Clostridium strains to produce ethanol from a gas substrate contains

申请号 JP2000616373 申请日 1999-05-07 公开(公告)号 JP2002543793A 公开(公告)日 2002-12-24
申请人 バイオエンジニアリング・リソーシズ・インコーポレーテツド; 发明人 ガツデイ,ジエイムズ・エル;
摘要 (57)【要約】 クロストリジウム・リュングダーリイの2種の新規な嫌気性菌株が、自然において共存している混在菌から単離され、そして工業的工程からのある種の廃ガスを有用な生産物、例えばエタノールへ変換するための方法において有用である。
权利要求
  • 【特許請求の範囲】 【請求項1】 菌株C−01、ATCC寄託番号55988の特徴をもち、
    そして基質が含有するガスの嫌気的発酵変換によるエタノール生産能を特徴とする、分離されたシー. リュングダーリイ(C.ljungdahlii)菌株。 【請求項2】 菌株O−52、ATCC寄託番号55989の特徴をもち、
    そして基質が含有するガスの嫌気的発酵変換によるエタノール生産能を特徴とする、分離されたシー. リュングダーリイ(C.ljungdahlii)菌株。 【請求項3】 (a)バイオリアクター中の栄養培地水溶液においてシー.
    リュングダーリイ(C.ljundahlii)O−52もしくはシー. リュングダーリイ(C.ljundahlii)C−01を用いて基質が含有するガスを嫌気的に発酵させ; (b)該バイオリアクターから該ブロスの一定分量を連続的に取り出し、そして(c)それからエタノールを回収する: の段階を含んでなる、エタノールの製造方法。 【請求項4】 基質が含有するガスが一酸化炭素および水を含有する、請求項3記載の方法。 【請求項5】 基質が含有するガスが二酸化炭素および水素を含有する、請求項3記載の方法。
  • 说明书全文

    【発明の詳細な説明】 【0001】 本発明は、米国エネルギー省(U.S.Department of Ene
    rgy),補助金No. DE−FCO2−90CE40939およびDE−FC
    O4−94AL98770によって援助された。 政府は本発明におけるある種の権利を有する。 【0002】 発明の分野本発明は、所望の生産物へのある種のガス状基質、特に工業的工程からの基質の嫌気的発酵において有用な生物学的微生物に対向する。 【0003】 発明の背景種々の工業的工程は、世界規模の大量な大気汚染物質および温室効果ガスを生じる。 廃一酸化炭素、二酸化炭素および素ガスが石油精製によって生成される。 また、一酸化炭素および/または水素は、カーボンブラック製造およびコークス製造により、アンモニア工業、製鋼所により、木材の亜硫酸パルプ化およびアジピン酸工業により生成される。 これらの廃ガス流は、一般には、燃料価値のために燃焼されるか、または燃やされる。 多くの場合、これらのガスは、大気中に直接排出され、環境への重大な汚染負荷をもたらす。 【0004】 他の菌の中でも、嫌気性細菌、例えばクロストリジウム・リュングダーリイ( Clostridium ljungdahlii )菌株PETCもしくはER
    I2を含む、発酵工程において潜在的に有用である種々の微生物が存在する[例えば、米国特許第5,173,429号;同第5,593,886号および同第5,821,111号;および本明細書において引用される文献、参照;また、
    1998年1月8日にWO98/00558として公開された国際特許出願PC
    T/US96/11146、参照]。 しかしながら、上記廃ガスを利用し、そしてそれから有用な生産物を生産することができる新規微生物の開発および/または単離に対する技術上の継続的ニーズが残されている。 【0005】 発明の概要 1つの態様では、本発明は、嫌気的条件下、栄養培地水溶液における発酵でエタノールを生産する能をもつ新規な微生物、O−52の生物学的に純粋な培養を提供する。 【0006】 その他の態様では、本発明は、嫌気的条件下、栄養培地水溶液における発酵でエタノールを生産する能力をもつ新規な微生物、C−01の生物学的に純粋な培養を提供する。 【0007】 本発明の他の態様および利点は、次の詳細な記述より明らかになるであろう。 【0008】 発明の詳細な記述本発明は、自然において共存している混在菌から単離され、そしてある種のガス流もしくは廃ガスのエタノールへの発酵変換のための方法において有用である、細菌クロストリジウム・リュングダーリイの2種の嫌気性菌株を提供する。 【0009】 A. 代表的発酵工程本明細書で使用される用語「廃ガス」、「合成ガス」もしくは「基質が含有するガス(substrate−containing gas)」は、気体状態において、例えば窒素およびメタンを含む他の元素もしくは化合物と混合されている、一酸化炭素および/または二酸化炭素および/または水および/または水素を意味する。 そのようなガスもしくはガス流は、典型的には、直接か、または燃焼を通して大気中に放出もしくは排出される。 通常は、放出は標準的な煙突温度および圧力下で起きる。 1つの実施態様では、基質が含有するガスは、一酸化炭素および水を含有する。 その他の実施態様では、基質が含有するガスは、二酸化炭素および水素を含有する。 したがって、本発明の微生物は、これらの大気汚染物質を有用な生産物、主としてエタノールに変換する方法において有用である。 【0010】 本発明の微生物が使用できる代表的な発酵変換方法は次のとおりである。 これらの微生物が他の工程においても使用でき、そして工程における変更が調節されて好適な結果を提供できることは、当業者にとって理解される。 そのような変えることができるファクターは、栄養成分および濃度、培地、圧力、温度、ガスの流速、液の流速、反応pH、撹拌速度(連続撹拌槽リアクターを利用する場合)
    、種菌レベル、阻害を避ける最大基質(導入されるガス)濃度、および阻害を避ける最大生産物濃度を含む。 下記の工程の実施態様では、工程が1気圧以上において実施されるのが好適である。 好ましくは、それが320気圧まで、より好ましくは20気圧まで、もっとも好ましくは15気圧までの圧力において実施されるのが好適である。 【0011】 一般に、廃ガスもしくは基質が含有するガスからエタノールを生産する工程において、変換工程の第1段階は嫌気性細菌のための栄養培地の調製である。 1つのそのような望ましい培地が、具体的に以下の実施例2において開示される。 望ましい実施態様では、基礎培地は酵母エキスおよびトリプチカーゼ(trypt
    icase)なしに使用される。 しかしながら、栄養培地の内容物は当業者によって所望のように変えることができる。 栄養物は、連続撹拌リアクター(Con
    tinuously Stirred Reacter(CSTR))、固定化細胞リアクター(Immobilized Cell Reacter(ICR
    ))、流下床リアクター(Trickle Bed Reacter(TBR)
    )、バブルカラム、ガスリフト発酵槽、または他の適当な発酵リアクターを含む種類の1個以上の容器および/または塔からなるバイオリアクターもしくは発酵槽に定常的にフィードされる。 バイオリアクター内には、酢酸/酢酸塩の代わりにエタノールを生産することができる、単一種か、またはO−52、C−01および可能ならば他の既知の嫌気性細菌種の混合物のいずれであってもよい微生物培養物が存在する。 一般に、低い発酵pH4.0−5.5が要求される。 【0012】 CSTR、TBR、バブルカラムおよびガスリフト発酵槽では、これらの細菌は、リアクターの液相中に分散して生存するが、ICRでは、細菌は内部の充填培養基に固着している。 この充填培養基は、最大表面積、高い物質移動速度、低い圧力損失、均一な気体および液体の分布を提供しなければならず、そして塞栓(plugging)、目詰り(fouling)、凝集(nesting)および壁のチャンネリングを最小にしなければならない。 そのような培養基材の例は、セラミックBerlサドル、Raschigリングまたは他の高性能充填材である。 【0013】 ガスを含有する基質は、バイオリアクター中に連続的に導入され、そして工程の効率を最大化する時間にわたってバイオリアクター中に滞留される。 次いで、
    不活性物質および未反応基質ガスを含有する排ガスが放出される。 流出液が、伴われる微生物を分別するために遠心分離器、中空糸膜、または他の濾過器に移行される。 これらの微生物は、バイオリアクターに戻されて速い反応速度を生じる高い細胞濃度を維持することができる(細胞リサイクル)。 細胞リサイクルは、
    リアクター中の細胞濃度を高めるために使用されてもよいが、この操作は工程作業を作るために必要なものではない。 場合によっては、この後者の細胞リサイクル段階は省略することができる。 【0014】 工程における次の段階は、浸透液もしくは遠心分離液からのエタノールの分離である。 培地中に希薄エタノールを含有する細胞リサイクル装置からの浸透液は、それが溶媒と接触される抽出チャンバーに移行される。 溶媒は、エタノールに対する高い分布係数、高い回収ファクター、ヒトに対する低い毒性、細菌に対する低い毒性、水との非混和性、適当に高い沸点をもたねばならず、そしてバイオリアクター成分とエマルジョンを形成してはならない。 溶媒と水相間の溶質の分布は、熱力学的可能性およびエタノールを除去するために必要な溶媒量を決定できる。 典型的な溶媒は、適当な溶媒中第2級および第3級アミン、適当な助溶媒中リン酸トリブチル、酢酸エチル、トリオクチルホスフィンオキシドおよび関連化合物、長鎖アルコール、ヘキサン、シクロヘキサン、クロロホルム、およびテトラクロロエチレンを含む。 【0015】 水相中の栄養物および材料は、バイオリアクターへ戻り、そして溶媒/エタノール/水溶液は蒸留塔へ移行し、ここで、それらは十分な温度に加熱されてエタノールおよび水から溶媒を分離する。 溶媒は、蒸留塔から冷却チャンバーを通過して抽出のために最適な温度まで低下され、次いで再使用のために抽出チャンバーに戻る。 エタノールと水の溶液は最終蒸留塔に移行し、ここでエタノールが水から分離、除去される。 95%エタノールが蒸留塔の上部に存在し、そして水(
    消耗培地)が塔の底部に存在する。 消耗培地は水のリサイクルとしてリアクターに送り戻される。 95%エタノールは分子ふるいシステムに送られて無水エタノールが生産される。 水は栄養調製物のために再循環される。 【0016】 B. 新規微生物本発明の両微生物、O−52およびC−01は、特許手続きのための微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の適当な約定に従って寄託された。 C.
    リュングダーリイ、菌株O−52は、受託番号55989として1997年6月27日に、アメリカン タイプ カルチャー コレクション、10801 ユニバーシティ ブールバード、マナッサス、VA20110−2209、USA(
    American Type Culture Collection,108
    01 University Boulevard,Manassas,VA2
    0110−2209,USA(以前には、12301 Parklawn Dr
    ive,Rockville,MD 20852,USAに置かれていた)に寄託された。 C. リュングダーリイ、菌株C−01は、受託番号55988として1997年6月27日に、アメリカン タイプ カルチャー コレクション、1
    0801 ユニバーシティ ブールバード、マナッサス、VA20110−22
    09、USA(American Type Culture Collect
    ion,10801 University Boulevard,Manas
    sas,VA20110−2209,USA(以前には、12301 Park
    lawn Drive,Rockville,MD 20852,USAに置かれていた)に寄託された。 【0017】 これらの微生物は、工業的流れからの廃ガス、ならびに他の合成ガスよりエタノールを生産するための発酵工程において有用である。 事実、嫌気性細菌のこれらの新規菌株は、高い効率をもって、上記のようにガス状基質からエタノールへの変換のための方法に関与できる。 【0018】 これらの嫌気性細菌株、O−52およびC−01は全く同様に挙動して、両C
    Oおよびエタノールに対して高い耐性を示す。 両微生物は、CO,CO 2およびH 2を使用し、そして低い副産物酢酸濃度とともに類似濃度のエタノールを生産する。 【0019】 シー. リュングダーリイ(C.ljundahlii)O−52は、基質が含有するガスの変換により生産物として酢酸の代わりにエタノールを生産することが可能である。 これは、先に記述したような工程において、好ましくは酵母エキスとトリプチカーゼなしの基礎培地を利用することによって達成される。 O−5
    2は、副産物としてごく少量の酢酸とともにCSTR中でエタノールを生産することが観察された。 微生物としてO−52を用いる上記工程の1つの実施態様では、CSTR(細胞のリサイクルなし)は、ガス滞留時間45.5−50分、液希釈率0.024−0.031/時間、温度36.5−39.0℃および撹拌速度750−1000rpmを用いた。 ガスは、65%CO、20%H 2 、11%
    CO 2および4%CH 4からなった。 運転条件は、微調整により変えられて最高エタノール濃度を得た。 この方法では、COガス変換は、最高エタノール生産の間に生じる比較的高い変換によって20〜60%の範囲であった。 H 2変換は約1
    0%に留まった。 最高細胞濃度(光学濃度として)は4.2であって、1040
    時間目に達した。 光学濃度(生産物濃度プロフィル)は約3.5のレベルであって、これは最高エタノール生産および最低酢酸生産の時に対応した。 最高エタノール濃度は約5g/Lであり、対応する酢酸濃度は0.5g/Lであった。 【0020】 さらなる実験が、ガス滞留時間約26分および液滞留時間24時間を用いた分離株O−52によるCSTRにおいて行われた。 生産物安定化時期240時間に続いて、培養は顕著な酢酸生産からエタノール生産に転移した。 CO変換は85
    −90%で安定であり、そしてH 2変換は平均20−30%で不安定であった。
    低いH 2変換は、単一CSTRにおいて比較的高いエタノール濃度を得た場合に典型的であった。 エタノール濃度は、酢酸からエタノール生産への切り換え後すぐに20g/Lの最高に達し、次いでその後250時間にわたって10.5−1
    1.0g/Lにおいて安定化した。 対応する酢酸濃度は2−3g/Lであった。
    乾燥細胞重量濃度は、実験を通して1.5−2.0g/Lにおいて安定であった。 【0021】 同様に、シー. リュングダーリイ(C.ljundahlii)C−01は、
    基質が含有するガスの変換からの生産物として酢酸の代わりにエタノールを生産することが可能である。 また、CSTR実験は、血清ボトル研究において酢酸に対して高い割合のエタノールを生産した分離株C−01を用いて実施された。 1
    つのそのような実験では、ガスは、32%H 2 、34%CO、5%CH 4および2
    9%CO 2を含有した。 液滞留時間(LRT)は32時間であり、そしてガス滞留時間は14.2分であった。 リアクターは、これらの条件において約500時間運転され続けた。 COガス変換は、約85%に維持され、そしてH 2変換は約50%においてかなり一定していた。 リアクターからの生産物は、エタノール2
    0−24g/Lおよび酢酸3−4g/Lを含有した。 乾燥細胞重量濃度は1.8
    −2.4g/Lであった。 【0022】 あるCSTR実験では、単一CSTRにおける最高の達成エタノール濃度は、
    両菌株について約25g/Lであり、そしてCSTRにおける典型的な濃度はエタノール約23g/Lおよび酢酸約3.5g/Lであった。 菌株C−01は、基質としてのCOに対して若干耐性であり、液相におけるやや高い溶存CO濃度を許す。 分離株O−52についての典型的な比ガス取り込み率は、1時間当たり2
    1mmolCO/g細胞および15mmolH 2 /g細胞であった。 分離株C−
    01についての典型的な比取り込み率は、1時間当たり25mmolCO/g細胞および10mmolH 2 /g細胞であった。 典型的なH 2 、CO、CO 2基質からのエタノールの収率は理論量の90%であった。 比生産性は,分離株O−52
    では1時間当たり0.21gエタノール/g細胞、そして分離株C−01では1
    時間当たり0.23gエタノール/g細胞であった。 かくして、分離株は、CO
    ,CO 2およびH 2を使用してエタノールを生産するそれらの能力においてほぼ相互に交換可能である。 【0023】 両菌株は、典型的な(1−2%)レベルのH 2 SおよびCOSの存在下で増殖し、そしてエタノールを生産することができる。 硫黄は細胞質量中に組み入れられ、細胞重量の約1%と計算される。 また、Na x S、H 2 Sの水相の形態は、リアクター内の嫌気的状態の確保を助けるために使用される。 【0024】 総括すると、新規なシー. リュングダーリイ菌株O−52およびC−01は、
    CO,CO 2およびH 2の発酵によって、好適な基質としてはCOを用いてエタノールを生産する。 好適な基質としてのCOの指定は、より高い細胞収量がCOにおいて得られ、そしてより高いCO変換が両COおよびH 2を含有するガス混合物において得られることを意味する。 両菌株についての好適な操作pH範囲はp
    H4.5〜5.5である。 CO,CO 2およびH 2の発酵生産物はエタノールおよび酢酸である。 両菌株は、培地組成および濃度、pH、ガスおよび液の流速、撹拌速度、およびガス組成のほぼ同一の発酵条件により非常に類似する生産物濃度を与える。 【0025】 かくして、本発明の微生物は、ガス状基質の発酵によってエタノールを生産する方法において使用でき、価値ある化学供給源の浪費を減少するのみならず、また、多くの工業の廃ガス流から有害な大気汚染物質を除去することができる。 これらの化学製品を生物学的に得る従来の方法は糖類の発酵に基づいていた。 【0026】 C. 実施例次の特定の実施例は、本発明を具体的に説明するために提供されるものであり、限定するものではない。 他に示さなければ、本明細書および特許請求項におけるすべての部分およびパーセンテージは容積に基づく。 【0027】 例1−製油所廃ガスからのエタノールの生産この実施例は、具体的には1998年1月8日に公開され、そして引用によって本明細書に組み入れられている、公開PCT特許出願WO98/00558の実施例1に記述されているように、ベンチスケールの連続変換系において例証される。 約45%CO、50%H 2および5%CHを含有する製油所廃ガスの混合物が、嫌気性細菌分離株O−52ATCC寄託番号55989を含有する細胞リサイクルなしの1.0L連続撹拌槽リアクター中にスパージされる。 製油所廃ガスは、例えば触媒再生器および触媒接触器、製油所において見いだされる共通の2種のユニット操作からの気流を混合することによって製造される。 リアクター内の操作圧力は水柱数インチであり、温度は37℃である。 ガス滞留時間は12
    分、そして液希釈率0.042/時間である。 液体培地は、エタノール生産を増強するために栄養物制限(酵母もしくはトリプチカーゼなし)において基礎塩類およびビタミン類を含有する。 リアクター中の操作pHは5.05であり、そして撹拌速度は1000rpmである。 これらの条件下で、CO変換は85%であり、そしてH 2変換は50%である。 リアクターからの生産物流中のエタノール濃度は21g/Lである。 酢酸副産物濃度は3g/Lである。 【0028】 発酵槽からの生産物流は生産物回収のために蒸留塔に送られる。 酢酸と水を含有する蒸留塔からの底部液が水リサイクルとして発酵槽に戻される。 95%エタノールを含有する蒸留からの上部生産物は、純エタノールを製造するために吸着ユニットに送られる。 【0029】 例2−BRI分離株C−01を用いる廃ガスからのエタノールの生産この実施例は、具体的には1998年1月8日に公開され、そして引用によって本明細書に組み入れられている、公開PCT特許出願WO98/00558の実施例1に記述されているように、ベンチスケールの連続変換系において例証される。 N 2中約14%CO、17%H 2および4%CO 2を含有するカーボンブラック廃ガスの混合物が、1.58気圧、37℃で操作され、そして最終生産物としてエタノールを生産することができるクロストリジウム・リュングダーリイ分離株C−01[ATCC寄託番号55988]を含有する、細菌リサイクルなしの1.01L連続撹拌槽リアクター中にスパージされる。 流下床リアクターは、
    RaschigリングもしくはBerlサドルのような市販の充填物を充填したカラムであり、この中で液およびガスが互いにカラムを通して流れながら接触する。 本実施例では、向流(ガスが底部にはいり、そして液が上部にはいる)も可能ではあるが、液とガス両方が、同時方式で上部からカラムにはいる。 ガス滞留時間は0.46分に維持され、そして液体培地希釈率は0.57/時間である。
    培養液にフィードされる栄養混合物は、次のとおりであった: 1. KH 2 PO 4 3.00g/L K 2 HPO 4 3.00g/L (NH 42 SO 4 6.00g/L NaCl 6.00g/L MgSO 4・2H 2 O 1.25g/L: からなる塩類 80.0ml 2. 酵母エキス 1.0g 3. トリプチカーゼ 1.0g 4. FeCl 2 *4H 2 O 1500mg ZnSO 4 *7H 2 O 100mg MnCl 2 *4H 2 O 30mg H 3 BO 3 300mg CoCl 2 *6H 2 O 200mg CuCl 2 *H 2 O 10mg NiCl 2 *6H 2 O 20mg NaMoO 4 *2H 2 O 30mg Na 2 SeO 3 10mg 蒸留水 1000ml: を含有するPFN微量金属溶液(Pfenning)3.0ml 5. ピリドキサルHCl 10mg リボフラビン 50mg サイアミンHCl 50mg ニコチン酸 50mg Ca−D−パントテン酸 50mg リポ酸 60mg p−アミノ安息香酸 50mg 葉酸 20mg ビオチン 20mg シアノコバラミン 50mg 蒸留水 1000ml: のビタミンB類 10.0ml 6. システインHCl 0.5g 7. CaCl 2・2H 2 O 0.6g 8. NaHCO 3 2.0g 9. Resazurin(0.01%) 1.0ml 10. 蒸留水 920.0ml。 【0030】 リアクターにおける撹拌は、再循環速度60gpmを用いる液再循環によって与えられた。 リアクター中の操作pHは5.05である。 これらの条件下で、C
    O変換は57%であり、そしてH 2変換は58%である。 中空糸ユニットが使用されて、リアクター内の細胞濃度13.6g/Lを維持した。 【0031】 リアクターからの生産物は、エタノール20g/Lおよび酢酸3g/Lである。 【0032】 かくして、本発明の微生物の成績として、廃ガスをエタノールに変換するための高度に効率的な改良方法が達成されることが評価されるであろう。 具体的に説明される実施態様において、本発明から逸脱することなく修飾および変更がなされることが考えられ、そしてこれまでの記述から当業者にとって明らかであろう。 したがって、これまでの記述および付随する図面は好適な実施態様のみの具体的に説明であり、それを限定するものではなく、そして本発明の真の精神および範囲は添付された請求項を参照して決定されることを明白に意図している。 【0033】 【表1】

    【0034】 【表2】

    ───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12R 1:145) B01D 53/34 135Z (C12N 1/20 C12R 1:145) (C12P 7/08 C12R 1:145) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU, CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,G E,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS ,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK, LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU ,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM, TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,Z A,ZW

    QQ群二维码
    意见反馈