[0001] 相关专利申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2010年8月19日提交的编号为No.61/401,835的美国申请的优先权，所述申请以引用的方式全文纳入本文。

[0003] 本发明涉及利用包含微生物发酵（特别是含CO的底物的微生物发酵）的步骤生产一种或多种化学产物。

[0004] 丁烯是有价值的产物,其可用于多种化学物质(包括燃料和聚合物)的生产。丁二烯是生产合成橡胶、尼龙的有价值的资源，也是合成环烷烃和环烯烃中的有价值的资源。甲基乙基甲酮（methyl ethyl ketone）（或丁酮）是用于生产塑料、纺织品、石蜡、亮漆（lacquer）、清漆、脱漆剂和胶水的有价值的工业溶剂，并且可以用作清洗剂。 [0005] 一氧化碳（CO）是有机材料（例如煤或油和油衍生产物）不完全燃烧的主要副产物。
虽然含碳前体的完全燃烧产生CO2和水作为仅有的终产物，但是一些工业过程需要高温，这相对于CO2更有利于CO的积累。一个实例是钢铁工业，其需要高温以生成所需的钢铁质量。
例如，据报道，澳大利亚的钢铁工业每年产生并向大气释放超过500，000吨的CO。 [0006] 此外，CO还是合成气的主要组分，其中通过含碳燃料的气化作用产生不同含量的CO和H2。例如，合成气可通过裂解废弃树木和木材的有机生物质产生，以生成用于生成燃料和更复杂化学物质的前体。

[0007] CO向大气中的排放可具有明显的环境影响。此外，可能需要支付排放税，增加了工厂的成本。由于CO是富含反应能的分子，它可被 用作产生多种化学物质的前体化合物。 发明内容

[0008] 本发明的目的是提供产生一种或多种化学产物的方法，包括产生丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮的方法，通过发酵含CO的底物产生2,3-丁二醇，而所述2,3-丁二醇又被转化为上述化合物中的一种或多种。

[0009] 在一个实施方案中，所述方法至少包括：

[0010] a.厌氧发酵含CO的底物以产生2,3-丁二醇；和

[0011] b.将所述2,3-丁二醇转化为丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮中的一种或多种。 [0012] 在一个实施方案中，所述方法包括在步骤a之后并且在2,3-丁二醇在步骤b中被转化为一种或多种化学产物之前，回收所述2,3-丁二醇。

[0013] 在一个实施方案中，所述方法包括在步骤（b）中回收中间化合物丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮。在另一个实施方案中，在步骤（b）中使2,3-丁二醇转化为一种或多种化学产物，而不回收丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮。

[0014] 在一个实施方案中，步骤（a）包括提供含CO的底物至含有一种或多种微生物的培养物的生物反应器，并厌氧发酵所述底物以产生2,3-丁二醇。

[0015] 在一个实施方案中，所述方法还包括在回收乙烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮后，在产生一种或多种化学产物的过程中转化或使用丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮。 [0016] 在另一个实施方案中，将2,3-丁二醇转化为一种或多种化学产物，而不从所述方法中回收丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮。

[0017] 在多个方面的具体实施方案中，所述含一氧化碳的底物是含一氧化碳的气态底物。所述含一氧化碳的气态底物可作为工业过程的副产物获得。在一些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品生产、非铁金属产品生产、石油精炼过程、生物质的气化、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在一个实施方案中， 所述气态底物包括从钢铁厂获得的气体。在另一个实施方案中，所述气态底物包括汽车废气。 [0018] 在具体实施方案中，所述含CO的底物通常包含较大比例的CO，例如至少20体积%至100体积%的CO，40体积%至95体积%的CO，40体积%至60体积%的CO，以及45体积%至55体积%的CO。在具体实施方案中，所述底物包括25体积%、或30体积%、或35体积%、或40体积%、或45体积%、或50体积%的CO、或55体积%的CO、或60体积%的CO。含更低浓度（例如6%）的CO的底物也可能是合适的，特别当还存在H2和CO2时。 [0019] 在多个方面的一些实施方案中，所述方法包括使用梭菌属（Clostridia）微生物进行的微生物发酵。

[0020] 在一个 实施方案 中，所述方 法包括 使用产乙 醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）进行的微生物发酵。

[0021] 在一个实施方案中，所述方法包括使用杨氏梭菌（Clostridium ljundahlii）进行的微生物发酵。

[0022] 在一个实施方案中，所述方法包括使用拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei）进行的微生物发酵。

[0023] 本发明从广义上说还在于本申请说明中提及或指出的部分、要素或特征（单独地或共同地），以及所述部分、要素或特征的两个或更多个的任意或所有组合，并且当本文提及在本发明涉及的领域中有已知等价物的具体整体时，所述已知等价物被认为如同其被单独提出一样纳入本文。

[0024] 详细描述本发明后，本发明的这些和其他目标和实施方案将会更加明显。 附图说明

[0025] 图1示出了DSM19630（图1A）和DSM23693（图1B）的2,3-丁二醇生产的曲线图。 [0026] 图2示出了产乙醇梭菌、杨氏梭菌和拉氏梭菌的2,3-丁二醇生产对时间的曲线图。

[0027] 图3示出了实施例3中产乙醇梭菌(DSM23693)的产物连续生产的曲线图。 具体实施方式

[0028] 以下是对本发明包括其优选实施方案的一般意义上的描述。在下文中的标题“实施例”下所给出的公开内容中将对本发明进一步举例说明，所述实施例提供了支持本发明的实验数据、本发明各方面的具体实施例和实施本发明的方式。

[0029] 术语“2,3-丁二醇”应被理解为包括以外消旋、部分立体异构纯的和/或基本上立体异构纯的形式存在的所述化合物的所有对映异构和非对映异构形式，包括(R,R)、(S,S)和内消旋形式。

[0030] 本文所用的“丁烯”（butene，butylene）旨在指所述烯烃的所有结构异构体（包括2-丁烯、丁-1-烯、2-甲基丙烯），和以异构体混合物以及纯的和/或基本上纯的形式存在的所述化合物的所有立体异构和几何异构形式（包括Z-丁-2-烯，E-丁-2-烯）。 [0031] 本文所用的“丁二烯”旨在指以异构体混合物以及纯的和/或基本上纯的形式存在的所述二烯的所有几何异构体，包括顺式和反式1,3-丁二烯。

[0032] 本文所用的“甲基乙基甲酮”（或MEK或丁酮）旨在指以部分纯的和/或基本上纯的形式存在的所述酮的所有异构体。

[0033] 本文所用的短语“一种或多种化学产物”是指可由丁烯、丁二烯和MEK中的一种或多种或使用丁烯、丁二烯和MEK的一种或多种制备的化学化合物或产物，并且包括在其生产过程中丁烯、丁二烯和MEK中的一种或多种被认为是中间产物的产物。下文提供了这些化学产物的多种非限制性实例。

[0034] 术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵装置，所述发酵装置包括连续搅拌釜反应器（CSTR）、固定化细胞反应器（ICR）、滴流床反应器（TBR）、鼓泡塔、气升发酵罐、静态混合器、或适用于气-液接触的其他容器或装置。如下文所述，在一些实施方案中，所述生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵 反应器。因此，当提到加入底物（例如含一氧化碳的底物）到所述生物反应器或发酵反应中时，应该理解为，如果合适的话，包括加入到这些反应器之一或两个中。

[0035] 术语“含一氧化碳的底物”及类似术语应理解为包括其中一氧化碳可被一种或多种细菌菌株利用进行例如生长和/或发酵的任何底物。

[0036] “含一氧化碳的气态底物”包括任何包含某一水平的一氧化碳的任何气体。所述气态底物通常包含较大比例的CO,优选至少15体积%至95体积%的CO。

[0037] 除非本文另外要求，本文所使用的短语“发酵”“酵本发酵过程”或“发酵反应”等旨在包括所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段。

[0038] 在一个方面，本发明提供产生一种或多种化学产物的方法，所述方法至少包括厌氧发酵含有CO的底物以产生2,3-丁二醇的步骤。在一个实施方案中，所述方法至少包括厌氧发酵含CO的底物以产生2,3-丁二醇并通过中间化合物丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮将所述2,3-丁二醇转化为一种或多种化学产物。

[0039] 在另一个方面，本发明提供产生丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮中的一种或多种的方法，所述方法至少包括厌氧发酵含CO的底物以产生2,3-丁二醇。在一个实施方案中，所述方法至少包括厌氧发酵含CO的底物以生产2,3-丁二醇，然后将所述2,3-丁二醇转化为丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮中的一种或多种。

[0040] 在一个实施方案中，本发明的方法包括在2,3-丁二醇被转化为丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮中的一种或多种之前，从发酵液中回收2,3-丁二醇。然而，在一些实施方案中，这可能不是必需的。

[0041] 在一个实施方案中，所述方法包括回收所产生的丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮中的一种或多种，并在回收后转化它们或将它们用在一种或多种化学产物的过程中。在其他的实施方案中，在将丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮转化或用于生产一种或多种化学产物前，不必需将它们回收。

[0042] 在一个实施方案中，所述微生物发酵包括提供含CO的底物，和在含有一种或多种微生物培养物的生物反应器中厌氧发酵所述底物以产生2,3-丁二醇。

[0043] 在一些实施方案中，本发明的方法是连续的。在一个实施方案中，从所述发酵液或生物反应器中连续回收2,3-丁二醇。在一些实施方案中，从发酵液或生物反应器回收的2,3-丁二醇被直接进料，用于化学转化为丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮中的一种或多种。例如，2,3-丁二醇可被直接进料到适于化学合成丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮中的一种或多种的一个或多个容器。类似地，在本发明的一些实施方案中，可从所述方法中连续回收丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮，并任选地将其直接进料到用于生产另一种化学产物的化学合成反应中。在其他的实施方案中，可在连续的基础上原地将丁烯、丁二烯和/或甲基乙基甲酮转化或用在产生其他化学产物的过程中。

[0044] 微生物

[0045] 能够发酵含CO的底物以产生2,3-丁二醇的任一种或多种微生物可用于本发明。在一个实施方案中，所述微生物是梭菌属的。

[0046] 在本发明的一些实施方案中，用于发酵的一种或多种微生物是产乙醇梭菌。在一些实施方案中，所述产乙醇梭菌是具有在德国生物材料资源中心（又称德国微生物和细胞培养物保藏中心，DSMZ）以鉴定保藏号DSM19630保藏的菌株（保藏日期为2007年10月19日）或在DSMZ以鉴定保藏号DSM23693保藏的菌株的鉴定特征的产乙醇梭菌（保藏日期为2010年6月7日）。在另一个实施方案中，所述产乙醇梭菌是产乙醇梭菌DSM10061或DSM23693。

[0047] 在其他的实施方案中，用于发酵的一种或多种微生物是杨氏梭菌或拉氏梭菌。在一些实施方案中，所述杨氏梭菌具有在德国生物材料资源中心（DSMZ）以鉴定保藏号DSM13582保藏的菌株的鉴定特征，并且所述拉氏梭菌具有在美国典型培养物保藏中心TM
(ATCC)以鉴定保藏号ATCC-BAA622 保藏的菌株的鉴定特征，但是应理解也可以使用其他菌株。

[0048] 对本发明方法中使用的细菌的培养可使用本领域中已知的用于使用厌氧菌培养和发酵底物的任意数目的方法进行。示例性技术在本文“实施例”部分中提供。又例如，可使用在以下文章中通常描述的使用气态底物进行发酵的那些方法：K.T.Klasson,M.D.Ackerson,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1991).Bioreactors for synthesis gas fermentations resources.Conservation and Recycling,5;145-165;K.T.Klasson,M.D.Ackerson,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1991).Bioreactor design for synthesis gas fermentations.Fuel.70.605-614;K.T.Klasson,M.D.Ackerson,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1992).Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels.Enzyme and Microbial Technology.14;602-608;J.L.Vega,G.M.Antorrena,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1989).Study of Gaseous Substrate Fermentation:Carbon Monoxide Conversion to Acetate.2.Continuous Culture.Biotech.Bioeng.34.6.785-793;J.L.Vega,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1989).Study of gaseous substrate fermentations:Carbon monoxide conversion to acetate.1.Batch culture.Biotechnology and Bioengineering.34.6.774-784; 和 J.L.Vega,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1990).Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations.Resources,Conservation and Recycling.3.149-160。

[0049] 底物

[0050] 含一氧化碳的底物,优选含一氧化碳的气态底物,被用于本发明的方法中产生2,3-丁二醇的发酵反应中。所述气态底物可以是作为工业生产副产物所获得的废气，或来源自一些其他来源例如来源自内燃机（例如汽车）废气。在一些实施方案中，所述工业生产选自铁金属产品生产（例如钢铁厂）、非铁金属产品生产、石油精炼过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在这些实施方案中，所述含CO的气体可以是在其被排放至大气之前使用任何常规方法从工业过程中捕获。根据含CO的气态底物的组成，还可能需要在将其引入发酵之前对其进行处理以除去任何不需要的杂质（如粉尘颗粒）。例如，可以使用已知方法对所述气态底物进行过滤或洗涤。

[0051] 在本发明的其他实施方案中，所述含一氧化碳气态底物可以来源自生物质的气化。所述气化过程包括在空气或氧气受限供应的情况下使生物质进行部分燃烧。所生成的气体通常主要包含CO和H2，以及少量体积的CO2、甲烷、乙烯和乙烷。例如，在食品提取和加工过程 （例如从甘蔗中提取蔗糖或者从玉米或谷物中提取淀粉）中所得到的生物质副产物，或林业中产生的非食品生物质废物，可被气化以产生适用于本发明的含CO的气体。 [0052] 所述含CO的底物通常包含较大比例的CO，例如至少15体积%至100体积%的CO，40体积%至95体积%的CO，40体积%至60体积%的CO，以及45体积%至55体积%的CO。在具体实施方案中，所述底物包括25体积%、或30体积%、或35体积%、或40体积%、或45体积%、或50体积%的CO、或55体积%的CO、或60体积%的CO。含更低浓度（例如
6%）的CO的底物也可能是合适的，特别是当也存在H2和CO2时。

[0053] 虽然所述气态底物不需要包含任何氢气，但这不被认为有损于2,3丁二醇生产。所述气态底物还可包含一些CO2，例如约1体积%至80体积%的CO2、或1体积%至约30体积%的CO2。在一个实施方案中，所述气态底物包含5体积%至10体积%的CO2。在另一个实施方案中，所述气态底物包含约20体积%的CO2。

[0054] 通常，一氧化碳被以气态形式加入发酵反应。但是，本发明不应被认为限于以该形态添加所述底物。例如，一氧化碳可以液体形式提供。例如，液体可用含一氧化碳的气体饱和，然后将该液体加入生物反应器。这可使用标准方法实现。例如，可以使用微泡分布发生器（microbubble dispension generator）(Hensirisak et.al.Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation;Applied Biochemistry and Biotechnology Volume101,Number3/October,2002)。

[0055] 在本发明的一个实施方案中，两种或多种不同底物的组合可用于所述发酵反应。此外，经常需要增加底物流中CO的浓度（或气态底物中CO的分压），并从而提高CO作为底物的发酵反应的效率。提高气态底物中CO的分压可增加向发酵培养基中的CO质量转移。用于给发酵反应进料的气体流的组成可对所述反应的效率和/或成本有显著的影响。例如，O2可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后的发酵过程各阶段中，对不需要或不必要的气体的处理会增加这些阶段的负担（例如，当在气体流进入生物反应器之前将气体流压缩时， 不必要的能量可能被用于压缩发酵过程中不需要的气体）。因此，可能需要处理底物流（特别是来自工业来源的底物流）以除去不需要的组分并增加所需组分的浓度。 [0056] 培养基

[0057] 应理解，为了所述一种或多种微生物的生长和底物至2,3-丁二醇发酵的发生，除了所述底物以外，还需要将合适的营养培养基加料至生物反应器。营养培养基应包含足以使所使用的微生物生长的组分,例如维生素和矿物质。仅作为示例，适用于产乙醇梭菌生长的厌氧培养基是本领域中已知的。例如，Abrini等人所描述的(Clostridium autoethanogenum,sp.Nov.,An Anaerobic Bacterium That Produces Ethanol From Carbon Monoxide;Arch.Microbiol.,161:345-351(1994))。下文“实施例”部分提供其他合适的培养基的实例。

[0058] 发酵条件

[0059] 所述发酵需要在适于发生所述底物到2,3-丁二醇的发酵的条件下进行。应考虑的反应条件包括温度、培养基流速、pH、培养基氧化还原电位、搅拌速率（如果使用连续搅拌釜反应器）、接种量、确保底物水平不成为限制而向所述生物反应器引入底物的最大底物浓度和速率，以及避免产物抑制的最大产物浓度。

[0060] 最佳反应条件将部分取决于所使用的具体微生物。但是，通常，所述发酵优选在高于环境压力的压力下进行。在增加的压力下操作可使得从气相向液相的CO转移速率显著增加，在液相中CO可被微生物摄取作为碳源用于产生2,3-丁二醇。这进而意味着，当生物反应器维持在升高的压力而非大气压力下时可以减少保留时间（定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速）。

[0061] 同样，因为给定的CO到产品的转化速率部分地是底物保留时间的函数，并且实现所需的保留时间进而可确定所需的生物反应器体积，使用加压体系可极大地减少所需的生物反应器体积，并因此减少发酵设备的主要费用。根据美国专利no.5,593,886中给出的实例，反应器体积的减少与反应器操作压力增加成线性比例，即在10个大气压下操 作的生物反应器仅需要在1个大气压下操作的反应器体积的十分之一。

[0062] 在升高的压力下进行气体到产品的发酵的优点也已在别处描述。例如，WO02/08438描述了在30psig和75psig压力下进行的气体到乙醇的发酵，获得的乙醇生产率分别为150g/l/天和369g/l/天。但是，发现使用类似培养基和输入气体组合物在大气压力下进行的实验性发酵产生低10-20倍的乙醇/升/天。

[0063] 还需要的是，含CO的气态底物的引入速率是例如可确保在液相中的CO浓度不成为限制。这是因为CO限制的条件的结果可能是2,3-丁二醇产物被培养物消耗。 [0064] 适用于对含CO的底物的厌氧发酵的发酵条件的实例详细记载于WO2007/117157、WO2008/115080、WO2009/022925和WO2009/064200。应认为，其中所报道的发酵条件可根据本发明的方法容易地调整。本发明人已经确定的是，在一个pH值不受控制的实施方案中，没有出现对2,3-丁二醇生产的不利影响。

[0065] 在一个具体的实施方案中，WO2009/151342中记载的方法和条件可用于本发明。 [0066] 生物反应器

[0067] 如本文中先前所述，发酵反应可在任何合适的生物反应器中进行。在本发明的一些实施方案中，所述生物反应器可包括第一生长反应器（在其中培养微生物），和第二发酵反应器（来自所述生长反应器的培养液被供料至其中，并且大部分发酵产物（例如，2,3-丁二醇）在其中产生）。

[0068] 产物回收

[0069] 在营养培养基中，所述发酵将得到包含所需产物（2,3丁二醇）和/或一种或多种副产品（例如乙醇、乙酸盐（acetate）和丁酸盐（butyrate））以及细菌细胞的发酵液。 [0070] 在所述反应的一些实施方案中，所述发酵液中2,3丁二醇的浓度是至少2g/L、或至少5g/L、或至少10g/L、或至少20g/L。

[0071] 在一些实施方案中，将所述发酵反应产生的2,3丁二醇直接从所述 发酵液中转化为MEK、丁烯和/或丁二烯。在其他实施方案中，先从所述发酵液中回收2,3丁二醇，然后将其转化为MEK、丁烯和/或丁二烯。

[0072] 在一些实施方案中，2,3丁二醇的回收包括连续移出部分发酵液并从所述移出的部分发酵液中回收2,3-丁二醇。

[0073] 在具体的实施方案中，2,3丁二醇的回收包括将所述含2,3丁二醇的移出的部分发酵液通过分离装置以将细菌细胞与所述发酵液中分离，并产生无细胞的含2,3丁二醇的渗透液，并将所述细菌细胞返回到生物反应器中。然后,所述含2,3丁二醇的无细胞渗透液可被用于随后向丁烯、MEK和/或丁二烯的转化。

[0074] 在一些实施方案中，发酵反应中产生的2,3丁二醇和/或一种或多种其他产物或副产物的回收包括连续移出部分发酵液并从所述移出的部分发酵液中分别回收2,3丁二醇和一种或多种其他产物。

[0075] 在一些实施方案中，2,3丁二醇和/或一种或多种其他产物的回收包括将所述移出的含2,3丁二醇和/或一种或多种其他产物的部分发酵液通过分离装置以将细菌细胞与所述2,3丁二醇和/或一种或多种其他产物中分离，并产生无细胞的含2,3丁二醇和一种或多种其他产物的渗透液，并将所述细菌细胞返回到生物反应器中。

[0076] 在上述的实施方案中，2,3丁二醇和一种或多种其他产物的回收优选地包括先从所述无细胞的渗透液中移出2,3丁二醇，然后从所述无细胞渗透液中移出所述一种或多种其他产物。然后，优选地将所述无细胞渗透液返回至生物反应器中。

[0077] 可通过本领域已知方法从所述发酵液中回收2,3-丁二醇或含2,3丁二醇的混合产物流。举例来说，可使用分馏或蒸发、渗透蒸发、以及萃取发酵。另外的实例包括：使用来自整个发酵液的蒸汽进行的回收(Wheat et al.1948)；与蒸馏结合的反渗透(Sridhar1989)；涉及2,3–BD的溶剂萃取的液-液萃取技术(Othmer et al.1945;Tsao1978;Eiteman and Gainer1989)；在PEG/葡聚糖系统中的2,3–BD的双水相萃取(Ghosh and Swaminathan2003);使用醇类或酯类（例如，乙酸乙酯、磷酸三丁酯、乙醚、正丁醇、十二烷醇、油醇）的溶剂萃取,以及乙醇/磷酸盐系统(Bo Jianga2009)；亲水性溶剂和无机盐组成的双水 相系统(Zhigang et.al.2010)。

[0078] 在某些情况下，由于2,3-丁二醇的低分配系数和低选择性，将所述发酵液通过蒸发(Othmer et al.1945)或微量过滤和反渗透(Sridhar 1989)脱水，然后将其暴露于溶剂中。使用氯化钾（KCl）或脱水K2CO3的排斥萃取或盐析也已被研究用于2,3-BD的回收（SYU2001年），例如K2CO3对丙酮-丁醇-乙醇发酵中丁醇提取的盐析效应(Xu2001;Hu et al.2003)。由于所述发酵液中2,3-丁二醇的浓度太低而使得即使在饱和的KCl或K2CO3溶液中也不能被盐析，所以在盐析前还测试了从所述发酵液中移除水。

[0079] 回收2,3-丁二醇方法的另一个实例是在酸的催化下使其与甲醛反应以形成缩甲醛。在上层油相中收集2,3-丁二醇缩甲醛并使其与酸甲醇反应以形成2,3-丁二醇和甲缩醛。甲缩醛可被水解形成甲醇和甲醛(Senkus1946)。

[0080] 另一个实例可以是使用离子液体从澄清的发酵液中提取乙醇/2,3-BD。离子液体可通过许多途径进行修饰以改变其物理性质。这个方法的优点是离子液体是不易挥发的。有些是水敏感性的，但有些不是。

[0081] 先前在乙醇和丁醇发酵中使用的渗透蒸发或真空膜蒸馏可用于浓缩作为所述发酵液提取物的水中的2,3-BD(Qureshi et al.1994)。在整合过程中使用微孔聚四氟乙烯（PTFE）膜，而在渗透蒸发的乙醇或丁醇发酵中通常使用硅酮膜。

[0082] 还可使用本领域已知的方法从所述发酵液中回收副产物例如酸（包括乙酸盐和丁酸盐）。例如，可使用包括活性炭过滤器或电渗析的吸附系统。

[0083] 在本发明的一些实施方案中，通过以下步骤从所述发酵液中回收2,3丁二醇和副产物：连续从生物反应器中移出部分发酵液；从所述发酵液中分离微生物细胞（例如，方便地通过过滤）；以及从所述发酵液中回收2,3丁二醇和任选的其他醇和酸。例如通过蒸馏，可方便地回收醇，例如通过活性炭吸附可回收酸。优选地，将所述分离的微生物细胞返回至发酵生物反应器中。还优选地，将已移除醇和酸后的剩余的无细胞渗透液返回至发酵生物反应器中。在将所述无细胞渗透液返 回至生物反应器之前，可向其中加入额外的营养素（例如维生素B）以补充所述营养培养基。

[0084] 并且，如果在回收2,3丁二醇和/或副产物过程中调节了发酵液的pH，那么在返回至生物反应器中之前，应该将pH重新调至与发酵反应器中发酵液的pH相似的pH。 [0085] 在一些实施方案中，从发酵液或生物反应器连续回收2,3-丁二醇，并直接将其给料用于化学转化为丁烯、丁二烯和甲基乙基甲酮中的一种或多种。例如，可通过管道直接给料2,3-丁二醇至适于丁烯、丁二烯和甲基乙基甲酮中的一种或多种或其他下游化学产物化学合成的一个或多个容器。

[0086] 转化成化学产物

[0087] 许多已知的方法可用于由2,3丁二醇产生MEK。例如，可在多种催化剂（硫酸、Cu、ALO3、沸石等）作用下通过直接脱水2,3-丁二醇获得MEK：实例参见Emerson et al.(1982）。

[0088] 许多已知的方法可用于由2,3丁二醇产生丁烯。例如，以HBr处理所述二醇，然后以Zn粉处理，得到丁-2-烯。以高度的抗立体专一性进行的脱溴作用(House and Ro,1958;Gordon and Hay,1968)，其中内消旋异构体产生反式丁烯，（+）异构体产生顺式丁烯。

[0089] 许多已知的方法可用于由2,3丁二醇产生丁二烯。例如，在存在作为稀释剂和加热介质的过热蒸汽的情况下，丁烯可被催化脱氢产生1,3-丁二烯(Kearby,1955)。又例如，还可在二氧化钍催化剂的存在下通过2,3-丁二醇的直接脱水获得丁二烯，但是大多数其他脱氢催化剂产生甲基乙基甲酮作为主要产物(Winfield,1945)。

[0090] 丁二烯、丁烯和MEK可随后被用在产生具有商业用途的产物的多种方法中。 [0091] 例如，丁烯可用于生产汽油和丁二烯。又例如，丁烯可在C12石蜡（例如用作航空燃料的异石蜡）的生产中用作组分或前体(例如参见US7,338,541)。

[0092] MEK可溶解许多物质，并且例如在涉及树胶、树脂、乙酸纤维素和硝酸纤维素涂料以及乙烯薄膜的方法中可被用作溶剂。出于这个原 因，发现MEK可用于例如制造塑料、纺织品、石蜡和家用产品例如亮漆、清漆和脱漆剂、胶水以及用作清洗剂。MEK还可用作变性剂，用于变性醇。又例如，它还可作为可擦写染料的溶剂用于干擦记号笔。此外，MEK是甲基乙基甲酮过氧化物的前体，甲基乙基甲酮过氧化物是某些聚合反应中使用的催化剂。此外，可通过将MEK与催化剂例如钌碳接触将MKE转化为2-丁醇。

[0093] 丁二烯可用于例如生产合成橡胶和聚合物树脂。虽然聚丁二烯本身是一种非常柔软的、近乎液体的材料，但是从丁二烯与苯乙烯或丙烯腈的混合物制备的聚合物（例如ABS）是坚硬且有弹性的。苯乙烯-丁二烯橡胶是最常用于汽车轮胎生产的材料。丁二烯还可用于通过中间产物己二腈、其他合成橡胶材料例如氯丁二烯以及溶剂环丁砜来制造尼龙。此外，可通过二聚化反应将丁二烯用于4-乙烯基环己烯的工业生产，通过三聚化反应将丁二烯用于环十二碳三烯的工业生产。丁二烯还可用于环烷和环烯的合成，因为它通过Diels-Alder反应与碳-碳双键和三键反应。又例如,丁二烯可用于制造环烷、环烯、十二烷二酸（DDDA）、己二腈、己内酰胺、苯乙烯、亚乙基降冰片烯、十二碳内酰胺和1,5-环辛二烯（COD）。

[0094] 应理解，本发明的方法可与由丁烯、丁二烯和/或MEK产生下游产物的一种或多种方法整合或关联。例如，本发明的方法可直接或间接地将丁烯、丁二烯和/或MEK给料至化学过程或反应，足以用于转化或生产其他有用的化学产物。在一些实施方案中，如前文中提到的，直接通过中间体化合物丁烯、丁二烯和/或MEK将2,3丁二醇转化为一种或多种化学产物，而不需要先从所述方法中回收丁烯、丁二烯和/或MEK然后将其用于产生所述一种或多种化学产物。

[0095] 在具体的实施方案中，通过一种或多种化学方法将2,3-丁二醇转化为丁烯、丁二烯和/或MEK，进而通过一种或多种化学方法将所述丁烯、丁二烯和/或MEK转化为一种或多种化学产物。在具体的实施方案中，可在不回收所述丁烯、丁二烯和/或MEK的情况下产生所述一种或多种化学产物。在另一个实施方案中，通过丁烯、丁二烯和/MEK中间体化合物中的一种或多种在单独一个化学过程中将2,3-丁二醇转化为一种或多种化学产物。 [0096] 现在，将参照以下非限制性实施例详细地描述本发明。

[0097] 实施例

[0098] 实施例1：

[0099] 材料和方法：

[0100]

[0101] Cr（II）溶液的制备

[0102] 将1L三颈烧瓶装配气密性入口和出口以使得可在惰性气体下操作，并且使得随后可将所需产物转移至合适的储存烧瓶中。在所述烧瓶中加入CrCl3·6H2O(40g,0.15mol)、锌颗粒[20目](18.3g,0.28mol),汞(13.55g,1mL,0.0676mol)和500mL蒸馏水。在用氮气吹洗1小时后，将所述混合物升温至约80℃以起始反应。在恒定氮气流下搅拌2小时后，将所述混合物冷却至室温并继续再搅拌48小时，至此所述反应混合物已变成深蓝色溶液。将该溶液转移至氮气吹扫的血清瓶中并贮存于冰箱中备用。

[0103] 细菌

[0104] 在以下的实例中使用两种类型的产乙醇梭菌。DSM19630和DSM23693均保藏于德国生物材料资源中心(DSMZ)。

[0105] 取样和分析步骤

[0106] 在每次发酵过程中的多个间隔从所述CSTR反应器中取培养基样品。每次对培养基取样时，小心确保没有气体进入或逸出所述反应器。

[0107] HPLC:

[0108] HPLC System Agilent1100系列。流动相:0.0025N硫酸。流速和压力:0.800mL/min。柱:Alltech IOA；目录号9648，150×6.5mm,颗粒大小5μm。柱温:60℃。检测器:折射率。检测器温度:45℃。

[0109] 样品制备的方法：

[0110] 将400μL样品、50μL0.15M ZnSO4和50μL0.15M Ba(OH)2加入微量离心管中。将所述管在4℃下以12,000rpm离心10分钟。将200μL上清液转移至HPLC小瓶中，并将
5μL注射至所述HPLC仪器中。

[0111] 顶空分析（Headspace analysis）：

[0112] 在具有两个已安装的通道的Varian CP-4900micro GC上进行测量。通道1是在70℃和200kPa氩气下运行且回洗时间为4.2s的10m分子筛柱，而通道2是在90℃和150kPa氦气下运行且无回洗的10mPPQ柱。两个通道的注射器温度均为70℃。运行时间设定为120s，但所有目的峰通常在100s之前洗脱。

[0113] 细胞密度：

[0114] 通过对发酵液的确定等分试样中的细菌细胞计数来测定细胞密度。或者，在600nm（分光光度计）下测量所述样品的吸光度，并根据公开的方法通过计算确定干重。 [0115] A:CSTR中的分批发酵

[0116] 将约1500mL溶液A转移至1.5L发酵罐中，并且用氮气鼓泡。加入刃天青（1.5mL2g/L溶液）和H3PO4（85%溶液，2.25mL）并用浓NH4OH(aq)将pH调至5.3。加入氮川三乙酸（nitrilotriacetic acid）(0.3ml0.15M溶液)，然后加入1.5ml溶液C。随后加入NiCl2(0.75ml0.1M溶液)和Na2WO3(1.5mL0.01M溶液)。加入15ml溶液B，并将所得溶液用氮气鼓泡，然后换为70mL/分钟的含CO的气体(42% CO；36%N2,2%H2,20%CO2)。然后，以200ml产乙醇梭菌19630培养物接种所述发酵罐。将所述发酵罐维持在37℃并以300rpm搅拌。在该实验过程中，以约0.3ml/小时的速率加入Na2S溶液（0.2M溶液）。根据所述微生物培养物的需求增加底物供应。

[0117] 图1A中示出由所述细菌产生2,3丁二醇。

[0118] B:CSTR中的分批发酵

[0119] 将约1500mL溶液A转移至1.5L发酵罐中，并且用氮气鼓泡。加入刃天青（1.5mL2g/L溶液）和H3PO4（85%溶液，2.25mL）并用浓NH4OH(aq)将pH调至5.3。加入氮川三乙酸(0.3ml0.15M溶液)，然后加入1.5ml溶液C。加入Na2WO3(1.5mL0.01M溶液)。加入15ml溶液B，并将所得溶液用氮气鼓泡，然后换为60mL/分钟的含CO的气体(42%CO；
58%N2)。然后，以180ml产乙醇梭菌23693培养物接种所述发酵罐。将所述发酵罐维持在
37℃并以300rpm搅拌。在该实验过程中，以约0.12ml/小时的速率加入Na2S溶液（0.5M溶液）。根据所述微生物培养物的需求增加底物供应。

[0120] 图1B中示出由所述细菌产生2,3丁二醇。

[0121] 实施例2：

[0122] 材料和方法:

[0123] 细菌菌株和生长条件:

[0124] 产乙醇梭菌DSM10061和杨氏梭菌DSM13582获自DSMZ(Deutsche Sammlung von TMMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，拉氏梭菌ATCC-BAA622 获自ATCC(美国典型培养物保藏中心)。所有生物在改良PETC培养基（ATCC medium1754）中厌氧培养，其中拉氏梭菌在30℃培养、产乙醇梭菌和杨氏梭菌在37℃培养。

[0125] 所述改良PETC培养基(每L)包括1g NH4Cl、0.4g KCl、0.2gMgSO4·7H2O、0.8g NaCl、0.1g KH2PO4、20mg CaCl2·2H2O、10ml微量元素溶液(见下文)、10ml Wolfe’s维生素溶液(见下文)、2gNaHCO3和1mg刃天青。将pH值调节至5.6后，将所述培养基在煮 沸、厌氧条件下分液（dispense），并在121℃下高压灭菌15分钟。可将从新西兰格伦布鲁克（Glenbrook,NZ）的New Zealand steel site收集的钢铁厂废气（组成：44％CO，32％N2，22％CO2，2％H2）或0.5％（w/v）果糖（具有N2顶空）用作碳源。所述培养基的最终pH为
5.9，并且用浓度为0.008%(w/v)的半胱氨酸-HCL和Na2S来还原。

[0126] 所述微量元素溶液每升由以下成分组成：2g氮川三乙酸(加入其它成分前，用KOH调节pH至6)、1g MnSO4、0.8g Fe(SO4)2(NH4)2·6H2O、0.2g CoCl2·6H2O、0.2mg ZnSO4·7H2O、20mg CuCl2·2H2O、20mgNiCl2·6H2O、20mg Na2MoO4·2H2O、20mg Na2SeO4和20mg Na2WO4。 [0127] Wolfe’s维生素溶液(Wolin et al.1963)(每L)含有2mg生物素、2mg叶酸、10mg盐酸吡哆醇、5mg盐酸硫胺素、5mg核黄素、5mg烟酸、5mg D-(+)-泛酸钙、0.1mg维生素B12、
5mg对氨基苯甲酸和5mg硫辛酸。

[0128] 在血清瓶中分批发酵

[0129] 在具有丁基橡胶瓶塞的塑料涂层500ml-Schott GL45瓶中，以200kPa钢铁厂废气作为唯一能源和碳源，在体积为100ml的PETC培养基中进行生长实验。通过测量600nm下的光密度（OD600nm）监测生长，并通过HPLC分析代谢终产物。 [0130] 图2示出由上述多种细菌产生2,3丁二醇。

[0131] 实例3：

[0132] 材料和方法:

[0133] 细菌

[0134] 产 乙 醇 梭 菌 以 保 藏 号 DSM23693保 藏 在 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)。

[0135] 取样和分析步骤：

[0136] 在每次发酵过程中的多个间隔从所述CSTR反应器中取培养基样品。每次对培养基取样时，小心确保没有气体进入或逸出所述反应器。

[0137] HPLC:

[0138] HPLC System Agilent1100系列。流动相：0.0025N硫酸。流速 和压力:0.800mL/min。柱:Alltech IOA；目录号9648，150×6.5mm,颗粒大小5μm。柱温:60℃。检测器:折射率。检测器温度:45℃。

[0139] 样品制备的方法：

[0140] 将400μL样品、50μL0.15M ZnSO4和50μL0.15M Ba(OH)2加入微量离心管中。将所述管在4℃下以12,000rpm离心10分钟。将200μL上清液转移至HPLC小瓶，并将5μL注射至所述HPLC仪器中。

[0141] 顶空分析：

[0142] 在具有两个已安装的通道的Varian CP-4900micro GC上进行测量。通道1是在70℃和200kPa氩气下运行且回洗时间为4.2s的10m分子筛柱，而通道2是在90℃和150kPa氦气下运行且无回洗的10mPPQ柱。两个通道的注射器温度均为70℃。运行时间设定为120s，但所有目的峰通常在100s之前洗脱。

[0143] 细胞密度：

[0144] 通过对发酵液的确定等分试样中的细菌细胞计数来测定细胞密度。或者，在600nm（分光光度计）下测量所述样品的吸光度，并根据公开的方法通过计算确定干重。 [0145] 在500L中试装置外部环流反应器（Pilot Plant External loop reactor）中连续发酵

[0146] 除加入1.4L溶液A和7L溶液B以外，还加入约500L溶液C，并用N2脱气过夜。然后向发酵罐通入气体（42％CO，36％N2，2％H2，20％CO2）。以80L产乙醇梭菌DSM23693培养物接种所述发酵罐。将所述发酵罐维持在37℃下。在该实验过程中，以约1mL/min/kg/hr气流的速率加入Na2S溶液（0.2M）。根据微生物培养的需求，增加气流，然后增加泵的速度和压力。一旦培养物达到2g/L的细胞密度，转为以50L/hr的稀释速率为1.8(天-1)的连续给料培养基并且以0.33(天-1)的细菌稀释速率开始细胞再循环。该发酵罐显示以2:1的乙醇：2,3-丁二醇比例产生10g/L2,3丁二醇、20g/l乙醇和5g/l的生物质(图3)。 [0147] 2,3丁二醇的回收——ATPE+蒸馏

[0148] 浓缩1％的2,3丁二醇的第一阶段是通过连续的ATPE（双水相萃取）进行的。将3000L乙醇-气提发酵液分至6个IBC（中型散装容器），每个IBC含有500L（标记为IBC1-6）。
向每个500L溶液中，加入212Kg硫酸铵并通过大型机械泵进行环流（recirculation）来溶解。一旦所有6个IBC中均加入了盐内容物并溶解后，将660L异丙醇加入至IBC1，将其在IBC1中环流约10分钟并静置沉淀约30分钟。环流和静置沉淀后，将在IBC1中形成的上层相（含异丙醇+2,3丁二醇的溶剂相）泵出并直接引入至IBC2中。将所述溶剂相在IBC2中环流约10分钟并静置沉淀约30分钟。在IBC3、4、5和6中重复所述环流、沉淀和溶剂相转移。当所有6个IBC均以暴露于所述溶剂溶液后，将所得溶剂溶液泵入备用的IBC。 [0149] 然后，对所收集的溶剂溶液进行蒸馏，用于除去异丙醇（馏出物），留下100L萃余液（约17.5%的2,3丁二醇）。

[0150] 为了进一步纯化所述2,3丁二醇溶液，将所得产物再次进行ATPE。此次用约100L异丙醇和50kg硫酸铵以一次分批方法进行ATPE。将所得最终溶剂溶液中除去异丙醇，并得到39L42%的2,3-丁二醇溶液。

[0151] 浓缩2,3-丁二醇的第二阶段是通过脱水真空蒸馏进行的。将所述39L42％的2,3丁二醇溶液在完全真空和约80℃的温度下进行蒸馏。在该过程中，所述2,3丁二醇溶液中的水和乙酸内容物作为头馏分被移出。所述蒸馏过程的剩余产物（萃余液）是含有剩余发酵固体的2,3-丁二醇浓缩物。

[0152] 浓缩的最后阶段是2,3-丁二醇的蒸发。在完全真空和120℃下，将2,3-丁二醇从所述发酵固体中蒸发出来，得到澄清的2,3-丁二醇产物。该产物等同于15L浓度为98%的2,3-丁二醇溶液。

[0153] 澄清的2,3-丁二醇产物的HPLC采样如下：

[0154]样品 磷酸 乳酸 乙酸 23BDO 乙醇
2,3BDO 0 0 0 995.97g/L 0

[0155] 2,3丁二醇向其他化学物质的转化

[0156] 在流动反应器中,使2,3丁二醇（2,3-BDO）在300℃下与氧化铝接 触。观察到，100％的2,3-BDO被转化并产生30％的甲基乙基甲酮（MEK）。

[0157] 在流动反应器中,将从上述试验中得到的MEK与含有5重量%钌碳的催化剂接触。所有的MEK均被转化,并得到产率为98％的2-丁醇。

[0158] 通过在流动反应器中于300℃下与γ-氧化铝接触，将从上述实施例3回收的2,3-BOD的一部分转化为MEK，实现2,3-丁二醇的100％转化，产率为约30％。所产生的其他产物包括MEK的二聚体、三聚体、四聚体。

[0159] 本文已参照某些优选实施方案描述了本发明，以便使读者能够实施本发明而无需过度实验。本领域技术人员应理解，除了具体描述的那些实施方案之外，可以容易地对本发明进行变化和改进。应理解，本发明包括所有这类变化和改进。另外，提供标题、题目等用于增强读者对本文的理解，而不应解释为限制本发明的范围。

[0160] 如果有的话，上文和下文中所引用的所有申请、专利和出版物的全部公开内容都以引用的方式纳入本文。