[0001] 本发明涉及一种N-BOC-L-高丝氨酸内酯的合成方法，特别涉及利用嗜烟碱节杆菌WYG001(CCTCC M 2014054)催化外消旋BOC-DL-高丝氨酸内酯，立体选择性水解反应合成光学纯N-BOC-L-高丝氨酸内酯，再将N-BOC-L-高丝氨酸内酯合成L-硒代蛋氨酸的方法。(二)背景技术

[0002] L-硒代蛋氨酸，英文名为：L-(+)-Selenomethionine，是一种重要的动物食品添加剂氨基酸，也是制备其它含硒药物的一种重要的中间体。其主要功能有：可以增强动物的精子活力；增加机体抗氧化能力，提高免疫力；具有防癌抗癌的作用；还能帮助机体排出体内毒素(如重金属)等。

[0003] 光学纯形式的高丝氨酸内酯是重要的手性中间体，广泛用于医药和食品添加剂等领域。本发明采用微生物酶法催化拆分制得一种手性中间体N-BOC-L-高丝氨酸内酯，并以其为底物成功合成了L-硒代蛋氨酸。

[0004] 由于高丝氨酸内酯的氨基比较活泼，其在不同的pH反应液中存在形式不同，给产物的提取带来不便，因此需要选择氨基保护基团对其进行保护。通过催化氨基保护的DL-高丝氨酸内酯选择性水解，实现消旋体中一个构型得以催化水解开环成酸，另一个构型不变，进而根据物理性质的不同，将高丝氨酸内酯的两种构型分开，最后得到光学纯的L-高丝氨酸内酯。

[0005] 目前，文献报道的合成N-BOC-L-高丝氨酸内酯主要通过L-高丝氨酸及其内酯氢溴酸盐或盐酸盐为底物，BOC氨基保护获得。其中L-高丝氨酸及其内酯盐的合成方法主要由相应构型的L-型天冬氨酸(韩冲,蒋立建,翟力海等.氨基酸和生物资源.2008,30(2):33-35)和L-型蛋氨酸(Troels Koch,Ole Buchardt,1993,1065-1067；Min-Can Wang,et al.Organic Chemistry.2008,73(1):168-176；腾汉兵.精细化工中间体.2008,38(3):20-21)为原料合成。其它的化学合成法还有以N-Boc保护的呋喃亚胺与α-叠氮乙酸乙酯不对称合成光学纯的高丝氨酸内酯。(Kumaraswamy G,et al.Tetrahedron Letters.2010,51(50):6500-6502)。化学合成工艺途径存在着收率低、成本高、步骤繁多、设备要求高、产物光学纯度较低、环境污染严重等问题。

[0006] 2011年，Mallam Venkataiah等(M Venkataiah,G Reddipalli,L Swarnalatha Jasti et al.Chemo-enzymatic synthesis of the azasugars1,4-dideoxyallonojirimycin and 1,4-dideoxymannojirimycin[J].Tetrahedron Asymmetry.2011,22:1855-1860)先将外消旋的苯乙酰化的α-氨基-γ-丁内酯，用10％液氨碱化调节pH成碱性，从而使内酯开环；然后用Immobilized Pen Gacylase水解得到开环的(R)型高丝氨酸和(S)-型的高丝氨酸的苯乙酰化的衍生物；最后在甲醇溶液中通过HCl酸化得到(S)构型的，N-苯乙酰-L-高丝氨酸内酯的e.e.＞99％，收率为47％(没有转化率)。

[0007] 2007 年，Kazuya Mochizuki,Kentaro Miyazaki 等 (Kazuya M,Kentaro M.Microbial resolution of DL-homoserine for the production of D-homoserine using a novel isolate,Arthrobacter nicotinovorans strain 2-3[J].Enzyme and Microbial Technology.2007,41:318-321)先将外消旋的高丝氨酸内酯内酯氢溴酸盐开环得到高丝氨酸，然后以外消旋的高丝氨酸为唯一碳源，从土壤中筛选出能够选择性的水解掉L构型，而得到D构型的高丝氨酸的菌株。筛选出来的微生物菌株Arthrobacter nicotinovorans Strain在磷酸盐溶液中立体选择性的催化外消旋的高丝氨酸，得到光学纯的对映体的e.e.S>99.9％，D构型产率为25％，而L-构型的高丝氨酸收率约为4％，且转化时间为48h，反应时间过长，不易于工业化生产。

[0008] 相比之下，本发明所报道的生物法具有立体选择性高、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化的优点。(三)发明内容

[0009] 本发明目的是提供一种N-BOC-L-高丝氨酸内酯的合成方法，该方法利用嗜烟碱节杆菌WYG001(CCTCC NO:M 2014054)催化外消旋N-BOC-DL-高丝氨酸内酯，立体选择性水解反应合成光学纯N-BOC-L-高丝氨酸内酯，再将N-BOC-L-高丝氨酸内酯合成L-硒代蛋氨酸，本发明方法具有立体选择性高、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化的优点。

[0010] 本发明采用的技术方案是：

[0011] 本发明提供一株新菌株--嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014054，保藏日期2014年2月28日，地址为中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

[0012] 本发明还提供一种嗜烟碱节杆菌WYG001在制备N-BOC-L-高丝氨酸内酯中的应用，所述的应用为：以嗜烟碱节杆菌WYG001经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体冷冻干燥后的干菌体为催化剂，以N-BOC-DL-高丝氨酸内酯为底物，以0.1M、pH7.0磷酸缓冲液为反应介质，在20～50℃、200rpm条件下进行转化反应(优选反应1-30h)，反应结束后，将反应液分离纯化，获得N-BOC-L-高丝氨酸内酯。

[0013] 本发明所述催化剂的制备方法为：(1)斜面培养：将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；每升斜面培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)组成：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH 7.0-7.2，加水至1000mL；121℃灭菌20min。

[0014] (2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液；种子培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH 7.0；

[0015] (3)发酵培养：在无菌条件下，以体积浓度6-8％的接种量将种子液接种于产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液，培养结束后将发酵液12000rpm离心10min，弃上清液，得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体；产酶培养基组成为：乳糖5-15g/L，酵母膏10-14g/L，NaCl 10g/L，MgSO40.22g/L、KH2PO40.136g/L，溶剂为水，pH 7.0；

[0016] (4)取步骤(3)湿菌体以1.2g/ml的量加入pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，-80℃条件下冷冻干燥，得到干菌体。

[0017] 进一步，所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为3～150g/L，优选10～100g/L，最优选10～50g/L，所述干菌体的用量以缓冲液体积计为1～50g/L，优选5～30g/L，所述底物初始浓度为1～100g/L，优选5-50g/L。

[0018] 本发明所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱除溶剂，得到N-BOC-L-高丝氨酸内酯。

[0019] 进一步，所述反应在20～50℃反应1～30h，更优选反应温度为30～35℃。

[0020] 本发明产酶培养基组成优选为：乳糖10g/L，酵母膏12g/L，NaCl 10g/L，MgSO40.22g/L、KH2PO40.136g/L，溶剂为水，pH 7.0。

[0021] 本发明利用N-BOC-L-高丝氨酸内酯制备L-硒代蛋氨酸的方法为：

[0022] (1)将N-Boc-L-高丝氨酸内酯与质量浓度33％氢溴酸的乙酸溶液混合，100℃加热回流10h，继续搅拌反应10h，缓慢降至室温，静置过夜，过滤，有固体析出，过滤得到产物L-2-氨基-4-溴丁酸氢溴酸盐，并用乙酸乙酯30mL洗涤产物，烘干得到白色固体，收率为85％；所述氢溴酸的乙酸溶液的体积用量以N-Boc-L-高丝氨酸内酯质量计为2.5ml/g；

[0023] (2)将二甲基二硒醚与无水甲醇混合，在氮气保护下分批加入硼氢化钠(硼氢化钠：二甲基二硒醚＝质量比2:1)，室温搅拌0.5h-2.5h，溶液由金黄色变为无色透明，得到CH3SeNa醇溶液；向CH3SeNa醇溶液中加入2-氨基-4溴丁酸氢溴酸盐，油浴加热至45℃-65℃，继续搅拌2-10h，反应结束后过滤即可得到L-硒代蛋氨酸粗产品；所述2-氨基-4溴丁酸氢溴酸盐与二甲基二硒醚质量比为1.4:1，所述无水甲醇的体积用量以二甲基二硒醚质量计为8ml/g。

[0024] N-BOC-L-高丝氨酸内酯(Ⅰ)，经氢溴酸开环溴化得到S-2-氨基-4-溴-丁酸内(Ⅲ)，在硼氢化钠存在下与二甲基二硒醚反应制的L-硒代蛋氨酸(Ⅴ)。

[0025]

[0026] 本发明所述医药中间体N-BOC-L-高丝氨酸内酯的制备方法的有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株--嗜烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001，利用嗜烟碱节杆菌WYG001制备N-BOC-L-高丝氨酸内酯，酶的区域选择性强，反应转化率高，下游分离简单，能耗低，环境污染小，适合工业化生产。(四)附图说明

[0027] 图1外消旋体N-BOC-L-高丝氨酸内酯对照品气相色谱图，峰a为N-Boc-D-高丝氨酸内酯，保留时间16.831分钟，峰面积489.4，峰高51.2，峰宽0.1465，对称因子1.16，峰b为N-Boc-L-高丝氨酸内酯，保留时间17.797分钟，峰面积485.9，峰高50.1，峰宽0.1501，对称因子0.905；

[0028] 图2N-BOC-L-高丝氨酸内酯标准品的气相色谱图，峰b为N-Boc-L-高丝氨酸内酯，保留时间17.791分钟，峰面积677.1，峰高73.1，峰宽0.1111，对称因子0.788；

[0029] 图3微生物催化产物N-BOC-L-高丝氨酸内酯的气相色谱图，峰b为N-Boc-L-高丝氨酸内酯，保留时间17.792分钟，峰面积628.2，峰高67.4，峰宽0.1327，对称因子0.815。

[0030] 图4为本发明反应流程图。

[0031] 图5为菌株WYG001的菌落形态图。

[0032] 图6为菌株WYG001在100倍下的光学显微照片。

[0033] 图7为菌株WYG001的16S rDNA电泳图，A为菌株WYG001的电泳图，左侧泳道为菌株WYG001，右侧泳道为标准分子量，B为A的放大图。(五)具体实施方式

[0034] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0035] 实施例1

[0036] 1、微生物的筛选

[0037] 本发明涉及到的微生物通过以下程序筛选分离得到：称取湿土样1～2g(从全国不同环境条件下土壤中取得)混悬于10mL 0.5％无菌生理盐水中，振荡混匀；接1～2mL混悬液于30mL液体富集培养基中，在30℃、200r/min下培养2～3d后，无菌操作转接1mL浑浊的菌液到新鲜的液体富集培养基，连续富集3次。富集培养基中，以N-BOC-DL-高丝氨酸内酯为唯一碳源，配方如下：NaNO34.0g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 1.0g/L，ZnSO40.05g/L，溶剂为水，pH 7.0。第一轮富集的N-BOC-DL-高丝氨酸内酯的浓度1g/L，第二轮的浓度为3g/L，第三轮的浓度为5g/L，pH 7.0。将第三轮富集后菌液经梯度稀释，涂布分离平板培养基，多次分离，获取单菌落。分离平板培养基组成为：富集培养基加入琼脂终浓度20g/L，底物N-BOC-DL-高丝氨酸内酯终浓度为5g/L，pH 7.0。

[0038] 挑取分离得到的单菌落接种于斜面培养基，30℃培养1-2天，获得斜面菌体。从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至50mL的种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液。在无菌条件下，取3mL种子液接种于50mL的产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液。每升斜面培养基组成牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，pH7.0-7.2，加水至1000mL；种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH 7.0；产酶培养基组成为：乳糖10g/L，酵母膏12g/L，NaCl 10g/L，MgSO40.22g/L、KH2PO40.136g/L，溶剂为水，pH 7.0。取15mL发酵液于50mL离心管中12000rpm离心10min，弃上清液，加入5mL 0.1mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液，振荡混匀，再加入终浓度8g/L底物N-Boc-DL-高丝氨酸内酯，在30℃、200r/min下，转化反应24h。取出离心管，取1mL的反应液，加入2mL乙酸乙酯，充分振荡，6000rpm离心5min。取上层有机相1mL，用少量无水硫酸钠干燥除水，以高效液相色谱检测N-Boc-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值

[0039] (e.e.)，反应转化率C，筛选对映体过量值(e.e.)大于90％，反应转化率C为(45％-60％)的微生物菌株，记为菌株WYG001。

[0040] 2、微生物菌株的鉴定

[0041] 生理生化特征：菌株WYG001为革兰氏阴性菌，专性好氧，生长对pH变化较敏感，最2+
适pH为7.0，菌落形态见图5和图6所示。利用无机氮源的能力较差，生长和产酶受到Cu 、
2+ 3+ 2+ 2+ + +
Fe 、Al 、Zn 等的抑制，受到Mg 、K、Na等的促进。

[0042] 经测序鉴定，菌株WYG001的16S rDNA序列如下(SEQ ID NO.1)，电泳图见图7所示：

[0043] TGCTTACACATGCAAGTCGAACGATGATCCCAGCTTGCTGGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACTCCTCATCGCATGGTGGGGGGTGGAAAGCTTTTGTGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCGTAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAAGACCGGGGCTCAACTCCGGTTCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGAACCGGAAAGACCTGGAAACAGGTGCCCCGCTTGCGGTCGGTTTACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGGGACCGGCGATGGGACTAAGTC

[0044] 根据生理生化特性和分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为嗜烟碱节杆菌菌(Arthrobacter nicotinovorans)，命 名 为 嗜 烟 碱 节 杆 菌 菌 (Arthrobacter nicotinovorans)WYG001，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址中国，武汉，武汉大学，430072)，保藏编号CCTCC NO：M 2014054，保藏日期2014年2月28日。

[0045] 实施例2：

[0046] 斜面培养：将嗜烟碱节杆菌WYG001接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得菌体斜面；斜面培养基组成同实施例1。

[0047] 种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至100mL种子培养基，在30℃、200r/min培养24h，获得种子液；种子培养基组成同实施例1。

[0048] 发酵培养：在无菌条件下，取10mL种子液接种于150mL的产酶培养基中，30℃、200r/min培养24h，获得发酵液，培养结束后将发酵液12000rpm离心10min，弃上清液，得到嗜烟碱节杆菌WYG001湿菌体。取湿菌体以1.2g/ml的量加入pH 7.0、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，-80℃条件下冷冻干燥得到干菌体。

[0049] 实施例3：

[0050] 取实施例2方法获得的湿菌体0.34g，加入N-BOC-DL-高丝氨酸内酯50mg和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液5mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应7.5h。将反应液过滤除去酶，取滤液用气相色谱分析测定转化后的N-Boc-DL-高丝氨酸内酯的含量，计算酶活，该发酵液比酶活力为36.85U/L。

[0051] 酶活定义为：U为1个酶活力单位，所述的1个酶活力单位是在规定的条件下，每分钟将1μmol的N-Boc-高丝氨酸内酯水解成N-Boc-高丝氨酸所需的酶量。

[0052] 气相色谱分析条件：采用气相色谱仪Agilent 6890型气相色谱仪；手性气相色谱柱BGB-175(0.25mm×30m)；载气N2(14.54kPa)，分流比20:1，进样口温度250℃，检测器温度220℃；柱箱升温程序：初始温度180℃，保持20min；进样量1.0μL，氢气流量：30mL/min空气流量：300mL/min；尾吹气流量：N225mL/min；氢离子火焰检测器。N-BOC-D-高丝氨酸内酯和N-BOC-L-高丝氨酸内酯分别在16.831min和17.797min出峰。

[0053] 用于酶活测定的N-BOC-DL-高丝氨酸内酯标准曲线方程：

[0054] 配制浓度分别为0.1％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％的外消旋N-Boc-DL-高丝氨酸内酯(w/v)，利用气相色谱进行检测，得出内酯的浓度与峰面积之间的线性关系，以N-Boc-DL-高丝氨酸内酯的质量浓度为纵坐标，气相色谱检测所得峰面积为横坐标得到标2
准曲线方程：y＝1352x–26.79，在0.1％-2％(w/v)浓度范围内，相关系数R＝0.999，达到了外标法所需的要求，该曲线可以用于N-Boc-DL-高丝氨酸内酯的分析测定。

[0055] 酶活计算公式：

[0056] A＝[(a1-a)/a1]×[C×V/(M×t)]×106 公式(1)

[0057] A——样品中酶的活力(U)；

[0058] a——转化反应结束后转化液中N-BOC-DL-高丝氨酸内酯的峰面积；

[0059] a1——根据上述标准曲线方程计算出的与初始底物浓度相同的N-BOC-DL-高丝氨酸内酯标样的峰面积；

[0060] C——转化液中，底物的质量浓度，g/L；

[0061] V——转化液体积，L；

[0062] M——底物N-BOC-DL-高丝氨酸内酯的摩尔质量，g/mol；

[0063] t——转化时间，Min。

[0064] 实施例4：

[0065] 取实施例2方法获得的干菌体0.2g，加入N-BOC-DL-高丝氨酸内酯0.1g，0.1M、pH7.0磷酸缓冲液10mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应7.5h。采用实施例3方法测定酶活，该干菌体比酶活力为5.53U/g。

[0066] 实施例5：

[0067] 取实施例2方法所得湿菌体3.4g，加入N-BOC-DL-高丝氨酸内酯0.25g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液50mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应4h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱溶剂后，得到N-BOC-L-高丝氨酸内酯0.12g。采用GC(检测条件同实施例3)检测计算得到N-BOC-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值e.e.s99.9％，转化率C为51.8％，产率为96.4％。

[0068] 对映体过量值(enantiomeric excesses)是衡量酶选择性的重要指标，N-BOC-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值简称e.e.s，其计算公式为：

[0069] 公式(2)

[0070] 其中S表示底物，SR和SS分别为(D)-和(L)-构型的底物的峰面积。

[0071] 反应转化率的计算公式为：

[0072] 公式(3)

[0073] N-BOC-L-高丝氨酸内酯的得率(Yield)的计算公式为

[0074]

[0075] 其中，SR0和SS0分别为(D)-和(L)-构型的底物的初始峰面积。

[0076] 实施例6：

[0077] 取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体1g，加入N-BOC-DL-高丝氨酸内酯0.5g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液100mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应7.5h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱溶剂后，得N-BOC-L-高丝氨酸内酯0.24g。采用GC(检测条件同实施例3)检测计算得到N-BOC-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值e.e.s为99.9％，转化率C为52.0％，产率为96.0％。

[0078] 实施例7

[0079] 取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体4g，加入N-BOC-DL-高丝氨酸内酯2g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液100mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应8h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱溶剂后，得N-BOC-L-高丝氨酸内酯0.97g。采用实施例3方法检测N-BOC-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值e.e.99.9％，转化率C为51.0％，产率为97.0％。

[0080] 实施例8

[0081] 取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体1.0g，加入N-BOC-DL-高丝氨酸内酯0.5g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液20mL，在35℃、200rpm条件下，搅拌反应14h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱溶剂后，得N-BOC-L-高丝氨酸内酯0.233g。采用实施例3方法检测计算得到N-BOC-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值e.e.s为99.9％，转化率C为52.5％，产率为93.2％。

[0082] 实施例9

[0083] 取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体1.0g，加入N-BOC-DL-高丝氨酸内酯1g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液20mL，在35℃、200rpm条件下，搅拌反应30h后，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱溶剂后，得N-BOC-L-高丝氨酸内酯0.453g。采用GC检测计算得到N-BOC-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值e.e.s为95.6％，转化率C为52.0％，产率为90.6％。

[0084] 实施例10：

[0085] 取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体0.2g，加入N-BOC-DL-高丝氨酸内酯0.15g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液10mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应13h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱溶剂后，得N-BOC-L-高丝氨酸内酯0.144g。采用实施例3方法检测N-BOC-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值e.e.99.9％，转化率C为50.8％，产率为96.0％。

[0086] 实施例11：

[0087] 取实施例1方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体1.5g，加入N-BOC-DL-高丝氨酸内酯1.5g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液100mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应13h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱溶剂后，得N-BOC-L-高丝氨酸内酯0.725g。采用GC检测计算得到N-BOC-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值e.e.s为99.9％，转化率C为50.7％，产率为96.6％。

[0088] 实施例12：

[0089] 取实施例1方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体5g，加入N-BOC-DL-高丝氨酸内酯10g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液100mL，在40℃、200rpm条件下，搅拌反应15h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱溶剂后，得N-BOC-L-高丝氨酸内酯4.70g。采用GC检测计算得到N-BOC-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值e.e.s为99.0％，转化率C为51.2％，产率为94.0％。

[0090] 实施例13：

[0091] 将实施例11中嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体分别用表1中的干菌体0.2g替代(干菌体的制备同实施例2)，加入N-BOC-DL-高丝氨酸内酯0.1g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液10mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应24h，反应结束后，将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱溶剂后，得N-BOC-L-高丝氨酸内酯。
采用GC检测计算得到N-BOC-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值e.e.s和转化率C，见表1。

[0092] 表1

[0093]

[0094] 表1结果表明，米曲霉wzz007等菌株对底物具有一定的催化效果和立体选择性，但是效果上不如本发明嗜烟碱节杆菌WYG001。

[0095] 实施例14：

[0096] (1)取实施例2方法制得的嗜烟碱节杆菌WYG001干菌体10g，加入N-BOC-DL-高丝氨酸内酯5g和0.1M、pH7.0磷酸缓冲液200mL，在30℃、200rpm条件下，搅拌反应11h，终止反应，反应液离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取(50mL×5)，取乙酸乙酯层减压蒸馏至干脱溶剂后，得到光学纯的N-Boc-L-高丝氨酸内酯2.40g(检测方法同实施例3)，产率为96.0％；N-BOC-L-高丝氨酸内酯的对映体过量值e.e.s为99.9％，其数据结构表征如下：

[0097] 1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.34(d,J＝8.4Hz,1H),4.37-4.28(m,2H),4.19-4.15(m13
,1H),2.39-2.34(m,1H),2.17-2.12(m,1H),1.39(s,9H). C NMR(150MHz,CDCl3))δ174.5,
155.6,78.5,64.7,49.1,29.2,27.3.Mp 123-125℃.[α]D＝+8.6°(c＝1,CHCl3)[0098] (2)2-氨基-4-溴丁酸氢溴酸盐的合成

[0099]

[0100] 在50mL的圆口烧瓶中，加入N-Boc-L-高丝氨酸内酯2.40g，然后加入6mL质量浓度33％的氢溴酸的乙酸溶液，油浴加热至100℃，继续搅拌反应10h，反应液由混浊变至澄清，缓慢降至室温，静置过夜，有固体析出，过滤，得到2-氨基-4溴丁酸氢溴酸盐的粗产品，并用乙酸乙酯洗涤产物，最后干燥得到白色固体2.65g，收率为85％。

[0101] 1H NMR(500MHz,D2O)δ2.22-2.41(m,2H),3.59-3.71(m,2H),4.00(d,J ＝13
5.6Hz,1H). C NMR(126MHz,D2O)δ174.6,51.7,32.9,28.3.

[0102] (3)L-硒代蛋氨酸氢溴酸盐的合成

[0103]

[0104] 在50mL的两口烧瓶中，加入1.88g二甲基二硒醚，然后加入15mL的无水甲醇，使其混合，一端连有氮气保护装置。在氮气保护下分批加入硼氢化钠3.76g，以防止反应过于剧烈。室温(25℃)搅拌10分钟，溶液由金黄色变为无色透明，得到CH3SeNa醇溶液。将制备的CH3SeNa醇溶液中加入2.65g 2-氨基-4溴丁酸氢溴酸盐，油浴加热至60℃，继续搅拌5h。反应结束后有固体析出，过滤即可得到L-硒代蛋氨酸的粗产品然后再用乙醇洗涤产物，干燥得到白色固体。收率为61.2％。

[0105] 1H NMR(500MHz,D2O)δ3.73-3.71(m,1H),2.52-2.49(m 2H),2.15-2.04(m,2H13
),1.92-1.90(m,3H). C NMR(125MHz,D2O)δ174.2,54.9,31.0,19.4,3.4.MS(ESI):m/z[M+H]+:198.Mp 267.2-269.3℃.[α]D＝+18.8°(c＝1,1N HCl)。