产高浓度乳链菌肽的乳酸菌及其筛选方法

                           技术领域

本发明涉及产乳链菌肽(Nisin)的乳酸菌、其筛选方法、以及使用乳酸菌的食品或饲料。

                           背景技术

一些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)——乳酸菌中的一种，通过发酵由糖产生乳酸和乳 链菌肽--一种抗菌肽。它的细胞和培养液对微生物具有抑菌和抗菌效果，并且近年来，特别 是其改善食品保存的性能已经引起人们的极大兴趣。

乳链菌肽是一种抗菌肽，其分子量大约为3.5kDa，包含34个氨基酸并且在一个分子内 包含羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸、脱水丙氨酸和脱水三丁酸甘油酯。关于乳链菌肽、乳 链菌肽A、乳链菌肽Z和乳链菌肽Q，早已报道将其用作天然氨基酸的替代物。人们已经认 识其抗菌谱广而且抗菌效果不仅表现在革兰氏阳性细菌而且也表现在革兰氏阴性细菌上(Gill A.O.et al.Adv.Int J Food Microbiol.2003，Vol.80，p 251-9.)。

乳链菌肽已经被美国FDA批准为细菌素中唯一的公认安全物质(GRAS)，并且它是一 种安全物质，已经在食品、饲料、药物制剂等等中被广泛接受、使用。

就使用生产乳链菌肽的乳酸乳球菌和其培养物用作抑菌剂的例子而言，曾提出通过利用 培养液用作食品添加剂(JP-A-5-268975)和通过与乳酸乳球菌混合而保藏易腐食品或者发酵 食品的方法(JP-A-5-211859)。

就其用作除食品外的用途而言的例子，曾提出用作嗽口水或药物制剂(JP-A-9-077681)。

有报道称，属于乳酸乳球菌的并作为有高乳链菌肽生产能力的乳酸菌，其产生的培养液 每毫升有6,750IU的乳链菌肽(De Vuyst et al.Blackie Academic and Professional，1994，p 151-211)。然而，没有披露具体的培养条件。有报道说在乳酸乳球菌UL719的分批培养中， 每毫升培养液中生产出4,100IU的乳链菌肽(Amiali et al.Adv.World J.Microbiol.Biotecnoly， 1998，p 887-894)。

作为筛选具有高乳链菌肽生产能力的菌株的方法，有报道称使用红霉素抗性作为指标挑 选的菌株具有高达5,000IU/ml乳链菌肽的抗性并提供最高10倍于使用乳酸乳球菌 Lactococcus lactis N8作为亲本菌株的乳链菌肽生产能力(Qiao et al.，Adv.Biotechnol.Let.， 1997，p 199-202)。据称其最高值为2.8×10-5IU/cfu。然而，对培养液的细菌数量未作描述， 并且未显示培养液的乳链菌肽生产总量。除了Qiao等的文件，既没有关于筛选具有高乳链菌 肽生产能力菌株的方法的报道，也没有关于使用乳链菌肽抗性作为指标筛选有高乳链菌肽生 产能力菌株的方法的报道。

从低乳链菌肽生产能力的乳酸菌培养液中获得高浓度乳链菌肽的方法要采用膜浓缩，或 者通过连续培养将乳链菌肽积聚在培养基中(JP-A-2002-85083公报)等等。然而、连续培 养要求复杂昂贵的装置，并且在浓缩法中乳链菌肽活性下降。因此，这些方法并不总是经济 而有效的方法。

还有报道称，生产乳链菌肽的乳酸菌培养物对微生物的抑菌力高于乳酸菌的抑菌力(美 国专利公报No.5,965,178)。实际上，在制造日本豆酱方法中(JP-A-2001-224359公报)或 者在制造熟豆方法中(JP-A-2003-116477公报)联合使用乳酸菌和乳链菌肽溶液增加了抑 菌效果。

同时，在通过前述浓缩或连续培养制备高浓度乳链菌肽溶液的方法中，存在着细菌被除 去的问题。因此，这就要求包含高浓度乳链菌肽和乳酸菌的培养液通过简单方法比如分批培 养来制备。最后，开发一种培养并筛选生产高浓度乳链菌肽的乳酸菌的方法，并且开发有高 乳链菌肽生产能力的乳酸菌是可取的。当开发有高乳链菌肽生产能力的乳酸菌时，其培养物 用于食品、饮料和饲料，这使得有效地改善这些食品、饮料和饲料的保藏特性成为可能。

                           发明内容

本发明的目的是，提供通过即使是简单的分批培养就能够在培养液中生产高浓度乳链菌 肽的乳酸菌和其培养液，并且提供有高乳链菌肽生产能力的乳酸菌的简易筛选方法。

为解决该问题，发明人发现，即使是在分批培养中，通过对用乳酸菌所产细菌素培养的 细菌进行筛选，特别是在一种包含有乳酸菌所产细菌素的合成培养基中使用肠道菌素抗性或 乳链菌肽抗性作为指标进行筛选，能够获得比迄今为止已经报道的乳酸菌有更高乳链菌肽生 产能力的乳酸菌。即，本发明内容如下所述。

(1)乳酸菌，在使用液体培养基进行分批培养时，其在每毫升培养基上的清液中能产生 6,800IU或更多的乳链菌肽。

(2)在(1)中所述的乳酸菌，其在每毫升培养基的上清液中产生8,100IU或更多的乳 链菌肽。

(3)在(1)中所述的乳酸菌、其在每毫升培养基的上清液中产生10,125IU或更多的乳 链菌肽。

(4)在(1)中所述的乳酸菌，其中液体培养基包含0.5％的酵母抽提物、0.5％的氯化 钠、3％的葡萄糖和1.5％的碳酸钙。

(5)在(1)中所述的乳酸菌，其中生产出的乳链菌肽是乳链菌肽A或乳链菌肽Z。

(6)在(1)中所述的乳酸菌属于乳球菌属。

(7)在(6)中所述的乳酸菌为乳酸乳球菌Lactococcus lactis AJ110212(FERM BP-8552)。

(8)一种产乳链菌肽的乳酸菌的筛选方法，包括筛选在含有乳酸菌所产细菌素的合成培 养基中培养的细菌。

(9)如在(8)中所述的产乳链菌肽的乳酸菌筛选方法，其中细菌素是肠道菌素或乳链 菌肽。

(10)如在(8)中所述的产乳链菌肽的乳酸菌的筛选方法，其中细菌素是每毫升培养基 中有11,000～90,000IU的乳链菌肽。

(11)如在(8)中所述的产乳链菌肽的乳酸菌的筛选方法，其中细菌素是每毫升培养基 中有20,000～80,000IU的乳链菌肽。

(12)一种含有通过在培养基中培养如(1)到(7)中所述的乳酸菌而获得的乳酸菌的 培养液，一种含有该乳酸菌的培养液干产品，一种乳酸菌被除去的培养液的上清液，或者该 培养液的上清液的干产品。

(13)一种含有(12)中所述的乳酸菌的培养液，一种含有乳酸菌的培养液的干产品， 一种除去乳酸菌的培养液的上清液，或者保藏特性得以改善的、含有该培养液的上清液的干 产品的食品、饮料或饲料。

本发明的乳酸菌是对乳酸菌所产细菌素具有抗性的菌株，在含有0.5％酵母抽提物、0.5％ 氯化钠、3％葡萄糖和1.5％碳酸钙的液体培养基中进行分批培养时，该菌株在每毫升培养基 的上清液中产生6,800IU或更多的乳链菌肽。

一种获得乳酸菌培养物的方法如下所述。

使用的液体培养基基本上要求能够培养产乳链菌肽的乳酸菌，它通常是一种由碳源、氮 源、无机盐等的水溶液制成的合成培养基。该合成培养基包含至少一种单糖比如葡萄糖和半 乳糖、乳糖和蔗糖作为碳源，以及至少一种蛋白质水解产物、蛋白胨、酵母抽提物、鱼肉提 取物、酪蛋白氨基酸、麦芽汁等等作为氮源。氯化钠、碳酸钙等作为无机盐。优选包含0.5％ 酵母抽提物、0.5％氯化钠、3％葡萄糖和1.5％碳酸钙的液体培养基。培养基调节至pH 6.0～7.0， 使用时灭菌然后冷却。对产生乳链菌肽来说，在培养期间将培养基pH调节至6.0～7.0很重要， 并且添加碳酸钙用于调节pH。

将生产乳链菌肽的乳酸菌接种在浓度为105～109细胞/ml的培养基中，在25℃～35℃ 下、优选在27.5℃～32.5℃下，以0(允许静置)到150rpm的低速搅拌，同时将pH调节 至5.0～6.5、优选5.5下进行培养。生产乳链菌肽的乳酸菌属于乳酸乳球菌Lactococcus lactis ssp. lactis，其例子包括JCM 7638、ATCC 11454、NCDO 497、IFO 12007等。

培养液的乳链菌肽活性采用Ishizaki等的方法测量(Adv.J.Fac.Agr.，Kyushu Univ.，40，p 73-85)。即，得到的培养液通过HPLC(高效液相层析法)测量。乳链菌肽药物制剂(Sigma 公司)用作标准样。此时，乳链菌肽的活性值是国际单位规定的40IU/μg。

当制备用于测量乳链菌肽活性的样品时，将吐温-20添加到样品培养液中使其终浓度变成 0.1％，并充分混合。混合物离心或通过0.22μm的过滤器处理以除去乳酸菌。

获得生产高浓度乳链菌肽的乳酸菌的方法描述如下。该方法中，使用突变菌株。首先， 在能够用于培养乳酸菌的合成液体培养基中培养菌体。接着，一部分乳酸菌培养液接种于一 种含有细菌素的液体培养基中，所述细菌素比如是植物乳杆菌素(plantaricin S)、赫乌替素 (herveticin J)、片球菌素(pediocin PA-1)或肠道菌素，优选接种于包含产乳酸菌的细菌素 的液体培养基中，所述细菌素比如是植物乳杆菌素S、赫乌替素J、片球菌素PA-1或肠道菌 素，更优选接种于包含乳酸菌素(lactibiotics)(乳酸菌产生的细菌素的一个分类)比如乳链 球菌素(lacticin)481、乳杆菌素(lactocin)S、和乳链菌肽或II-型细菌素类(乳酸菌产生的 细菌素的一个分类)比如片球菌素PA-1和肠道菌素的液体培养基中，进一步优选接种于包含 属于乳酸菌素的乳链菌肽或属于II-型细菌素类的肠道菌素的液体培养基中，尤其优选接种于 乳链菌肽数量大于亲本菌株产生的乳链菌肽数量的液体培养基中，于30℃下培养，接着通 过自发突变诱导或者使用突变诱导物、紫外线等对乳酸菌进行诱导。突变诱导物的例子包括 N-甲基-N’-硝基-N-硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、4-二甲基氨基苯重氮磺酸钠(DAPA) 等。

将突变诱导的菌株涂到包含细菌素比如乳链菌肽的合成琼脂培养基上。此时，合成琼脂 培养基的乳链菌肽浓度是11,000～90,000IU/ml，优选20,000～80,000IU/ml。而除乳链菌肽 之外的细菌素，涂以乳酸菌素或II-型细菌素类。细菌素的数量是一个可以抑制其中亲本菌株 生长的数量，并且优选2～200倍，更优选5～200倍。例如，对于肠道菌素，虽然其数量随亲 本菌株而变，但根据Fujita等报道的结果(在2004 Nihon Nyusankin Gakkai上宣布的 “Enterococcus faecium TUA 1344L产生的细菌素”)，它通常可以是0.5μg/ml或以上、1～100 μg/ml、2.5～100μg/ml，以及从10～100μg/ml。涂在培养基上的乳酸菌的数量优选使得为 形成的菌落彼此不接触。具体地讲，菌落数目优选每平板100～300个。为有效地筛选提高乳 链菌肽生产能力的突变株，从生长在培养基上的菌株中选出比亲本菌株生长更好的菌株。从 视觉上观察生长情况。

按照前述用于获得乳酸菌培养液的方法培养筛选的菌株。使用培养液进行小平板分析， 并且筛选出对指标细菌的抗菌活性高于亲本的菌株。小平板分析描述如下。将通过逐步稀释 乳酸菌培养液上清而获得的溶液、和作为一个指标的对乳链菌肽敏感的革兰氏阳性细菌培养 液，添加到小平板的每个孔，以使细胞数量为102～105细胞/ml，并且将它们混合。这里使用 的指标细菌包括Bacillus subtilis JCM1456T，Lactobacillus sakei JCM1157T等。接着，这些小 平板在37℃下保温4～24小时，优选12～21小时，以指标细菌的生长程度测量抗菌活性，即 培养液中的乳链菌肽活性。生长程度用孔的混浊程度估计(Abs＝595nm)。当培养液中乳链 菌肽活性在高到抑制指标细菌的生长时，孔的混浊度不再增加。随着孔混浊度的增加，比较 亲本菌株和突变株在培养液的上清最大稀释比例，通过估计菌株生产的乳链菌肽数量可能比 亲本菌株所提供的数量更大来筛选稀释比例比亲本菌株高的菌株。

最后，培养上述筛选的菌株，使用HPLC测量培养液中的乳链菌肽数量，以证实培养液 中乳链菌肽活性，即乳酸菌的乳链菌肽生产能力提高了。

通过前述方法，可以有效地获得即使采用分批培养也能在培养液中产生高浓度乳链菌肽 的乳酸菌。在过去的报导中，乳链菌肽的最大生产量是6,750IU/ml(De Vuyst et.al.)。同时， 具有比已知的最高乳链菌肽生产能力更高的乳酸菌，即具有在每毫升的上清液中产生6,800 IU或更多乳链菌肽能力的乳酸菌，可以通过在包含0.54％酵母抽提物、0.5％氯化钠、3％葡 萄糖和1.5％碳酸钙并维持pH的液体培养基中于优化条件下培养而获得。具体地讲，有可能 获得在每毫升的上清液中产生乳链菌肽至少为7,425IU/ml的乳酸菌，其乳链菌肽生产能力 是已知乳链菌肽生产能力最高的乳酸菌的1.1倍，在每毫升的上清液中产生乳链菌肽至少为 8,100IU/ml的乳酸菌，其乳链菌肽生产能力是已知乳链菌肽生产能力最高的乳酸菌的1.2倍， 在每毫升的上清液中产生至少10,125IU/ml乳链菌肽的乳酸菌，其乳链菌肽生产能力是已知 乳链菌肽生产能力最高的乳酸菌的1.5倍，在每毫升的上清液中产生至少12,150IU/ml乳链 菌肽的乳酸菌，其乳链菌肽生产能力是已知乳链菌肽生产能力最高的乳酸菌的1.8倍。据此 认为，通过在更适当的加入丝氨酸和半胱氨酸或其类似物的培养基中培养有乳链菌肽生产能 力的乳酸菌，可以获得每毫升的上清液中最高数量为20,000IU的乳链菌肽。

通过在易于生长乳酸菌的培养基比如YDCS培养基(0.54％酵母抽提物、0.5％氯化钠、 3％葡萄糖、0.67mg/dl丝氨酸、0.67mg/dl半胱氨酸和1.5％碳酸钙)中进行分批培养，能 够有效地生产有高乳链菌肽生产能力的乳酸菌和包含乳酸菌的培养液。例如，包含乳酸菌的 培养液通过喷雾干燥或鼓式干燥，可以形成包含乳酸菌的培养液的干产品。通过例如对包含 乳酸菌的培养液进行过滤处理或倾析而形成乳酸菌从培养液被除去的培养液上清液，以及可 以通过例如对培养液的上清液进行的喷雾干燥或鼓式干燥以形成培养液上清液的干产品。将 通过前述方法获得的培养物以0.01～10％的量添加到食品、饮料或饲料中能够提高保藏特性。 此时，培养物可以是培养液本身、经消毒的培养液、除去细菌的培养液、或者其浓缩物或干 产品。食品和饮料的例子包括果汁、乳制品、肉制品、提取的产品、发酵食品调味品比如日 本豆酱和酱油，等等。饲料例子包括青贮饲料等等。例如，在日本豆酱或酱油中米曲的生产 步骤期间，通过喷洒产乳链菌肽乳酸菌和包含高浓度乳链菌肽的培养液，可以被比平常更有 效地抑制不希望有的微生物比如杆菌属细菌的污染。因此，容易形成具有较少微生物污染的 感官出色的产品。此外，米曲(日本酒曲)的微生物污染可以通过在米曲中使用前述培养液 而得到抑制。也有可能通过使米曲经受无盐分解并将蛋白质以很高程度分解的方式制造新的 调味品。

当包含乳链菌肽的培养液被用作食品抑菌剂时，据认为培养基成分对使用的食品有感官 上的副作用。然而，含乳链菌肽培养液的使用减少了培养液的添加量，从而消除了培养基成 分的感官副作用。在乳酪生产中，有个例子，其中产乳链菌肽的乳酸菌作为抑制会使乳酪呈 多孔状的梭状芽孢杆菌的生长的曲引接种。当乳酸菌生产大量的乳链菌肽时，其抑菌效果自 然地提高，以至于可以更安全地生产没有污染的乳酪。

                                具体实施方式

下面参照实施例对本发明加以具体说明。当然，本发明的技术范围并不限于这些实施例。

实施例1

从自然界分离的产乳链菌肽Z的菌株(亲本菌株显示于表3)涂到乳链菌肽浓度为1,000、 2,000、5,000或10,000IU/ml的M17培养基(Difco公司制造)上，并且在30℃下培养2 天。该菌株在乳链菌肽浓度为1,000或2,000IU/ml的M17培养基上生长，而没有在乳链菌 肽浓度为5,000或10,000IU/ml的M17培养基上生长。结果证实这些菌株对乳链菌肽的最小 生长抑制浓度(MIC)是5,000IU/ml。

从自然界分离的产乳链菌肽Z的乳酸菌在M17培养基上预培养，培养的乳酸菌用500μg /ml的NTG处理以诱导突变。

突变菌株涂到制备的M17培养基上去，使得乳链菌肽浓度变成1,000、2,000、4,000、8,000、 10,000、20,000、40,000、80,000、或100,000IU/ml，并且在30℃下保温大约3天。

在各个乳链菌肽浓度的培养基中培养的细胞数目如表1所示。

                             表1：在含乳链菌肽培养基上培养的产乳链菌肽Z的乳酸菌细胞数   乳链菌肽浓度   (IU/ml)   0   1,000   2,000   4,000   8,000   10,000   20,000   40,000   80,000   100,000   培养数量   (细胞/ml)   1.20E+9   1.20E+9   1.20E+9   1.20E+9   7.00E+8   1.14E+8   3.21E+7   9.35E+5   1.16E+3   4.76E+2

如表1所示，当乳链菌肽浓度达到8,000IU/ml或更高时，能够在平板生长的细胞数目 开始下降。因此，据此认为以高浓度生产乳链菌肽的乳酸菌可以在包含8,000IU/ml到100,000 IU/ml乳链菌肽的合成培养基上筛选。这样，从每个平板中选出300株菌株，并且通过小平 板分析将那些乳链菌肽生产能力优于亲本的菌株选出。

每个筛选的乳酸菌菌株培养在不含葡萄糖的硫基乙醇酸盐培养基(Difco公司制造)上于 37℃下培养24小时。将其培养液播种在50ml的YD培养基(0.5％酵母抽提物、0.5％氯化 钠、3.0％葡萄糖和1.5％碳酸钙、pH7.0、Sakaguchi烧瓶)中，以100rpm振荡以进行分批培 养。

每个菌株的乳链菌肽产量通过HPLC测量。结果是，以每毫升培养基中产量为6,800IU 或更多的乳链菌肽生产菌株数目如表2所示，每个平板上获得的突变株的乳链菌肽活性如表 3所示。

                               表2：产高浓度乳链菌肽的菌株数量   培养基的乳链菌肽浓度   (IU/ml)   8,000   10,000   20,000   40,000   80,000   100,00   生产6,800IU/ml或更多   乳链菌肽的突变株数量   0   0   2   19   5   0

                             表3：获得的菌株乳链菌肽活性   乳链菌肽活性   (IU/ml)   乳酸浓度   (％)   消耗的葡萄糖浓度   (％)   培养液O.D.值   (Abs＝595nm)   L.lactis JCM7638   3,620   1.97   2.67   5.88   亲本菌株   4,030   2.00   3.00   5.95   L.lactis #404   7,243   2.15   2.33   5.94   L.lactis AJ110212   12,247   2.05   2.32   6.02   L.lactis #N139   10,090   1.49   2.20   4.59   L.lactis #N43   8,198   1.99   3.00   5.54   L.lactis #N113   7,483   1.94   3.00   4.27   L.lactis #N84   8,413   2.12   2.71   6.63

L.lactis JCM7638：普通乳链菌肽Z菌株

L.lactis #404：在20,000IU/ml乳链菌肽平板上筛选的菌株

L.lactis AJ110212：在40,000IU/ml乳链菌肽平板上筛选的菌株

L.lactis #N139：在40,000IU/ml乳链菌肽平板上筛选的菌株

L.lactis #N43：在40,000IU/ml乳链菌肽平板上筛选的菌株

L.lactis #N113：在40,000IU/ml乳链菌肽平板上筛选的菌株

L.lactis #N84：在80,000IU/ml乳链菌肽平板上筛选的菌株

因此发现，可以从含20,000IU/ml到80,000IU/ml乳链菌肽的培养基中有效地筛选出 乳链菌肽产量为6,800IU/ml或更多的菌株。

在从含40,000IU/ml乳链菌肽的平板上筛选的菌株中获得了乳链菌肽生产能力最高的菌 株L.lactis AJ110202。研究发现，L.lactis AJ110212菌株的乳链菌肽生产能力是亲本菌株的大 约3.0倍，并且是普通乳链菌肽Z生产菌株L.lactis JCM7638的大约3.4倍。进一步发现，其 乳链菌肽生产能力大约是1.8倍于de Vuyst等曾报导的6,750IU/ml的最高乳链菌肽生产能 力。顺便讲一下，L.lactis AJ110212菌株于2003年11月19日保藏于国家高级工业科学和技 术研究所国际专利微生物保藏中心，保藏编号FERM BP-8552。

实施例2

按如下方法制备含肠道菌素溶液。使用粪肠球菌Enterococcus faecium JCM 5804作为产 肠道菌素的细菌在MRS培养基(Difco公司制造)于37℃下培养22小时，同时摇床振荡。 将培养液离心分离，使用过滤器(ADVANTEC制造的免洗注射器过滤装置、Dismic-25cs、 纤维素醋酸酯0.45μm)过滤得到上清液。使用超滤膜初步纯化上清液。也就是说，通过离心 和超滤(脱盐)收集上清液部分。该步骤中，浓缩培养液中的肠道菌素以制备包含大约200μg /ml肠道菌素的溶液。浓缩前后抗菌活性通过使用如实施例1中的从自然界分离的乳链菌肽Z 的乳酸菌进行的由均匀生长于固体培养基的菌落方法(spot-on-lawn method)得到了确认。

从自然界分离的产乳链菌肽Z的乳酸菌(亲本菌株显示于表3中)在M17培养基(Difco 公司制造)上预培养，培养的乳酸菌用500μg/ml的NTG处理以诱导突变。

将突变菌株涂到M17培养基或肠道菌素浓度为约20μg/ml的M17培养基上，在30℃ 下保温大约1～3天。生长在含肠道菌素的M17平板上的菌落数与在不含肠道菌素的M17平 板上的菌落数相比是1/100。因此，从含乳链菌肽M17培养基上的结果看，应当认为产高浓 度乳链菌肽的乳酸菌生可以从含这一浓度肠道菌素的M17培养基中挑选出来。从而筛选出 108株菌株，并且通过小平板分析将乳链菌肽生产能力优于亲本菌株的菌株挑选出来。

每个筛选的乳酸菌在不含葡萄糖的硫基乙醇酸盐的培养基(Difco公司制造)中于37℃ 下培养24小时。将其培养液播种在50ml的YD培养基(0.5％酵母抽提物、0.5％氯化钠、 3.0％葡萄糖和1.5％碳酸钙、pH7.0、Sakaguchi烧瓶)中，以100rpm振荡以进行分批培养。

每个菌株的乳链菌肽产量通过HPLC测量。然后得到了24个每毫升培养基的产乳链菌肽 浓度为6,800IU或更多的菌株。

从本方法的在含肠道菌素的平板中筛选的菌株中得到了有最高乳链菌肽生产能力的菌株 L.lactis AJ110376(乳链菌肽活性10,802IU/ml)。研究发现，L.lactis AJ110212菌株的乳链菌 肽生产能力是亲本菌株的大约2.7倍，是普通乳链菌肽Z生产菌株L.lactis JCM7638的大约 3.4倍。研究进一步发现，该菌株具有的乳链菌肽生产能力大约是1.6倍于De Vuyst等曾报导 的6,750IU/ml的最高乳链菌肽生产能力。

对照例1

在实施例1中描述的L.lactis #N43涂到制备好的红霉素浓度为0.01～0.2μg/ml的M17 培养基上，在30℃下保温大约1～3天。接着，乳酸菌在不含葡萄糖的硫基乙醇酸盐培养基 (Difco公司制造)中于37℃下培养24小时。将其培养液播种在50ml的YD培养基(0.5％ 酵母抽提物、0.5％氯化钠、3.0％葡萄糖和1.5％碳酸钙、pH 7.0、Sakaguchi烧瓶)中，以100 rpm振荡培养。在培养基上清液中每个菌株生产的乳链菌肽数量通过HPLC测量，结果如表 4所示。

              表4：使用红霉素抗性作为指标的产乳链菌肽细菌的筛选   乳链菌肽活性(IU/ml)   乳酸浓度(％)   消耗的葡萄糖浓度(％)   亲本菌株(#N43)   8198   0.00   1.99   L.lactis E1   7096   2.99   2.55   L.lactis E2   3954   3.00   2.46   L.lactis E3   4713   3.00   2.25   L.lactis E4   5070   2.96   2.21   L.lactis E5   5637   3.00   2.47   L.lactis E6   6804   3.00   2.41   L.lactis E7   4446   2.88   1.31   L.lactis E8   5340   2.84   1.56   L.lactis E9   5979   2.93   1.87   L.lactis E10   4174   2.84   1.33   L.lactis E11   5386   3.00   2.68   L.lactis E12   4613   2.97   2.25   L.lactis E13   4348   3.00   2.30   L.lactis E14   5594   2.99   2.44   L.lactis E15   5147   2.87   1.45   L.lactis E16   4854   2.89   1.70   L.lactis E17   4645   2.86   1.31   L.lactis E18   5042   2.99   1.84   L.lactis E19   7442   3.00   2.50   L.lactis E20   4369   2.87   1.28

如表4所示，未能获得同亲本菌株相比乳链菌肽生产能力有所提高的菌株，并且未能如 Qiao等在文献中的描述那样，通过用红霉素抗性作为指标进行筛选而提高乳链菌肽生产能力。 最后，使用乳链菌肽作为指标的筛选方法应当认为是到目前为止比使用红霉素抗性作为指标 更为有效的筛选方法。

对照例2

如实施例1描述的从自然界分离的产乳链菌肽Z的乳酸菌(亲本菌株显示于表3中)在 M17培养基(Difco公司制造)上预培养，培养的细菌用500μg/ml的NTG处理以诱导突变。

突变菌株涂到制备的红霉素浓度变成0.2μg/ml的M17培养基上，在30℃下保温大约 1～3天。接着，从平板上生长的乳酸菌中随机地挑选出20个菌株。每个菌株在不含葡萄糖的 硫基乙醇酸盐培养基(Difco公司制造)上于37℃下培养24小时。将其培养液播种在50ml 的YD培养基(0.5％酵母抽提物、0.5％氯化钠、3.0％葡萄糖和1.5％碳酸钙、pH7.0、Sakaguchi 烧瓶)，以100rpm振荡培养。使用HPLC测量每个菌株在培养物上清液中生产的乳链菌肽数 量。最终未能获得一株其乳链菌肽活性高于亲本的菌株。如此，未获得乳链菌肽生产能力优 于亲本的菌株，并且未能如Qiao等在文献中的描述那样，通过用红霉素抗性作为指标进行筛 选而提高乳链菌肽生产能力。因此，用乳链菌肽或者除了乳链菌肽之外的细菌素作为指标的 筛选方法，应当认为是到目前为止比用红霉素抗性作为指标的筛选方法有效得多。

工业实用性

使用本发明的方法可以获得乳链菌肽生产能力高的乳酸菌，并且本发明的乳酸菌可以生 产高浓度的乳链菌肽。因此，有高乳链菌肽活性的培养液可以通过简单的分批培养制备。该 培养液用于多种食品、饮料和饲料，如此能改善食品、饮料和饲料的保存性能。因此，本发 明在食品和饲料工业领域很有用。