醚(如乙基叔丁基醚(ETBE)、叔戊基甲基醚(TAME)和甲基叔丁基醚 (MTBE))被广泛用作无铅汽油中的辛烷值强化剂。在芬兰，MTBE被以9 到13的体积百分比掺入汽油中。MTBE(其在欧洲于20世纪80年代取代 铅)和芳香族化合物相比作为辛烷值强化剂(燃料氧化剂)更有效并且从环境 观点看使用更安全。一些叔醇，例如叔丁基醇(TBA)和叔戊基醇(TAA)也是 潜在的燃料氧化剂。TBA是降解ETBE和MTBE的中间体。
供水系统中MTBE的检测集中在汽油泄漏和溅出导致的土壤和地下 水污染。对于MTBE的致癌性、致畸性、致突变性和神经毒性有不同的看 法。然而，像其他醚一样，MTBE具有刺激性味道和气味，因此在非常低 的浓度35μg/l下都可检测到。美国EPA推荐的饮用水中MTBE最大浓度 为在动物中导致可观察到的影响健康的最低浓度的2万分之一到10万分之 一。在某些水文地质条件下，水溶性MTBE倾向于比其他汽油成分在地下 水中移动得稍快、稍远。
MTBE是土壤和地下水中的持久性物质。个人消费者可以使用安装在 水龙头的活性炭柱作为除去MTBE的味道和气味的暂时性方法。然而，土 壤或地下水中不应该存在MTBE和其他汽油成分。这么大规模的机械的和 /或化学的清除方法将是非常棘手和昂贵的(如果可能的话)。最近的研究表 明在例如石油灾难后自然本身的令人惊奇的生物除污能力。生物除污是活 的生物体发挥作用以降解土壤、地下物质、水和淤泥中有害的有机污染物 或将有害无机污染物转变到环境安全水平的过程。在过去的几十年中，在 燃料氧化醚和其他汽油成分的生物降解潜力和生物清除策略方面进行了研 究。
Salanitro等(Salanitro J.P.，Diaz L.A.，Williams M.P.和 Wisniewski H.L.(1994)Appl.Environ.Microbiol.60：2593-2596)和US 5 750 346首先表明了通过混合的微生物培养物以34mg/g细胞/小时有氧降 解MTBE。研究中观察到的TBA降解得甚至比MTBE还慢。MTBE的无 氧降解首先由Mormille等(Mormille M.R.，Liu S.和Suflita J.M.(1994) Environ.Sci.Technol.28：1727-1732)报道。公认MTBE的无氧降解缓慢， 但是在许多情况下可以通过加入O2、营养物和微生物增加剂得到改善。
Steffan等(Steffan R.J.，McClay K.，Vainberg S.，Condee C.W.和 Zhang D.(1997)Appl.Environ.Microbiol.63：4216-4222)建议丙烷氧化细 菌通过切割甲醛使MTBE经过叔丁氧基甲醇降解成TBA。TBA被进一步 经过2-甲基-2-羟基-1-丙醇降解成为2-羟基异丁酸(HIBA)，然后HIBA经 过2-丙醇、丙酮和羟基丙酮被降解成丙酮酸。
Hardison等(Hardison L.K.，Curry S.S.，Ciuffetti L.M.和Hyman M.R.(1997)Appl.Environ.Microbiol.，63：3059-3067)证明了粘束孢种 (Graphium sp.)的一株丝状真菌ATCC 58400能够用二乙基醚作为碳源和 能源共代谢降解低浓度(750ppb)MTBE。检测到叔丁基甲酸(TBF)和TBA 是MTBE的降解产物。中间体形成的动力学表明TBF的产生在TBA积累 之前并且TBF被生物地或非生物地水解产生TBA。
Hanson等(Hanson J.R.，Ackerman C.E.和Scow K.M.(1999) Appl.Environ.Microbiol.，65：4788-4792)分离了细菌菌株PM1，其能够利 用MTBE作为其唯一碳源和能源。对初始浓度为5、50和500μg MTBE/ml，MTBE被2×106个细胞/ml降解的初始线性速率分别为0.07、 1.17和3.56μg/ml/小时。
Pivateau等(Pivateau P.，Fayolle F.，Vandecasteele J-P.和Monot F. (2001)Appl.Microbiol.Biotechnol.55：369-373)分离了一株需氧细菌菌株 CIP I-2052，其能够利用TBA和ETBE作为其唯一碳源和能源。最大TBA 降解速率是35.8±8.5mg TBA/g细胞干物质/小时。
在″In Situ and On-Site Bioremediation，The Sixth International Symposium″(2001年6月4-7日，San Diego，California)报道了MTBE通 过TBF降解。Martinez-Prado等在大会摘要中描述了一株牝牛分歧杆菌 (Mycobacterium vaccae)菌株，其能够通过TBA共代谢地降解MTBE但是 不能利用MTBE作为其唯一碳源和能源。Hyman等描述了一株暂时鉴定 为多噬菌菌株的VB-1，其能够在汽油中发现的芳香族化合物上生长后共代 谢地降解MTBE。Soon-Woong等提供了一张海报，其描述了丁烷生长的 微生物也能够经过TBF共代谢地降解MTBE。然而，没有描述能够利用 MTBE作为其唯一碳源和能源的细菌菌株。
这样，因为燃料及其添加剂产生的污染物，如土壤和地下水中的燃料 氧化醚不能完全避免，并且生物降解方法仍然相当低效和缓慢，所以仍然 需要更有效和更快的降解这些污染物的生物方法。还需要降解醚的能力增 强的新的生物体。本发明现在提供满足这些需求的方法。
发明概述
本发明在于多噬菌(Variovorax)菌株的发现，该菌株能够降解醚及其降 解产物，并且甚至能够利用MTBE作为它们的唯一碳源和能源。这些菌株 能够快速高效地降解醚及其的降解产物。
本发明提供了多噬菌菌株，其特征是其能够利用甲基叔丁基醚(MTBE) 作为其唯一碳源和能源。这种菌株提供了一种生物降解例如土壤和地下水 中的燃料氧化醚和它们的降解产物的有效途径。本发明还提供了混合的细 菌菌群，其特征是其含有一种或多种本发明菌株。
本发明还提供了细菌降解醚和它们的降解产物的方法，其特征是用含 有一种或多种能够利用甲基叔丁基醚(MTBE)作为它们的唯一碳源和能源 的多噬菌菌株发酵含有一种或多种醚或它们的降解产物的溶液。
本发明还涉及一种或多种本发明多噬菌菌株在净化受污染的土壤和水 中的用途。
附图简述
图1描述了本发明细菌菌株的MTBE降解途径。X表示质子[H]载体。
发明详述
本发明的多噬菌菌株能够降解醚和它们的降解产物并且能够利用 MTBE作为它们的唯一碳源和能源。所要降解的醚可以是任何醚——线性 的或支链的醚。这些醚优选地为燃料氧化醚，如乙基叔丁基醚(ETBE)、叔 戊基甲基醚(TAME)、二异丙基醚(DIPE)、二乙基醚(DEE)和MTBE。醚 的降解产物包括从醚开始经中间代谢最终以二氧化碳结束的代谢途径中可 发现的作为中间体的所有化合物。降解产物优选地为燃料氧化醚的降解产 物，如叔醇。一些降解中间体，如TBA(一种叔醇)也可以被该菌株用作唯 一碳源和能源。
令人惊奇地发现本发明的细菌能够比现有技术中的任何微生物更有效 地降解MTBE和TBA。本发明的多噬菌菌株优选地属于奇异多噬菌 (Variovorax paradoxus)种。奇异多噬菌的两个菌株奇异多噬菌JV-1和 奇异多噬菌CL-3被保藏在德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH)(DSMZ，Braunschweig， 德国)，保藏号分别为DSM 14357和DSM 14433。菌株JV-1能够代谢至少 20毫克、优选至少60毫克、最优选至少80毫克MTBE/克干细胞/小时。 菌株CL-3能够代谢至少80毫克、优选至少100毫克TBA/克干细胞/小时。 尽管本申请集中于细菌降解燃料氧化醚和它们的降解产物的能力，但是不 排除其他生物除污过程，如芳香族化合物或石油烃类的降解。
通过气相色谱质谱(GC-MS)和送料试验研究MTBE和TBA降解的代 谢途径。图1阐明了所提议的途径。通过(GC-MS)检测到TBF和TBA是 短暂的中间体，它们于菌株在MTBE上生长时在培养液中积累。代谢物形 成的动力学表明TBF积累先于TBA积累。预计叔丁氧基甲醇(在该研究中 检测不到)是MTBE和TBF之间的一种不稳定的中间体。TBA和甲酸一起 诱导MTBE降解。从而，提议甲酸将被从TBF切割下来并降解成CO2。 释放的氢然后还原载体(X)，该载体增强了MTBE的降解。
在本发明的一个实施方案中，菌株JV-1被用于降解溶液中MTBE及 其降解产物的方法中。在本发明的另一个实施方案中，菌株CL-3被用于 降解溶液中的TBA及其降解产物。
在本发明的另一个实施方案中，菌株JV-1和CL-3被一起使用以便降 解燃料氧化醚和它们的降解产物。菌株的共培养在降解过程中是有利的， 因为在降解途径开始时菌株JV-1是非常高效的MTBE降解剂而菌株CL-3 降解TBA(MTBE的一种降解中间体)非常高效。TBA的有效降解很重要， 因为TBA的积累将抑制途径的第一步。
本发明的方法特别适于降解含有MTBE和/或TBA的溶液。
本发明的菌株适于用在大规模反应器中溶液的生物除污。所要生物除 污的溶液可以是任何含水溶液，如城市废水、工业废水或受污染的地下水 或任何其他受污染水的污泥。优选地，该反应器是具有能够附着微生物的 固定载体的有氧生物反应器。优选地，使用含有一种或多种本发明细菌菌 株的混合培养物。多种菌株的混合培养物是有利的，因为在水和污泥中有 多种不同污染物。这样，需要许多不同降解途径以便达到所有污染物的可 接受的降解水平。在混合菌群中包含的其他细菌或其他微生物优选从水净 化过程中得到和富集，例如来自活性污泥。
在本发明的另一个实施方案中，醚和它们的降解产物根据本发明被用 来自受污染土壤(如加油站附近土壤)的水溶液提取然后被生物除污。
待处理以降解污染物的溶液可以是任何水溶液，如受污染的地下水、 污泥或从受污染土壤收集的水。只要有足够水分使得微生物能够生存和发 挥功能，那么可以净化受污染的土壤。优选地，将土壤的水分收集到反应 器中以保证微生物降解污染物的最适条件。备选地，水分从土壤循环到反 应器并返回到土壤(如果需要，进行几次)以便保证土壤中污染物降低到环 境可接受的水平。当土壤被例如具有高水溶性的醚污染时，该实施方案尤 其有用。
下面提供的实施例仅仅用于说明的目的，它们并不用于限制本发明的 范围。
实施例
实施例1：菌株的分离和鉴定
通过用MTBE作为唯一碳源和能源选择性富集从活性污泥中分离出 本发明的菌株。向1升具有50ml包含10mg/l酵母抽提物的CLM培养基 (1g K2HPO4·3H2O，0.25g NaH2PO4.2H2O，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O和Ca(NO3)2·4H2O溶于1升蒸馏水或去离子水)的气密 烧瓶中加入MTBE(10μl)和50ml污泥并在22℃下静止孵育。底物消失后 (4个月)加入更多MTBE。6个月后，将该混合的富集培养物悬浮于60ml 含有酵母抽提物、微量元素和MTBE(10μl)的CLM培养基中并在22℃下 静止孵育(1个月)，用含有MTBE(10μl/100ml)、微量元素和维生素的CLM 培养基进行1∶5(体积/体积)稀释并孵育直到可看到混浊。保持培养物(叫做 CL-EMC-1)接种间隔为1.5-2个月，用MTBE作为唯一碳源和能源。在该 阶段，用MTBE或TBA作为它们的唯一碳源和能源分离菌株的试图失败 了。3年后，通过4个月的定期(15天)重新接种，CL-EMC-1的混合富集 培养物适应了200mg/l MTBE。
将该培养物(其利用MTBE作为唯一碳源和能源最大达到1.5g/l)涂含 有MTBE的CLM琼脂平板。检验分离的菌落生长在含有MTBE的CLM 琼脂上的能力。平板上的菌落通过将单一菌落于CLR琼脂(在1升含有1.5 到2.0％(重量/体积)细菌用琼脂(Difco Laboratories，Detroit，USA)的CLM 培养基中包含1g大豆蛋白胨、0.2g胰蛋白胨和0.2g酵母抽提物)上划线 连续稀释而纯化。将一株分离的纯菌株命名为JV-1，其利用MTBE作为 其唯一碳源和能源。
将20ml CL-EMC-1培养物加入到1升装有80ml含0.05g/l TBA、 微量元素和维生素的CLM培养基的气密烧瓶中并在22℃下静止孵育。底 物消失(2周)后再加TBA。一个月后将20ml该培养物用含有TBA(0.1g/l) 的CLM培养基1∶10(体积/体积)稀释并在28℃、152转/分钟下在旋转摇床 上孵育直到混浊(7天)。该步骤重复3次。然后将培养物在22℃下在含有 0.05g/lTBA的CLM琼脂上涂平板。检测分离的菌落用TBA作为唯一碳 源和能源在CLM培养基上生长的能力。划线(通过在CLR琼脂上连续稀 释单菌落)使生长在平板上的菌落变纯。一株分离的纯菌株(命名为CL-3) 利用TBA高达7g/l。
DSMZ(德国微生物菌种保藏中心，Braunschweig，德国)鉴定了这两株 分离的菌株JV-1和CL-3。两株菌株都有奇异多噬菌的特点。它们是革兰 氏阴性细菌，具有棒状细胞，宽0.5-0.7μm，长1.5-3.0μm。16SrDNA的 部分序列和多噬菌具有99.3％的相似性，其他相似性要低得多。细胞脂肪 酸图谱和生理学检验数据清楚地证实了该结果。生理学检验结果在下表1 中给出：
表1
反应                  菌株JV-1            菌株CL-3
革兰氏反应            -                   -
3％以下酶的溶菌作用   +                   +
氨肽酶(Cerny)         +                   +
氧化酶                弱                  +
过氧化氢酶            +                   +
色素形成              黄色                黄色
游动性                +弱                 无数据
鞭毛                  +                   无数据
在30℃生长            +                   +
ADH                   -                   -
脲酶                    +            +
明胶水解                -            -
自养生长                -            -
硝化还原                -            -
反硝化作用              -            -
利用
    葡萄糖              +            +
    乙酸苯酯            +            +
    柠檬酸              +            +
    苹果酸              +            +
    阿拉伯糖            +            +
    葡萄糖酸            +            +
    己二酸              弱           弱
    海藻糖              +            无数据
    丙二酸              +            +
    L-扁桃酸            -            -
    [反]乌头酸          +            +
    对羟基苯甲酸        +            +
    L-组氨酸            +            +
    Etanolamine         -            -
    甘露醇              +            +
    果糖                +            +(D-果糖)
    水杨苷              +            +
    蔗糖                -            -
    阿糖醇              +            +
    肌醇                +            +
    2-酮葡萄酸          +            +
    间酒石酸            +            +
柠康酸           无数据        +
乙酸             无数据        +
Sebacinate       无数据        +
庚二酸           无数据        +
D-木糖           无数据        +
水解esculine     -             -
在2升含有0.2升如下面的实施例2所描述的具有微量元素与维生素 的基本盐培养基的瓶中研究菌株JV-1和CL-3在丁烷上的生长。瓶子用装 有衬了特氟隆的硅氧烷隔垫的螺旋帽密闭。将50ml、100ml和200ml体积 的丁烷(纯度99％)加入瓶中作为超压。在540nm处初始吸光度为0.1(30mg/l 细胞干重)时接种后在22℃对菌株JV-1和CL-3平行地静止孵育和于旋转 摇床(152转/分钟)上孵育。在任何瓶中孵育5个月期间在培养液中没有检 测到生长(540nm的吸光度小于0.1)。
实施例2  实验室规模的MTBE和TBA的降解
在2升含有0.2升培养基的用带特氟隆包裹的塞子封口的气密烧瓶中 在实验室条件下研究菌株JV-1在MTBE上和CL-3在TBA上的生长。用 于富集和培养本发明细菌的基本盐培养基的成分如下(g/l蒸馏水或去离子 水)：K2HPO4·3H2O，1；NaH2PO4·2H2O，0.25；(NH4)2SO4，0.1； MgSO4·7H2O，0.05；Ca(NO3)2·4H2O，0.02；FeCl3·6H2O，0.002，pH 7.0-7.3。该培养基还含有下面的元素(mg/l)：H3BO3，2；FeSO4·7H2O，2； Na2SeO3·5H2O，1；Na2MoO4·2H2O，1；CoCl2·6H2O，1；MnSO4·2H2O，0.5； ZnSO4·7H2O，0.5；AlCl3·6H2O，0.05；NiCl2·6H2O，0.02；CuSO4·7H2O， 0.01，pH 7.0-7.3。在121℃下对培养基灭菌20分钟。维生素储存液如下 (mg/l蒸馏水或去离子水)：核黄素，10；烟酸，5；泛酸钙，5；硫胺素，5； 叶酸，2；盐酸吡哆素，1；维生素B12，1；生物素，1。将维生素溶液(10ml) 过滤除菌并加入高压灭菌冷却后的培养基中。菌株JV-1的接种密度是每毫 升培养基1.1×106到1.2×107个细胞，菌株CL-3的接种密度是每毫升培 养基1.6×106到1.1×107个细胞。加入合适的碳源(MTBE或TBA)。在22 ℃下静止孵育菌株JV-1，在28℃下于旋转摇床上孵育菌株CL-3。
实施例3对新途径的气相色谱质谱研究
用气相色谱质谱(GC-MS)(用装备有HP5973质量选择探测器和PONA 交联的甲基硅氧烷毛细管柱(50m×0.2mm；0.5μm膜厚，Agilent Technologies，U.S.A))分析从实施例2得到的培养液样品中的MTBE、TBF 和TBA。将炉温保持在35℃15分钟，然后以10℃/分钟升温到70℃，保持 在该温度3分钟然后以20℃/分钟升温到250℃并保持在该温度5分钟。 载气(氦气)保持在恒定的柱流速0.5ml/分钟。通过电子离子化(70eV)用完 全扫描监测分析样品(m/z＝25到200)。通过法定标准和GC-MS软件(Wiley 275)中的数据库进行化合物鉴定的质谱解析。
实施例4  实验室规模的MTBE的降解和与现有技术的比较
菌株JV-1生长在上面提到的条件下，用MTBE作为唯一碳源和能源。 表明该菌株降解MTBE比Hanson等报道的菌株PM1(现有技术中已知的 最好的MTBE降解细菌)快得多。实验结果和JV-1与PM1的比较如表2 所示。
表2.奇异多噬菌JV-1株与能够降解MTBE的菌株PM1的比较 参数 奇异多噬菌JV-1 PM1* 在MTBE上的生长速度， 每小时 0.03±0.004 无数据 生长产率，g(细胞干 重)/g(所用的MTBE) 0.47±0.03 0.18±0.06 降解速度，mg MTBE/g 干细胞/小时 88±14 0.07-3.56# MTBE降解浓度，g/l 高达1.5 0.005-0.5 应用MTBE的初始生物 3-15 - 量浓度，mg干细胞/l或 接种密度，细胞数/ml  1.1×106-1.2×107  2×106
*＝Hanson等测量的。
#＝对于初始浓度分别是5、50和500μg MTBE/ml时，2×106个细胞 /ml降解MTBE的初始速度分别是0.07、1.17和3.56μg/ml/小时。
实施例5  实验室规模的TBA降解和与现有技术的比较
菌株CL-3在上面提到的条件下生长，用TBA作为唯一碳源和能源。 表明该菌株降解TBA比菌株CIP I-2052(Pivateau等报道，现有技术中已 知的最好的TBA降解细菌)快得多。实验结果和CL-3与CIP I-2052的比 较如表3所示。
表3.奇异多噬菌CL-3株与能够降解TBA的菌株Burkholderia cepacia CIP I-2052的比较 参数 奇异多噬菌CL-3  Burkholderia cepacia  CIP I-2052* 在TBA上的最大生长速 度，每小时 0.042±0.005  0.032±0.004 生长产率，g(细胞干 重)/g(所用TBA) 0.59±0.04  0.54±0.02 最大降解速度，mg TBA/g干细胞/小时 99.5±10.5  35.8±8.5 TBA降解浓度，g/l 高达7  高达6 应用TBA的初始生物量 浓度，mg干细胞/l或 接种密度，细胞数/ml 3-15 1.6×106-1.1×107  47  无数据 MTBE降解速度，mg MTBE/g干细胞/小时 0.41  不能降解MTBE
*＝Pivateau等所测
实施例6大规模生物除污
三年内在大规模实验中试验本发明的菌株。在带有固定载体的100 m3 有氧生物反应器中孵育MTBE污染的地下水。将反应器用含有菌株JV-1 和CL-3以及其他从活性污泥中分离的细菌的混合细菌培养物进行接种。 流速是35m3地下水/天。平均水温是16℃，但是发明人已经证明菌株JV-1 甚至可以在8℃下降解MTBE。反应器运行3年。观察到MTBE和其他有 机污染物的显著减少。实验结果如下：
表 有机污染物     水中污染物浓度(μl)     处理前     处理后 MTBE     5-11     ＜1 苯     1-3     ＜1 甲苯     1-12     ＜1 乙苯     1-4     ＜1 间/对-二甲苯     2-4     ＜1 邻-二甲苯     2-5     ＜1 1，3，5-三甲基苯     2-10     ＜1 1，2，4-三甲基苯     2-12     ＜1 萘     3-35     ＜0.05 二氢苊     0.1-7     ＜0.05 芴     0.1-5     ＜0.05 菲     0.1-6     ＜0.05 蒽     0.1-0.2     ＜0.05
                      PCT/RO/134表   0-1   0-1-1 表格-PCT/RO/134(EASY) 与保藏的微生物或其它生物材料有关的 声明(PCT细则第13条之2) 制备时利用 PCT-EASY版本2.92 (01.10.2002更新)   0-2 国际申请号 PCT/FI02/00807   0-3 申请人或代理人的参考卷号 2010506PC/nu   1   1-1   1-2 下面列出与说明书中提及的保藏的微生 物或其它生物材料有关的声明： 页 行 4 20-24   1-3   1-3-1   1-3-2   1-3-3   1-3-4 保藏鉴定 保藏机构名称 保藏机构地址 保藏日期 保藏号 DSMZ-德国微生物菌 种保藏中心 Mascheroder Weg 1b， D-38124 Braunschweig， 德国 2001年4月20日 (20.04.2001) DSMZ 14357   1-4 其它声明 根据PCT细则第13条之 2，申请人希望将鉴定证 明送交指定国   1-5 声明适用的指定国 所有指定国   1-6 声明的单独提供 这些声明之后将提交给国际局 无   2   2-1   2-2 下面列出与说明书中提及的保藏的微生 物或其它生物材料有关的声明： 页 行 4 20-24   2-3   2-3-1 保藏鉴定 保藏机构名称 DSMZ-德国微生物菌 种保藏中心
  2-3-2   2-3-3   2-3-4 保藏机构地址 保藏日期 保藏号 Mascheroder Weg 1b， D-38124 Braunschweig， 德国 2001年7月26日 (26.07.2001) DSMZ 14433   2-4 其它声明 根据PCT细则第13条之 2，申请人希望将鉴定证 明送交指定国   2-5 声明适用的指定国 所有指定国   2-6 声明的单独提供 这些声明之后将提交给国际局 无
                  只对受理局 0-4 是否该表格与国际申请同时收到 是 0-4-1 授权官员
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