可作为免疫调节剂的副干酪乳酸杆菌LT12

申请号 CN201010602463.7 申请日 2010-12-23 公开(公告)号 CN102168043B 公开(公告)日 2013-04-24
申请人 利统股份有限公司; 发明人 张天鸿; 王宜婕; 李淑绫;
摘要 本 发明 提供一种副干 酪乳 酸杆菌LT12组合物,其具有调节免疫的活性,以及其用于调节免疫反应及 治疗 过敏的用途。
权利要求

1.一种经分离的副干酪乳酸杆菌菌株(Lactobacillus paracasei),其中该菌株为LT12,寄存于农业研究机构培养物保藏中心,寄存编号为NRRL-B50327。
2.一种组合物,包括如权利要求1所述的副干酪乳酸杆菌。
3.如权利要求2所述的组合物,其特征为具有抗过敏活性。
4.如权利要求2所述的组合物,其特征为具有免疫调节活性及抗过敏活性。
5.如权利要求2所述的组合物,其特征为该副干酪乳酸杆菌为活体。
6.如权利要求2所述的组合物,其特征为该副干酪乳酸杆菌是非活化的。
7.如权利要求2所述的组合物,其为食物或是药物。
8.如权利要求7所述的组合物,其为饮料。
9.如权利要求2所述的组合物,其可进一步包含第二种副干酪乳酸杆菌菌株。
10.如权利要求9所述的组合物,其中该副干酪乳酸杆菌与第二种副干酪乳酸杆菌菌株的菌数比介于2∶1至100∶1。
11.如权利要求10所述的组合物,其特征为具有免疫调节活性及抗过敏活性。
12.如权利要求9所述的组合物,其为食物或是药物。
13.如权利要求12所述的组合物,其为饮料。
14.一种组合物用于制备调节免疫的药物的用途,其中该组合物包括有效量的如权利要求1所述副干酪乳酸杆菌菌株与医药上可接受载体。
15.如权利要求14所述的用途,其特征为该组合物能调节先天性免疫(innate immunity)或适应性免疫(adaptive immunity)。
16.如权利要求14所述的用途,其特征为该组合物能促进细胞激素的产生。
17.如权利要求16所述的用途,其特征为该细胞激素为选自于由IL-1α、IL-6、IL-10、INF-γ、MCP-2和TNF-α所组成的群的一细胞激素。
18.一种组合物用于制备治疗过敏的药物的用途,其中该组合物包括有效量的如权利要求1所述副干酪乳酸杆菌菌株与医学上可接受载体。
19.如权利要求18所述的用途,其特征为用于制备治疗免疫球蛋白E(IgE)介导的立即性过敏反应(immediate hypersensitivity)或是T细胞介导的迟发性过敏反应(delayed hypersensitivity)的药物。

说明书全文

可作为免疫调节剂的副干酪乳酸杆菌LT12

技术领域

[0001] 本发明关于一种新颖副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)及其用于调节免疫反应及治疗与过敏相关疾病的用途。

背景技术

[0002] 过敏是指免疫系统对外来物,例如细菌、花粉或灰尘等,产生的一种过度免疫反应,该外来物被通称为“过敏原”。这些过敏原有时会被人体视为有害或具危险性而启动一部分的免疫系统,但事实上该过敏原不会造成感染或有毒性。当人体与过敏原接触而造成免疫反应时,组织胺和前列腺素可能接着会被释放出来造成过敏症状,包括呼吸道的发炎反应、异位性皮肤炎、过敏性结膜炎、荨麻疹、湿疹、特定胃肠疾病或哮喘等。
[0003] 据报导指出,发达国家的孩童较容易患有过敏,因为这些国家过分注重公共卫生,也常接种疫苗或使用抗生素,因此降低了感染的机会,而感染通常会对抗过敏或气喘。在医学上,这种现象被称为是“卫生学假说”,主要论述孩童时期若是缺乏对感染原的接触,会趋向Th-2的免疫反应,例如:生产过剩的IL-4(interleukin-4)、IL-5及IL-13。这些Th-2型细胞激素会吸引嗜伊性红血球(eosinophils)、嗜性白血球(basophils)及肥大细胞(mast cell)至发炎位置,这些细胞可以单独或是与免疫球蛋白E(IgE)共同作用而产生过敏反应。另外,IL-4与IL-13可促进B细胞进行抗体的类型转换(isotype switch)以增加血液中IgE的量。根据“卫生学假说(hygiene hypothesis)”,诱发Th-1(T helper 1)细胞的免疫反应,例如:促进IFN-γ的表现,也许可以有效的减缓过敏反应。
[0004] 许多研究指出,乳酸菌(Lactobacillus sp.)在生物体内具有调节免疫反应的能,包括促进细胞激素的分泌、活化巨噬细胞与自然杀手细胞及抗体的产生等(Madsen et al.,2001,Gastroenterology 121:580-591)。Collins等人(U.S.Pat.No.7,390,519)曾表示唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)AH102,AH103,AH105,AH109或AH110等品系可做为一种抗发炎的生物治疗剂来有效预防及/或治疗发炎反应。Hsu等人(U.S.Pat.No.6994848)也揭露副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)GM-080可促进IFN-γ的分泌,且可用来治疗与过敏相关的疾病。
[0005] 然而,多种自然界中存在的乳酸菌至今还未被完全发现及进行完整地研究。本发明提供一个组合物,其包含一种新颖副干酪乳酸杆菌品系(Lactobacillus paracasei)及其免疫调节的应用,其与相关的先前文献已揭露的品系不同。

发明内容

[0006] 本发明一方面为提供一种具有免疫调节功能的新颖副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)LT12。
[0007] 本发明另一方面为提供一种组合物,包含上述副干酪乳酸杆菌LT12及载体。此组成物可为食品(例如:优格、饼干、麦片、巧克力及点心棒),饮料(例如:茶、不含酒精的饮料、奶及果汁),或是包含医学上可接受的载体的药物。
[0008] 本发明的再另一方面提供一种调节免疫系统(如:先天性免疫(innate immunity)或适应性免疫(adaptive immunity))或治疗过敏的方法及其组合物,其是为给予有需要的个体服用有效量的上述任一组合。该个体(例如:人类患者)可为患有IgE介导的立即性过敏反应(immediate hypersensitivity)或是T细胞介导的迟发性过敏反应(delayed hypersensitivity)的病人。
[0009] 本发明又一方面亦包含利用前述副干酪乳酸杆菌LT12制备调节免疫系统或治疗过敏的药物的用途。
[0010] 应了解前述的发明内容和下列实施方式仅为例示和说明,并非为本发明的限制。附图说明
[0011] 参照附图,将更能了解前述的发明内容以及实施方式。
[0012] 在图中:
[0013] 图1为一照片显示利用人类细胞激素抗体数组分析法(Human cytokine antibody Array)分析各组的转渍(blot):周边血液单核细胞来源C空白组(图1A)、以LT12单独刺激周边血液单核细胞来源C(图1B)、以LT12刺激周边血液单核细胞来源C(图1C)、周边血液单核细胞来源E空白组(图1D)及以LT12与第二种副干酪乳酸杆菌刺激周边血液单核细胞来源E(图1E)。细胞激素抗体数组于膜上的位置图如表5所示。
[0014] 菌株LT12保藏信息:菌株LT12于2009年9月21日寄存于农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)(1815N.University Street,Peoria,Illinois,61601,U.S.A.),寄存编号为NRRL-B50327。

具体实施方式

[0015] 本发明详细说明如下。在本发明中,参考文献的资料将详列于实施例中。为更佳了解本发明,本文中所使用的术语将另加以详细说明。
[0016] 本发明提供一种新颖副干酪乳酸杆菌品系,命名为LT12,此菌株可用来调节免疫反应及治疗过敏。该菌株LT12于2009年9月21日寄存于农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)(1815N.University Street,Peoria,Illinois,61601,U.S.A.),寄存编号为NRRL-B50327。
[0017] 副干酪乳酸杆菌株LT12自人类粪便中分离,须在检体采样后的十二小时内进行分离的步骤。称重(约一公克)的检体放至均质机(Stomacher400,Seward,UK)搅拌30秒使其均质化,再以预还原(pre-reduced)的脑心浸出物培养液(brain heart infusion broth)稀释,接着以适合的选择性培养基进行培养。适当的稀释物涂盘于乳酸菌醋酸盐培养基(Rogosa Acetate agar,Difco,USA),或含有12μg/ml万古霉素(vancomycin,Sigma,USA)的乳酸菌醋酸盐培养基(Rogosa Acetate agar,Difco,USA),以培养所有的乳酸菌属以及可抗万古霉素的乳酸菌,例如:副干酪乳酸杆菌群(L.paracasei group),包含副干酪乳酸杆菌(L.paracasei)、酪蛋白乳酸杆菌(L.casei)及雷曼氏乳酸杆菌(L.rhamnosus)等。API 50CHL系统(bioMérieux,Inc.USA)用于鉴定抗万古霉素的副干酪乳酸杆菌中的品系。鉴定结果如表1所示。
[0018] LT12的微生物学特征如下:
[0019] (1)形态学特征
[0020] (a)细胞形状及大小:菌体在37℃下于MRS培养液中隔夜培养
[0021] 后,在显微镜下观察到的形状为杆状,边缘为圆形。
[0022] (b)活动力:有
[0023] (c)鞭毛:无
[0024] (d)孢子形成:无
[0025] (e)革蓝氏染色:阳性
[0026] (2)培养特征:
[0027] (a)培养基:MRS培养液(Difco,USA),最终pH 6.2~6.5。
[0028] (b)培养条件:37℃兼性厌
[0029] (3)生理学特征:
[0030] (a)过氧化氢酶:阳性
[0031] (b)氧化酶:阴性
[0032] (c)API 50CHL测试:测试结果如表1所示
[0033] (4)遗传特征:
[0034] 如实施例2所示,以随机放大多形态DNA鉴定(Random Amplification Polymorphic DNA,RAPD)方法针对LT12、Lactobacillus paracasei(Cell biotech Co.,Ltd.,Korea)(以下简称LP-CBT)、Lactobacillus paracasei GMNL32(以下简称:GMNL32)、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei BCRC 14023(以下简称:BCRC 14023)及Lactobacillus paracasei subsp.paracasei BCRC 12188(以下简称:BCRC 12188)进行RAPD的分析。12个随机核酸引子如表2所列。电泳图结果显示LT12具有不同的条带模式(如表3所示)。综合以上鉴定结果,LT12为一种新颖副干酪乳酸杆菌株。
[0035] 根据本发明的一个具体实施例,可使用活细胞的形式的LT12或其功能变异株。根据本发明的另一个具体实施例,可使用非活细胞的形式,如热致死菌体,其包含菌株LT12产生的有利因子。本文在此所称的“功能变异株”一词是指其具有LT12相同特征的菌株,可达相同功效。
[0036] 本发明提供一个LT12菌株及其功能变异株,其具有调节免疫活性及/或抗过敏反应的活性。本文在此所称的“调节免疫活性”一词是指其具有自稳定态或低落的免疫系统提升免疫活性(免疫刺激活性),或是抑制多余或过度的免疫反应以回复到适当的平(抑制免疫活性)。以另一度来说,此是用来调控免疫性细胞(例如T细胞、B细胞或巨噬细胞)以稳定总体免疫反应的平衡。举例来说,但不限于,刺激或抑制细胞激素的产生、活化淋巴细胞、平衡Th1/Th2活性及抑制过敏反应等。
[0037] 本发明亦提供一可用于治疗过敏的LT12菌株或其功能变异株。本文在此所称的“过敏”一词是指生理上的保护性免疫所导致而伤害宿主的一种免疫反应。最常见的两种过敏是由IgE介导的立即性过敏反应,及T细胞介导的迟发性过敏反应。过敏的临床症状包含过敏性鼻炎、过敏性哮喘、食物过敏、过敏性皮肤炎、眼睛过敏及全身型过敏性反应(anaphylaxis)等。本文在此所称的“治疗过敏”一词是指丨系列可以反转上述所提到免疫症状的免疫反应,例如,但不限于,阻断Th-2介导的免疫反应,减少Th-2型细胞激素(如:IL-4,IL-5,IL-13),增加Th-1型细胞激素(如INF-γ),以及抑制IgE+记忆B细胞及嗜伊性红血球的活化或分化。
[0038] 根据本发明的一个具体实施例,藉由ELISA分析确认LT12能刺激由捐赠者血液分离出的周边血液单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)分泌INF-γ(如表四)。INF-γ是一种细胞激素,其对于先天性免疫及适应性免疫于对抗病毒及细菌的感染非常重要。它是Th-1型细胞激素的代表,可以抑制Th-2型细胞的分化,因此减少L-4,IL-5,IL-13的生成,该等细胞激素会刺激免疫球蛋白类转换成IgE,以及扩增原始及IgE+记忆B细胞的数量。因此,促进INF-γ的表现可能有效地治疗过敏。
[0039] 根据本发明的另一个具体实施例,LT12也能刺激周边血液单核细胞分泌其它的细胞激素,包含由人类细胞激素抗体微数组(Human cytokine antibody array)所分析出的IL-1α、IL-6、IL-10、IFN-γ、MCP-2以及TNF-α(参见图1A-1E及表6)。
[0040] 因此,本发明提供一种调节免疫的方法及组合物,包括给予一个体服用有效量的副干酪乳酸杆菌LT12与医学上可接受的载体。
[0041] 本发明亦提供一个治疗过敏方法及组合物,包括给予一个体服用有效量的副干酪乳酸杆菌LT12与医学上可接受的载体。本文在此所称的“医药上可接受的载体”包括,但不限于:生理食盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其相关的组合物。
[0042] 令人意外的是,本发明发现一组合物,包含LT12与第二种副干酪乳酸杆菌,亦具有免疫调节活性及/或抗过敏活性。在一个实施例中,第二种副干酪乳酸杆菌的品系为LP-CBT,LT12与其的菌数比例为100∶1。较佳的LT12与第二种菌株的菌数比为2∶1。如实施例4的结果所示,组合物亦能刺激周边血液单核细胞分泌其它的细胞激素,包含由人类细胞激素抗体微数组(Human cytokine antibody array)所分析的IL-1α、IL-6、IL-10、IFN-γ、MCP-2以及TNF-α。另外,MCP-3仅由经LT12组合物刺激的周边血液单核细胞产生。
[0043] 根据本发明,LT12提供了极佳的免疫调节及抗过敏的活性。根据本发明的一个实施例,LT12或其组合物可以用来作为一组合物的有效成分。该组合物可被制为食物、饮料或药物。除此的外,也可包含各种的添加物,添加物的种类举例来说,但不限于,例如人工色素(例如:β-胡萝卜素、胭脂树红色素、姜黄、辣椒粉、药品及化妆品染料等)、调味料、香料、甜味剂、乳化剂及/或增稠剂防腐剂、维生素及抗氧化剂(例如:维生素A、C、D、E、B-1、B-5、B-6、锌、硒、、α-维生素E、麸胱胺(glutathione)、二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、丁基羟基甲氧苯(butylated hydroxyanisole,BHA)及半胱胺酸(cysteine))。
[0044] 本发明将由下列实施例做进一步的说明,但实际发明并不局限于此说明书所陈述的实施例。
[0045] 实施例1:分离副干酪乳酸杆菌株LT12
[0046] 副干酪乳酸杆菌LT12从人类粪便进行分离,须在检体采样后十二小时内进行分离的步骤。称重(约一公克)的检体放至均质机(Stomacher400,Seward,UK)搅拌30秒使其均质化,再以预还原(pre-reduced)的脑心浸出物培养液(brain heart infusion broth)稀释,接着以适合的选择性培养基进行培养。适当的稀释物涂盘于乳酸菌醋酸盐培养基(Rogosa Acetate agar,Difco,USA),或含有12μg/ml万古霉素(vancomycin,Sigma,USA)的乳酸菌醋酸盐培养基(Rogosa Acetate agar,Difco,USA)以培养所有的乳酸菌属,以及可抗万古霉素的乳酸菌,例如:副干酪乳酸杆菌群(L.paracasei group),包含副干酪乳酸杆菌(L.paracasei)、酪蛋白乳酸杆菌(L.casei)及雷曼氏乳酸杆菌(L.rhamnosus)等。API 50CHL系统(bioMérieux,Inc.USA)系用于鉴定抗万古霉素的副干酪乳酸杆菌的品系。
[0047] 实施例2:副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)的鉴定
[0048] API 50CHL系统用于鉴定乳酸菌。藉由一系列酵素反应来建立乳酸菌菌株的特性。LT12的API 50CHL系统鉴定结果列示如表1。
[0049] 表1LT12的API 50CHL系统鉴定结果
[0050]
[0051] 随机放大的多形态DNA(RAPD分析)鉴定:
[0052] 以下几种菌株分别进行40小时的培养后进行DNA萃取:LT12、Lactobacillus paracasei(Cell biotech Co.,Ltd.,Korea)(简称LP-CBT)、Lactobacillus paracasei GMNL32( 简 称:GMNL32)、Lactobacillusparacasei subsp.paracasei BCRC 14023( 简称:BCRC 14023)、Lactobacillus paracasei subsp.paracasei BCRC 12188(简称:BCRC12188),抽取染色体后以12个随机多型性核酸引子(表2)进行RAPD分析。RAPD分析结果详见表3,可由电泳分析观察到LT12与其它四株菌株有不同的的条带模式。
[0053] 综合API 50CHL鉴定及RAPD分析,LT12有别于典型的副干酪乳酸杆菌菌株。因此,LT12为一种新颖副干酪乳酸杆菌株。
[0054] 表2
[0055]编码 DNA序列(5’-3’) 序列编号 图示
OPD-01 ACCGCGAAGG 1 1A
OPD-03 GTCGCCGTCA 2 1B
OPD-07 TTGGCACGGG 3 1C
OPD-20 ACCCGGTCAC 4 1D
OPS-03 5 1E
CAGAGGTCCC
OPS-07 6 1F
TCCGATGCTG
OPS-10 7 1G
ACCGTTCCAG
OPS-11 8 1H
AGTCGGGTGG
OPS-12 9 1I
CTGGGTGAGT
OPS-13 10 1J
TGGGGACCAC
OPS-17 11 1K
TGGGGACCAC
OPS-19 12 1L
GAGTCAGCAG
[0056] 表3
[0057]
[0058]
[0059] 实施例3:LT12与其它乳酸菌的过敏调节功能
[0060] 实验菌体的制备
[0061] LT12、LP-CBT及Lactobacillus rhamnosus GG(以下简称LGG)于乳酸菌MRS培养液中37℃培养24小时,接着菌液以3000rpm离心15分钟。沉淀物加入1ml无菌PBS(phosphate buffered saline)清洗两次后,接着加热至95℃加热30分钟,制备成热致死菌液。
[0062] 周边血液单核细胞(PBMC)的制备
[0063] 新鲜血液来自于健康捐赠者(二男三女,年龄分布为24至40岁),于室温下以2000rpm离心10分钟,接着收集肤色血球层(buffy coat layer)的样本。收集的样本加入等量稀释液(Dilute medium,含RPMI-1640,2%胎牛血清)缓慢地移至内装4ml的Histopaque-1077ficoll plus溶液。在室温中以1200rpm离心30分钟后,加入8ml清洗液(Wash medium,含RPMI-1640,2%胎牛血清,1%PBS)混合均匀充分清洗两次并自样品的界面收集PMBC。已收集的PMBC以完全培养液(complete medium,包含RPMI-1640,10%胎牛
6
血清,1%PBS)再悬浮后,以浓度10 细胞/ml培养于24孔盘中。
[0064] 刺激IFN-γ分泌及细胞激素IFN-γ定量
[0065] 将PBMCs分别与三种菌株(LT12、LP-CBT及LGG)各以给定浓度(5x106,5x 107或8
5x 10CFU/ml)进行共同培养。经过48小时的共同培养后,收集各井的细胞上清液,以酵素免疫分析套组(ELISA kit)定量分析细胞激素IFN-γ,步骤如下。其中分别以5μg/ml植物血球凝集素PHA(phytohemagglutinin)及10μg/ml脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)作为正对照组。
[0066] 于 96 孔 盘 中 加 入 100μL/ 井4μg/ml 的 抗 IFN-γ 抗 体 (HumanIFN-γELISA,RayBiotech Inc.,USA),于4℃静置隔夜。移除孔内液体,加入250μL/well清洗缓冲液(wash buffer)清洗,随的移除孔内液体,重复上述清洗步骤共5次。加入200μL/井的检测稀释液(assay diluent),于室温下静置1小时。加入250μL/井的清洗缓冲液清洗,重复上述清洗步骤共5次。接着加入100μL/井的PMBCs样本于室温下反应二小时。加入250μL/井清洗缓冲液清洗五次后,各井加入100μL/井的二级抗体反应一小时。加入250μL/井清洗缓冲液清洗五次后,接着加入100μL/井的辣根过氧化酵素(Avidin-HRP)(1∶250)反应30分钟。加入250μL/井的清洗缓冲液清洗7次,接着加入100μL/井的受质溶液(substrate solution)。于室温下静置3~15分钟呈色后,加入50μL/井的2N H2SO4停止反应。孔盘各井以波长450nm测定吸光值,依标准曲线换算样品中细胞激素(IFN-γ)浓度。测试结果如表4。
[0067] 在各菌株中,LT12在不同的菌体浓度下都具有最强的刺激IFN-γ生成的能力。
[0068] 表4
[0069]
[0070] 实施例4:LT12及其组合物的对于周边血液单核细胞产生细胞激素的功能评估[0071] 热致死的LT12,及其组合物包括菌数比例为2∶1的LT12及LP-CBT,以前述的方7 7
法制备。PBMCs(来源C及来源E)与LT12(5x 10/ml)及LT12组合物(5x 10/ml)共同培养48小时后,以人类细胞激素抗体微数组( Human cytokine antibody array,Cat.AAH-CYT-1,RayBiotech Inc.,USA)评估被诱发的细胞激素分泌型态。
[0072] 分析步骤如分析套组的说明所示(http://www.raybiotech.com/cytokine_antibody_array.asp)。简单来说,剪开膜片包装,用平头镊小心将膜片夹至套组所附的八孔盘中,沿盘壁注入2mL/井的阻隔缓冲液(blocking buffer)置于摇动器上轻摇,室温培养30分钟。除去阻隔缓冲液,注入1mL/井的检体。置于摇动器上轻摇2小时反应后,以2mL/井的清洗缓冲液I清洗2次,再用2mL/井的清洗缓冲液II清洗3次。加入1mL/井的生物素(biotin)-抗体溶液,置于摇动器上轻摇2小时反应。除去抗体溶液后,以2mL/井的清洗缓冲液I清洗2次,再用2mL/井的清洗缓冲液II清洗3次。注入2mL/井的辣根过氧化酵素亲合素(HRP-Streptavidin),置于摇动器上轻摇培养2小时。用镊子小心夹出膜片滴干残存液体,再置回已除去液体的孔盘,注入0.5mL/井的混合检测液体(detection buffer),避光反应2分钟。用镊子将膜片夹至套组所附的两片塑料片的中或塑料套(plastic wrap),将膜片连同塑料片置于避光暗盒(cassette)中于暗房内压片40秒及显影。细胞激素抗体数组于膜上的位置图如表5所示。
[0073] 表5细胞激素抗体微数组位置图
[0074]
[0075] 分析结果如表6及图1A-E所示。试验分析的组别计有5组,分别为PBMC来源C的空白组(图1A)、PBMC来源C与LT12共同培养组(图1B)、PBMC来源C与LT12组合物共同培养组(图1C)、PBMC来源E的空白组(图1D)及PBMC来源E与LT12共同培养组(图1E)。各共同培养试验组皆观察到细胞激素分泌的增加,包括IL-1α、IL-6、IL-10、INF-γ、MCP-2和TNF-α,其中细胞激素IL-1α、INF-γ、MCP-2和TNF-α仅有经LT12和LT12组合物刺激的PBMCs才被诱发产生。将同为PBMC来源C的各组进行组间比较,可发现LT12组合物对诱发GRO-α、IL-10和MCP-2产生的能力高于LT12。此外,仅有LT12组合物能诱发PMBCs表现MCP-3。
[0076] 表6
[0077]
[0078] a.各组数据为经由比较空白组与试验组所得到的结果
[0079] b.0:无讯号
[0080] :试验前后无差别
[0081] +:增加
[0082] ++:大量增加
[0083] 0→+:仅出现在试验组中
[0084] 所属技术领域的技术人员应了解,在不悖离其广泛的发明概念下,上述具体实施例可做改变。因此应了解,本发明并不受限于本文中所揭示的特定具体实施例,而意欲涵盖在权利要求所定义的本发明的精神和范畴内的修改
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