鸡败血支原体制剂 |
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| 申请号 | CN201080005239.8 | 申请日 | 2010-01-22 | 公开(公告)号 | CN102292432B | 公开(公告)日 | 2013-05-22 |
| 申请人 | 乔治亚大学研究基金公司; | 发明人 | S.H.克莱文; N.M.费尔古森; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种在鸡形目的 鸟 类中 预防 有毒鸡败血支原体感染的制剂。所述制剂包括位于药学上可接受的载体中的活鸡败血支原体菌株K5831或其衍 生物 。还提供一种在鸡形目的鸟类中预防有毒鸡败血支原体感染的 疫苗 。还提供施用所述制剂和疫苗的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种分离的鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)菌株，其中所述分离的鸡败血支原体菌株是K5831鸡败血支原体菌株，其以保藏号PTA-9495保藏在ATCC。 |
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| 说明书全文 | 鸡败血支原体制剂[0001] 继续申请数据 [0002] 本申请要求享有2009年1月22日提交的美国临时申请系列号61/146,472的权益，其在此通过援引并入。 [0003] 背景 [0004] 鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum (MG))是鸡和火鸡的感染性呼吸病原体。它是家禽最致病的和经济上最重要的支原体病原体。来自尸体弃用或降级的经济损失，降低的饲养和产蛋效率，和增加的医药花费是使得其成为世界范围内商品化家禽生产面临的最昂贵的病害问题之一的因素。MG的控制通常通过分离和维持不含MG的种畜。但是，在小型地理区域中家禽生产的快速扩增和总量从不减少的多年龄(multiple-age)农场使得单独通过这种生物安全努力来消灭和控制MG变得很困难，需要采用其他措施。在这些情况下，抗MG相关疾病的家禽预防接种包括使用灭活疫苗或暴露于MG的减毒活疫苗株。参见，例如，Kleven et al, 1997, Acta Vet Hung; 45(3):299-305。 [0005] 但是，每种方法都有缺点。灭活疫苗，尽管通常能够有效预防蛋鸡产蛋量的损失，但不能可靠地预防感染或提供抗呼吸系统疾病的一贯预防。并且，尽管减毒MG活疫苗看起来比灭活疫苗更有效(因此更受欢迎)，但是它们可能造成疾病或损害生殖功能。 [0006] 有效MG活疫苗的重要特性是增加对野生型菌株感染的抗性的能力，以及在多年龄生产场所用疫苗菌株取代野生型菌株的能力(Levisohn and Kleven, 2000, Rev Sci Tech; 19(2):425-42; 和Turner and Kleven, 1998, Avian Dis; 42(2):404-7)。 [0007] 目前，提供用于控制MG的活疫苗包括F菌株(Luginbuhl et al, 1967, Ann NY Acad Sci; 143:234-238; Adler et al., 1960, Am J Vet Res; 21:482-485)，6/85 (Evans and Hafez, 1992, Avian Dis; 36:197-201)和ts-11 (Whithear et al., 1990, Aust Vet J; 67:159-165; and Whithear et al., 1990, Aust Vet J; 67: 168-174)。F菌株可传输到未接种的鸡舍同伴或相邻鸡舍的鸡，并且可以在接种停止后很久从农场分离。当接触时，菌株ts-11和6/85可以从接种的家禽传输到未接种的家禽，尽管较弱。在上呼吸道F菌株保留比ts-11或6/85更高的水平，并且ts-11看起来比6/85更有效地定殖(colonize)。F菌株还从母鸡传输到卵。令人遗憾地，尽管每种现有疫苗都具有其优点，它们中没有一个在各个方面都达到理想状态。因此，需要改进的活MG疫苗株，它们既安全又有效，既稳定又无毒。 [0008] 发明概述 [0010] 本发明包括一种基本上生物纯的K5831鸡败血支原体菌株的培养物，所述K5831鸡败血支原体菌株以专利命名PTA-9495保藏在ATCC。 [0011] 本发明包括一种分离的鸡败血支原体菌株，其中所述分离的鸡败血支原体菌株是以专利命名PTA-9495保藏在ATCC的K5831鸡败血支原体菌株，或其后代或衍生物，其中其后代或衍生物具有以专利命名PTA-9495保藏在ATCC的K5831鸡败血支原体菌株的相同生物学、血清学和/或遗传学特征。 [0012] 本发明包括一种基本上生物纯的以专利命名PTA-9495保藏在ATCC的K5831鸡败血支原体菌株或其后代或衍生物的培养物，其中其后代或衍生物具有以专利命名PTA-9495保藏在ATCC的K5831鸡败血支原体菌株的基本上相同的生物学和血清学特征。 [0013] 在本发明的一些实施方案中，所述分离的鸡败血支原体菌株，其后代或衍生物是冻干的。 [0014] 本发明包括一种组合物，其包含如本文描述的分离的鸡败血支原体菌株，其后代或衍生物。在一些实施方案中，组合物还可以包含水。在一些实施方案中，组合物还可以包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物可以被配制用于粘膜施用。在一些实施方案中，组合物可以被配制用于鼻内，眼内或口服施用。在一些实施方案中，组合物可以被配制用于喷雾或雾化(aerolizing)。 [0015] 本发明包括一种疫苗，其包含如本文描述的分离的鸡败血支原体菌株，其后代或衍生物，或如本文描述的组合物。在一些实施方案中，疫苗可以降低鸡形目的鸟类对鸡败血支原体诱导的疾病的易感性。 [0016] 本发明包括一种用于鸡形目鸟类的疫苗，包括一定量的以专利保藏命名(Patent Deposit Designation) PTA-9495保藏在ATCC的K5831鸡败血支原体菌株或其衍生物和药学上可接受的载体，所述量足以保护鸟类免受鸡败血支原体诱导的疾病。在一些实施方案中，保护量是K8531鸡败血支原体菌株定殖到鸟类上呼吸道需要的量。在一些实施方案中，7 保护量是约50到约5×10 ccu/鸟。 [0017] 本发明包括一种用于降低鸡形目的鸟类对鸡败血支原体诱导疾病的易感性的方法，所述方法包括给鸟类施用以专利保藏命名PTA-9495保藏在ATCC的K5831鸡败血支原体菌株，或其后代或衍生物。 [0018] 本发明包括一种用于降低鸡形目的鸟类对鸡败血支原体诱导疾病的易感性的方法，所述方法包括给鸟类施用如本文描述的分离的鸡败血支原体菌株、后代或衍生物，如本文描述的组合物，或如本文描述的疫苗。 [0019] 本发明包括一种用于保护鸡形目的鸟类抗鸡败血支原体诱导疾病的方法，所述方法包括给鸟类施用以专利保藏命名PTA-9495保藏在ATCC的K5831鸡败血支原体菌株，或其后代或衍生物。 [0020] 本发明包括一种用于保护鸡形目的鸟类抗鸡败血支原体诱导疾病的方法，所述方法包括给鸟类施用如本文描述的分离的鸡败血支原体菌株、后代或衍生物，如本文描述的组合物，或如本文描述的疫苗。 [0021] 在本发明方法的一些方面，K5831鸡败血支原体菌株或其后代或衍生物保留在鸟类的呼吸上皮。在本发明方法的一些方面，K5831鸡败血支原体菌株或其后代或衍生物从呼吸上皮排除其他鸡败血支原体菌株。在本发明方法的一些方面，给呼吸粘膜施用K5831鸡败血支原体菌株或其后代或衍生物。在本发明方法的一些方面，通过滴眼剂施用K5831鸡败血支原体菌株或其后代或衍生物。在本发明方法的一些方面，经鼻施用K5831鸡败血支原体菌株或其后代或衍生物。在本发明方法的一些方面，通过气雾剂施用K5831鸡败血支原体菌株或其后代或衍生物。在本发明方法的一些方面，通过饮用水施用K5831鸡败血支原体菌株或其后代或衍生物。在本发明方法的一些方面，所述方法还包括给鸟类施用至少一种额外的加强剂。在本发明方法的一些方面，鸟类可以是鸡或火鸡。 [0023] 除非另作说明，“一”，“该”和“至少一”可以互换使用，表示一或多于一。 [0025] 图1是描述直接接触者传播研究的结果概述的图示。结果显示为%阳性。 [0026] 图2是描述分泌研究的结果概述的图示。结果显示为%阳性。 [0027] 图3是描述取代研究结果的图示，表示为引入R菌株播种者(seeders)后第0，2，4和8周接种鸡和未接种鸡(对照)中R菌株的拷贝数(Log10)。 [0028] 图4是描述取代研究结果的图示，表示为引入R菌株播种者后第0，2，4和8周接种鸡和未接种鸡(对照)中R菌株的拷贝数(Log10)。 [0029] 图5是描述取代研究结果的图示，表示为引入R菌株播种者后第0，2，4和8周来自鸡的疫苗的拷贝数(Log10)。 [0030] 图6是描述取代研究结果的图示，表示为引入R菌株播种者后第0，2，4和8周来自鸡的疫苗的拷贝数(Log10)。 [0031] 图7显示对K5831B-19和回传(back passage)分离物K5883-2进行指纹分析的随机扩增多态性DNA (RAPD)分析的结果。第1道是K2101。第2道是K5831B-19。第3道是K5833-2。第4道是R菌株。第5道是6/85。第6道是ts-11。第7道是F菌株。第8道是阴性对照。第9道是100 bp 梯。 [0032] 图8显示对用K5831B-19，K882-1或R菌株攻击后10天的K5831B-19回传分离物进行指纹分析的随机扩增多态性DNA (RAPD)分析的结果。 [0033] 本发明示例性实施方案的详述 [0034] 本发明提供鸡败血支原体（MG）菌株K5831，其后代和衍生物，当作为活制剂施用时它们是无毒的，免疫原性的和稳定的。本发明的鸡败血支原体制剂能够安全和有效的抑制鸡败血支原体感染，可用于降低鸟类中鸡败血支原体感染疾病的发病率和严重性。 [0035] 鸡败血支原体菌株K5831于2008年9月15日作为PTA-9495保藏于美国典型培养®物保藏中心(ATCC), 10801 大学大道，马纳萨斯（University Boulevard, Manassas）, VA 20110-2209, USA。该菌株是依据用于专利程序的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约(Budapest Treaty)进行保藏的。鸡败血支原体菌株K5831在本文中还被称为鸡败血支原体菌株K5831B-19，MG K5831, MG K5831B-19, MG菌株K5831, MG菌株K5831B-19, K5831, K5831B-19, ATCC PTA-9495和PTA-9495。从用鸡败血支原体菌株K2101 (MG K2101)攻击的鸡中分离鸡败血支原体菌株K5831。MG K2101是野外分离物，在Colorado于1984年从显示卵保护降低的商品化蛋鸡群中分离。在大约30种分离物，分离物B-1到B-30，中选择分离物MG K5831B-19用于进一步的表征和分析。 [0036] 本发明包括分离的鸡败血支原体(MG)菌株K5831，其于2008年9月15日以ATCC专利保藏命名PTA-9495进行保藏。如本文使用的，“分离的”是指从其初始环境（例如，如果其是天然存在的，就是自然环境）取出的材料，因此“借助人工”从自然状态被改变。还包括在本发明中的是鸡败血支原体菌株K5831 (ATCC专利保藏命名PTA-9495)的分离的后代和分离的衍生物，以及具有等同或类似生物学、血清学和/或遗传特征的菌株。如本文使用的，血清学、生物学和遗传特征可以包括在与此一起包括的实施例和附图的数据中描述的一种或更多种特征。更具体的，PTA-9495材料的后代或衍生物菌株保留特别有利的属于本发明的保护特性。可以通过本领域已知的增殖鸡败血支原体(包括，例如，在体外培养或鸟类的回传中)的各种方法中的任一种获得鸡败血支原体菌株K5831 (ATCC专利保藏命名PTA-9495)的后代。后代的实例包括，例如，重分离物K5866，K5969，K5872，和K5876，以及K5883-2，如实施例3所述。鸡败血支原体菌株K5831 (ATCC专利保藏命名PTA-9495)的衍生物应当包括保藏的MG K5831菌株的遗传改造形式。这类操作包括，但不限于，诱变处理MG菌株，或将编码选择性蛋白或无功能蛋白的基因或基因盒或非编码核苷酸序列导入MG生物体。 [0037] 可以鉴定MG菌株K5831及其后代和衍生物并与其他鸡败血支原体菌株进行区分，使用已经开发用于区分鸡败血支原体菌株的许多技术中的任一种，包括，例如，蛋白模式分析(Khan et al., 1987, Avian Dis; 31:315-320)，限制性片断长度多态性(RFLP) (Kleven et al., 1988, Avian Dis; 32:731-741)，核糖体分型(Yogev et al., 1988, Avian Dis; 32:220-231)，菌株特异性DNA探针(Khan et al., 1989, Avian Pathol;18:135-146)，利用菌株特异性引物的PCR (Nascimento et al., 1993, Avian Dis; 37:203-211)，和随机扩增的多态性DNA (RAPD) (Charlton et al., 1999, J Vet Diag Invest; 11:158-161; Fan et al., 1995, Avian Dis 39; 729-735; and Geary et al., 1994, Mol Cell Probes; 8:311-316)。RAPD方法已经成功在实验室和野外条件下用于鉴定疫苗株(Ley et al., 1997, Avian Dis; 41:187-194; Kleven and Fan, 1998, Avian Dis; 42:300-306; Turner and Kleven 1998, Avian Dis 42; 404-407)，以及用于在野外追踪流行病学相关的分离物(Kempf, 1998, Avian Pathol; 27:7–14; Ley et al., 1997, Emerg Infect Dis; 3:375-380; Charlton et al., 1999, J Vet Diagn Invest 11, 408–415; Levisohn & Kleven, 2000, Rev Sci Tech; 19:425-442)。K5831的后代或衍生物可以具有MG菌株K5831的一种或更多种鉴定特征。K5831的后代或衍生物可以具有基本上所有这类鉴定特征。在另一个方面，本发明还预期亲本MG K2101菌株及其后代和衍生物，以及它们在本文描述的组合物、疫苗和方法的任一项中的用途。 [0038] 使用随机扩增的多态性DNA（RAPD）分析可以鉴定MG菌株K5831、其后代和衍生物，并与其他鸡败血支原体菌株进行区分。简单来说，使用Fan等更详细描述的步骤(Fan et al., 1995, Avian Dis; 39:729-735)，利用3条任意选择的引物进行随机引发的聚合酶链反应(AP-PCR)，包括低严谨性扩增的3个循环继之以更高严谨性的PCR。使用的3条寡核苷酸引物是 [0039]和 。K5831B-19 和后代K5833-2的这类RAPD分析的代表性结果显示于图7和8。当使用Fan引物时，其后代和衍生物显示与鸡败血支原体菌株K5831 (ATCC专利保藏命名为PTA-9495)基本上等同的RAPD模式。 [0040] 可以使用基因靶向测序(GTS)法来鉴定K5831、其后代或衍生物，并与其他鸡败血支原体菌株进行区分。可以分析各种基因的任一种。例如，可以使用gapA基因，mgc2基因，pvpA基因和/或编码预测的保守表面脂蛋白的基因的遗传序列。在鸡败血支原体Rlow菌株的基因组中首先鉴定了这4种基因序列(Papazisi et al., 2003, Microbiol;149:2307-2316)。gapA基因编码的蛋白被证明参与细胞粘附过程(Goh et al., 1998, Microbiol; 144:2971-2978)，经鉴定为基因组编码DNA序列(CDS) MGA_0934。mgc2基因编码的第二种细胞粘附素蛋白已知也在粘附过程中起作用(Hnatow et al., 1998, Infect Immun; 66:3436-3442)，经鉴定为基因组CDS MGA_0932。pvpA基因编码假定的辅助细胞粘附素，其在鸡败血支原体菌株之间显示大小变化(Boguslavsky et al., 2000, Infect Immun; 68:3956-3964; Liu et al., 2001, J Clin Microbiol; 39:1882-1888)。 最初被Nascimento等识别的编码预测的保守表面脂蛋白的基因(Nascimento et al. 1991, Avian Dis; 35:62-69)，经鉴定为基因组CDS MGA_0319 (Papazisi et al., 2003, Microbiology; 149:2307-2316)。 [0041] 在细胞粘附素pvpA基因(SEQ ID NO:13)，细胞粘附素gapA基因(SEQ ID NO:15)，细胞粘附素mgc2基因(SEQ ID NO:14)，或非特征性的假设表面脂蛋白编码基因指定的基因组编码DNA序列(CDS) MGA_0319 (SEQ ID NO:12)的部分中，K5831的后代或衍生物具有鸡败血支原体菌株K5831B的一种或更多种鉴定序列，这是通过实施例8更详细描述的基因靶向测序(GTS)分析，随后按照例如Ferguson等更详细描述的方法(Ferguson et al.,2005, Microbiol; 151:1883-1893)确定的。 [0042] MG菌株K5831及其后代或衍生物可以显示Taqman实时PCT标准曲线，其具有对于1，2，3，4，5，6，7和8的模板log10拷贝数的平均CT值37.20，33.48，30.48，27.15，23.97，20.74，17.28和13.70中的一个或更多个，线性方程为y=-0.3021x + 12.203；和/或R-均方值0.9996。这类Taqman实时PCT可以利用来自mgc2基因( GenBank登录号AY556238)的引物，诸如，例如，使用正向引物序列(5'→3')包括AY556238的核苷酸 218到237 ，反向引物序列(5'→3')包 括AY556238的核苷酸329到308 ，双 标 记 探 针 序 列 (5' → 3') 包 括 AY556238 的 核 苷 酸 280 到 303 ，和61℃的退火/延伸温度。可 选的，可以使用来自mgc2基因( GenBank登录号AY556282)的类似探针。用于这类测定的方法由Raviv等更详细地描述(Raviv et al., 2008, Veterinary Medicine; 129(1-2):179-87)。K5831的后代或衍生物可以具有通过这类Taqman实时PCR测定而确定的MG菌株K5831的一种或更多种鉴定特征。 [0043] 本发明的鸡败血支原体菌株显示各种额外的生物学和/或血清学特征，包括但不限于与此一起包括的实施例中描述的那些特征中的任一项。例如，本发明的鸡败血支原体菌株可以显示更低的传染率。本发明的鸡败血支原体菌株可以显示在上呼吸道中增强的保留性。当回传时，本发明的鸡败血支原体菌株几乎不显示或不显示毒性的增加。本发明的鸡败血支原体菌株显示有限的或没有垂直传染。利用本发明鸡败血支原体菌株的接种可以产生其他鸡败血支原体菌株(诸如例如R菌株)较低的定殖。利用本发明鸡败血支原体菌株的接种可以导致攻击后的肉眼损害(gross lesions)，主要存在于受攻击鸟类的呼吸系统中。 [0044] 利用本发明，通过研究最小剂量，传染性，保留性和分泌，回传，机体分布，垂直传染，毒性菌株的取代，含胚卵和鸡的致病性，以及生化学、生物学和血清学特性的表征，来评价鸡败血支原体菌株K5831。感染和诱导足够疫苗保护必需的MG K5831最小滴度是约5 6.22×10CCU/ml。MG K5831具有相对低的传染率，并在上呼吸道中保留至少5个月。当通过鸡回传5次时，MG K5831的毒性没有增加，并评价攻击后的肉眼损害。MG K5831主要保留在受攻击鸟类的呼吸系统中。没有检测到MG K5831的垂直传染。并且，利用MG K5831的接种导致R菌株的更低定殖。 [0045] 本发明包括本文描述的鸡败血支原体菌株，其后代和衍生物的组合物。这类组合物可以作为疫苗，以降低鸟类对鸡败血支原体诱导的疾病的易感性。这类组合物可从作为疫苗，以保护鸟类免受鸡败血支原体诱导的疾病。本发明的组合物和疫苗可以包括，例如，水或培养基。这类组合物和疫苗可以包括药学上可接受的载体或稀释剂。载体包括，例如，稳定剂，防腐剂和缓冲剂。合适的稳定剂包括，例如，SPGA，碳水化合物（诸如山梨糖醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，葡聚糖，谷氨酸或葡萄糖），蛋白（诸如奶粉，血清，白蛋白或酪蛋白）或其降解产物。合适的缓冲剂包括，例如，碱金属磷酸盐。合适的防腐剂包括，例如，硫柳汞(thimerosal)，乙汞硫代水杨酸钠(merthiolate)和庆大霉素。稀释剂，包括，但不限于，水，水性缓冲液（例如，缓冲盐水），醇，和多元醇（诸如甘油）。 [0046] 本发明的MG菌株，组合物和疫苗可以是基本上纯的。如本文使用的，“基本上纯的”表示基本上不含任何类似大分子或其他生物学实体(在自然界中通常与其一起被发现)的材料。 [0047] 优选的用于这类制剂的生物体是活的。在一些实施方案中，生物体，组合物或疫苗可以是冻干的。 [0048] 本发明的组合物和疫苗可以施用给对鸡败血支原体易感的各种禽类物种中任一种的鸟类，包括但不限于，家禽，鸡形目的鸟类，和外来鸟类物种。鸡形目的鸟类包括，但不限于，鸡，火鸡，松鸡，鹌鹑和野鸡。如本文使用的，家禽包括饲养用于收集它们的蛋，或杀死取它们的肉和/或羽毛的驯化鸟类。这些最常见的是鸡雁小纲(Galloanserae)总目（家禽）的成员，特别是鸡形目（其包括，例如，鸡，鹌鹑，火鸡，和松鸡）和鸭科（雁形目），通常被称为“水鸟”（包括，例如，鸭，鹅，和天鹅）。家禽还可以包括杀死取它们肉的其他鸟类，诸如鸽子(pigeons)或鸠鸽(doves)或被认为是猎物的鸟类(像野鸡)。鸡包括，但不限于，母鸡，公鸡，肉仔鸡，烤用仔鸡，蛋鸡，种鸡，育种母鸡和蛋鸡的后代。如本文使用的，术语“对...易感”表示对引用微生物的不利应答的可能性或现状，诸如，例如，当与非易感的个体或群组比较时，减少的活力或发育停滞，和/或指示鸡败血支原体感染的一种或更多种病理状态。 [0049] 本发明的组合物和疫苗可以配制用于通过兽医领域已知的各种途径中的任一种进行输送，诸如例如，粘膜、鼻内、眼内或口服施用。本发明的组合物和疫苗可以配制用于输送到呼吸粘膜，并可施用使得其立即或最终接触鸟类的呼吸粘膜。本发明的组合物和疫苗可以配制用于通过兽医领域已知的各种方式中的任一种进行输送，诸如例如，喷雾或雾化。本发明的免疫原性组合物或疫苗可以通过接种鸟类的任意合适的已知方法进行施用，包括但不限于，鼻的，眼的，通过注射，饮用水，喂食，通过暴露，卵内，母系地，等等。 [0050] 免疫原性组合物或疫苗可以通过大规模施用技术进行施用，诸如将疫苗放入饮用水中或通过给动物的环境进行喷雾。可以通过用溶液给个体或群体喷雾来施用组合物，这类气雾剂输送包括施用混合入小液体颗粒的组合物。这类喷雾型颗粒的液滴尺寸范围是约10到约100微米，更优选的，液滴尺寸为约<1到约50微米。为了产生小颗粒，可以使用常规的喷雾装置和气雾剂发生器，诸如商品化供应的用于背罐喷雾、孵化场喷雾和atomist喷雾的喷雾发生器。可以使用常规装置进行通过饮用水的施用。当通过注射施用时，可以肠胃外施用免疫原性组合物或疫苗。肠胃外施用包括，例如，通过静脉内，皮下，肌内或腹腔内注射的施用。 [0051] 本发明的组合物或疫苗可以在孵化之前或之后给鸟类施用。鸟类可以在各个时期中的任一个接受这类疫苗组合物。对于孵化后的输送来说，可以在例如，孵化后约1周，孵化后约2周，孵化后约3周，孵化后约4周，孵化后约5周，孵化后约6周，或其任意范围进行材料的输送。对于卵内施用来说，可以在温育约十七天，温育约十八天，温育约十九天，温育约二十天，和其任意范围进行材料的输送。 [0052] 可以调整本发明的组合物和疫苗以包括指定浓度的鸡败血支原体。生物体可以测定为颜色改变单位。鸡败血支原体的颜色改变单位，本文中也称为“ccu”，是使用确立的标准方法来定量的，包括，例如，Rodwell和Whitcomb阐述的方案（在“Methods in Mycoplasmology,”中， Eds. Razin and Tully, 1993)。例如，可以按照每只鸟每眼一滴给3 6 单只鸟施用有效量，一滴大约0.05 ml，因此浓度为约1×10 到约1×10 颜色改变单位/ml 2 (ccu/ml)，这相当于约50到约50,000 ccu/鸟。例如，可以使用以下浓度：约 50, 约1×10 2 3 3 4 ccu/ml, 约5×10 ccu/ml, 约1×10 ccu/ml, 约5×10 ccu/ml, 约1×10 ccu/ml, 约 4 5 5 6 6 5×10 ccu/ml, 约1×10 ccu/ml, 约5×10 ccu/ml, 约1×10 ccu/ml, 约5×10 ccu/ 7 7 5 ml, 约1×10 ccu/ml, 约5×10 ccu/ml, 及其任意范围(诸如，例如，约1×10 ccu/ml 6 到约1×10 ccu/ml)。 [0053] 可以给鸟类施用本发明的鸡败血支原体菌株以降低对鸡败血支原体感染的易感性。利用这类施用，所述材料不产生显著的指示鸡败血支原体的临床体征或病变。所述材料是稳定的，不是通过遗传改造产生，具有低毒性，在体内许多次传代期间具有增加的稳定性，当回传5次时毒性不增加，和/或主要保留在呼吸系统中。所述材料不传输到蛋，或以非常低的比例传输到蛋。此外，本发明可以取代毒性野生型菌株和取代来自家禽操作的循环性地方菌株。 [0054] 因此，本发明的一个目的是提供不产生显著的指示MG疾病的临床体征或病变的免疫材料。另一个目的是提供在上呼吸道保留至少5个月的免疫材料。另一个目的是提供不是通过遗传改造产生的免疫材料。另一个目的是提供具有低毒性的免疫材料。另一个目的是提供在体内许多次传代期间具有增加的稳定性的免疫材料。另一个目的是提供当回传至少5次时毒性不增加的免疫材料。另一个目的是提供主要保留在呼吸系统的免疫材料。另一个目的是提供不传输到蛋，或以非常低的比例传输到蛋的免疫材料。另一个目的是提供预防毒性野生型菌株的感染进而取代来自家禽操作的循环性地方菌株的免疫材料。 [0055] 不希望受到任一具体理论的束缚，本发明的MG菌株刺激免疫，并保留在受治疗鸟类的呼吸粘膜中，特别是上呼吸道中。因此，利用所述材料治疗鸟类的有益结果是所述材料排除毒性野生菌株在上呼吸道定殖的能力。如本文使用的，“野生”菌株包括存在于鸟类环境中的任意菌株，包括野生型菌株，或通过先前的接种尝试存在于混合家禽中的菌株。施用的量可以是在任意单只鸟，或任意指定群体的上呼吸道中定殖，优选的足以提供预防毒性野生型菌株侵袭的保护的时间段所必需的量。施用的量可以足够在鸟类的呼吸道中定殖。 [0056] 可以根据，但不限于下列方案，在培养基中培养本发明的鸡败血支原体(MG)菌株。用于分离禽类支原体的Frey's培养基∶ [0057] 支原体肉汤基料 22.5 g [0058] 葡萄糖 3 g [0059] 猪血清 120 ml [0060] 酵母提取物 35 ml [0061] 酚红(1%) 2.5 ml [0062] 醋酸亚铊(10%)A 6 ml [0063] 氨苄青霉素 1 g/升A [0064] 将试剂混合，并用蒸馏水补足到1000 ml。 [0065] A-当利用纯MG培养物(诸如在商品化的疫苗生产中)时，可以省略醋酸亚铊和氨苄青霉素。 [0066] 用20% NaOH将pH调节到7.8，并过滤除菌。 [0067] 可以使用其他生长因子和防腐剂来替代上面所列物质而不脱离本发明的范围。 [0068] 对于琼脂培养基来说，使用1%的纯化琼脂诸如离子琼脂#2，Noble琼脂，或Difco纯化琼脂。通过在121℃高压灭菌15分钟，将除了血清和氨苄青霉素以外的所有成分灭菌。冷却到50℃，无菌添加血清和氨苄青霉素(它们已通过过滤预灭菌并加温到50℃)。混合并倒入平板到大约5 mm的厚度。 [0069] 本发明还提供一种试剂盒，包括本文描述的鸡败血支原体菌株K5831，和/或其后代或衍生物。所述试剂盒可以包括装填本发明鸡败血支原体的一个或更多个容器。鸡败血支原体菌株k5831可以是冻干的。所述试剂盒可以包括鸡败血支原体的其他菌株或其他家禽病原体的额外的分离容器。此外，所述试剂盒还可包括实施本发明需要的其他试剂诸如缓冲液和溶液。任选的与这类容器相伴的是通知或打印的说明书。本发明的试剂盒可以包括“包装材料”。如本文使用的，术语“包装材料”是指一个或更多个用于容纳试剂盒内容物的物理结构。包装材料通过公知的方法构建，优选的提供无菌、无污染的环境。包装材料可以是固体基质或材料诸如玻璃，塑料，纸，箔，等等。因此，例如，包装可以是用于包含ccu量鸡败血支原体菌株K5831的玻璃或塑料小瓶。 [0070] 通过下列实施例说明本发明。应理解具体实施例，材料，量和方法是根据本文阐述的本发明范围和精神广泛解释的。对于本文公开的包括不连续步骤的任意方法，所述步骤可以按照任何可行的顺序进行。并且，合适情况下，可以同时进行两个或更多个步骤的任意组合。实施例 [0071] 实施例1 [0072] 鸡败血支原体菌株K5831最小剂量研究 [0073] 本实施例研究鸡败血支原体(MG)菌株K5831作为活疫苗在鸡中的最小感染剂量和最小保护剂量。从已知不含MG和MS的来源获得80只8周龄的商品化蛋鸡型鸡，并放在8个鸡舍中。通过到达时的培养和血清学筛选鸡的支原体存在。鸡的接种前筛选结果对于支原体和抗体的存在是阴性的。 [0074] 对于血清学筛选，分析血清的MG抗体，利用商品化抗原(Intervet America, Millsboro, Del)进行血清板凝集(SPA)试验，和利用从A5969菌株和鸡红细胞制备的抗原进行血凝抑制(HI)试验。根据Kleven描述的方法进行SPA和HI试验(Kleven, S. H. Mycoplasmosis. In: A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, Fourth Edition, Four ed. D. E. Swayne, J. R. Glisson, M. W. Jackwood, J. E. Pearson and W. M. Reed, eds. American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, PA. pp 74-80. 1998)。≥1的SPA分数被认为是阳性的。1:20的HI滴度被认为是疑似的，≥1:40被认为是阳性的。还针对血清(IDEXX, Westbrook, Maine)进行商品化的酶联免疫吸附测定(ELISA)。 [0075] 为了分离和鉴定支原体，使用来自鼻后孔裂缝，气管，气囊或机体分布各个部位的药棉拭子进行培养。将拭子接种到Frey's改良肉汤和琼脂，并在37℃孵育至少三周。使用直接免疫荧光鉴定支原体分离物。 [0076] 为了确定最小感染剂量，利用107颜色改变单位/ml (ccu/ml)到102 ccu/ml的K5831B-19稀释物通过气雾剂接种6组共12只鸡。攻击后3天，用拭子对鸡擦拭，并针对MG6 进行培养。接种后五周，从鸡取血并培养。6.22×10 ccu/ml的剂量感染12只鸡中的10 5 4 只(83%)；6.22×10 ccu/ml感染12只鸡中的4只(33%)和6.22×10 ccu/ml感染12只 6 5 鸡中的2只(17%)。接种后33天，用6.22×10 ccu/ml和6.22×10 ccu/ml的K5831B-19接种的组通过培养对MG是100%阳性的。这些发现概述于表1。 [0077] 表1. 最小感染剂量。利用K5831B-19A接种(气雾剂) 3天后来自鸡气管的MG分离物。 [0078] [0079] 为了确定最小保护剂量，在接种后6周用R菌株对鸡进行攻击。一组作为未接种的攻击对照，第二个未攻击组作为阴性对照。攻击后10天对鸟进行尸检，通过气囊病变打分，血清学，培养和气管粘膜厚度和打分进行评价。当与未接种的攻击对照比较时，接种6.22×106 ccu/ml和6.22×105 ccu/ml的K5831B-19的组具有显著更低的平均气囊病变分数和平均气管粘膜测量值。当与对照比较时，6.22×106 ccu/ml的疫苗剂量也产生显著更少的来自鸟类气囊的MG分离物。对来自接种6.22×106 ccu/ml和6.22×105 ccu/ml的K5831B-19的组的一些分离物的RAPD分析显示所述分离物可能是R菌株和K5831B-19的混合培养物。这些结果概述于表2。 [0080] 因此，6.22×105 ccu/ml的K5831B-19是感染和诱导足够疫苗保护必需的最小滴度。尽管最初只有33%的鸡被这一剂量感染，30天后100%的组被感染，并且保护是良好的。6 6.22×10 ccu/ml的滴度产生更好的保护。这一最小剂量可能受到许多因子的影响，包括施用方法，畜舍和环境。 [0081] 实施例2 [0082] 鸡败血支原体菌株K5831传染和分泌 [0083] 本实施例研究鸡败血支原体（MG）菌株K5831从感染的鸡传染到首次用于实验的(naive)鸡的潜能。研究K5831B-19在接种鸟类的呼吸道中的保留(分泌)。 [0084] 步骤 [0085] 从不含支原体的来源获得125只雄性蛋鸡型鸡。将鸡放入鸡舍。有4组（每个鸡舍35，15，20和20只鸡）用于传染研究，1组35只鸡用于分泌研究。在3周龄时，通过培养和血清学对5只鸡进行支原体筛选。 [0086] 传染性。在4周龄时，通过气雾剂用K5831B-19感染播种者组鸡的35只鸡。然后将这些鸡中的5只与15只直接接触者的组混在一起。将20只鸡放入非常接近直接接触者(跨金属丝接触(across-wire contacts))的鸡舍。将另一组20只鸡放入通过空鸡舍与直接接触者分隔的鸡舍（跨越空鸡舍的接触）。从15只直接接触者和5只来自跨金属丝接触和跨越空鸡舍的接触组每种的的鸡取血用于血清学检测，在播种者接种后1，2，4，8，12，16和20周获得拭子进行支原体培养。在每个取血/拭子擦拭中，5只老的播种者被去除（取血和拭子擦拭）并被5只新的播种者取代。在接种后20周，从所有鸟类取血，培养并安乐死。 [0087] 分泌。在四周龄时，通过气雾剂用K5831B-19接种35只鸡。在接种后1，2，4，8，12，16和20周，取出5只鸡，通过血清学，气管和气囊拭子的培养以及气管组织病理学进行评价。 [0088] [0089] 结果 [0090] 传染性。传染结果显示于表3。播种者导入后(PI)四周，一只混杂在一起的鸟类(直接接触者)对K5831B-19是培养物阳性的。导入后(PI) 8周，通过培养和血清学证实直接接触者具有低水平的感染(2/15)。PI 16周，K5831B-19感染大多数直接接触者(12/14)。疫苗不传输到通过金属丝网分隔的相邻鸡舍中的鸟类，或通过空鸡舍分隔的鸟类。这些数据在图1中用图表表示。 [0091] 表3. （传染性）。直接接触，相邻鸡舍(邻近的)之间或利用空鸡舍分隔的间接接触，通过滴眼剂(播种者)用K5831B-19菌株攻击后来自鸡鼻后孔裂隙的血清学应答和MG分离。 [0092] [0093] [0094] 分泌。分泌结果显示于表4。直至接种后20周(本研究结束时)仍从接种鸟类再分离出K5831B-19。从气囊和气管再分离的发生率随时间降低。在接种后8周气囊里不存在疫苗，在接种后20周来自气管的回收发生率降至60% (3/5)。在接种后20周，鸟类仍然是血清阳性的。这些数据在图2中用图表表示。 [0095] 在本研究中，大多数混杂在一起的鸡直至性成熟开始后20周龄仍是阴性的。可以总结得出K5831B-19具有相对低的传染率。在本研究中，K5831B-19在整个研究期间(5个月)都保留在上呼吸道。 [0096] 实施例3 [0097] 鸡败血支原体菌株K5831在鸡中的回传 [0098] 本实施例研究在鸡中5次回传后,鸡败血支原体（MG）菌株K5831在鸡中引起疾病的潜能。还研究了受攻击的鸡体内MG的分布。 [0099] 步骤 [0100] 回传。获得3周龄的25只SPF鸡，并放入5个分离单位。通过滴眼剂用K5831B-19攻击一组5只鸡。攻击后1周，用拭子擦拭这些鸟类的气管，使用这些拭子感染第二组5只鸡。采用这种方式将K5831B-19回传5次。通过在使用拭子转移感染(K5866, K5969, K5872, 和K5876)后将气管拭子接种入改良的Frey's肉汤，从感染的鸡重分离MG。在攻击研究中使用K5831B-19的最终重分离物(K5883-2)。 [0101] 攻击。从已知不含MG和MS的来源获得80只商品化的蛋鸡型鸡。将这些鸡放入4个鸡群舍。在4周龄，通过血清学和培养筛选8只鸡以确保它们不含MG。在5周龄，用 8 7 8 K5831B-19 (2.59×10 CCU/ml)，K5883-2 (1.21×10ccu/ml)和R菌株(1.15×10 ccu/ml)菌株的对数期培养物攻击3组鸡。一组不进行攻击(阴性对照)。攻击后10天对鸟进行尸检，通过气囊病变打分，血清学和培养进行评价。 [0102] 机体分布。除气管和气囊之外，还培养来自用上述K5831B-19 (2.59×108 ccu/ml)攻击的5只鸟的6个部位（肾，肝，粘液囊，肺，盲肠扁桃体，和脾）。 [0103] 随机扩增多态性DNA（RAPD）。使用RAPD分析对MG分离物进行指纹分析。使用4种靶基因(pvpA, mgc2, gapA和MGA_0319)的RAPD分析和测序来比较K2101，K5831B-19和K5883-2。使用的步骤和引物描述于Fan等 (Fan et al., 1995, Avian Dis; 39:729-735)。 [0104] DNA序列分析。按照先前的描述，分析和比较分离物和参考菌株的DNA序列(Ferguson et al., 2003, Avian Dis; 47(3):523-30)。按照先前的描述(Ferguson et al., 2005, Microbiol; 151:1883-1893)，比较pvpA基因(Boguslavsky et al.,2000, Infect Immun; 68:3956-3964; and Liu et al., 2001, J Clin Microbiol; 39:1882-1888)，脂 蛋 白序 列(MGA_0319) (Nascimento et al., 1991, Avian Dis; 35:62-69)，gapA (Goh et al., 1998, Microbiol; 44:2971-2978; and Keeler et al., 1996, Infect Immun; 64:1541-1547)，和mgc2细胞粘附素(cytadhesin)基因(Hnatow et al., 1998, Infect Immun; 66:3436-3442)的序 列。 利用 MegAlign (DNASTAR, Lasergene, Inc. Madison, Wisconsin)进行序列分析。 [0105] 定量菌株分化实时PCR。将尸检鸟类的喉收集在4 ml无菌PBS管中。使用1 ml喉清洗液(将样品涡旋30秒后)进行DNA提取。使用能够区分疫苗(K5831B-19, K5054, ts-11, 6/85, F-菌株)和R-菌株的引物和探针，对DNA提取物进行Taqman实时PCR。通过在先前确定的标准曲线上随着反应的标准化对照绘制阈值循环数目(CT值)，进行定量分析。(Raviv et. al., 2008, Vet Microbiol; 129(1-2):179-87)。 [0106] 结果 [0107] 回传。K5831B-19和K5883-2的RAPD和序列分析显示没有回传造成的遗传改变。这两者均显示K2101 RAPD模式。RAPD结果显示于图7和8。 [0108] 攻击。攻击结果显示于表5。当与用初始K5831B-19的攻击和阴性对照比较时，用回传分离物(K5883-2)的攻击不产生肉眼损害(气囊分数)的显著增加(P< 0.05)。 [0109] 机体分布。从用K5831B-19攻击的鸟类的肺(5/5)以及气管(20/20)回收到MG。从这些鸡的20个气囊的6个(30%)中重分离到MG。从肾，肝，粘液囊，盲肠的研究中不存在分离物。 [0110] 表5. K5831B-19回传。用K5831B-19，K883-2或R菌株A攻击后10天，鸡的血清学应答和病变分数。 [0111] [0112] 讨论 [0113] K5831B-19 (一种天然存在的低毒性MG菌株)具有以下优势：当与实验室减毒疫苗菌株比较时，具有在许多次体内传代后增加的稳定性的优势。本实施例显示，当通过鸡回传5次时，K5831B - 19的毒性没有增加，并评价攻击后的肉眼损害。根据机体分布分析，本实施例还显示K5831B-19主要保留在受攻击鸟类的呼吸系统中。 [0114] 实施例4 [0115] 鸡败血支原体菌株K5831垂直传染 [0116] 本实施例研究鸡败血支原体（MG）菌株K5831B-19从感染的鸡传染到胚胎的潜能。 [0117] 步骤 [0118] 从不含支原体的来源获得30只雌性和9只雄性蛋鸡型鸡。将鸟放入3个鸡舍(每个鸡舍10只雌性和3只雄性)。在25周龄时(大约80%生产量)，通过培养和血清学对58 只鸡进行支原体筛选。在25.3周龄，通过气雾剂用K5831B-19 (6.2×10 ccu/ml)攻击鸡。 从24周龄每天收集鸡蛋直至研究结束。对温育18天胚胎的卵黄囊进行支原体培养。在32周龄，对鸡进行尸检并评价。 [0119] 结果 [0120] 在接种前的筛选中，通过血清学和培养证实鸡对支原体是阴性的。 [0121] 胚胎培养。研究期间没有从任何胚胎回收到支原体。 [0122] 气管和气囊培养。接种后7周，从35/36 (97%)的气管拭子回收到MG，但只从4/36 (11%)的气囊拭子回收到MG。 [0123] 血清学。接种后7周，全部鸡都血清转化为MG。 [0124] 气管和气囊病变。在尸检中没有观察到气囊病变。一些鸟类具有非常轻微的气管病变，由淋巴细胞浸润，粘液腺增生，和纤毛损失组成。 [0125] 为了鉴定病变，通过从0到4等级的气囊病变打分来粗略评价研究期间经尸检的鸡的病变(Kleven et al., 1972, Avian Dis; 16:915-924)。通过测量气管粘膜的宽度，显微镜下鉴定气管病变。从气管的上三分之一处(大约离喉1英寸)收集切片，并固定于10%中性福尔马林。在气管截面的组织学载片上的4个等距离点测量气管粘膜厚度。还从 0到3给气管病变打分。利用统计学分析，通过Kruskal-Wallis Rank Sums检验来分析气囊病变分数，气管分数和SPA分数。平均气管粘膜厚度，HI滴度log10，ELISA S/P比例，和拷贝数log10使用Tukey-Kramer HSD检验来分析。JMP® Statistics Made Visual (SAS Institute Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC 27513)。 [0126] 讨论 [0127] 利用这个实施例，在含胚卵中没有检测到K5831B-19。菌株必须变为内吸收的以穿过生殖道到达后代。根据早期研究，K5831B-19似乎仍然主要保留在上呼吸道，尽管其可以在接种后相对长的时段(直至20周)从这些区域回收，来自气囊的回收是更易变的，并在数周内减少。本实施例还显示，如果K5831B-19完全通过卵传染，它的比例非常低，在这些实验条件下不能检测到。 [0128] 实施例5 [0129] 鸡败血支原体疫苗取代 [0130] 本实施例研究鸡败血支原体(MG)疫苗K5831B-19, K5054, ts-11, 6/85和F菌株在被感染的鸡中取代毒性菌株的潜能。 [0131] 步骤 [0132] 从商品化来源获得1天龄的127只无MG/MS蛋鸡型鸡。在3周龄时，通过培养和血清学对10只鸡进行支原体筛选。在8周龄时，用K5831B-19, K5054, ts-11, 6/85和F-菌株接种20只鸡的组。在13.3周龄时，通过滴眼剂用R菌株接种一组12只鸡(播种者)。在14周龄时，对来自每个接种组的5只鸡进行尸检和评价(第1次尸检)。此时(接种后6周)，将两个播种者与每个接种组的剩余15只鸡以及15只首次用于实验的鸡(攻击对照)混杂在一起。在这个时候通过用Newcastle/传染性支气管炎的接种让鸡产生应激。引入播种者后两周，从每组取出5只鸟，进行尸检和评价(第2次尸检)。在攻击后4和8周重复这一步骤(第3和4次尸检)。在每次尸检时，鉴定由培养，血清学，气囊病变评分，气管组织病理学，和定量PCR（Q-PCR）分析组成。 [0133] 接种。使用商品化的涂料喷雾器(Preval Sprayer Division, Precision Valve Corporation, Yonkers, NY)通过粗粒喷雾施用6/85 (Mycovac-L® Intervet, Millsboro, DE)和F-菌株(F Vax-MG® Schering-Plough Animal Health Corporation, Summit, NJ) 疫苗。按照制造商的说明书，利用蒸馏水重建这些冻干疫苗到1剂量/ml的浓度。K5831B-19和K5054还作为新鲜活跃生长的培养物通过粗粒喷雾施用。在应用到更贴近商品化疫苗的剂量之前，用Frey's改良肉汤1:10稀释对数期培养物。每只鸟施用大约1毫升(ml)培养物。按照制造商的说明书，通过滴眼剂解冻施用ts-11疫苗(Merial Select, Gainesville, GA)。还按照制造商的指导，通过粗粒喷雾用Newcastle-支气管炎(Poulvac® Aero, Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA)接种所有组。 [0134] 攻击。R-菌株是毒性MG菌株。它通过滴眼剂(100 μl/鸟)给播种者施用。 [0135] 结果 [0136] 血清学。根据第一次尸检(接种后6周)的血清学结果，所有接种组都血清转化为MG，除了用6/85接种的组。与用K5831B-19，K5054和F-菌株接种的组相比，ts-11组血清转化的强度较弱。从血清转化来说，6/85和ts-11组落后于其他组，直至引入播种者后4到8周。 [0137] 气囊病变。引入播种者后2周，一些鸟类具有轻微的气囊病变，可能与Newcastle-支气管炎接种有关。 [0138] 气管病变。通过引入NDV/IB疫苗病毒进行气管反应的分析。在引入播种者之前在组中也存在一些反应和疫苗病毒(可能与鸡舍间的环境差异有关)。 [0139] PCR。当与其他疫苗和未接种对照比较时，在整个研究期间用K5831B-19和F-菌株接种的组降低R菌株的拷贝数log10。这些差异并不总是显著的。在用6/85接种的组中没有检测到6/85，直至引入播种者后8周时的最终尸检。应当注意到所有播种者都感染了相应疫苗。 [0140] 讨论 [0141] 本实施例的结果显示于表6和7以及图3-6。本实施例显示K5831B-19和F菌株疫苗导致R菌株的最低拷贝数log10，表明R菌株的更少定殖。这些疫苗对于预防有毒野生型菌株的感染是非常有用的，从而可以取代来自家禽操作的循环性地方菌株。 [0142] [0143] [0144] 实施例6 [0145] 含胚卵中鸡败血支原体菌株K5831的致病性 [0146] 通过评价含胚卵致死剂量(ELD50)并与R菌株的进行比较，确定鸡败血支原体(MG)菌株K5831在含胚卵中的致病性。8 [0147] 含胚卵致死剂量(ELD50)。将0.2 mL的100到10 ccu/ml稀释样品(K5831B-19和R菌株)通过卵黄囊途径接种入10个6天的含胚卵。温育十二天后，检查胚胎并计算ELD50。本实施例的结果显示于表8和9。 [0148] 实施例7 [0149] 鸡败血支原体菌株K5831的生化学，生物学和血清学特性 [0150] 利用这个实施例，评价鸡败血支原体（MG）菌株K5831的生化学，生物学和血清学特性。 [0151] 步骤 [0152] 通过下列试验检测K5831B-19的特性∶ [0155] 3. ß-NAD需求试验 [0156] 4. 四唑还原试验 [0157] 5. 膜和样点产生试验 [0158] 6. 血细胞吸附试验 [0159] 7. 生长抑制试验(GIT) [0160] 8. 代谢抑制试验(MIT) 。 [0161] [0162] 根据在Methods in Mycoplasmology (Vol. I. S. Razin, J. G. Tully, Eds.1983)中更详细描述的常规方法，进行各项试验。简单来说∶对于葡萄糖发酵试验，材料是试验培养基(改良的Frey's肉汤(含葡萄糖))，对照培养基(改良的Frey's肉汤，不含葡萄糖)，和试验菌株的对数期肉汤培养物。方法∶在对照培养基中制备1:1000稀释的试验培养物。将0.1ml稀释培养物转移到包含试验培养基和对照培养基的管。管在37℃温育 24小时，观察颜色变化。 [0163] 对于精氨酸水解试验，材料是试验培养基(改良的Frey's肉汤，含精氨酸)，对照培养基(改良的Frey's肉汤(不含精氨酸))，和试验菌株的对数期肉汤培养物。方法∶在对照培养基中制备1:1000稀释的试验培养物。将稀释培养物接种入包含试验培养基和对照培养基的管。管在37℃温育，观察颜色变化共两周。 [0164] 对于ß- NAD需求试验，材料包括试验培养基(改良的Frey's肉汤，不含ß-NAD)，对照培养基(改良的Frey's肉汤(含ß-NAD))，和试验菌株的对数期肉汤培养物。方法∶在试验培养基中制备1:1000稀释的试验培养物。将稀释培养物接种入包含试验培养基和对照培养基的管。管在37℃温育，观察生长(颜色变化)。 [0165] 对于四唑还原试验，材料包括试验培养基（四唑肉汤）和试验菌株的对数期肉汤培养物。方法∶在试验培养基中制备1:1000稀释的试验培养物。将稀释的培养物接种入包含试验培养基的管。管在37℃温育，观察生长和颜色变化(粉红色到略带红的紫色)。 [0166] 对于膜和样点产生试验，材料包括卵黄乳化琼脂平板和试验菌株的对数期肉汤培养物。方法∶将试验菌株接种到琼脂平板，并在37℃温育。每天观察板的膜和样点共2周。 [0167] 对于血细胞吸附试验，材料包括经清洗的PBS中的10%鸡红细胞悬液和具有试验菌株集落的琼脂平板。方法∶制备2 ml PBS中的0.5% RBC悬液，并移液到琼脂平板。将板在37℃温育30分钟。倒掉过量的RBC悬液，并用5 ml PBS清洗板。检查板上RBC与集落的吸附。 [0168] 对于生长抑制试验(GIT)，材料包括抗血清(MG和MS)，无菌吸收性过滤纸片(6mm直径)，试验生物体的肉汤培养物，和改良的Frey's琼脂平板。方法∶用MG或MS抗血清饱和纸片。用0.1 ml稀释的试验培养物接种板，并均匀涂布。允许接种物在室温下吸附。将纸片置于接种的琼脂表面，相隔至少两厘米。将板在37℃温育，并检测抑制带的证据。 [0169] 对于代谢抑制试验(MIT)，材料包括改良的Frey's肉汤(含葡萄糖和NAD)，试验生物体的肉汤培养物，抗血清(MG和MS)，和微量滴定板。方法∶向微量滴定板的所有孔中添加25 μl肉汤培养基。首先将25 μl热处理的MG或MS抗血清添加到孔中(除了对照)并进行系列稀释(2倍)。将50 μl适当稀释的培养物(103 - 104 CCU/ml)添加到除了对照以外的所有相应孔。将125 μl肉汤添加到除了对照以外的所有孔(其接收175 μl培养基)。将微量滴定板密封，并在37℃温育。在温育72小时后第一次读取板。 [0170] 检测下列菌株∶ [0171] K5831B-19 [0172] 鸡败血支原体 PG31 [0173] 关节液支原体(Mycoplasma synoviae) WVU1853 [0174] 衣阿华支原体(M. iowae) (血清型I) (只进行精氨酸水解试验) [0175] 鸡支原体(M. gallinarum) (血清型B) K285 (只进行膜和样点产生试验)[0176] 结果 [0177] 表10显示来自这些研究的数据。 [0178] 表10. 鸡败血支原体菌株K2101 (K5831B-19)的特性。 [0179] [0180] 实施例8 [0181] 通过基因靶向测序对鸡败血支原体菌株K5831的表征 [0182] 通过假定的细胞粘附素pvpA基因，细胞粘附素gapA基因，细胞粘附素mgc2基因，和未表征的假设表面脂蛋白编码基因指定基因组编码DNA序列(CDS) MGA_0319的部分的基因靶向测序(GTS)分析，继之以Ferguson等更详细描述的步骤(Ferguson et al.,2005, Microbiol; 151:1883-1893)，其在此通过援引并入，来表征鸡败血支原体菌株K5831B-19。 [0183] 简单来说，从150到250 μl在改良的Frey's培养基中生长的培养物或冷冻的Frey's培养基贮存培养物(用5% (v/v)甘油保存)提取核酸。按 照 制 造商 的 推荐，利 用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)提 取基 因 组DNA。针对靶基因的正向和反向序列如下所示。对于gapA，正向引物是gapA 3F，具有 的序列，反向引物是gapA 4R，具有 的序列。对于MGA_0319基因，正向 引物是lp 1F，具有 的序列，反向 引物是lp 1R，具有 的序列。对 于mgc2基因，正向引物是mgc2 1F，具有 的序列，反向引物是mgc2 1R，具有 的 序 列。 对 于 pvpA 基 因， 正 向 引 物 是 pvpA 3F， 具 有 的序列，反向引物是pvpA 4R，具有 的序列。 [0184] 所有扩增都在PTC-200 DNA Engine MJ热循环仪(MJ Research)中进行，94 ℃ 3分钟，和40个循环：94℃ 20秒，55到60 ℃ 40秒，72 ℃ 60秒，和72 ℃ 5分钟。用于扩增MGA_0319和pvpA基因的最佳退火温度是55℃，使用58℃的退火温度来扩增mgc2基因，使用60℃扩增gapA基因。在包含μg溴乙锭/ml的2%琼脂糖凝胶中利用紫外线检测PCR产物。利用Applied Biosystems Prism 377自动测序仪(PE Applied Biosystems)对扩增的基因片段进行测序。利用正向和反向扩增引物对每个扩增产物进行双向测序。使用SEQMAN程序(in LASERGENE; DNASTAR)进行互补序列的完全重叠。 [0185] 对鸡败血支原体菌株K5831B-19中MGA_0319基因的GTS分析得到下列序列： [0186] [0187] 。 [0188] 对鸡败血支原体菌株K5831B-19中pvpA基因的GTS分析得到下列序列： [0189] [0190] 。 [0191] 对鸡败血支原体菌株K5831B-19中mgc2基因的GTS分析得到下列序列： [0192] [0193] 。 [0194] 对鸡败血支原体菌株K5831B-19中gapA基因的GTS分析得到下列序列： [0195] [0196] 。 [0197] GTS分析将K5831B-19表征为gapA序列Va型，MGA_0319序列Va型，mgc2序列IVa型，pvpA序列IIIa型，mgc2/pvpA序列IIIa型，和gapA/MGA_0319/mgc2/pvpA序列VIIa型，如Ferguson等所述。 [0198] 本文引用的所有专利，专利申请和出版物的全部内容，和电子提供的材料(包括，例如，在例如GenBank和RefSeq中提交的核苷酸序列，和在例如SwissProt, PIR, PRF, PDB中提交的氨基酸序列，以及GenBank和RefSeq中来自注释编码区的翻译)被通过援引并入。给出上述详细说明和实施例只是为了便于理解。应了解由此不产生不必要的限制。本发明不限于所显示和描述的精确细节，对本领域技术人员来说显而易见的变化也包括在权利要求确定的本发明之内。 [0199] 所有标题是为了方便读者，不应用于限制标题后正文的含义，除非这样指定。 [0201] SEQ ID NO:1-11和16-18 合成的寡核苷酸引物。 [0202] SEQ ID NO: 12 通过基因靶向测序获得的鸡败血支原体菌株K5831B-19中MGA_0319基因的部分核苷酸序列。 [0203] SEQ ID NO:13 通过基因靶向测序获得的鸡败血支原体菌株K5831B-19中pvpA基因的部分核苷酸序列。 [0204] SEQ ID NO: 14 通过基因靶向测序获得的鸡败血支原体菌株K5831B-19中mgc2基因的部分核苷酸序列。 [0205] SEQ ID NO: 15 通过基因靶向测序获得的鸡败血支原体菌株K5831B中gapA基因的部分核苷酸序列。 |
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