序列的相似序列和参考序列。运用软件ClustalX（Version 1.83）对多序列进行比对。选取其中6个典型菌株的16SrDNA 序列，以小单孢菌属种类Micromonospora viridifaciens为外群，运用分析软件Mega6.06中的邻位相连法进行系统发育树构建。结果表明，菌株DTJ-24与Streptomyces lavendulae聚类在一个分支上。 [0025] 因此，结合形态、生理生化特征及16SrDNA系统发育分析结果，将菌株DTJ-24鉴定为淡紫灰链霉菌（S. lavendulae）。 [0026] 实施例3 生防菌剂的制备将斜面低温保存的淡紫灰链霉菌菌株DTJ-24划线接种到高氏一号平板中，25℃，培养 48 h进行活化，活化后的菌株以20%接种量接种于种子培养基中，25℃，120r/min，摇床振荡培养3d进行种子扩大培养，获得种子液。 [0027] 将种子液以4%（v/v）的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐培养基装量70%，发酵条件为温度25℃，通气量18%，搅拌速度120r/min，发酵周期为3d，发酵液中菌体数量达9 6×10cfu/ml，发酵液与基质微粉碳酸钙等量混合均匀并干燥，得到生防菌剂，菌剂中活菌 9 数达1×10cfu/ml。 [0028] 种子培养基配方如下：葡萄糖20g/L、鱼粉5g/L、硝酸钾0.5g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸镁0.5g/L和硫酸亚铁0.01g/L，初始pH值7.5 。发酵培养基配方如下：葡萄糖20g/L、豆饼粉10g/L、氯化钠1g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L和硫酸亚铁0.01g/L，初始pH值7.5 。 [0029] 实施例4 温室盆栽试验检测DTJ-24生防菌剂对草莓炭疽病的防效试验于2014年5-9月在辽东学院农学院温室进行，草莓品种为“红颜”，试验温度30℃，相对湿度40％，自然光照。 [0030] 1、叶面喷施防效在盆栽草莓移植成功后做如下处理（将药液均匀的喷洒到草莓植株上，以叶面滴水为度）。（1）用实施例3制备的生防菌剂200倍稀释液进行叶面喷施；（2）清水叶面喷施作为阴性对照；（3）75%百菌清800倍稀释液叶面喷施作为阳性对照。2天后喷施草莓炭疽病病 5 原菌孢子液（1.0×10个/ml）接种病原菌，每个处理组20株，3次重复。每隔7天喷药1次，连续喷施3次，于28d 统计病情指数，计算防治效果，结果见表1。 [0031] 2、灌根处理防效草莓苗盆栽之前做如下处理。（1）用实施例3制备的生防菌剂200倍稀释液浸根处理幼苗20min，移栽时用30mL生防菌剂200倍稀释液灌根处理。（2）清水处理作为阴性对照； （3）75%百菌清800倍稀释液处理作为阳性对照。移栽一周后喷施草莓炭疽病病原菌孢子 5 悬液（1.0×10个/ml）接种病原菌。每个处理组20株，3次重复。每隔7天用药1次，连续使用3次，于28d后统计病情指数，计算防治效果，结果见表2。 [0032] 草莓炭疽病叶柄与匍匐茎的病情分级标准0级：无病；1级：发病部出现浅红色和褪色晕圈，或红褐色斑点，病斑平均长度≤2.0 mm；3级：病斑沿叶柄或匍匐茎方向向两侧扩大呈梭形黑褐色凹陷病痕，病斑平均长度在 2.1~5.0 mm；5级：出现典型的纺锤型病斑，病斑平均长度在 5.1~9.0 mm：7级：病斑扩大，平均长度为 9.1~15.0 mm；9级：叶柄或匍匐茎发病部呈黑色抽缩状，发病叶柄的叶片伴随出现萎蔫，病斑平均长度>15.0 mm。 [0033] 病情指数 = [∑（各级病株数×对应各级值）/（调查总株数×发病最高级值）]×100。相对防效（%）= [（对照病情指数–处理病情指数）/对照病情指数]×100。 [0034] 表1 生防菌剂DTJ-24叶面喷施对草莓炭疽病的防治效果处理 病情指数 防治效果 生防菌剂500倍稀释液 7.53 71.57±0.15a 75%百菌清800倍稀释液 9.04 65.87±1.23b 清水对照 26.49 – 注：表中数据为平均值±标准差，数据后小写字母表示经邓肯新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。 [0035] 表2 生防菌剂DTJ-24灌根处理对草莓炭疽病的防治效果处理 病情指数 防治效果 生防菌剂500倍稀释液 5.64 78.28±0.21a 75%百菌清800倍稀释液 9.57 65.02±0.54b 清水对照 27.36 – 注：同表1。 [0036] 由上述结果可见，本发明实施例3制备的生防菌剂对草莓进行叶面喷施和灌根处理均可降低炭疽病的病情指数和发病率，对炭疽病的防治效果分别达71.6和78.3%，无明显防效差异，两种使用方法均能够有效防治草莓炭疽病的发生。 |
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