使用高甘油浓度的用于产生1,3-丙二醇的微生物 |
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| 申请号 | CN201180064621.0 | 申请日 | 2011-11-10 | 公开(公告)号 | CN103298945A | 公开(公告)日 | 2013-09-11 |
| 申请人 | 代谢探索者公司; | 发明人 | R.菲格; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及用于生产1,3-丙二醇(POD)的丙 酮 丁醇梭菌群体，其中所述群体包含丙酮丁醇梭菌菌种的至少一种菌株，其包含选自在表1中鉴定出的突变的突变，其中在特定的基因中选择所述突变的相对百分比。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于产生1,3-丙二醇(PDO)的丙酮丁醇梭菌群体，其中所述群体包含丙酮丁醇梭菌菌种的至少一种菌株，其包含选自在表1中鉴定出的突变的突变，其中所述突变以如下的相对百分比存在于下述基因家族中： |
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| 说明书全文 | 使用高甘油浓度的用于产生1,3-丙二醇的微生物[0001] 本发明涉及用于产生1,3-丙二醇的新的经过修饰的微生物。该微生物经过适应可以在具有高甘油含量，尤其是高浓度工业甘油的培养基中生长和产生1,3-丙二醇。本发明还涉及所述经过适应的微生物的培养条件和产生1,3-丙二醇的过程。最后，本发明涉及所述微生物产生的1,3-丙二醇和其的用途。 [0002] 发明背景 [0003] 1,3-丙二醇(1,3-propanediol)(PDO)，也称为丙撑二醇(trimethylene glycol)或丙二醇(propylene glycol)，是已知最早的发酵产物之一。其早在1881年由August Freund在含有巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)的甘油发酵培养物中鉴定。PDO是甘油发酵的典型产物，并且也在其它有机底物的厌氧转化(anaerobic conversions)中发现。只有几种生物可以形成1,3-丙二醇，其都是细菌。它们包括了克雷伯氏菌属(Klebsiella)(肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae))、肠杆菌属(Enterobacter)(成团肠杆菌(E.agglomerans))和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)(弗氏柠檬酸杆菌(C.freunddi))的肠细菌，乳杆菌属(Lactobacilli)(短乳杆菌(L.brevis)和布赫纳氏乳杆菌(L.buchneri))和丁酸梭菌(C.butyricum)和巴氏梭菌(C.pasteurianum)组的梭菌属(Clostridia)。 [0004] 作为双功能的有机化合物，PDO可以潜在地用于许多合成反应，尤其是作为产生聚酯、聚醚、聚氨酯以及尤其是聚对苯二甲酸丙二醇酯(polytrimethylene terephtalate，PTT)的缩聚作用的单体。这些结构和反应性的特征使其在化妆品、纺织品(衣物纤维或地板材料)或塑料(汽车工业和包装或涂料)中有多种应用。 [0005] PDO可以由不同的化学途径产生，但是它们会产生含有极度污染性物质的废水并且生产的成本较高。因此，化学产生的PDO无法与石油化学可得的二醇，例如1,2-乙二醇、1,2-丙二醇和1,4-丁二醇竞争。为提高这样的竞争力，在1995年DuPont开始了将葡萄糖生物学转化为PDO的研究项目。虽然该过程是环保的，其还是有缺点：i)其使用非常昂贵的辅因子维生素B12，ii)由于生产菌株的不稳定性其是不连续的过程。 [0007] 领域内已知可以从甘油产生PDO，所述甘油是生物柴油生产的不必要的副产物，其含有与盐和水混合的大约80%-85%的甘油。 [0008] 之前描述了丁酸梭菌可以在分批和两步连续发酵(batch and two-stage continuous fermentation)中在工业甘油中生长并从中产生PDO(Papanikolaou-1等,2000)。然而，在最高甘油浓度下，在稀释率0.02h 获得的最高PDO效价(titer)是-1 -1 -1 -1 48.1g.L ，即生产力为0.9g.L .h 。培养的补料培养基中最大甘油浓度是90g.L ，并且含有酵母抽提物，其是一种昂贵的含有有机氮的混合物，领域内已知其可以帮助提高细菌生物质的产生。 [0009] 申请文件WO2006/128381公开了使用这种甘油以分批和补料分批(batch and fed-batch)培养的方式，以例如如肺炎克雷伯氏菌、丁酸梭菌或巴氏梭菌的天然的产生PDO的生物体产生PDO。进一步的，WO2006/128381中使用的培养基也含有酵母抽提物。如-1 -1该专利申请文件描述的，其达到的最高生产力是在0.8和1.1g.l .h 之间。 [0010] 在Gonzalez-Pajuelo等,2005中已经描述了含有维生素B12-非依赖性甘油-脱水酶以及来自丁酸梭菌的PDO-脱氢酶的经过修饰的丙酮丁醇梭菌菌株，叫做“丙酮丁醇梭-1菌DG1pSPD5”。该菌株在含有高达120g.l 纯甘油的补料培养基中生长和产生PDO。另外，-1 在含有最高60g.l 的纯的或者工业甘油的补料培养基中的分析指出并无分别。这些结果-1 是在存在酵母抽提物的条件下获得的。另外，其没有进行有浓度高于60g.l 的工业甘油的测试。当比较野生型丁酸梭菌与经过修饰的微生物“丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5”时，可以观察到总体相似的行为(globally similar behaviour was observed)。 [0011] 在专利申请PCT/EP2010/056078中发明人描述了如在Gonzalez-Pajuelo等(2005)中描述的使适应高浓度工业甘油和无酵母抽提物条件的方法，使丙酮丁醇梭菌-1DG1pSPD5适应的过程。生成的菌株可以在含有高达120g.l 工业甘油的培养基中产生PDO，-1 -1 -1 其效价多至53.5g.L 并且生产力多至2.86g.L .h 。 [0012] 在本发明中，发明人凸显了用于生成PDO的适应的微生物的主要的遗传修饰，例如在存在高浓度工业甘油的条件下适应之后获得的。 [0013] 发明概述 [0014] 本发明涉及一种用于产生1,3-丙二醇(PDO)的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)群体，其中所述群体包含丙酮丁醇梭菌菌种的至少一种菌株，其包含选自在表1中鉴定出的突变的突变，其中所述突变以如下的相对百分比存在于下述基因家族中： [0015] [0016] 特别地，本发明的群体包含选自下组的至少一种丙酮丁醇梭菌菌株： [0017] -菌株DG1pSPD5PD0001VE05c01，以保藏号I-4378保藏于CNCM； [0018] -菌株DG1pSPD5PD0001VE05c05，以保藏号I-4379保藏于CNCM； [0019] -菌株DG1pSPD5PD0001VE05c07，以保藏号I-4380保藏于CNCM。 [0020] CNCM的意思是“法国微生物培养物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)”，其在巴黎的巴斯德研究所(Pasteur Institute)。 [0021] 在本发明的特别的实施方案中，所述群体含有进一步突变了以下点突变中的至少一种的上面的菌株： [0023] -将丙酮丁醇梭菌基因组中位于基因座CA_C1300位置1444099处的G替换为A，所述基因座编码RNA聚合酶sigma因子RPOD(转录和翻译调控) [0024] -将丙酮丁醇梭菌基因组中位于基因座CA_C2670位置2787387处的C替换为T，所述基因座编码Glu-tRNAGln酰胺转移酶亚基A(转录和翻译调控) [0025] -将丙酮丁醇梭菌基因组中位于基因座CA_C3339位置3512658处的C替换为T，所述基因座编码ABC转运蛋白中的ATP酶组分(两个ATP酶域) [0026] -将丙酮丁醇梭菌基因组中位于基因座CA_C1610位置1752341处的C替换为T，所述基因座编码支链的氨基酸通透酶(转运蛋白)。 [0027] 本发明还涉及产生1,3-丙二醇的方法，其包括在含有甘油作为唯一的碳源的培养基中培养根据本发明的用于产生1,3-丙二醇(PDO)的丙酮丁醇梭菌群体，并从培养基中回收1,3-丙二醇。 [0028] 发明详述 [0029] 用于产生1,3-丙二醇(PDO)的丙酮丁醇梭菌群体 [0030] 用于产生1,3-丙二醇(PDO)的丙酮丁醇梭菌群体是指用于从作为唯一碳源的甘油中产生1,3-丙二醇的一种或多种经过遗传学修饰的丙酮丁醇梭菌。这样的菌株是领域内已知，并特别的在申请WO200104324和WO2008052595中公开的。本发明的群体可以是几种菌株的组合，其主要部分包含根据本发明的突变，以及单个菌株，特别是分别以保藏号I-4378、I-4379、I-4380保藏在CNCM的菌株DG1pSPD5PD0001VE05c01、DG1pSPD5PD0001VE05c05或DG1pSPD5PD0001VE05c07，或者菌株DG1pSPD5PD0001VE05c08。 [0031] 突变是在菌株基因组中的核苷酸改变，更加特别的是与母菌株DG1pSPD5PD0001VT比较时鉴定出的SNPs(“单核苷酸多态性”)。所述的菌株在WO200104324中公开，并且是由基因组已公布的菌株ATCC824( 等,2001)衍生而来的。 [0032] 突变可以出现在编码序列或非编发序列中。这些突变可以是同义的(synonymous)，其没有修饰对应的氨基酸；或是非同义的，其改变了对应的氨基酸。同义突变对翻译的蛋白质的功能没有影响，但是如果突变的序列位于调控因子的结合位点中，则可以对相应的基因或甚至其它基因的调控有影响。非同义突变既可以影响翻译的蛋白的功能，也可以取决突变序列的性质而影响调控。 [0033] 用于产生1,3-丙二醇的丙酮丁醇梭菌群体可以优选的包含所述保藏的菌株，其包含至少一种以下的修饰作为额外的修饰： [0034] -将丙酮丁醇梭菌基因组中位于基因座CA_C0175位置198989处的C替换为T，其编码预测的糖磷酸异构酶，其为真核生物的葡糖激酶调控因子(碳水化合物代谢)的同源物 [0035] -将丙酮丁醇梭菌基因组中位于基因座CA_C1300位置1444099处的G替换为A，其编码RNA聚合酶sigma因子RPOD(转录和翻译调控) [0036] -将丙酮丁醇梭菌基因组中位于基因座CA_C2670位置2787387处的C替换为T，其编码Glu-tRNAGln酰胺转移酶亚基A(转录和翻译调控) [0037] -将丙酮丁醇梭菌基因组中位于基因座CA_C3339位置3512658处的C替换为T，其编码ABC转运蛋白中的ATP酶组分(两个ATP酶域) [0038] -将丙酮丁醇梭菌基因组中位于基因座CA_C1610位置1752341处的C替换为T，其编码支链的氨基酸通透酶(转运蛋白)。 [0039] 其可优选包含这些突变的任意组合，包含1、2、3、4或5种所述突变。 [0040] 本发明的菌株的群体可以在包含高达120g.L-1的甘油，并且特别是工业甘油的培养基中生长。 [0041] 本发明的群体的菌株可以通过在梭菌属中诱发突变和/或基因置换的标准技术获得，如在申请WO2008040387中所公开的，将其内容通过提述并入本文。 [0042] 本领域技术人员可以从申请WO200104324和WO2008052595中公开的菌株开始，也可以使用分别以保藏号I-4378、I-4379、I-4380保藏在CNCM的菌株c01、c05或c07中的一种开始，并引入额外的突变。 [0043] 在优选的实施方案中，本发明的群体包含菌株DG1pSPD5PD0001VE05c08，将其的突变在表1中鉴定。本领域技术人员知晓如何将所述突变引入梭菌属菌株中以从分别以保藏号I-4378、I-4379、I-4380保藏在CNCM的菌株DG1pSPD5PD0001VE05c01、DG1pSPD5PD0001VE05c05或DG1pSPD5PD0001VE05c07中的一种开始，使用标准基因置换和重组技术生成与菌株DG1pSPD5PD0001VE05c08相似的菌株。 [0044] 包含甘油的培养基 [0045] “合适的培养基”或“培养基”是指为梭菌属菌株或群体的生长和二醇-产生而优化的培养基。发酵过程通常是在反应器中以适应梭菌属菌种使用，具有已知限定组分并含有甘油的合成的，特别是无机的培养基进行。 [0046] 术语“合成培养基”的意思是包含化学限定的组分的培养基，生物在其上生长。在本发明的培养基中，甘油有利地为单一的碳源。 [0047] 术语“甘油(glycerine)”和“丙三醇(glycerol)”是同义词，并且在本发明中可交替地使用以指代相同的分子。 [0048] 在特定的实施方案中，将甘油加入培养基中，所述甘油的形式是包含至少50%甘油，最优的包含至少85%的甘油的甘油组合物。 [0049] 有利地，本发明中培养基使用的甘油是工业甘油。“工业甘油”的意思是从工业过程中获得，未经过充分纯化的甘油产物。工业甘油也可以指代为“生甘油(raw glycerine)”。工业甘油包含多于70%的甘油，优选地包含多于85%的甘油，其包含水和杂质如矿物盐和脂肪酸。工业甘油中甘油的最大含量通常是90%，更加通常是大约85%。 [0051] 在特别的实施方案中，所述工业甘油是来自生物柴油生产的副产物，并且包含已知的从生物柴油生产中获得甘油的已知杂质，其包含大约80%到85%的甘油并带有盐、水和一些其它有机化合物例如脂肪酸。从生物柴油生产中获得的工业甘油并未受到进一步的纯化步骤。 [0052] 优选地，所述培养基包含高浓度的甘油。 [0053] 术语“高甘油含量”或“高甘油浓度”的意思是在培养基中多于90g.L-1的甘油。在-1优选的实施方案中，所述浓度为90-200g.L 的甘油，更特别为90-140g/L的甘油，优选为大-1 约120g.L 的甘油。 [0054] 优选地，所述培养基是没有额外添加有机氮的合成培养基。 [0055] 这样的培养基是在领域内公开的，特别是在2010年5月5日提交的PCT/EP2010/056078和2010年10月5日提交的PCT/EP2010/064825，将其内容通过提述并入本文中。 [0056] 培养微生物 [0057] 在本发明的方法中，有利地在分批、补料分批或连续过程中完成生产。在工业规模上培养微生物以生产1,3-丙二醇是领域内知晓的，特别是在2010年5月5日提交的PCT/EP2010/056078和2010年10月5日提交的PCT/EP2010/064825中公开，将其内容通过提述并入本文中。 [0058] 1,3-丙二醇回收 [0059] 从发酵培养基中回收和最终纯化1,3-丙二醇的方法是领域内技术人员所知晓的。可以通过蒸馏分离1,3-丙二醇。在多数实施方案中，1,3-丙二醇是与副产物，例如醋酸酯(acetate)，一起从发酵培养基中蒸馏出来，并进一步用已知的方法纯化的。 [0060] 特别的纯化方法在申请WO2009/068110和WO2010/037843中公开，将其内容通过提述并入本文。 [0063] 实施例1：从经过进化的群体中分离克隆 [0064] 从群体菌株丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5 PD0001VE05的生长的烧瓶培养物中开始，在琼胶平板上进行克隆分离。烧瓶培养物中使用的合成培养基中每升去离子水 含 有：甘 油,30g；KH2PO4,0.5g；K2HPO4,0.5g；MgSO4,7H2O,0.2g；CoCl26H2O,0.01g；醋酸,99.8%,2.2ml；NH4Cl,1.65g；MOPS,23.03g,生物素,0.16mg；对-氨基苯甲酸,32mg；FeSO4,7H2O,0.028g；刃天青(resazurin),1mg以及半胱氨酸,0.5g。以NH4OH6N将培养基的pH值调节到6.5。 [0065] 使用了不同的培养基在琼脂平板上进行分离：具有商业甘油或者生甘油的合成琼脂培养基(与上面描述的相同)；以及CGM(Clostridial生长培养基)，其中每升去离子水含有：商业或生甘油30g；酵母抽提物,5g；KH2PO4,0.75；K2HPO4,0.75g；MgSO4,7H2O,0.4g；天冬酰胺,2g；(NH4)2SO4,2g；NaCl,1g；MnSO4,H2O,10mg；FeSO4,7H2O,10mg；MOPS,23.03g；刃天青,1mg以及半胱氨酸,15g。以NH4OH3N将培养基的pH值调节到6.6。 [0066] 将来自烧瓶培养物(表2)中的细胞以四种不同的方式铺板： [0067] -在含有商业甘油的合成培养基的琼脂平板上； [0068] -在含有生甘油的合成培养基的琼脂平板上； [0069] -在含有商业甘油的丰富培养基的琼脂平板上； [0070] -在含有生甘油的丰富培养基的琼脂平板上。 [0071] 在琼胶平板上三轮相继的次代培养后，认为分离的克隆是纯的。接下来将纯克隆转移到含有商业或生甘油(表2)的液体丰富培养基中。然后将液体培养物在20%甘油中储备在-80℃中直至进一步表征。 [0072] 然后用以下的方式表征克隆： [0073] -在储备后测量存活率：评估细胞在合成培养基上的生长速度； [0074] -评估生长和新陈代谢：在培养过程中测量OD620nm，以及PDO/甘油在合成培养基上的产率； [0075] -遗传分析：PCR分析以确认该菌株的基因型； [0076] -恒化器培养以比较分离的克隆与的性能与群体的性能(实施例2)； [0077] -提取gDNA以序列分析克隆(实施例3)。 [0078] 表2：用于从群体中分离4个克隆的合成琼脂培养基与液体培养基 [0079] [0080] 实施例2：克隆C08在含有高浓度生甘油的恒化器培养中的性能 [0081] 细菌菌株： [0082] 丙酮丁醇梭菌菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05的分离的克隆(将菌株1/从pSOL1中消除(cured from pSOL1)，2/用携带dhaB1,dhaB2和dhaT基因，即1,3-丙二醇操纵子的质粒pSPD5转化，并且3/在高浓度的生甘油上进化)。分离规程在实施例1中描述。 [0083] 培养基： [0084] 用于梭菌属分批培养的合成培养基每升去离子水中含有：甘油,30g；KH2PO4,0.5g；K2HPO4,0.5g；MgSO4,7H2O,0.2g；CoCl26H2O,0.01g；H2SO4,0.1ml；NH4Cl,1.5g； 生物素,0.16mg；对-氨基苯甲酸,32mg和FeSO4,7H2O,0.028g。将该培养基的pH以NH4OH3N调节至6.3。使用购买自Sigma的商业甘油(纯度99.5%)分批培养。用于连续培养的补料培养基每升自来水(tap water)中含有：生甘油,105g；KH2PO4,0.5g；K2HPO4,0.5g； MgSO4,7H2O,0.2g；CoCl26H2O,0.026g；NH4Cl,1.5g；生物素,0.16mg；对-氨基苯甲酸,32mg； FeSO4,7H2O,0.04g； 消 泡 剂 (anti-foam),0.05ml；ZnSO4,7H2O,8mg；CuCl2,2H2O,4mg； MnSO4,H2O,40mg；H3BO3,2mg；Na2MoO4,2H2O,0.8mg。在该情况下不调节培养基pH值。来自生物柴油的酯交换过程的生甘油是由Novance(Venette,法国)提供的，并具有以下纯度：甘油84.8%(w/w)。 [0085] 实验设置： [0086] 在5L的，具有2000mL的工作容积的生物反应器Tryton(Pierre Guerin，法国)中进行连续培养。通过自动调节培养物水平将培养物容积保持在恒定的2000mL。以200RPM搅拌培养物，将温度设置为35℃并通过自动加入NH4OH5.5N将pH保持在恒定的6.5。在整个培养过程中控制POR测量(mV)。为创造缺氧条件，在60℃下向容器中的灭菌培养基中冲入灭菌无O2的氮气一小时并再次冲入直至达到35℃(在2小时过程中冲入)。以连苯三酚装置(pyrogallol arrangement)(Vasconcelos等,1994)保护生物反应器的气体出口使不受氧气。在灭菌后，对补料培养基也以灭菌无O2的氮气冲入直至达到室温并且维持在200mbar的氮气下以避免O2进入。 [0087] 分批和连续培养过程： [0088] 用于评估的过程已在专利申请PCT/EP2010/056078中描述(实施例2)。 [0089] 用在100mL烧瓶中的合成培养基(与上面描述的分批培养物使用的相同但是加入-1 -1了额外的醋酸，2.2g.L 和MOPS，23.03g.L )上生长的培养物作为接种物(5%v/v)，所述接种物是在指数生长期的末尾取出的。 [0090] 首先分批式的使培养物生长。在早期指数生长期我们进行了一次商业甘油的脉-1冲：对于该脉冲，将含有105g.L 生甘油的合成培养基(与分批培养的描述相同)以恒定-1 流速在.小时中加入(即加入18g.L 的甘油)。接下来以分批式使生长继续，在指数生长-1 -1 期结束之前开始连续补料，其稀释率为0.025h ：补料培养基含有105g.L 的生甘油。在生-1 物反应器接种后8-10天，并且在3个停留时间后通过不同的阶段将稀释率从0.025h 提高-1 -1 -1 到0.060h ：在48小时中提高0.01h 单位-24小时无改变-在48小时中提高0.01h 单-1 位-24小时无改变-在48小时中提高0.015h 单位。在此之后，先稳定培养物，再用下面描述的HPLC规程测定1,3-丙二醇产生和甘油的消耗。特别地，我们等待直至残余的甘油的浓度尽可能小。 [0091] C8克隆的总体性能呈示在表3中，并与在相同条件下的群体的性能以及如Gonzalez-Pajuelo等(2005)中描述的菌株DG1pSPD5PD0001VT的性能进行对比。 [0092] 分析步骤： [0093] 以测量浊度的方法在620nm测量细胞浓度，并与直接测定的细胞干重相关联。以HPLC分析测定甘油、1,3-丙二醇、乙醇、丁醇、醋酸和丁酸的浓度。在Biorad Aminex HPX-87H柱上进行分离并利用折射率完成检测。运行条件如下：流动相硫酸0.5mM；流速 0.5ml/min；温度25℃。 [0094] 表3：丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5群体PD0001VE05(来自4个恒化器的平均数据)的-1 -1性能和c08PD0001VE05c08的性能。补料培养基含有105g.L 的生甘油，稀释率是0.060h-1 -1 和0.025h 。数值对应于在稀释率为0.060h 在3个停留时间后分析的样品的平均值。 [0095] [0096] Y1,3-PDO：PDO产率(g/g消耗的甘油) [0097] Q1,3PDO：PDO容积的生产力 [0098] NI：无信息(no information)。PD0001VT菌株不能在缺乏酵母萃取物的培养基中生长。 [0099] 这些结果显示了经过适应的丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5群体可以在更高浓度的工业甘油中生长，因此与没有经过适应，不能在缺乏酵母萃取物的培养基中生长的来自Gonzalez-Pajuelo等(2005)的丙酮丁醇梭菌DG1pSPD5PD0001VT相比，在工业甘油上显示了PDO的更好的效价和生产力。 [0100] 实施例3： [0101] 提取基因组DNA [0102] 使用Qiagen基因组试剂盒500G(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)提取来自菌株PD0001VT、PD0001VE05、PD0001VE05c01、PD0001VE05c05、PD0001VE05c07和PD0001VE05c08的基因组DNA。简言之，将细胞分别在青霉素管(70mL)中缺氧生长在丰富甘油培养基或合成甘油培养基中(如实施例1和2中描述的)到晚指数期(A6201.5到2.0)。在细胞裂解中保持严格的缺氧条件。收集细胞并以SET缓冲溶液(25%蔗糖、0.05M Tris-HCl、0.05M EDTA)洗涤两次。将细胞沉淀悬浮在含有44μL RNA酶、30mg/mL溶菌酶以及100μg/mL蛋白酶K的11mL B1试剂盒缓冲液中。使混合物在37℃温育45min，离心并根据Qiagen DNA纯化试剂盒的说明书将上清用于提取DNA。接下来将DNA悬浮在50μL的10mM Tris-HCl(pH8.0)中。 [0103] 测序分析 [0104] 使用Roche GS FLX技术对天然的DG1pSPD5PD0001VT菌株和进化的群体DG1pSPD5PD0001VE05的基因组DNA进行测序。测序工程是在Eurofins Genomics MWG/Operon(ZA de Courtabeauf-9Avenue de la Laponie,91978Les Ulis Cedex)进行的，其对于每个菌株都带有1个Long-Tag配对末端文库(Long-Tag paired end libraries)(8Kb)，以GS FLX Titanium Series化学用半运行(half run)(最大600000读取，最大180000-300000真实配对末端读取)生成重叠群的支架(scaffolding)和序列。 [0105] 将来自进化的群体的分离的克隆测序，测序使用由NimbleGen(Roche NimbleGen Inc.500S.Rosa Rd.Madison WI53719)开发的比较基因组测序(comparative genomic sequencing)(CGS)方法。CGS分析是在两个阶段中进行的：在阶段1中，将基因组差异区域以天然菌株和进化的菌株的DNA的比较杂交鉴定。在阶段2中，只将鉴定的基因组差异区域测序，由此产生一组完整表征的单核苷酸多态性(SNPs)。 [0106] SNP分析 [0107] 将进化的群体的生物信息学和SNP分析以Eurofins Genomics MWG/Operon进行。对于该分析，使用软件gsMapper(Roche454,V2.3)将两个菌株的读取组个别地作图到(mapped to)Genbank参考序列(丙酮丁醇梭菌ATCC824http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AE001437)。将三个SNP文件递交对比DG1pSPD5PD0001VT和ATCC824，DG1pSPD5PD0001VE05和ATCC824以及DG1pSPD5PD0001VT和DG1pSPD5PD0001VE05。将天然和进化的菌株之间独特的SNPs呈现在下面。将低覆盖(<25)和低变体频率(<85%)除去以生成160个独特的SNPs，根据用于家族组注解的KEGG数据库所述SNPs分布在17个家族中。 [0108] 将分离的克隆的SNPs分析以NimbleGen(Roche)进行。将SNP文件递交使用 Genbank参考 序 列(丙 酮丁 醇 梭菌 ATCC824http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AE001437) 比 较 天 然 DG1pSPD5PD0001VT 和 DG1pSPD5PD0001VE05c01、DG1pSPD5PD0001VE05c05、DG1pSPD5PD0001VE05c07或DG1pSPD5PD0001VE05c08。 [0109] 将生成的序列呈现在表1中，其含有以下信息： [0110] [0111] [0112] [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] [0122] 参考文献 [0123] 1.González-Pajuelo M,Meynial-Salles I,Mendes F,Andrade JC,Vasconcelos I 和 Soucaille P.2005.Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the industrial production of1,3-propanediol from glycerol.Metabolic Engineering7:329-336。 [0124] 2.González-Pajuelo M,Meynial-Salles I,Mendes F,Soucaille P. 和Vasconcelos I.2006.Microbial conversion of a natural producer,Clostridium butyricum VPI3266,and an engineered strain,Clostridium acetobutylicum DG(pSPD5).Applied and Environmental Microbiology,72:96-101。 [0125] 3. ,Breton G,Omelchenko MV,Makarova KS,Zeng Q,GibsonR,Lee HM,Dubois J,Qiu D,Hitti J,Wolf YI,Tatusov RL,Sabathe F,Doucette-Stamm L,Soucaille P,Daly MJ,Bennett GN,Koonin EV,Smith DR.2001.Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacterium Clostridium acetobutylicum.Journal of bacteriology183(16):4823-4838。 [0126] 4.Papanikolaou S,Ruiz-Sanchez P,Pariset B,Blanchard F和Fick M.2000.High production of 1,3-propanediol from industrial glycerol by a newly isolated Clostridium butyricum strain.Journal of Biotechnology.77:191-208。 [0127] 5.Vasconcelos I,Girbal L,Soucaille P.1994.Regulation of carbon and electron flow in Clostridium acetobutylicum grown in chemostat culture at neutral pH on mixtures of glucose and glycerol.Journal of bacteriology.176(5):1443-1450。 [0128] 359692 [0129] PCT [0130] *RO/EP 打印文本(原始为电子形式) [0132] [0133] [0134] 只用于受理局 [0135] [0136] 只用于国际局 [0137] |
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