[0001] 本发明涉及一种能同时利用蔗糖和甘油作为碳源的产琥珀酸突变微生物。尤其是，本发明涉及一种能同时利用蔗糖和甘油以生产琥珀酸的产琥珀酸突变微生物，该突变微生物通过解除产琥珀酸微生物中的蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制而获得。

[0002] 琥珀酸是一种包含四个碳原子的二羧酸并能够被用于多种工业应用。琥珀酸可作为工业重要化学品（包括己二酸、1,,4-丁二醇、乙二胺二琥珀酸盐、衣康酸、γ-丁内酯、γ-氨基丁酸和四氢呋喃）的前体使用，并且琥珀酸（包括其前体）的全球市场规模估计大约150亿美元（McKinlay等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,76:727,2007）。随着当下对环境可持续发展的兴趣和因石油储备量减少和由此导致的价格波动，过去十年进行了生物基琥珀酸生产方面的全球性研究（McKinlay等，Appl.Microbiol.Biotechnol.76:727，2007；Song等，Enzyme Microbial Technol.，39:352，2006；Jantama等，Biotechnol.Bioeng.，99:1140，2008）。尽管如此，时至今日已发现的任何种类的菌株都没有能够最大化琥珀酸的生产能力和产量的同时最小化副产物的产生。当生产能力高时，效率低，反过来，当效率高时，生产能力低。进一步说，当生产能力高时，也产生了大量副产物。因此，一种能够增加生产能力和产量同时只生产琥珀酸的理想菌株尚未被发现（Jantama等，Biotechnol.Bioeng.，99:1140，
2008）。

[0003] 蔗糖的价格是常用于微生物发酵生产琥珀酸的葡萄糖价格的大约1/4。同时，随着全球生物柴油制造的快速增长，产生了作为副产物的甘油，其价格因超量供应和需要一种处理甘油的适当的方法而下降。因此，甘油的价格非常低并持续的下降（Miller-Klein Associates，Oct.2006）。

[0004] 大部分微生物从不同的碳源混合物中优先利用首选的碳源。为使其成为可能，大多数微生物拥有当首选碳源可用时抑制非首选碳源利用的分解代谢抑制机制（Gorke等，Nature Reviews，6:613，2008）。在受分解代谢抑制机制调节的碳源的优先利用方面，众所周知，如1942年Monod et al.所报道的，大肠杆菌在葡萄糖和乳糖都存在时呈现二次生长。在这里，首选的碳源是葡萄糖，大肠杆菌的二次生长曲线中，显示了葡萄糖彻底消耗后的短的滞后期后，开始消耗非首选碳源乳糖。因为这个分解代谢抑制机制，对于常规曼海姆菌株很难同时利用蔗糖和甘油。不过，利用甘油作为碳源具有许多优势。甘油是高度还原性的，当它作为碳源使用时，在中间体磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的生产中，比糖类（例如葡萄糖、木糖和蔗糖）产生多2倍的量的还原当量（NADH，NADPH，FADH2等）。因此，甘油对于还原性化学品的生长是引人注目的碳源。（Yazdani等，Curr.Opin.Biotechnol.，18:213，2007）。尽管如此，在很多情况下，在厌氧条件下的利用甘油的细胞生长速度比利用其他糖类的低，也因此使得利用甘油作为单一碳源虽然就还原力方面而言是有优势的，但是其显示出的低生长速度，使得在增加所需的生物产品的生产能力上受限制。

[0005] 为克服该限制，如果能通过同时利用比甘油有更高利用速度且能使细胞生长处于更高水平和速度的糖类（例如蔗糖）增加甘油的利用速度，细胞便可以以高速度生长的同时可利用甘油的高还原力的优势，由此可以有效地生产还原性化合物，特别是琥珀酸。

[0006] 因此，本发明人为开发通过同时利用廉价的蔗糖和甘油以高效率生产高纯度的琥珀酸的方法进行了广泛的努力，结果发现当培养通过从产琥珀酸微生物中删除果糖磷酸转移酶编码基因或向微生物引入甘油激酶编码基因而获得的产琥珀酸突变微生物时，可解除突变微生物中的分解代谢抑制机制从而使该突变微生物实现以常规方法不能达到的同时利用蔗糖和甘油生产琥珀酸、使副产物的产生最小化，和以高效率和非常高的生产能力生产均一琥珀酸(homo-succinic acid)，从而完成本发明。

[0007] 本发明的目的之一是提供一种突变微生物，其中解除了分解代谢抑制机制以便该微生物能够同时利用蔗糖和甘油，最大化琥珀酸的产量以接近理论水平，同时最小化副产物的产生，从而产生均一琥珀酸。

[0008] 本发明的另一个目的是提供一种在厌氧条件下利用蔗糖和甘油作为碳源在所述的突变微生物中生产均一琥珀酸且不产生副产物的方法。

[0009] 技术方案

[0010] 为达到上述目的，本发明提供了一种能够同时利用蔗糖和甘油以生产琥珀酸的突变微生物，该突变微生物通过解除产琥珀酸微生物中蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制而获得。

[0011] 本发明还提供了一种制备能利用蔗糖和甘油以获得产琥珀酸突变微生物的方法，该方法包括解除产琥珀酸微生物中蔗糖介导的甘油分解代谢抑制。

[0012] 本发明还提供一种生产琥珀酸的方法，该方法包括步骤：在厌氧条件下培养前述产琥珀酸突变微生物；和从发酵液中回收琥珀酸。

[0013] 附图简述

[0014] 图1示意性地显示了蔗糖和甘油的代谢途径和曼海姆菌株中的分解代谢抑制机制。确切地说，图1A显示了蔗糖和甘油常规的代谢途径和其中的分解代谢抑制机制，图1B显示了图1A中为解除分解代谢抑制机制有可能被代谢操作的部分（GLY，甘油；G3P，甘油-3-磷酸；SCR，蔗糖；G6P，葡萄糖-6-磷酸；FRU，果糖；F1P，果糖-1-磷酸；FBP，1,6-二磷酸果糖（果糖-1，6-二磷酸）；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；SUC，琥珀酸；PYR，丙酮酸；IIBCF，果糖磷酸转移酶系统IIBC单元（fructose PTS IIBC unit）；IIBCS，蔗糖磷酸转移酶系统IIBC单元（sucrose PTS IIBC unit）；EI，酶I；HPr，组氨酸蛋白；IIA，磷酸转移酶系统酶IIA（PTS enzyme IIA）；Fpr，双功能果糖特异性IIA/HPr蛋白；AC，腺苷酸环化酶；cAMP，环腺苷酸；CRP，环腺苷酸受体蛋白）。

[0015] 图2为一组显示了获自曼海姆产琥珀酸菌PALK（图2A）、曼海姆产琥珀酸菌PALFK（图2B）和曼海姆产琥珀酸菌PALKG（图2C）的分批补料培养物的细胞生长情况和代谢产物的图表。

[0016] 图3为显示了获自以增加的量接种的曼海姆产琥珀酸菌PALFK菌株的分批补料培养物的细胞生长情况和代谢产物的图表。

[0017] 图4A为显示了MCRB培养方法的示意图，其中实线表示液流（培养基、包含细胞的培养基、包含代谢物的培养基等），虚线表示气流（二氧化碳）。图4B为显示获自使用MCRB培养方法的曼海姆产琥珀酸菌PALFK株的培养物的细胞生长情况和代谢产物的图表。

[0018] 除非另有定义，在此使用的全部科技术语与本发明所属技术领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。通常地，在此使用的术语是众所周知的和常规地用于本领域。

[0019] 一方面，本发明涉及能同时利用蔗糖和甘油以生产琥珀酸的突变微生物，该突变微生物通过解除产琥珀酸微生物中蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制而获得。

[0020] 本文使用的术语“分解代谢抑制机制”涉及当微生物在有多种碳源存在的培养基中培养时，在首选碳源存在的情况下，抑制该微生物的非首选碳源的利用的机制（Gorke等，Nature Reviews，6:613,2008）。

[0021] 对于产琥珀酸的曼海姆菌株，因为该分解代谢机制而不能同时利用蔗糖和甘油以生产琥珀酸。

[0022] 通常地，当蔗糖和甘油共存时，在首选碳源蔗糖被消耗后，才消耗甘油。并且，相对于甘油，曼海姆菌更优选蔗糖，所以蔗糖和甘油同时存在时，其更快速地代谢蔗糖。

[0023] 本发明的目的在于人为地解除这个分解代谢抑制机制。

[0024] 分解代谢抑制机制主要分为两种：转录抑制和变构抑制（Deutscher等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，70:939,2006；Gorke等，Nature reviews，6:613，2008；Pettigrew等，J.Bacteriol.，178:2846，1996；Zwaig等，J.Bacteriol.，102:753,1970）。就转录抑制而言，GlpR调节子抑制参与细胞内甘油的转运和利用的基因的转录。本文使用的术语“变构抑制”涉及甘油激酶活性的减少，其由果糖1,6二磷酸（FBP）或EIIA与甘油代谢中扮演关键角色的甘油激酶的结合而导致。在蔗糖和甘油同时存在的环境中，GlpR调节子引起的转录抑制与FBP和EIIA引起的变构抑制同时发生，所以甘油代谢通常被抑制。能解除这一分解代谢机制的策略避免了GlpR引起的转录抑制以及FBP和EIIA引起的变构抑制。

[0025] 图1示意性地显示了曼海姆菌株中蔗糖和甘油的代谢途径以及分解代谢抑制机制。确切地说，图1A显示了蔗糖和甘油常规的代谢途径和分解代谢抑制机制；图1B显示了解除分解代谢抑制机制，图1A中可能被代谢操作的部分。图1中，实线箭头表示蔗糖和甘油的代谢途径，其粗度表示相对的代谢速度。细的虚线箭头表示磷酰基连续地从PEP到磷酸转移酶系统IIBC单元的转移过程，粗的虚线箭头示意性地显示了能诱导glp操纵子表达的多种途径，包括起始自磷酸化的IIA的途径、起始自腺苷酸环化酶（AC）的途径、起始自CRP-cAMP的途径、起始自G3P-GlpR的途径等。在末端有T形状的粗的虚线表示在glp操纵子中扮演关键角色的甘油激酶（GlpK）由非磷酸化的IIA和/或1,6-二磷酸果糖（FBP）引起的变构抑制的相对程度。

[0026] 如图1A中所示，蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制主要分为由GlpR等引起的转录抑制，和由FBP和EIIA引起的变构抑制。如图1B中所示，克服抑制的方法包括通过诱导产生多种活化剂而克服转录抑制的方法，通过减少FBP或IIA的浓度来解除GlpK介导的变构抑制的方法等等。

[0027] 例如，其为以下方法：从图1B的部分1移除IIBCF使得磷酸化的IIA的浓度相应增加以诱导AC表达，从而更多地产生cAMP以增加CRP-cAMP的产生，因而诱导glp操纵子的表达。因此由额外表达的GlpK产生的G3P将转录抑制物GlpR从glp调节子（glpABC、glpF、glpK等）的DNA结合位点上分离以促进glp调节子基因的转录。与此同时，保持非磷酸化的IIA的浓度在一个相对低的水平，且因移除IIBCF而减少蔗糖的总代谢导致FBP的浓度相对减少，从而缓解变构抑制。这两个因素的同步效果导致甘油代谢的增加。

[0028] 作为另一个实例，其为以下方法：增加图1B部分2中的磷酸化的IIA的浓度以诱导AC的表达，从而更多的产生cAMP以增加CRP-cAMP的产生，因而诱导glp操纵子的表达。因此由额外表达的GlpK产生的G3P使得转录抑制物GlpR从glp调节子的DNA结合位点上分离以促进glp调节子基因的转录，从而导致甘油代谢的增加。

[0029] 作为另一个实例，其为以下方法：诱导图1B部分3中的AC过表达使更多地产生cAMP以增加CRP-cAMP的产生，从而诱导glp操纵子的表达。由额外表达的GlpK产生的G3P将转录抑制物GlpR从glp调节子的DNA结合位点上分离以促进glp调节子基因的转录，从而导致甘油代谢的增加。

[0030] 作为另一个实例，其为以下方法：同时诱导图1B部分4中的CRP过表达和图1B部分3的AC过表达从而增加CRP-cAMP的产生，从而诱导glp操纵子的表达。由额外表达GlpK产生G3P，使得转录抑制物GlpR从glp调节子的DNA结合位点上分离以促进glp调节子基因的转录，从而导致甘油代谢的增加。

[0031] 作为另一个实例，其为以下方法：诱导图1B部分4中的CRP过表达，从而增加CRP-cAMP的产生，因此诱导glp操纵子的表达。通过额外表达的GlpK产生的G3P将转录抑制物GlpR从glp调节子的DNA结合位点上分离以促进glp调节子基因的表达，从而导致甘油代谢的增加。

[0032] 作为另一个实例，其为诱导图1B部分5中的GlpK过表达从而增加G3P的产生的方法。其将转录抑制物GlpR从glp操纵子的DNA结合位点上分离以促进glp操纵子基因的转录，从而导致甘油代谢的增加。

[0033] 作为另一个实例，其为过表达glp操纵子的所有基因或过表达一些基因的多种组合从而导致甘油代谢增加的方法。

[0034] 作为另一个实例，其为以下方法：将没有GlpR可以结合的位点的过表达启动子引入启动子位点以表达图1B部分5中的染色体上的glp操纵子的每一个转录单元，从而根本性地阻断GlpR导致的抑制且过表达glp调节子，从而导致甘油代谢增加。

[0035] 此外，还有移除GlpR因而解除glp操纵子的表达抑制从而导致甘油代谢增加的方法。作为另一个实例，其为减少图1B部分6和7中的IIA和/或FBP的浓度从而减弱GlpK引起的变构抑制的程度，由此导致甘油代谢增加的方法。

[0036] 除前述所列方法以外，还有这些方法可能的组合，例如，设计源自异源菌株的甘油激酶以受到较少的变构抑制或受到变构抑制时过表达从而导致甘油代谢的增加的方法。此外，还有解除分解代谢抑制机制从而激活甘油代谢的方法。

[0037] 琥珀酸是典型的还原性化学品，其包括二个羧基，并以PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）作为中间前体的C4化合物。产琥珀酸微生物是指与其他微生物相比生产更多琥珀酸并能用于商业化地发酵生产琥珀酸的微生物。典型的产琥珀酸微生物包括瘤胃细菌。已知的瘤胃细菌包括放线杆菌属菌(Actinobacillus sp.)，厌氧螺菌属菌(Anaerobiospirillum sp.)和曼海姆菌属菌（Mannheimia sp.,其包括Basfia属菌（Basfia sp.），Basfia属最初分离时被命名为曼海姆菌属，后命名为“Basfia属”，且其16S rRNA序列与曼海姆菌属菌具有99.8%的同一性，因此Basfia属在本发明也被称为“曼海姆菌属”/Scholten等，WO2009/024294A；Kuhnert等，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.，60:44）。从已知多种生产琥珀酸的瘤胃细菌的部分基因信息（16s rRNA）、酶分析和发酵结果发现这些瘤胃细菌中从碳源生产琥珀酸的主要生物合成途径几乎与瘤胃细菌曼海姆菌属菌生产琥珀酸的生物合成途径相同。特别是参与琥珀酸生产的所有瘤胃细菌利用二氧化碳固定酶将C3化合物（磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸盐）转化成C4化合物（草酰乙酸和苹果酸）并将C4化合物转化成延胡索酸，从而产生琥珀酸（Zeikus等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，51:545，1999；Lee等，
Appl.Environ.Microbiol.，72:1939，2006）。换言之，所有的瘤胃细菌（包括曼海姆菌属菌）有相同的生物合成琥珀酸的途径，并且对于本领域技术人员而言，本发明的基因突变能应用到除本发明实施例中所示的曼海姆产琥珀酸菌以外的源自瘤胃细菌的产琥珀酸菌株上是显而易见的。

[0038] 本发明中，产琥珀酸微生物可以是瘤胃细菌。该瘤胃细菌可以选自由曼海姆菌属菌、放线杆菌属菌和厌氧螺菌属菌组成的组。

[0039] 本发明中，曼海姆菌属菌株可以是曼海姆产琥珀酸菌PALK（KCTC10973BP）。

[0040] 本发明中，可以通过删除编码果糖磷酸转移酶的基因解除分解代谢抑制机制，并且突变微生物可以是曼海姆产琥珀酸菌PALFK（KCTC11694BP）。

[0041] 本发明中，可以通过引入编码甘油激酶的基因解除分解代谢抑制机制，并且产琥珀酸突变微生物可以是曼海姆产琥珀酸菌PALFK（KCTC11694BP）。

[0042] 本发明中，通过基因操纵产琥珀酸微生物的瘤胃细菌而构建提供琥珀酸的最高产量且不产生其他有机酸的产琥珀酸突变微生物。

[0043] 在本发明的一个实例中，通过从曼海姆产琥珀酸菌PALK（KCTC10973BP）的基因组DNA中删除果糖磷酸转移酶编码基因（fruA）而构建具有同时代谢蔗糖和甘油的能力的曼海姆产琥珀酸菌PALFK（KCTC11694BP）。该构建的菌株以高产量和生产能力产生琥珀酸且不产生副产物。

[0044] 本发明中，通过采用同源重组方法失活该目标基因而删除基因。尽管如此，在本发明中可以使用任何基因操纵方法而没有特殊的限定，只要其可以修饰或消除目标基因从而不产生该目标基因编码的酶。

[0045] 本发明中，可以通过任何常规发酵过程中已知方法培养产琥珀酸突变微生物和回收琥珀酸。

[0046] 本发明中，在曼海姆产琥珀酸菌PALFK（KCTC11694BP）和常规突变株（曼海姆产琥珀酸菌PALK（KCTC10973BP））之间比较琥珀酸的产量、副产物的产生和碳源代谢能力。曼海姆产琥珀酸菌PALK（KCTC10973BP）是通过从曼海姆菌属菌株基因组中删除乳酸脱氢酶编码基因（ldhA）、磷酸转乙酰酶编码基因（pta）和乙酸激酶编码基因（ackA）而获得的突变微生物，其是未删除果糖磷酸转移酶编码基因（fruA）的本发明突变微生物曼海姆产琥珀酸菌PALFK（KCTC11694BP）的亲本株。

[0047] 与产琥珀酸突变株曼海姆产琥珀酸菌PALK（KTCT10973BP）相比，本发明的产琥珀酸突变微生物曼海姆产琥珀酸菌PALFK（KCTC11694BP）的副产物（包括乳酸、丙酮酸、乙酸和甲酸）的产生最小化并且增加了琥珀酸的生产能力并接近理论产量（1.71-1.86mol/mol），表明其是生产琥珀酸的优良菌株。

[0048] 另一方面，本发明涉及制备能利用蔗糖和甘油生产琥珀酸的突变微生物的方法，该方法包括解除产琥珀酸微生物中的蔗糖介导的甘油分解代谢抑制机制。

[0049] 本发明的另一实例，通过将大肠杆菌甘油激酶编码基因导入曼海姆产琥珀酸菌PALK（KCTC10973BP）的基因组DNA中而构建具有同时代谢蔗糖和甘油能力的曼海姆产琥珀酸菌PALKG（KTCT11693BP）。该构建的菌株以高生产能力和产量生产琥珀酸且不产生副产物。

[0050] 也以之前描述的方式比较了产琥珀酸微生物曼海姆产琥珀酸菌PALKG（KCTC11693BP）。

[0051] 另一方面，本发明还提供生产琥珀酸的方法，该方法包括步骤：在厌氧条件下培养前述产琥珀酸突变微生物；和从发酵液中回收琥珀酸。

[0052] 本发明中，可在含有蔗糖和甘油二者的培养基中进行培养，且作为副产物的其他有机酸的产量是琥珀酸产量的1wt%或更少。

[0053] 另一方面，本发明还涉及生产能力提高的生产琥珀酸的方法，该方法包括步骤：（a）在厌氧条件下培养以高产量生产琥珀酸的同时很少或不产生副产物的突变微生物，或者为了能够同时利用蔗糖和甘油而解除蔗糖介导的甘油分解抑制机制所获得的突变微生物（；b）浓缩发酵液中的微生物细胞达到高浓度；（c）培养该高浓度细胞；和（d）从发酵液中回收琥珀酸。

[0054] 本发明中，浓缩发酵液中的细胞达到高浓度的步骤（b）可以通过接种高浓度生产菌株的接种法或膜式细胞循环生物反应器（MCRB）法（以下简称“MCRB法”）实现。

[0055] 依照使用能同时利用蔗糖和甘油以生产琥珀酸的本发明突变微生物的产琥珀酸的方法，可以以接近理论产量的超高产量生产琥珀酸且没有副产物。蔗糖的价格是通常用于微生物发酵生产琥珀酸的葡萄糖价格的大约1/4。而且，随着全球生物柴油制造的快速增长，产生了作为副产物的甘油，并因超量供应和需要一种处理甘油的合适方法使其价格降低。因此，甘油的价格非常低并持续的下降（Miller-Klein Associates，Oct.2006）。本发明的生产琥珀酸的方法的极高价值体现在能够低成本地通过微生物发酵生产琥珀酸，不是需要大量原材料成本的化学合成方法，以接近理论产量的超高产量生产琥珀酸，并且以超高纯度生产琥珀酸，从而使分离和纯化的成本最小化。

[0056] 使用本发明的PALFK株能够以非常高的接近理论产量（1.71到1.86mol/mol）的产量生产均一琥珀酸且没有副产物。三个因素（包括生产能力、产量和副产物/琥珀酸的比率）是琥珀酸生产的工业化中最关键的因素。确切地说，与初始投资成本和能源成本相关的生产能力以及产量是原材料的有效使用的衡量标准，并且与占据生物工艺成本重要部分的原材料成本有关；副产物/琥珀酸的比例与占据生物工艺总成本的一半或更多的分离和纯化成本有关。

[0057] 因此，本发明的一个实例中，使用PALFK菌株，使产量最大化并且使副产物/琥珀酸的比例最小化，将如前所述的三个关键因素中的两个（产量和副产物/琥珀酸的比率）改进到可达到的最高水平。此外，为找到改进生产能力的方法进行了广泛的努力，结果发现接种法和MCRB法增加发酵液中的细胞浓度并提高琥珀酸生产能力，分别是亲本株的至少2倍和10倍。

[0058] 实施例

[0059] 以下，在关于实例的更多细节方面描述本发明。显然对于本领域普通技术人员而言，这些实例仅为说明用途而不能解释为限制本发明的范围。

[0060] 尤其是，为了依据本发明删除基因，下述实例仅举例说明特定性的载体和作为宿主细胞的产琥珀酸微生物曼海姆菌属菌。尽管如此，显然对于本领域技术人员而言，使用其他种类的产琥珀酸微生物也能够提供产高纯度琥珀酸的突变微生物。

[0061] 实施例1：构建fru-A删除载体（pSacHR06fruA）

[0062] 为了通过同源重组从产琥珀酸微生物的基因组中删除fruA基因（果糖磷酸转移酶编码基因），以下述方式构建基因交换载体（交换基因的载体）。首先，以曼海姆产琥珀酸菌MBEL55E（KCTC0769BP）的基因组DNA作为模板，以引物对SEQ ID NOS:1和2、引物对SEQ ID NOS:3和4以及引物对SEQ ID NOS:5和6分别进行PCR，从而分别获得包括fruA左侧同源区域（HL）、氯霉素（Cm）抗性基因和fruA右侧同源区域（HR）的PCR片段。

[0063] 之后，使用上述三个PCR片段作为模板以及引物SEQ ID NOS:1和6进行重叠PCR，DNA片段用SacI和PstI消化并插入pSacHR06载体，从而构建获得pSacHR06fruA载体。

[0064] SEQ ID NO:1:5'-ATCGCGGATCCGGTGGAAACCCTCGGTTTATT

[0065] SEQ ID NO:2:5'-AATCTGCTCTGATGCGCAGCTAAAACCTGGTGCAATA

[0066] SEQ ID NO:3:5'-CCAGGTTTTAGCTGCGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAG

[0067] SEQ ID NO:4:5'-AATTACACTTGAAACCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTAC

[0068] SEQ ID NO:5:5'-ATCCACAGAATCAGGGTTTCAAGTGTAATTGGCGGAG

[0069] SEQ ID NO:6:5'-TCGACGCGTCGACTTCATCTAACCCCAACGCTTG

[0070] 实施例2：构建曼海姆产琥珀酸菌PALFK株

[0071] 使用出于删除fruA基因的目的而在实施例1中构建的pSacHR06fruA载体从曼海姆产琥珀酸菌PALK（KCTC10973BP）的基因组中删除fruA而构建突变株。

[0072] 尤其是，接种曼海姆产琥珀酸菌PALK（KCTC10973BP）到BHI（Brain-Heart Infusion）固体培养基，39℃培养36小时。将形成的克隆接种到10mL BHI液体培养基并培养12小时。以1%的浓度将充分生长的细胞发酵液接种到100mL BHI液体培养基并在39℃下静态培养器中培养。

[0073] 大约4-5小时后，发酵液的OD600达到大约0.3-0.5时，0-4℃保持20分钟使得细胞不再生长。之后，4℃、4,500rpm离心发酵液15分钟以收集细胞。之后，在4℃下用200mL10%的甘油溶液重悬细胞并在前述条件下离心。重悬和离心共进行三次，同时每次减少1/210%甘油溶液的体积。最终获得的细胞用等体积10%甘油溶液重悬，分装并储藏在-80℃。

[0074] 如前所述获得的该细胞浓缩悬液与实施例1中构建的基因删除载体pSacHR06fruA混合并在2.5kV、25μF和200ohms的条件下进行电穿孔以用载体转化曼海姆产琥珀酸菌PALK（KCTC10973BP）。添加电穿孔细胞到BHI液体培养基并在39℃下静态培养器中孵育1小时。之后，接种培养液到包含6.8μg/mL抗生素氯霉素的BHI固体培养基上并在39℃下静态培养器中孵育48小时或更长时间。为了筛选发生双交叉的克隆，将形成的克隆接种到包含氯霉素（6.8μg/mL）和100g/L蔗糖的BHI固体培养基上并培养24小时，此后将形成的克隆再次接种到同样的培养基上。

[0075] 在包含抗生素的BHI液体培养基中培养已在培养基上形成的突变株，并用Rochelle等的方法（Rochelle等，FEMS Microbiol.Lett.，100:59,1992）从培养的菌株中分离基因组DNA。用突变株中分离的基因组DNA作为模板进行PCR，并且对PCR产物进行电泳以确定fruA基因是否从基因组DNA中删除。通过下述方式进行两次PCR确定是否删除了fruA基因。首先，以突变株基因组DNA作为模板和引物对SEQ ID NOS:7和8以及引物对SEQ ID NOS:9和10分别进行PCR。对两次PCR获得的PCR片段进行电泳以通过大小确定fruA的删除。结果，构建了曼海姆产琥珀酸菌PALFK（KCTC11694BP）并保藏在韩国典型培养物保藏中心（Korean Collection for Type Cultures），韩国生物科学和生物技术研究所（Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology），保藏编号KCTC11694BP。

[0076] SEQ ID NO:7:5'-CTATGATTTGGTCGGGCGTTT

[0077] SEQ ID NO:8:5'-TGAATGGCAGAAATTCGAAA

[0078] SEQ ID NO:9:5'-TGATCTTCCGTCACAGGTAT

[0079] SEQ ID NO:10:5''TTGACCGCACTTTGCACATC

[0080] 实施例3：构建pME18glpK22载体和构建转入该载体的曼海姆产琥珀酸菌PALKG株[0081] 为了获取包含大肠杆菌甘油激酶编码基因（glpK22）的DNA，使用大肠杆菌（Escherichia coli）K-12MG1655（ATCC47076；美国典型培养物保藏中心，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国）的基因组DNA和引物对SEQ ID NOS:11和12、引物对SEQ ID NOS:13和14以及引物对SEQ ID NOS:15和16分别进行PCR。之后，以获得的三个PCR产物作为模板进行PCR。PCR产物包含glpK22基因，所述glpK22基因中编码序列的第913对碱基由原始大肠杆菌K-12MG1655的glpK基因的鸟嘌呤变为腺苷。已知相对于非突变glpK，glpK基因表达产生的甘油激酶遭受较少的FBP和IIA引起的变构抑制（Pettigrew等，J.Bacteriol.，178:2846，
1996）。

[0082] SEQ ID NO:11:5'-ACTCCGGAATTCAACGCACTGACAATCTCACTT

[0083] SEQ ID NO:12:5'-CAGCGAAGCTTTTTGGGTAGAAAGTATAAAGACAGAATCACA

[0084] SEQ ID NO:13:5'-TTTATACTTTCTACCCAAAAAGCTTCGCTGTAATATG

[0085] SEQ ID NO:14:5'-CCATAAACACCGCACTTTCCAACGCATAGTTCACTTC

[0086] SEQ ID NO:15:5'-AACTATGCGTTGGAAAGTGCGGTGTTTATGGCAGG

[0087] SEQ ID NO:16:5'-ACCTGCGAGCTCATTATTGATGTGTGCGGGGT

[0088] 将如上获得的PCR产物克隆到pME18（Jang等，Appl.Environ.Microbiol.，73:5411，2007）的EcoRI和SacI位点，从而构建pME18glpK22载体。并且使用引物SEQ ID NOS:17到21由Sogent公司（韩国）对载体进行测序。

[0089] SEQ ID NO:17:5'-TAGCTATGTGTTAAAGCCTT

[0090] SEQ ID NO:18:5'-ACCAGGGCACCACCAGCTCC

[0091] SEQ ID NO:19:5'-CCGATTACACCAACGCCTCT

[0092] SEQ ID NO:20:5'-ATGTGGTTCCGGCATTTACC

[0093] SEQ ID NO:21:5'-TTATGCCGCATCCGGTAGTCCC

[0094] 将如前所述构建的pME18glpK22载体转入曼海姆产琥珀酸菌PALK（KCTC10973BP）以构建曼海姆产琥珀酸菌PALKG（KCTC11693BP）株。为了导入该表达载体，如实施例2中所描述的进行细胞浓缩悬液的制备和电穿孔，并且将细胞接种到含有25μg/mL氨苄青霉素（代替氯霉素）的BHI固体培养基上，并在39℃下静态培养器中培养48小时。生成的纯克隆在BHI液体培养基中培养8小时，之后与甘油溶液混合使终浓度为15%（w/v），在这之后，细胞溶液被储存在-80℃备用。

[0095] 实施例4：使用曼海姆产琥珀酸菌PALFK株和PALKG株生产均一琥珀酸

[0096] 在含有10g/L蔗糖的10mL MH5培养基（每升，2.5g酵母提取物，2.5g蛋白胨，1g NaCl，0.02g CaCl2·2H2O，0.2g MgCl2·6H2O,8.7g K2HPO4,and10.0gNaHCO3）中和39℃厌氧条件下，培养实施例2和3中构建的曼海姆产琥珀酸菌PALFK（KCTC11694BP）或PALKG（KCTC11693BP）达8小时。之后，在300mL同样的培养基中培养菌株。接种发酵液到包含2.5L合成培养基（每升，1g NaCl,2g(NH4)2HPO4,0.02g CaCl2.2H2O,0.2g MgCl2.6H2O,8.709g K2HPO4,0.5g半胱氨酸,0.5g甲硫氨酸,0.5g丙氨酸，0.5g天冬酰胺,0.5g天冬氨酸,2.46g脯氨酸,0.5g丝氨酸,0.005g烟酸,0.005g泛酸钙,0.005g盐酸吡哆醇,0.005g硫胺,0.005g抗坏血酸和0.005g生物素）的微生物反应器（Bioflo3000，New Brunswick Scientific Co.，Edison，新泽西州，美国）中进行发酵。在22.25g/L（65mM）起始蔗糖浓度、4.6g/L（50mM）起始甘油浓度、39℃的温度、200rpm，同时向反应器中以0.2vvm（二氧化碳体积/培养器工作体积/每分）的速度通入纯二氧化碳的条件下进行发酵。发酵过程中，使用氨水调节发酵液的pH值到6.5，并且添加以下抗生素：对于PALK添加50μg/mL壮观霉素，对于PALFK添加6.8μg/mL氯霉素，对于PALKG添加25μg/mL氨苄青霉素。为生产高浓度的琥珀酸，当碳源完全消耗时，半连续地将700g/L蔗糖和甘油溶液添加到发酵液中。为与PALFK的性能相比较，以前述相同的方式培养产琥珀酸菌株曼海姆产琥珀酸菌PALK（KCTC10973BP）。用分光光度计测量并用之前测量的分光光度计的吸收值和干细胞重量的验证试验计算发酵液中的细胞浓度。发酵期间，定期地从生物反应器中收集样品。13,000rpm离心所收集的样品10分钟，之后通过高效液相色谱（HPLC）分析上清液中的多种代谢物、琥珀酸、蔗糖和甘油的浓度。

[0097] 结果，如图2和表1中所示，与曼海姆产琥珀酸菌PALK（KCTC10973BP）相比，曼海姆产琥珀酸菌PALFK（KCTC11694BP）显示了更高的琥珀酸产量并且产生了高纯度的琥珀酸且不产生副产物。甘油摄取的减少与增加大约7倍的琥珀酸表现的程度一致，并且甘油的摄取与副产物产生的减少直接相关，因为与使用蔗糖不同，使用甘油没有介导与副产物直接相关的丙酮酸盐的产生。此外，增加的甘油摄取可以减少需用的蔗糖的量，从而使用减少的碳源量以高产量生产均一琥珀酸。

[0098] 曼海姆产琥珀酸菌PALKG（KCTC11693BP）还显示了与PALFK株稍微不同的模式，其中在不削弱蔗糖利用和细胞生长的范围内增加PALKG株中甘油的利用，并因此维持丙酮酸盐的积累与PALK株相同的水平。然而，PALKG株利用甘油的能力比PALK株至少高两倍，结果，PALKG株以1.39mol/mol的产量生产琥珀酸，其比PALK株（1.24mol/mol）高。

[0099] 表1:曼海姆株培养物的特征

[0100]菌株 PALK PALFK PALKG
蔗糖(g/L) 77.88 39.80 61.87
甘油(g/L) 5.52 29.75 11.84
琥珀酸(g/L) 65.05 68.41 64.67
丙酮酸(g/L) 8.00 0 7.70
乙酸(g/L) 1.43 1.03 0.62
全部副产物(g/L) 9.44 1.03 8.32
副产物/琥珀酸 0.15 0.02 0.13
产量(mol/mol) 1.24 1.57 1.39

[0101] *蔗糖和甘油的值以摄取的值表示，琥珀酸、丙酮酸和乙酸的值是酸的产生量。产量通过计算折算成葡萄糖等价物的蔗糖和甘油的量获得。

[0102] **蔗糖和甘油、产生量和产量都是三次独立实验的平均值。

[0103] 实施例5：改善生产高产量均一琥珀酸的曼海姆产琥珀酸菌PALFK株的琥珀酸生产能力

[0104] 在本实施例中，测验了改善生产高产量均一琥珀酸的曼海姆产琥珀酸菌PALFK株的琥珀酸生产能力的方法。

[0105] 如图2B中可见，接种后13-15小时PALFK株达到最高生产能力，并且与此同时细胞浓度也最高。因此，为了最大化琥珀酸生产能力，测验了增加细胞浓度导致的生产能力的改变。

[0106] 为了测验琥珀酸生产能力的改变，在如实施例4中描述的培养条件下，PALFK的起始细胞浓度增加到OD600=9.03时，进行下述实验。如实施例4中所述，在装有含22.25g/L蔗糖和10g/L甘油的5L MHI培养基的微生物反应器（Bioflo 3000）中，在温度为39℃且200rpm同时以0.2vvm（二氧化碳体积/培养器工作体积/每分钟）的速度向培养基中通入纯二氧化碳的条件下进行发酵。发酵过程中，通过添加氨水调节发酵液的pH值到6.5，并且向培养基添加6.8μg/mL抗生素氯霉素。PALFK株的细胞浓度达到OD600大约为4.6，培养过程终止，并且在室温下6000rpm离心发酵液10分钟以收集细胞沉淀。收集的细胞沉淀用300mL MH5培养基重悬以获得高浓度的接种物，其在之后被接种到实施例4所述的合成培养基中并在所述的条件下培养。结果，如图3和表2中可见，琥珀酸的生产能力为6.03g/L/h（最高生产能力：10.69g/L/h），比最初的条件至少高两倍，且副产物产生的程度和琥珀酸的产量与在最初的条件下的几乎相同。

[0107] 基于这些结果，为了人为地增加细胞浓度，使用了膜式细胞循环生物反应器（MCRB）系统（图4A）。

[0108] MCRB系统中，将用于细胞循环的空纤维膜装置（CellFlo Plus Module；Spectrum Laboratories Inc.，Rancho Dominguez，加州，美国）与Bioflo110反应器（New Brunswick Scientific Co.）相连，且生物反应器的工作体积维持在0.4L。生物反应器中的搅拌速度保持在100rpm，且用于细胞循环的膜片泵设定为150mL/min的速度。

[0109] 合成培养基的成分与实施例4中使用的相同，不同的是包含0.5g/L脯氨酸。生物反应器中，起始蔗糖浓度为22.25g/L，起始甘油浓度为4.6g/L，以及给料槽中，使用30g/L蔗糖和21g/L甘油。MCRB运转过程中，稀释速度（D）维持在1.027h-1，决定细胞生长情况的细胞流出速度通常情况下维持在0.015h-1。MCRB运转过程中，至少五次分析样品以确定细胞浓度、代谢产物和碳源消耗等，其间隔长于最小周转时间（其涉及作为培养期中稀释速度（D）的变量的达到工作体积的时间；在D=1或2时，达到工作体积的时间为1小时和0.2小时），并且将这些测量结果维持在恒定水平的情况定义为通常情况。

[0110] 如前所述MCRB中进行的培养的结果显示在图4B和表2。由此可见，PALFK株的琥珀酸生产能力为29.73g/L/h，比亲本株至少高10倍。琥珀酸的产量维持在相同的水平，副产物的产生比实施例4中的略高，但仍维持在低水平。总之，如本实施例中所示，本发明人通过使用最大化产量和减少副产物产生之后增加生产能力的策略，成功实现以接近理论产量的超高生产能力29.73g/L/h和高效率（1.54mol/mol）制备琥珀酸。本实施例中显示的琥珀酸的生产能力是尚未被任何常规方法达到的超高生产能力，它在达到接近的理论产量的1.54mol/mol产量的同时达到超高生产能力具有重大意义。

[0111] 表2：多种发酵方法的PALFK株的培养物的特征

[0112]

[0113] *分批补料培养’是指在分批补料培养发酵中以高浓度细胞（起始接种后瞬间OD600=9.03）接种的分批培养。

[0114] **分批补料培养发酵的数据是三次独立实验的平均值，MCRB的数据是在达到通常情况后连续五次取样的平均值。

[0115] [微生物保藏]

[0116] 保藏机构：韩国生物科学和生物技术研究所；

[0117] 保藏编号：KCTC11693BP；

[0118] 保藏日：2010年5月10日。

[0119] 保藏机构：韩国生物科学和生物技术研究所；

[0120] 保藏编号：KCTC11694BP；

[0121] 保藏日：2010年5月10日。

[0122] 工业实用性

[0123] 如前所述，当培养产琥珀酸突变微生物时，其同时利用蔗糖和甘油使得可以以接近理论产量的最大产量的高生产能力生产琥珀酸的同时最小化副产物的产生。此外，按照本发明，能更有效地生产常规方法中以低产量产出的多种还原性化学品。

[0124] 电子文件作为附件在此附上。