[0001] 本公开涉及用于工程化光合自养生物体以转化二氧化碳和光成为脂肪酸酯和其他分子的方法和组合物，所述脂肪酸酯和其他分子然后由该生物体分泌到培养基中。 背景技术

[0002] 光合作用是生物实体利用阳光和二氧化碳产生糖以获取能量的过程。由于自然进化，光合作用是一个具有众多且知之甚少的反馈回路、控制机制和过程无效(process inefficiency)的极其复杂的系统。这个复杂的系统对于单因子轮换
(one-factor-at-a-time)和全局优化法都呈现出可能无法逾越的障碍[Nedbal等，Photosynth Res.，93(1-3)：223-34(2007)；Salvucci 等，Physiol Plant.，120(2)：
179-186(2004)；Greene等，Biochem J.，404(3)：517-24(2007)]。

[0003] 现有的光合自养生物体(如植物、藻类和光合细菌)很难适用于工业生物加工，并因此没有显示出针对这一目的的商业可行性。与工业化异养生物体如大肠杆菌(20分钟)相比，这类生物体具有缓慢的倍增时间(3-72小时)，这反应出低下的总生产力。此外，遗传操作技术(敲除、经整合或游离(episomic)质粒扩增的转基因的过表达)是低效、费时、费力的或不存在的。发明内容

[0004] 本文所述的发明确认了赋予光合自养生物体直接产生碳基产物的能力的途径和机制。所获得的产生碳基产物的工程化光合自养生物特别地能够直接从二氧化碳和光高效地产生碳基产物，无需目前 从生物质源(包括玉米、甘蔗、芒草、纤维素等)产生生物燃料和生物化学产品所必需的费时的和昂贵的处理步骤。因此，本发明的新型微生物能够通过固定二氧化碳合成从各种生物合成途径获得的碳基目的产物，还能释放这类产物。 [0005] 这类产物的范围包括醇类，如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯；烃和链烷烃，如丙烷、辛烷、柴油、JP8；聚合物如对苯二甲酸酯、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、多元醇、PHA、PHB、丙烯酸盐、己二酸、ε-己内酯、异戊二烯、己内酰胺、橡胶；商用化学品如乳酸盐、DHA、3-羟基丙酸盐、γ-戊内酯、赖氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸盐、天门冬氨酸、山梨醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸、异戊烯醇、羊毛甾醇、ω-3 DHA、番茄红素、衣康酸盐、1，
3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸、谷氨酸盐、苹果酸盐、HPA、乳酸、THF、γ-丁内酯、吡咯烷酮、羟丁酸盐、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸；特种化学品如类胡萝卜素、类异戊二烯、衣康酸；药物或药物中间体，如7-ADCA/头孢菌素、红霉素、聚酮、抑制素(statin)、紫杉醇、多烯紫杉醇、萜烯、肽、类固醇、ω-脂肪酸和其它这类适合的目的产物。
这些产物可用于燃料、生物燃料、工业和特种化学品、添加剂、作为用于制造其他产品(如营养补充剂、营养保健品、聚合物、石蜡替代品，个人护理产品和药物)的中间体。这些化合物也可以用作随后反应(例如，酯交换反应、氢化作用、经氢化、热裂解或两者结合的催化裂解或者环氧化反应)以产生其他产品的原料。

[0006] 还公开了选择和利用各种生物体直接将太阳光和二氧化碳转化成碳基产物的方法。本发明的一方面提供了一种引入编码一个或多个能够固定二氧化碳以产生和(在一些实例中)排出或分泌碳基目的产物(如乙醇、乙烯、烃、乙基酯和甲基酯)的蛋白质的工程核酸序列的方法。本文提供的显著特征是，该微生物可优选地以商业规模生产各种碳基目的产物，而无需可再生的碳基中间体或源(如生物质)作为起始原料。

[0007] 为产生至少一种所需的碳基目的产物如烃，利用了各种能够固 定二氧化碳的生物体(例如那些能够进行光合作用的生物体)或可选择地经工程化以固定二氧化碳的生物体。例如，光合自养生物体包括真核植物和藻类，以及原核蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌和紫色非硫细菌。

[0008] 在一个方面中，能够固定二氧化碳的宿主细胞被工程化以产生具有希望数目的碳的碳基产物。优选地，该宿主细胞以商业规模产生各种碳基目的产物。

[0009] 在其它的实例中，经修饰的宿主细胞是用编码参与涉及产物或中间体产生的生物合成途径的单个蛋白质的外源核酸序列遗传修饰的。在其它实施方式中，经修饰的宿主细胞是用编码参与涉及产物或中间体产生的生物合成途径的两个或多个蛋白质(例如，生物合成途径中的第一和第二个酶)的外源核酸序列遗传修饰的。

[0010] 在另一方面中，本发明提供了能够固定二氧化碳的宿主细胞，其产生乙烯。该宿主细胞可以包含编码乙烯形成酶，efe，的外源核酸。该乙烯形成酶，efe，可以包括雷尔氏菌乙烯形成酶。

[0011] 在一个实施方式中，这样一种碳基目的产物是乙醇。在一个优选的实施方式中，该宿主细胞产生商业产量的乙醇。还提供了一种利用生物体以商业规模直接将阳光、水和二氧化碳转换成乙醇的方法。另外公开了一种将产生的乙醇以及与乙醇的产生相关的吸收的二氧化碳货币化的方法。

[0012] 在某些方面中，乙醇产生通过在光照下将碳引导离开糖原并朝向丙酮酸等进行优化。糖原通常是在光中形成的，并在黑暗中消耗以减少能量。在一个实施方式中，糖原合成基因被弱化或敲除，和在其它实施方式中，使糖酵解基因成为组成型的。在其他方面中，消除了某些发酵途径，如产生乙酸、乳酸、琥珀酸等的途径(如果存在)。

[0013] 进一步在其他方面中，如果实施光-暗周期，糖原产生在光照过程中被优化(与生物量等相反)，并以干细胞重量(可以为糖原)的％增加(即，该细胞经工程化以打破阻止细胞增长全糖原的任何限制)。 然后，在黑暗中，使得从积累的糖原进行乙醇合成，已弱化或敲除了其它发酵途径。此外，公开了采用与糖原合成/代谢率相匹配的光暗周期以使浪费的时间最少(糖原未消耗且细胞非生产性地保持在黑暗中，或者在黑暗阶段中有太多糖原完全消耗)。

[0014] 在本发明的各方面中，描述了用于产生糖的遗传修饰的光合生物体。在某些实施方式中，产生了糖类，如葡萄糖、果糖或其组合。优选地，产生的糖通过单向运输蛋白或转运蛋白扩散。在其它实施方式中，糖通过在产生3-磷酸甘油醛(3PGAL)的所选择宿主细胞中表达酶来产生，并利用转运蛋白主动运输。在再另外的实施方式中，光合生物体功能性地缺乏纤维素、糖原或蔗糖合成。所获得的光合产物(如光合生物体产生的糖)可作为产生其它的碳基目的产物的原料或碳源。

[0015] 在本发明的另一方面中，本发明提供了生产麦芽糖的光合生物体。在某些实施方式中，本发明提供了糖原水解酶的克隆基因，其使工程细胞将糖原水解为葡萄糖和/或麦芽糖并从细胞运输麦芽糖和葡萄糖。用于从细胞运输麦芽糖的酶包括用于麦芽糖运输的叶绿体麦芽糖排出泵：MEX1；葡萄糖通透酶，低和高Km、葡萄糖:H+协同转运蛋白、葡萄糖/果糖通透酶、用于葡萄糖运输的总糖:H+反向转运蛋白；和葡萄糖-6磷酸:Pi反向转运蛋白、用于葡萄糖-6-磷酸运输的丙糖磷酸:磷酸反向转运蛋白是本发明可预想的转运机制。 [0016] 在另一个实施方式中，通过对各种能够固定二氧化碳的或者经工程化以固定二氧化碳的生物体进行工程化来产生烃。在一个实施方式中，该微生物引入了一个或多个编码乙酰CoA:ACP酰基转移酶活性(fabH)、乙酰CoA羧化酶活性(accBCAD)、丙二酰CoA:ACP酰基转移酶活性(fabD)、3-酮酰-ACP合成酶活性(fabB)、3-酮酰-ACP还原酶活性(fabG)、3-羟酰-ACP脱水酶活性(fabA)、烯酰-ACP还原酶活性(fabI)、酰基-ACP水解酶活性(FAS1)、醛脱氢酶活性(adhA、adhB)、醇脱氢酶活性(ADH I)、烷烃1-单加氧酶活性(alkB)的外源核酸序列。

[0017] 可以过表达以产生脂肪酸衍生物的其它基因为例如，pdh、panK、aceEF(编码丙酮酸和2-酮戊二酸脱氢酶复合体的EIp脱氢酶成分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶成分，登 录 号：NP_414656，NP_414657，EC：1.2.4.1.2.3.1.61，2.3.1.12)、accABCD/fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(编码FAS，登录号：CAD85557，CAD85558，NP_842277，NP_841683，NP_415613，EC：2.3.1.180，2.3.1.39，1.1.1.100，1.6.5.3，2.3.1.179)、编码脂酰CoA还原酶(登录号：AAC45217，EC1.2.1.-)的基因、UdhA或类似的基因(编码吡啶核苷酸转氢酶，登录号：CAA46822，EC：1.6.1.1)和编码脂酰CoA还原酶(登录号：AAC45217，EC1.2.1.-)的基因。

[0018] 与表达使得产生脂肪酸衍生物的外源核酸序列相反，宿主可以有一个或多个功能缺失或弱化的内源性基因。例如，可以至少弱化ackA(EC 2.7.2.1)、ackB(EC 2.7.2.1)、adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)、fabF(EC 2.3.1.179)、fabR(登录号NP_418398)、fadE(EC1.3.99.3，1.3.99.-)、GST(EC 6.3.2.3)、gpsA(EC 1.1.1.94)、ldhA(EC 1.1.1.94)、pflB(EC 2.3.1.54)、plsB(EC 2.3.1.15)、poxB(EC 1.2.2.2)、pta(EC2.3.1.8)、谷胱甘肽合成酶(EC 6.3.2.3)及其组合。

[0019] 这类微生物可以经工程化以产生具有限定碳链长度、分支和饱和度的烃或脂肪酸。

[0020] 在一些实施方式中，表达了由外源核酸序列编码的肽类(例如硫酯酶)以提供均质的产物，这将降低与发酵和分离有关的整体成本。

[0021] 在一些实施方式中，微生物包含一个或多个外源工程核酸，其编码酰基CoA合成酶(EC6.2.1.3)、硫酯酶(EC3.1.2.14)、蜡合成酶(EC2.3.1.75)、醇乙酰转移酶(EC2.3.1.84)或其组合。在另外的实施方式中，微生物包含编码硫酯酶(EC3.1.2.14)、酰基CoA还原酶(EC1.2.1.50)、醇脱氢酶(EC1.1.1.1)、脂肪醇形成酰基CoA还原酶(EC1.1.1.*)或其组合的工程核酸。

[0022] 在一些实施方式中，本文所述的微生物产生每升发酵培养基至少1mg的碳基目的产物，例如，烃。在更优选的实施方式中，微生 物产生至少100mg/L、500mg/L、1g/L、5g/L、10g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、50g/L、100g/L或120g/L的烃。在一些实施例中，所述烃由微生物产生和释放，且在另外的实施例中，微生物在产物分离之前被裂解。 [0023] 在某些实施例中，所述烃包含至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、
30、32或34个碳长的碳链。在一些实施例中，至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的制备的烃产物包含2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34个碳长的碳链。在再另外的实施例中，至少60％、70％、80％、85％、90％或95％的脂肪酸衍生产物包含
1、2、3、4或5个不饱和点。

[0024] 如WO 2007/136762(通过引用以其整体和全面引入)所示，可对某些生物合成途径工程化以产生脂肪醇和蜡/脂肪酸酯，各底物(乙酰-CoA、丙二酰-CoA、酰基-ACP、脂肪酸和酰基-CoA)各个产物(乙酰-CoA、丙二酰-CoA、酰基-ACP、脂肪酸和酰基-CoA)的转化可以通过使用几种不同的多肽(其为所示的酶类的成员)而实现。

[0025] 本文所述的宿主可以产生醇类(短链、长链、支链的或不饱和的)。这些醇可以直接被用作燃料或其可以被用于产生酯，即如上所述酯的A侧。这种酯单独地或与本文所述的其他脂肪酸衍生物结合是用作燃料。

[0026] 类似地，本文所述的微生物所产生的烃可用作生物燃料。这些基于碳氢化合物的燃料可以被设计为包含分支点、限定的饱和度和特定的碳长度。当单独地或与其他脂肪酸衍生物结合用作生物燃料时，烃可另外与添加剂或其它传统燃料(醇类、源自甘油三酯的柴油和基于石油的燃料)相结合。

[0027] 在一个实施方式中，本发明提供了一种工程微生物宿主细胞，其中所述工程宿主细胞包含一个或多个工程核酸，并且其中所述工程宿主细胞能够利用最少量的光能直接从二氧化碳和水合成碳基目的产物，和其中所述碳基目的产物选自于乙基酯、甲基酯、蔗糖、 醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯、烃、正链烷烃、丙烷、辛烷、柴油、JP8、聚合物、对苯二甲酸盐、多元醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、PHA、PHB、丙烯酸盐、己二酸、ε-己内酯、异戊二烯、己内酰胺、橡胶、乳酸盐、DHA、3-羟基丙酸盐、γ-戊内酯、赖氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸盐、天门冬氨酸、山梨醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸、异戊烯醇、羊毛甾醇、ω-3DHA、番茄红素、衣康酸盐、1，3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸、谷氨酸盐、苹果酸盐、HPA、乳酸、THF、γ-丁内酯、吡咯烷酮、羟丁酸盐、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、衣康酸、柠檬烯、药物或药物中间体、红霉素7-ADCA/头孢菌素、聚酮、抑制素、紫杉醇、多烯紫杉醇、萜烯、肽、类固醇以及ω-脂肪酸。 [0028] 在另一个实施方式中，宿主细胞所包含的工程核酸编码乙烯形成酶(Efe)活性。在相关的实施方式中，该乙烯形成酶选自于菜豆晕疫病菌(Pseudomonas syringae pv.Phaseolicola)D13182、豌豆细菌性枯萎病菌(P.syringae pv.Pisi)AF101061和青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)AL646053。在另一个实施方式中，该工程核酸编码密码子优化的雷尔氏菌(Ralstonia)乙烯形成酶。在相关的实施方式中，该密码子优化是对于大肠杆菌(Eschericia coli)密码子选择进行的。在再另一相关的实施方式中，该工程核酸是SEQ ID NO.7。

[0029] 在一些实施方式中，本发明的工程细胞产生高于每升发酵培养基约1mg、100mg、500mg、1g、5g、10g、20g、25g、30g、35g、40g、50g、100g、120g或150g的量的乙烯。 [0030] 在某些实施方式中，本发明的工程细胞所包含的工程核酸编码醇脱氢酶活性。在相关的实施方式中，该醇脱氢酶活性选自于运动发酵单胞菌(Z.mobilis)adhII、运动发酵单胞菌adhII TS42和运动发酵单胞菌adhB活性。在另一个相关的实施方式中，该工程核酸编码NADPH依赖性醇脱氢酶活性。在再另一个实施方式中，其中该NADPH依赖性醇脱氢酶活性是穆尔氏菌(Moorella)HUC22-1种adhA。

[0031] 在另一个实施方式中，本发明的工程细胞所包含的工程核酸编码丙酮酸脱羧酶活性。在相关的实施方式中，该丙酮酸脱羧酶活性选自于Z.palmae和运动发酵单胞菌pdc活性。

[0032] 在一些实施方式中，本发明的工程细胞在培养中能够在72小时内以每升培养基至少约249mg的产量产生乙醇。在另一些实施方式中，整个72小时内的乙醇产量为至少约296mg/L。而在再另外的实施方式中，乙醇产量是介于约2.5至约5g/L培养基·小时之间。
在另一些实施方式中，72小时后所述培养基中乙醛的水平为低于约14mg/L。在其它实施方式中，该细胞在培养中产生每OD至少约36mg/L的乙醇，或者每OD至少约47mg/L的乙醇。 [0033] 在另一个实施方式中，本发明的工程细胞所包含的工程核酸编码蛋氨酸合成酶活性。

[0034] 在另一个实施方式中，本发明的工程细胞所包含的工程核酸编码选自于大肠杆菌糖磷酸转运蛋白UhpT(NP_418122.1)、拟南芥(A.thaliana)葡萄糖-6-磷酸转运蛋白GPT1(AT5G54800.1)和拟南芥葡萄糖-6-磷酸转运蛋白GPT2(AT1G61800.1)的磷酸转运蛋白活性。

[0035] 在另一实施方式中，本发明的工程细胞所包含的工程核酸编码选自于人(H.sapiens)葡萄糖-6-磷酸酶G6PC(P35575)、大肠杆菌葡萄糖-1-磷酸酶Agp(P19926)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)葡萄糖-1-磷酸酶AgpE(Q6EV19)和大肠杆菌酸性磷酸酶
YihX(P0A8Y3)的磷酸酶活性。

[0036] 在另一个实施方式中，本发明的工程细胞所包含的工程核酸编码选自于人葡萄糖转运蛋白GLUT-1、-3或-7(P11166、P11169、Q6PXP3)、酿酒酵母(S.cerevisiae)己糖转运蛋白HXT-1、-4或-6(P32465、P32467、P39003)和运动发酵单胞菌葡萄糖单向转运蛋白Glf(P21906)的葡萄糖/己糖转运蛋白活性。在相关的实施方式中，本发明的工程细胞进一步包含编码葡萄糖/果糖:H+协同转运蛋白、集胞藻(Synechocystis)属的种(P15729)的GlcP细菌GlcP、主要葡萄糖(或2-脱氧葡萄糖)吸收转运蛋白GlcP Q7BEC、己糖(葡萄糖和果糖)转运蛋白、恶性疟原虫 (Plasmodium falciparum)O97467的PfHT1、Glut-1转运蛋白或Glut-2转运蛋白的工程核酸。

[0037] 在另一个方面中，本发明所提供的工程细胞中选自于纤维素合成酶、糖原合成酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖磷酸化酶、α-1，4-葡聚糖裂合酶和1，4-α-葡聚糖分支酶的酶活性弱化。在相关的方面中，该工程细胞进一步包含编码磷酸酶或者己糖激酶活性的工程核酸。 [0038] 在再另一个实施方式中，本发明提供了包含选自于α-，β-，γ-淀粉酶；葡糖淀粉酶；异淀粉酶；支链淀粉酶；麦芽糖转葡糖基酶；淀粉-α-1，6-葡萄糖苷酶；磷酸化酶激酶和磷酸化酶的糖原水解活性的工程细胞。

[0039] 在再另一个实施方式中，本发明提供能够产生选自于葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、麦芽糖和麦芽糖磷酸的糖或糖磷酸酯的工程细胞。在相关的实施方式中，该细胞能够产生高于其内源性水平的糖或糖磷酸酯并将所述糖运输至细胞外。在再另一相关的实施方式中，该细胞产生的糖选自于包括葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、木糖、戊糖、鼠李糖和阿拉伯糖的糖类。在某些方面中，本发明的工程细胞在培养中能够以高于每升发酵培养基约1mg、100mg、500mg、1g、5g、10g、20g、25g、30g、35g、40g、50g、100g、120g或150g的量产生糖或糖磷酸酯。

[0040] 在再另一个实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码选自于乙酰CoA乙酰转移酶、AtoB、β-羟基丁基CoA脱氢酶、巴豆酸酶、CoA脱氢酶、CoA-酰化醛脱氢酶(CoA-acylating aldehyde dehydrogenase)(ALDH)和醛醇脱氢酶，AdhE活性的工程核酸。在再另一个实施方式中，该细胞包含编码选自于2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶(2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate aldolase)，aroF(EC 2.5.1.54)、3-脱氢奎尼酸合成酶，aroB(EC 4.2.3.4)、3-脱氢奎尼酸脱水酶，aroD(EC 4.2.1.10)、3-脱氢莽草酸脱水酶，quiC(EC 4.2.1.n)、β-酮己二酸单酰CoA合成酶(β-ketoadipyl-CoA synthase)，pcaF(EC 2.3.1.174)、β-酮己二酸CoA转移酶，pcaIJ(EC 2.8.3.6)、3-氧代己二酸烯醇内酯水解酶，pcaL(EC 3.1.1.24)、4-羧基粘康酸内酯脱羧酶(4-carboxymuconolactone decarboxylase)，pcaL(EC 4.1.1.44)、γ-羧基-顺，顺-粘康酸环异构酶，pcaB(EC
5.5.1.2)、原儿茶酸-3，4-加双氧酶，pcaGH(EC 1.13.11.3)、原儿茶酸1，2-顺-二氢二醇脱氢酶，tpaC(EC 1.3.1.n)和对苯二甲酸1，2-双加氧酶，tpaAB(EC 1.14.12.15)的活性的工程核酸。在再另一个实施方式中，该细胞包含编码选自于α-D-葡萄糖-6-磷酸酮醇异构酶(alpha-D-glucose-6-phosphate ketol-isomerase)，PGI1(EC 5.3.1.9)、D-甘露糖-6-磷酸酮醇异构酶(D-Mannose-6-phosphate ketol-isomerase)，din9(EC 5.3.1.8)、D-甘露糖-6-磷酸1，6-磷酸变位酶，atpmm(EC 5.4.2.8)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶(mannose-1-phosphate guanylyltransferase)，cyt(EC 2.7.7.22)、GDP-甘露糖-3，5-差向异构酶，gme(EC 5.1.3.18)、半乳糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶，VTC2(EC 2.7.n.n)、L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶，VTC4(EC 3.1.3.n)、L-半乳糖脱氢酶，At4G33670(EC 1.1.1.122)和L-半乳糖酸内酯氧化酶，ATGLDH(EC 1.3.3.12)的活性的工程核酸。

[0041] 在另一个实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码选自于C-16:1硫酯酶，fatB、丙二酸单酰CoA:ACP转酰基酶，fabD、醇还原酶，acr1、脱羰基酶(decarbonylase)，cer1的活性以及列于表11中的基因的工程核酸。

[0042] 在再另一个实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码选自于大肠杆菌tesA、大肠杆菌fadD和A.baylyi wax-dgat的基因的工程核酸。

[0043] 在一些实施方式中，本发明提供的工程细胞能够产生链烷烃、链烯烃、甲基酯或乙基酯。

[0044] 在某些其它实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码MEV途径酶的工程核酸。在一些实施方式中，该MEV途径酶选自于乙酰CoA硫解酶、HMG CoA合成酶、HMG CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和IPP异构酶。 [0045] 在再另一个实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码DXP途径酶的工程核酸。在相关的实施方式中，该DXP途径酶选自于1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶、4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合
成酶、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇激酶、2C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环焦磷酸合 成酶(2C-methyl-D-erythritol-2，4-cyclodiphosphate synthase)、1- 羟基 -2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸合成酶和异戊基/二甲基烯丙基焦磷酸合成酶。

[0046] 在再另一个实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码选自于高柠檬酸合成酶，lys21(EC 2.3.3.14)、高乌头酸酶，lys4，lys3(EC 4.2.1.36)、同分异构柠檬酸(homoisocitrate)脱氢酶，lys12，lys11，lys10(EC 1.1.1.87)、2-氨基己二酸转氨酶，aro8(EC 2.6.1.39)、磷酸甘油酸脱氢酶，serA(EC 1.1.1.95)、磷酸丝氨酸转氨酶，serC(EC 2.6.1.52)、磷酸丝氨酸磷酸酶，serB(EC 3.1.3.3)、丝氨酸O-乙酰基转移酶，AtSerat2；1(EC 2.3.1.30)、半胱氨酸合成酶，At1G55880(EC 2.5.1.47)、乙酰乳酸合成酶，ilvN，ilvB(EC 2.2.1.6)、乙酰羟酸异构还原酶，ilvC(EC 1.1.1.86)、二羟酸脱水酶，ilvD(EC 4.2.1.9)、缬氨酸转氨酶，ilvE(EC 2.6.1.42)、ACV合成酶，Ava_1613(EC6.3.2.26)、异青霉素-N合成酶，Ava_5009(EC1.21.3.1)，将N-[L-5-氨基-5-羧基戊酰基(carboxypentanoyl)]-L-半胱氨酰-D-缬氨酸和O2转化为异青霉素-N、异青霉素-N差向异构酶，cefD(EC5.1.1.17)、头孢菌素生物合成扩环酶/羟化酶，cefEF(EC 1.14.20.1，
1.14.11.26)和脱乙酰头孢菌素C乙酰基转移酶，cefG(EC 2.3.1.175)的活性的核酸。 [0047] 在再另一个实施方式中，本发明提供的工程细胞包含编码醇脱水酶活性(EC
4.2.1.n)的核酸。在相关的实施方式中，该醇脱水酶活性选自具有EC编号4.2.1.2、
4.2.1.3、4.2.1.4、4.2.1.11、4.2.1.17、4.2.1.55、4.2.1.33、4.2.1.34、4.2.1.35、
4.2.1.54、4.2.1.58、4.2.1.60、4.2.1.68、4.2.1.74或4.2.1.79的醇脱水酶。在再另一个实施方式中，所述醇脱水酶是EC 4.2.1.54。

[0048] 在再其它的实施方式中，本发明提供的工程细胞能够产生药物或其中间体。在某些相关的实施方式中，所述药物或其中间体以高于每升发酵培养基约1mg、100mg、500mg、1g、5g、10g、20g、25g、30g、35g、40g、50g、100g、120g或150g的量产生。

[0049] 在更进一步的实施方式中，本发明提供的工程细胞能够产生碳基目的产物，其包含选自于醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯、乙基酯、甲基酯、烃、正链烷烃、丙烷、辛烷、柴油、JP8、聚合物、对苯二甲酸盐、多元醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、PHA、PHB、丙烯酸盐、己二酸、ε-己内酯、异戊二烯、己内酰胺、橡胶、乳酸盐、DHA、3-羟基丙酸盐、γ-戊内酯、赖氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸盐、天门冬氨酸、山梨醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸、异戊烯醇、羊毛甾醇、ω-3DHA、番茄红素、衣康酸盐、1，3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸、谷氨酸盐、苹果酸盐、HPA、乳酸、THF、γ-丁内酯、吡咯烷酮、羟丁酸盐、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸、类胡萝卜素、类异戊二烯、衣康酸、柠檬烯、药物或药物中间体、红霉素7-ADCA/头孢菌素、聚酮、抑制素、紫杉醇、多烯紫杉醇、萜烯、肽、类固醇以及ω-脂肪酸的化合物。在某些实施方式中，该细胞产生的类异戊二烯选自于异戊基焦磷酸酯(isopentylpyrophosphate)(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAP)、单萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜和多萜。

[0050] 在另外的实施方式中，本发明提供的工程细胞包含的细胞选自于真核植物、藻类、蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫色非硫细菌、嗜极微生物(extremophile)、酵母、真菌、其工程生物体和合成生物体。在某些相关实施方式中，该细胞是光依赖性的或固定碳。在其他相关的实施方式中，该细胞有自养活性或光合自养活性。在其它实施方式中，该细胞在有光时为光合自养的，和在没有光时为异养的或混合营养的。在其他相关的实施方式中，该工程细胞是选自于拟南芥属(Arabidopsis)、甜菜属(Beta)、大豆属(Glycine)、麻风树属(Jatropha)、芒属(Miscanthus)、黍属(Panicum)、虉草属(Phalaris)、杨属(Populus)、甘蔗属(Saccharum)、柳属(Salix)、油蜡树属(Simmondsia)和玉蜀黍属(Zea)的植物细胞。在再另外的相关实施方式中，本发明的工程细胞是藻类和/或蓝细菌生物体，选自于刺菊石属(Acanthoceras)、Acanthococcus、Acaryochloris、曲壳 藻 属 (Achnanthes)、翼 硅 藻 属 (Achnanthidium)、星 形 藻 属(Actinastrum)、Actinochloris、辐环藻属(Actinocyclus)、辐射鼓藻属(Actinotaenium)、双金藻属(Amphichrysis)、前沟藻属(Amphidinium)、Amphikrikos、双肋藻属(Amphipleura)、茧形藻属(Amphiprora)、分须藻属(Amphithrix)、双眉藻属(Amphora)、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、暗额藻属(Aneumastus)、针连藻属(Ankistrodesmus)、锚藻属(Ankyra)、异 菱 藻 属(Anomoeoneis)、虚 幻 球 藻 属 (Apatococcus)、束 丝 藻 属(Aphanizomenon)、隐球藻属(Aphanocapsa)、隐毛藻属(Aphanochaete)、隐杆藻属(Aphanothece)、梨 囊 藻属(Apiocystis)、顶 丝藻 属(Apistonema)、四 棘鼓 藻属(Arthrodesmus)、节旋藻属(Artherospira)、Ascochloris、星杆藻属(Asterionella)、星球藻属(Asterococcus)、奥氏藻属(Audouinella)、浮生直链藻属(Aulacoseira)、杆状藻属(Bacillaria)、巴尔比亚藻属(Balbiania)、似竹鼓藻属(Bambusina)、红毛菜属(Bangia)、Basichlamys、串珠藻属(Batrachospermum)、骈胞藻属(Binuclearia)、角藻属(Bitrichia)、盘苔属(Blidingia)、Botrdiopsis、气球藻属(Botrydium)、葡萄藻属(Botryococcus)、球葡萄藻属(Botryosphaerella)、咸胞藻属(Brachiomonas)、短螺旋体属(Brachysira)、海雹菜属(Brachytrichia)、Brebissonia、毛鞘藻属(Bulbochaete)、柱杆藻属(Bumilleria)、拟杆藻属(Bumilleriopsis)、美壁藻属(Caloneis)、眉藻属(Calothrix)、马 鞍 藻 属(Campylodiscus)、盒 管 藻 属 (Capsosophon)、四 鞭 藻 属(Carteria)、Catena、Cavinula、顶 刺 藻 属 (Centritractus)、Centronella、角 藻 属(Ceratium)、角毛藻 属(Chaetoceros)、Chaetochloris、硬毛藻 属(Chaetomorpha)、Chaetonella、毛 丝 藻 属(Chaetonema)、盾 毛 藻 属 (Chaetopeltis)、胶 毛 藻 属(Chaetophora)、毛球藻属(Chaetosphaeridium)、管胞藻属(Chamaesiphon)、轮藻属(Chara)、Characiochloris、拟小桩藻属(Characiopsis)、小桩藻属(Characium)、轮藻目(Charales)、缘胞藻属(Chilomonas)、厚胞藻属(Chlainomonas)、Chlamydoblepharis、Chlamydocapsa、衣藻属(Chlamydomonas)、Chlamydomonopsis、衣粘藻属(Chlamydomyxa、Chlamydonephris、 Chlorangiella、拟 绿 囊 藻 属 (Chlorangiopsis)、小 球 藻 属(Chlorella)、绿葡萄藻属(Chlorobotrys)、绿幅藻属(Chlorobrachis)、绿点藻属(Chlorochytrium)、绿球藻属(Chlorococcum)、绿胶藻属(Chlorogloea)、拟绿胶藻属(Chlorogloeopsis)、绿梭藻属(Chlorogonium)、绿带藻属(Chlorolobion)、拟衣藻属(Chloromonas)、Chlorophysema、绿藻门(Chlorophyta)、绿胶囊藻属(Chlorosaccus)、Chlorosarcina、Choricystis、色植藻属(Chromophyton)、单鞭金藻属(Chromulina)、拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、色球藻属(Chroococcus)、色指藻属(Chroodactylon)、蓝隐藻属(Chroomonas)、Chroothece、金变形藻属(Chrysamoeba)、金网藻属(Chrysapsis)、金星藻属(Chrysidiastrum)、金囊藻属(Chrysocapsa)、Chrysocapsella、Chrysochaete、金色 藻 属 (Chrysochromulina)、 金 颗 藻 属 (Chrysococcus)、Chrysocrinus、Chrysolepidomonas、Chrysolykos、Chrysonebula、金藻门(Chrysophyta)、金钟 藻属(Chrysopyxis)、Chrysosaccus、Chrysophaerella、金环藻属(Chrysostephanosphaera)、刚毛藻属(Clodophora)、链孢藻属(Clastidium)、拟新月藻属(Closteriopsis)、新月藻属(Closterium)、胶球藻属(Coccomyxa)、卵形藻属(Cocconeis)、Coelastrella、空星藻属(Coelastrum)、腔球藻属(Coelosphaerium)、Coenochloris、无胶集球藻属(Coenococcus)、聚囊藻属(Coenocystis)、柄祼藻属(Colacium)、鞘毛藻属(Coleochaete)、Collodictyon、Compsogonopsis、弯枝藻属(Compsopogon)、Conjugatophyta、Conochaete、Coronastrum、鼓藻 属 (Cosmarium)、Cosmioneis、胶 球 鼓 藻 属 (Cosmocladium)、Crateriportula、Craticula、发 毛 针 藻 属 (Crinalium)、十 字 藻 属 (Crucigenia)、卵 胞 藻 属(Crucigeniella)、Cryptoaulax、隐藻属(Cryptomonas)、隐藻门(Cryptophyta)、栉水母门(Ctenophora)、Cyanodictyon、Cyanonephron、Cyanophora、蓝藻门(Cyanophyta)、蓝杆藻属(Cyanothece)、Cyanothomonas、环胞藻属(Cyclonexis)、环冠藻属(Cyclostephanos)、小环藻属(Cyclotella)、筒藻属(Cylindrocapsa)、柱胞鼓藻属(Cylindrocystis)、柱孢藻属(Cylindrospermum)、细柱藻 属(Cylindrotheca)、波缘藻属(Cymatopleura)、桥弯藻属(Cymbella)、Cymbellonitzschia、胞 甲 藻 属 (Cystodinium)、蓝 纤 维 藻 属(Dactylococcopsis)、单板藻属(Debarya)、细齿藻属(Denticula)、Dermatochrysis、皮果藻属(Dermocarpa)、果菌属(Dermocarpella)、缢带藻属(Desmatractum)、角丝鼓藻属(Desmidium)、Desmococcus、带线藻属(Desmonema)、Desmosiphon、长刺藻属(Diacanthos)、Diacronema、Diadesmis、等片藻属(Diatoma)、Diatomella、双细胞藻属(Dicellula)、双须藻 属(Dichothrix)、叉 球 藻 属 (Dichotomococcus)、Dicranochaete、网 绿 藻 属(Dictyochloris)、球网藻属(Dictyococcus)、胶网藻属(Dictyosphaerium)、泡双吸虫属(Didymocystis)、Didymogenes、异形藻属(Didymosphenia)、丝藻属(Dilabifilum)、双形藻属(Dimorphococcus)、锥囊藻属(Dinobryon)、球甲藻属(Dinococcus)、双绿藻属(Diplochloris)、双壁藻属(Diploneis)、Diplostauron、Distrionella、基纹鼓藻属(Docidium)、竹 枝 藻 属 (Draparnaldia)、杜 氏 藻 属 (Dunaliella)、孔 壳 藻 属(Dysmorphococcus)、Ecballocystis、纺锤藻属(Elakatothrix)、Ellerbeckia、内丝藻属(Encyonema)、浒苔属(Enteromorpha)、内枝藻属(Entocladia)、Entomoneis、石囊藻属(Entophysalis)、附金藻属(Epichrysis)、附钟藻属(Epipyxis)、窗纹藻属(Epithemia)、独球藻属(Eremosphaera)、Euastropsis、凹顶鼓藻属(Euastrum)、立方藻属(Eucapsis)、真卵 形藻 属(Eucocconeis)、空 球藻 属(Eudorina)、裸 藻属(Euglena)、裸藻 门(Euglenophyta)、短 缝藻 属 (Eunotia)、Eustigmatophyta、双 鞭藻 属 (Eutreptia)、Fallacia、费氏藻属(Fischerella)、脆杆藻属(Fragilaria)、Fragilariforma、披刺藻属(Franceia)、肋缝藻属(Frustulia)、Curcilla、双胞藻属(Geminella)、短水绵属(Genicularia)、灰胞藻属(Glaucocystis)、灰色藻门(Glaucophyta)、Glenodiniopsis、薄甲藻属(Glenodinium)、粘球藻属(Gloeocapsa)、Gloeochaete、Gloeochrysis、圆球藻属(Gloeococcus)、胶囊藻 属(Gloeocystis)、Gloeodendron、胶胞藻 属(Gloeomonas)、Gloeoplax、粘杆藻属(Gloeothece)、胶丝藻属 (Gloeotila)、胶刺藻属(Gloeotrichia)、Gloiodictyon、多芒藻属(Golenkinia)、拟多芒藻属(Golenkiniopsis)、孢根藻属(Gomontia)、楔桥弯 藻属(Gomphocymbella)、异极藻 属(Gomphonema)、束球藻 属(Gomphosphaeria)、棒形鼓藻属(Gonatozygon)、Gongrosia、角绿藻属(Goniochloris)、盘藻属(Gonium)、膝口藻属(Gonyostomum)、粒绿藻属(Granulochloris)、拟粒囊藻属(Granulocystopsis)、Groenbladia、裸甲藻属(Gymnodinium)、缢丝鼓藻属(Gymnozyga)、布纹藻属(Gyrosigma)、红球藻属(Haematococcus)、Hafniomonas、Hallassia、双尖藻属(Hammatoidea)、Hannaea、菱 板 藻 属 (Hantzschia)、软 管 藻 属 (Hapalosiphon)、Haplotaenium、定鞭藻门(Haptophyta)、Haslea、半沟藻属(Hemidinium)、Hemitoma、茸壳藻属(Heribaudiella)、异毛藻属(Heteromastix)、异线藻属(Heterothrix)、Hibberdia、胭脂藻属(Hildenbrandia)、隐鞭藻属(Hillea)、Holopedium、须藻属(Homoeothrix)、管鞘藻属(Hormanthonema)、皮襟藻属(Hormotila)、Hyalobrachion、Hyalocardium、明盘藻属(Hyalodiscus)、透明棱藻属(Hyalogonium)、圆丝鼓藻属(Hyalotheca)、Hydrianum、Hydrococcus、水 鞘 藻 属(Hydrocoleum)、水 条 藻 属 (Hydrocoryne)、水 网 藻 属(Hydrodictyon)、水涟藻属(Hydrosera)、水树藻属(Hydrurus)、蓝枝藻属(Hyella)、膜胞藻 属(Hymenomonas)、细 绿 藻 属(Isthmochloron)、Johannesbaptistia、肾 粒 藻 属(Juranyiella)、Karayevia、尖 眼 藻 属(Kathablepharis)、Katodinium、金 杯 藻 属(Kephyrion)、角 球藻 属(Keratococcus)、蹄形 藻属(Kirchneriella)、克里 藻属(Klebsormidium)、Kolbesia、Koliella、Komarekia、Korshikoviella、Kraskella、拉氏藻属(Lagerheimia)、烧瓶藻属(Lagynion)、丽枝藻属(Lamprothamnium)、鱼子菜属(Lemanea)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、钩端螺旋体属(Leptosira)、Lobococcus、Lobocystis、叶衣藻属(Lobomonas)、Luticola、鞘丝藻属(Lyngbya)、Malleochloris、鱼鳞藻属(Mallomonas)、Mantoniella、射星藻属(Marssoniella)、Martyana、鞭鞘藻属(Mastigocoleus)、胸隔藻属(Gastogloia)、直链藻属(Melosira)、平列藻属(Merismopedia)、 Mesostigma、中带鼓藻属(Mesotaenium)、微芒藻属(Micractinium)、小星藻属(Micrasterias)、微毛藻 属(Microchaete)、微 鞘 藻 属(Microcoleus)、微 胞 藻 属(Microcystis)、软 壳 藻 属(Microglena)、微 单 胞 菌 属(Micromonas)、微 孢 藻 属(Microspora)、小 丛 藻 属(Microthamnion)、柄球藻属(Mischococcus)、单鞭金藻属(Monochrysis)、蒜头藻属(Monodus)、Monomastix、单针藻属(Monoraphidium)、礁膜属(Monostroma)、转板藻属(Mougeotia)、拟转板藻属(Mougeotiopsis)、喙藻属(Myochloris)、Myromecia、粘囊藻属(Myxosarcina)、瓶丝藻属(Naegeliella)、微绿球藻属(Nannochloris)、类球藻属(Nautococcus)、舟形藻属(Navicula)、Neglectella、长篦藻属(Neidium)、Nephroclamys、肾形 藻 属(Nephrocytium)、Nephrodiella、肾藻 属(Nephroselmis)、梭形 鼓 藻 属(Netrium)、丽藻属(Nitella)、拟丽藻属(Nitellopsis)、菱形藻属(Nitzschia)、节球藻属(Nodularia)、念珠藻属(Nostoc)、棕鞭藻属(Ochromonas)、鞘藻属(Oedogonium)、Oligochaetophora、棘接鼓藻属(Onychonema)、Oocardium、卵囊藻属(Oocystis)、具隙藻属(Opephora)、黄管藻属(Ophiocytium)、Orthoseira、颤藻属(Oscillatoria)、Oxyneis、厚枝藻属(Pachycladella)、四集藻属(Palmella)、掌网藻属(Palmodictyon)、实球藻属(Pnadorina)、Pannus、Paralia、巴喧氏藻属(Pascherina)、Paulschulzia、盘星藻属(Pediastrum)、柄钟藻属(Pedinella)、平藻属(Pedinomonas)、指藻属(Pedinopera)、Pelagodictyon、柱 形 鼓 藻 属(Penium)、袋 鞭 藻 属 (Peranema)、拟 多 甲 藻 属(Peridiniopsis)、多甲藻属(Peridinium)、Peronia、石藻属(Petroneis)、壳衣藻属(Phacotus)、扁裸藻属(Phacus)、Phaeaster、褐皮藻属(Phaeodermatium)、褐藻门(Phaeophyta)、Phaeosphaera、金枝藻属(Phaeothamnion)、席藻属(Phormidium)、叶楯藻属 (Phycopeltis)、Phyllariochloris、Phyllocardium、Phyllomitas、 羽 纹 藻 属(Pinnularia)、Pitophora、Placoneis、游 丝 藻 属 (Planctonema)、浮 球 藻 属(Planktosphaeria)、Planothidium、织线藻属(Plectonema)、 杂球藻属(Pleodorina)、Plearastrum、厚 皮 藻 属(Pleurocapsa)、侧 枝 藻 属 (Pleurocladia)、双 盘 藻 属(Pleurodiscus)、斜纹藻属(Pleurosigma)、侧链藻属(Pleurosira)、宽带鼓藻属(Pleurotaenium)、Pocillomonas、Podohedra、 多 鞭 藻 属 (Polyblepharides)、Polychaetophora、多 角 藻 属 (Polyedriella)、多 突 藻 属 (Polyedriopsis)、Polygoniochloris、Polyepidomonas、Polytaenia、素衣藻属(Polytoma)、Polytomella、紫球 藻 属 (Porphyridium)、Posteriochromonas、Prasinochloris、 绿 枝 藻 属(Prasinocladus)、Prasinophyta、溪 菜属(Prasiola)、Prochlorphyta、原 绿发藻 属(Prochlorothrix)、原皮藻属(Protoderma)、原生管属(Protosiphon)、朴罗藻属(Provasoliella)、三毛金藻属(Prymnesium)、Psammodictyon、Psammothidium、伪项圈藻属(Pseudanabaena)、Pseudenoclonium、Psuedocarteria、Pseudochate、Pseudocharacium、Pseudococcomyxa、Pseudodictyosphaerium、假金杯藻属(Pseudokephyrion)、伪瘤皮藻属(Pseudoncobyrsa)、Pseudoquadrigula、Pseudosphaerocystis、Pseudostaurastrum、Pseudostaurosira、Pseudotetrastrum、翼 膜 藻 属 (Pteromonas)、Punctastruata、Pyramichlamys 塔 胞 藻 属 (Pyramimonas)、甲 藻 门 (Pyrrophyta)、四 毛 藻 属(Quadrichloris)、Quadricoccus、并联藻属(Quadrigula)、芒球藻属(Radiococcus)、辐丝藻属(Radiofilum)、尖头藻属(Raphidiopsis)、Raphidocelis、针丝藻属(Raphidonema)、Raphidophyta、Peimeria、棒条藻属(Rhabdoderma)、杆胞藻属(Rhabdomonas)、根枝藻属(Rhizoclonium)、红 胞 藻 属 (Rhodomonas)、红 藻 门(Rhodophyta)、弯 楔 藻 属(Rhoicosphenia)、棒杆藻属(Rhopalodia)、胶须藻属(Rivularia)、Rosenvingiella、Rossithidium、Roya、栅藻属(Scenedesmus)、Scherffelia、Schizochlamydella、裂壁藻属(Schizochlamys)、裂线藻属(Schizomeris)、裂须藻属(Schizothrix)、弓形藻 属(Schroederia)、Scolioneis、螺翼藻属(Scotiella)、Scotiellopsis、Scourfieldia、双歧藻属(Scytonema)、月牙藻属(Selenastrum)、月绿藻属(Selenochloris)、Sellaphora、Semiorbis、褐胞藻属(Siderocelis)、拟铁囊藻属 (Diderocystopsis)、Dimonsenia、管线藻属(Siphononema)、Sirocladium、链膝藻属(Sirogonium)、骨条藻属(Skeletonema)、群星藻属(Sorastrum)、Spermatozopsis、Sphaerellocystis、拟球藻属(Sphaerellopsis)、Sphaerodinium、环 藻属(Sphaeroplea)、瘤 接鼓 藻属(Sphaerozosma)、刺胞 藻 属(Spiniferomonas)、水 绵属(Spirogyra)、螺 带鼓 藻属(Spirotaenia)、螺旋 藻 属(Spirulina)、Spondylomorum、顶接鼓藻属(Spondylosium)、Sporotetras、Spumella、角星鼓藻属(Staurastrum)、叉链藻属(Stauerodesmus)、幅节藻属(Stauroneis)、十字脆杆藻亚属(Staurosira)、Staurosirella、长羽藻属(Stenopterobia)、Stephanocostis、冠盘藻属(Stephanodiscus)、冠 孔 藻 属(Stephanoporos)、Stephanosphaera、裂 丝 藻 属(Stichococcus)、粘胶藻属(Stichogloea)、毛枝藻属(Stigeoclonium)、真枝藻属(Stigonema)、柄球藻属(Stipitococcus)、斯特克藻属(Stokesiella)、陀螺藻属(Strombomonas)、柄胞藻属(Stylochrysalis)、Stylodinium、柱钟藻属(Styloyxis)、绿柄球藻属(Stylosphaeridium)、双菱藻属(Surirella)、Sykidion、束藻属(Symploca)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、针杆藻属(Synedra)、聚赭胞藻属(Synochromonas)、黄群藻属(Synura)、平板藻属(Tabellaria)、Tabularia、Teilingia、切孢藻属(Temnogametum)、裂顶鼓藻属(Tetmemorus)、四球藻属(Tetrachlorella)、四环藻属(Tetracyclus)、四链藻属(Tetradesmus)、Tetraedriella、四角藻属(Tetraedron)、Tetraselmis、四 孢 藻 属 (Tetraspora)、四 星 藻 属 (Tetrastrum)、海 链 藻 属(Thalassiosira)、丛毛藻属(Thamniochaete)、Thermosynechococcus、Thorakochloris、红索藻 属(Thorea)、鸟 巢藻 属(Tolypella)、单 歧藻 属(Tolypothrix)、囊 裸藻属(Trachelomonas)、Trachydiscus、共球藻属(Trebouxia)、橘色藻属(Trentepholia)、四棘藻属(Treubaria)、黄丝藻属(Tribonema)、束毛藻属(Trichodesmium)、Trichodiscus、小箍藻属(Trochiscia)、盘杆藻属(Tryblionella)、丝藻属(Ulothrix)、辐尾藻属
(Uroglena)、尾丝藻属(Uronema)、尾管藻属(Urosolenia)、尾孢藻属(Urospora)、Uva、周泡藻属(Vacuolaria)、 无节藻属(Vaucheria)、团藻属(Volvox)、Volvulina、韦斯藻属(Westella)、网 甲 藻 属(Woloszynskia)、多 棘 鼓 藻 属 (Xanthidium)、黄 藻 门(Xanthophyta)、异球藻属(Xenococcus)、双星藻属(Zygnema)、拟双星藻属(Zygnemopsis)和Zygonium。而在另外的相关实施方式中，本发明提供的工程细胞源自于绿曲挠菌属(Chloroflexus)、绿丝菌属(Chloronema)、颤绿菌属(Oscillochloris)、螺丝菌属(Heliothrix)、滑柱菌属(Herpetosiphon)、玫瑰弯菌属(Roseiflexus)、和热微菌属(Thermomicrobium)的细胞。绿色硫菌选自于绿菌属(Chlorobium)、格状绿菌属
(Clathrochloris)和突柄绿菌属(Prosthecochloris)。紫色硫细菌选自于以下菌属：
Allochromatium、着色菌属(Chromatium)、盐着色菌属(Halochromatium)、Isochromatium、Marichromatium、小红卵菌属(Rhodovulum)、热着色菌属(Thermochromatium)、荚硫菌属(Thiocapsa)、硫红球菌属(Thiorhodococcus)和囊硫菌属(Thiocystis)。紫色非硫细菌选自于：褐螺菌属(Phaeospirillum)、Rhodobaca、红细菌属(Rhodobacter)、红微菌属(Rhodomicrobium)、红球形菌属(Rhodopila)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红海菌属(Rhodothalassium)、红螺菌属(Rhodospirillum)、Rodovibrio和玫瑰螺旋菌属(Roseospira)；需氧的化能无机营养菌选自：硝化细菌(nitrifying bacteria)、硝化杆菌科的种(Nitrobacteraceae sp.)、硝化细菌属的种(Nitrobacter sp.)、硝化刺菌属的种(Nitrospina sp.)、硝化球菌属的种(Nitrococcus sp.)、硝化螺菌属的种(Nitrospira sp.)、亚硝化单胞菌属的种(Nitrosomonas sp.)、亚硝化球菌属的种(Nitrosococcus sp.)、亚硝化螺菌属的种(Nitrosospira sp.)、亚硝化叶菌属的种(Nitrosolobus sp.)、亚硝化弧菌属的种(Nitrosovibrio sp.)；无色硫细菌如卵硫细菌属的种(Thiovulum sp.)、硫杆菌属的种(Thiobacillus sp.)、硫微螺菌属的种(Thiomicrospira sp.)、硫球形菌属的种(Thiosphaera sp.)、高温毛发菌属的种(Thermothrix sp.)；专性化能无机营养氢细菌如氢杆菌属的种(Hydrogenobacter sp.)，铁和锰氧化和/或沉淀细菌如铁球菌属的种(Siderococcus sp.)，及磁 性细菌 (magnetotactic bacteria)如水 螺菌属的 种(Aquaspirillum sp)；古细菌(archaeobacteria)选自于产甲烷古细菌如甲烷杆菌属的种(Methanobacterium sp.)、甲烷短杆菌属的种(Methanobrevibacter sp.)、甲烷嗜热菌属的种(Methanothermus sp.)、甲烷球菌属的种(Methanococcus sp.)、甲烷微菌属的种(Methanomicrobium sp.)、甲烷螺菌属的种(Methanospirillum sp.)、产甲烷菌属的种(Methanogenium sp.)、甲烷八叠球菌属的种(Methanosarcina sp.)、甲烷叶菌属的种(Methanolobus sp.)、甲烷丝菌属的种(Methanothrix sp.)、拟甲烷球菌属的种
(Methanococcoides sp.)、甲烷盘菌属的种(Methanoplanus sp.)；极端嗜热硫代谢菌如热变形菌属的种(Thermoproteus sp.)、热网菌属的种(Pyrodictium sp.)、硫化裂片菌属的种(Sulfolobus sp.)、嗜酸菌属的种(Acidianus sp.)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、链霉菌属的种(Streptomyces sp.)、雷尔氏菌属的种(Ralstonia sp.)、红球菌属的种(Rhodococcus sp.)、棒状杆菌属的种(Corynebacteria sp.)、短杆菌的种(Brevibacteria sp.)、分枝杆菌的种(Mycobacteria sp.)和产油酵母；及嗜极菌，选自延胡索酸火叶菌(Pyrolobus fumarii)；Synechococcus lividis、嗜温菌、低温微生物、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、昆虫类、耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)、嗜压微生物(piezophiles)、适压微生物(barophiles)、耐超重生物、耐低重生物、耐真空生物、节肢动物(tardigrades)、昆虫类(insects)、微生物种子(microbes seeds)、耐干燥脱水生活生物(dessicant tolerant anhydrobiotic organism)、耐旱生物、卤虫(Artemia salina)、线虫类、微生物类、真菌、地衣类、耐盐生物、嗜盐生物、盐杆菌科(halobacteriacea)、杜氏盐藻(Dunaliella salina)、耐PH生物、嗜碱菌(alkaliphiles)、嗜盐碱杆菌(Natronobacterium)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)OF4、螺旋藻属的种(Spirulina spp.)、嗜酸细菌(acidophiles)、Cyanidium caldarium、Ferroplasma sp.、不能耐受氧的厌氧菌(anaerobes)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、耐部分氧的微需气菌、梭菌属(Clostridium)、需要氧气的需氧菌、耐 纯CO2的耐气生物体、Cyanidium caldarium、耐金属生物体、耐金属菌(metalotolerant)、Ferroplasma acidarmanus Ralstonia sp.CH34。

[0051] 然而在其他实施方式中，本发明提供的工程细胞源自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、柳枝黍(Panicum virgatum)、巨芒(Miscanthus giganteus)和玉米(Zea mays(植物))、布朗 葡萄 藻(Botryococcus braunii)、莱 茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)和杜氏盐藻(Dunaliela salina(海藻))、聚球藻PCC7002(Synechococcus PCC 7002 种 )、 聚 球 藻 PCC7942(Synechococcus PCC 7942 种 )、 集 胞 藻PCC6803(Synechocystis PCC 6803 种 ) 和Thermosynechococcus elongatus BP-1( 蓝细菌)、微温绿菌(Chlorobium tepidum(绿色硫细菌))、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus auranticus)(绿色非硫细菌)、微温着色菌(Chromatium tepidum)和酒色着色菌(Chromatium vinosum(紫色硫细菌属))、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palusris(紫色非硫细菌))。

[0052] 在另外的实施方式中，本发明提供的工程细胞是杨氏棱菌(Clostridium ljungdahlii)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或运动发酵假单胞菌细胞。

[0053] 在某些实施方式中，本发明所提供的工程细胞能够进行或调节选自于光合作用、硫酸盐还原、甲烷生成、乙酸生成(acetogenesis)、还原性TCA循环、卡尔文循环、3-HPA循环和3HP/4HB循环的至少一个代谢途径。

[0054] 在某些其它实施方式中，本发明提供了一种生产碳基目的产物或其中间体的方法，包括将一个或多个工程核酸引入固碳生物中，其中所述工程宿主细胞能够利用最少量的光能直接从二氧化碳和水合成碳基目的产物，培养所述工程宿主细胞，然后从所述工程细胞或培养基分离碳基目的产物。在一相关的实施方式中，该细胞是在光生物反应器中 培养。在另一相关实施方式中，该碳基目的产物是被细胞释放、渗透或输出。在再另一相关实施方式中，碳基产物是分离自细胞培养基。

[0055] 在一些实施方式中，本发明提供的工程细胞能够产生碳基目的产物，其特征在于具有约63.5至约66的-δp(‰)和约37.5至40的-D(‰)。

[0056] 本发明还提供了一种将碳基目的产物的产生和与产生碳基目的产物相关的工程光合自养生物体吸收的二氧化碳货币化的方法，包括：对所述工程光合自养生物体产生的所述产物的量进行定量；对与产生的所述产物的所述量相关的吸收二氧化碳的量进行定量；根据市场价值对所述产物的所述量进行估值；对与产生的所述产物的量相关的所述吸收的二氧化碳的量进行估值；及通过出售所述产物的所述量和向碳市场出售CO2排碳权，将产生的所述产物和与产生所述产物的所述量相关的吸收的二氧化碳的所述量货币化。 [0057] 本发明还提供了生物生产乙醇的方法，包括：在光和CO2的存在下在培养基中培养工程化的蓝细菌，其中，所述蓝细菌包含至少两个拷贝的重组醇脱氢酶基因，且其中所述重组醇脱氢酶基因的至少一个拷贝位于染色体外。在某些相关的实施方式中，所述重组醇脱氢酶基因的至少一个拷贝的表达由λcI启动子驱动。

[0058] 在另一实施方式中，本发明提供了通过工程化的蓝细菌增加乙醇生产的方法，包括改变所述蓝细菌中的重组表达的醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的活性的步骤。在某些实施方式中，蓝细菌是嗜热菌。在相关的实施方式中，通过差异表达醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶改变活性水平。在再另一个实施方式中，通过调节控制醇脱氢酶或丙酮酸脱羧酶的表达的启动子的强度实现差异表达。在再另一个实施方式中，权利要求4所述的方法，其中，所述醇脱氢酶的表达由至少两个相异(distinct)的质粒(例如，选自AQ1、pAQ3、pAQ4、pAQ5、pAQ6和pAQ7的质粒)上的启动子驱动。在再另一个实施方式中，通过控制醇脱氢酶或丙酮酸脱羧酶所需的辅助因子的水平改变活性。

[0059] 在通过工程化的蓝细菌增加乙醇生产的方法的某些实施方式中，由所述工程化的生物体释放到所述培养基中的乙醛的测量水平在培养大 约10天后小于大约7mg/ml。在某些其他实施方式，由所述工程化的生物体释放到所述培养基中的乙醇的累计量在大约380小时后等于或大于大约4g/L。在再其他的实施方式中，由所述工程化的生物体释放到所述培养基中的乙醇的测量水平为至少大约1750mgs/ml。在更其他的实施方式中，所述工程化的生物体释放到所述培养基中的乙醇的测量浓度(mg/ml)高于所述培养基中的乙醛的测量水平100、200或300倍。

[0060] 本发明还提供了包含受λcI启动子控制的醇脱氢酶的工程化的蓝细菌。在相关的实施方式中，工程化的蓝细菌是包含至少两个工程化的质粒的工程化聚球藻(Synechococcus)菌株。例如，质粒可以选自pAQ1、pAQ3、pAQ4、pAQ5、pAQ6和pAQ7。在相关的实施方式中，两个工程化的质粒独立地编码重组醇脱氢酶的活性。在再其他的相关的实施方式中，重组醇脱氢酶活性是adhAM.。在一个实施方式中，蓝细菌缺乏具有功能的乳酸脱氢酶基因或乳酸脱氢酶的酶活性。在再另一个实施方式中，除了醇脱氢酶活性以外，蓝细菌经工程化来表达重组丙酮酸脱羧酶的活性。在再另一个实施方式中，重组丙酮酸脱羧酶活性由编码重组醇脱氢酶活性的至少两个工程化质粒之一来编码。附图说明

[0061] 图1(A-O)提供了在生产碳基目的产物中可以在本发明的二氧化碳固定工程微生物中表达、上调、弱化或敲除的经确认的各种基因。

[0062] 图2提供了产生乙醇、琥珀酸及其它衍生物的途径的实例。

[0063] 图3提供了由GAP产生乙烯的示意图。

[0064] 图4提供了正链烷烃和脂肪醇合成途径的实例。

[0065] 图5提供了产生几种不同化学产物：琥珀酸、谷氨酸、衣康酸和3-羟基丙酸的途径的实例。

[0066] 图6提供了琥珀酸或3-羟基丙酸转化为各种化学产物的示意图。

[0067] 图7提供了谷氨酸或衣康酸转化为各种化学产物的示意图。

[0068] 图8提供了从琥珀酸产生丁二醇的途径的示意图。

[0069] 图9显示了对照的聚球菌(Synechococcus)7002菌株的GC/FID色谱。

[0070] 图10显示了7002/efe_rs重组菌株的GC/FID色谱。

[0071] 图11图示了选择的产乙醇细菌(ethanologens)随着时间变化的光密度。 [0072] 图12图示了上清液中培养物的乙醇浓度随时间的变化。

[0073] 图13图示了上清液中培养物的乙醛浓度随时间的变化。

[0074] 图14图示了上清液中培养物的乙醇与乙醛的比率随时间的变化。

[0075] 图15图示了上清液中培养物的乙醇浓度与OD(730nm)的比率随时间的变化。 [0076] 图16图示了在TMS-衍生的α-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖洗脱的保留时间窗中JCC342c、JCC545和JCC547的总离子色谱图。为了清晰，省略了JCC543痕迹。

[0077] 图17图示了在TMS-衍生的蔗糖洗脱的保留时间窗中JCC342c、JCC545和JCC546的总离子色谱图。细胞密度如图16中所示。为了清晰，省略了JCC543痕迹。

[0078] 图18显示了用于分析麦芽糖存在的JCC738(顶部痕迹)和JCC724(底部痕迹)的典型GC/MS色谱。显出了α-麦芽糖和β-麦芽糖的峰。

[0079] 图19是以mg/L给出的细胞抽提物沉淀中培养物的麦芽糖量的图表。

[0080] 图20描述了用以分析乙酯存在的菌株的典型GC/FID色谱。显示了肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、乙酸乙酯和硬脂酸乙酯的峰。(A)JCC879(抗性标记)236h时间点，#1瓶；(B)JCC750(PaphII-tesA)236h时间点，#1瓶；(C)JCC803(lacIqPtrc-tesA-fadD-wax)236h时间点，#1瓶；(D)JCC723(PaphII-tesA-fadD-wax)236h时间点，#1瓶。

[0081] 图21描绘了与甲醇(顶部痕迹)或乙醇(底部痕迹)一起孵育 的JCC803的细胞抽提物沉淀的GC/MS色谱图。标出了甲酯(MEs)或乙酯(EEs)产生的峰。

[0082] 缩略语和术语

[0083] 提供下列术语和方法的解释以更好地描述本发明，以及指导本领域普通技术人员实践本发明。本文所使用的“包含”是指“包括”，且除非上下文另有明确表示，单数形式“一”或“一个”或“该”包括复数指代。例如，提到“包含一细胞”包括一个或多个这样的细胞，以及提到“包含该硫酯酶”包括指一种或多种硫酯酶肽和本领域普通技术人员知道的其等同物，等等。除非上下文另有明确表示并非如此，术语“或”是指所述的可替代成分中的单一成分或者两个或多个成分的组合。

[0084] 除非另有说明，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员一般理解相同的含义。虽然在本发明的实践和实验中可以使用与本文所述类似或等效的方法和材料，下面描述了合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅仅是说明性的，而非意在限制。本发明的其他特征从下面的详细说明和权利要求来看是很清楚的。 [0085] 登录号：本说明书通篇的登录号来源于NCBI数据库(美国国立生物技术信息中心)，该数据库由美国国立卫生研究院维持。该登录号由2008年2月1日的数据库提供。 [0086] 酶分类号(EC)：本说明书通篇的EC号来源于KEGG配体数据库，该数据库由东京大学部分主办的京都基因与基因组百科全书维持。该EC号码由2008年2月1日的数据库提供。

[0087] 氨基酸：DNA分子中的核苷酸三联体(被称为密码子)编码肽中的氨基酸。术语密码子也用于mRNA中对应的(和互补的)三核苷酸的序列，其中DNA序列转录为该mRNA。 [0088] 弱化：本文所用的该术语一般指功能缺失，包括基因序列或控 制基因序列转录的序列的突变、部分或完全缺失、插入或者其它变异，其减少或抑制该基因产物的产生或使该基因产物没有功能。在某些情况中，功能缺失被描述为敲除突变。弱化还包括通过改变核酸序列、将该基因至于较弱的启动子控制下、下调、表达干扰RNA、核酶或靶向目的基因的反义序列、或通过本领域熟知的任何其它技术产生的氨基酸序列变化。在一个实例中，特定酶对反馈抑制或者由非作为产物或反应物(非途径特异性反馈)的成分引起的抑制作用的敏感度降低，导致酶活性没有受到化合物存在的影响。在其它情况中，已经被改变成为较低活性的酶可称为弱化的。

[0089] “碳基目的产物”包括醇类如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇、脂肪酸酯、蜡酯；烃和链烷烃，如丙烷、辛烷、柴油、喷气发动机燃料(Jet Propellant)8，聚合物如对苯二甲酸盐、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、多元醇、多羟基链烷酸酯(PHAs)、多羟基丁酸酯(PHBs)、丙烯酸盐、己二酸、ε-己内酯、异戊二烯、己内酰胺、橡胶；商业化学品如乳酸盐、二十二碳六烯酸(DHA)、3-羟基丙酸盐、γ-戊内酯、赖氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸盐、天门冬氨酸、山梨醇、抗坏血酸盐、抗坏血酸、异戊烯醇、羊毛甾醇、ω-3DHA、番茄红素、衣康酸盐、1，3-丁二烯、乙烯、丙烯、琥珀酸盐、柠檬酸盐、柠檬酸、谷氨酸盐、苹果酸盐、3-羟基丙酸(HPA)、乳酸、THF、γ-丁内酯、吡咯烷酮、羟丁酸盐、谷氨酸、乙酰丙酸、丙烯酸、丙二酸；特种化学品如类胡萝卜素、类异戊二烯、衣康酸；药物或药物中间体，如7-氨基去乙酰氧基头孢烯酸(7-aminodesacetoxycephalosporonic acid)、头孢菌素、红霉素、聚酮、抑制素、紫杉醇、多烯紫杉醇、萜烯、肽、类固醇、ω-脂肪酸和其它适合的目的产物。这些产品可用于生物燃料、工业和特种化学品、作为用于制造其他产品(如营养补充剂、营养保健品、聚合物、石蜡替代品、个人护理产品和药物)的中间体。

[0090] 缺失：从核酸分子中删除一个或多个核苷酸或者从蛋白质中删除一个或多个氨基酸，从而将两侧区域接合在一起。

[0091] DNA：脱氧核糖核酸。DNA是一种长链聚合体，其中包含了大 多数存活生物体的遗传物质(一些病毒具有包含核糖核酸，RNA的基因)。DNA聚合体中的重复单元是4种不同的核苷酸，其各包含四种碱基之一，结合于脱氧核糖的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，磷酸基团也结合于脱氧核糖。

[0092] 内源性的：本文用到的有关于核酸分子和特定的细胞或微生物，指的是是在细胞内而非利用重组工程技术引入到细胞(或其祖细胞)中的核酸序列或肽。例如，当细胞最初从自然界分离时，基因就存在于该细胞中。如果激活转录或翻译的控制序列(如启动子或增强子序列)已经通过重组技术发生改变，该基因仍然被认为是内源性的。

[0093] “酶活性”：本文所使用的术语“酶活性”意思是所指的酶(如“乙醇脱氢酶活性”)在以下方面具有可测量的属性，例如，底物比活性、pH值、最适温度、作为参考酶(如乙醇脱氢酶)编码的活性的酶活性的其它标准量度。此外，如通过BLAST检索测量的，该酶在核酸或氨基酸水平上与参考酶序列具有至少90％的同一性。

[0094] 外源性的：如本文中使用的有关于核酸分子和特定的细胞或微生物，指的是当细胞最初从自然界分离时并不存在于细胞中的核酸序列或肽。例如，核酸源自不同的微生物并利用重组DNA技术或用于递送所述核酸的其它方法工程转化到另一细胞中的核酸是异源性的。

[0095] 表达：基因的编码信息转化为细胞的结构和功能(如蛋白质、转运RNA或核糖体RNA)的过程。被表达的基因包括那些被转录成mRNA并然后翻译成蛋白质的基因，以及那些被转录成RNA但没有被翻译成蛋白质(如转运和核糖体RNA)的基因。

[0096] 表达控制序列：用于本文中是指影响其可操作地连接的编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效RNA加工信号如剪接和多聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(如 核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；和需要时，提高蛋白质分泌的序列。这种控制序列的性质随宿主生物体而不同；在原核生物中，这种控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”意在包括至少其存在对于表达所必需的所有成分，且还可以包括其存在是有利的其他成分，例如，前导序列和融合配体序列。

[0097] 过表达：当一个基因与该基因的内源性转录率相比使得以提高的速率被转录。在一些实例中，过表达另外包括与该基因的内源性翻译率相比，该基因翻译速率提高。检测过表达的方法是本领域熟知的，例如，可利用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)评价转录RNA的水平和可利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析评价蛋白质水平。此外，当基因相对于其内源性活性显示出增高的活性时，其被认为是过表达，这可能例如，通过减小其抑制剂的浓度或活性或通过表达活性提高的其突变体而发生。在优选的实施方式中，当宿主细胞编码具有所需生化活性的内源基因时，有利的是过表达外源基因，这使得能够更明确地在发酵中的调控，也是有效地减轻集中于内生基因显性的中央代谢调控影响的手段。

[0098] 下调：一个基因与该基因的内源性转录率相比使得以降低的效率被转录。在一些实例中，下调另外包括与该基因的内源性翻译率相比该基因翻译水平降低。检测下调的方法是本领域熟知的。例如，可利用RT-PCR评价转录RNA水平和可利用SDS-PAGE分析评价蛋白质水平。

[0099] 敲除：表达水平或活性降低到零的基因。在一些实例中，基因通过部分或全部其编码序列的缺失敲除。在其它实例中，基因是通过在其开放阅读框中引入一个或多个核苷酸敲除，其导致无义或其它非功能性蛋白质产物的翻译。

[0100] 自养生物：自养生物(或自养的生物体)是从简单的无机分子和外部的能源，如光(光合自养生物)或无机化合物的化学反应，产生复杂的有机化合物的生物体。

[0101] 烃：该术语通常指由元素碳(C)、氢(H)和任选的氧(O)组成的化学化合物。基本上有三种类型的烃，如芳烃、饱和烃和不饱和烃，如烯烃、炔烃和二烯烃。本术语还包括燃料、生物燃料、塑料、蜡、溶剂和油类。烃包括生物燃料，以及塑料、蜡、溶剂和油类。 [0102] “不混溶的”或“不混溶性”是指化合物在水中相对不能溶解，并由化合物的分配系数定义。分配系数，P，定义为化合物在有机相(两相体系中，有机相通常是在生产过程中由脂肪酸衍生物形成的相，但在一些实例中，可以提供有机相(如辛烷层以利于产物的分离))中的平衡浓度除以其在水相中(即发酵培养液)的平衡浓度。当描述一个两相系统时，通常以logP来讨论P。logP为10的化合物以10∶1分配到有机相中，而logP为0.1的化合物以10∶1分配到水相。

[0103] 生物合成途径：也称为“代谢途径”，是指一系列合成代谢或分解代谢的生化反应，用以将一种化学物质转化(改变)为另一种。例如，烃生物合成途径指将输入物和/或代谢产物转化成类似烃产物的中间体，然后转化成烃或烃产物的一系列生化反应。合成代谢途径包括从较小分子构建较大分子，是需要能量的过程。分解代谢途径涉及降解较大的分子，通常释放能量。

[0104] 纤维素：纤维素[(C6H10O5)n]是β-葡萄糖的长链聚合物多糖碳水化合物。它形成植物的初级结构组分，并且不能被人类消化。纤维素是植物细胞壁中的常见物质，并于1838年首次被注意到。它只有在棉花纤维中以几乎纯的形式存在；在所有植物材料中，其被发现与木质素和任何半纤维素结合。

[0105] 生物燃料：生物燃料是从生物源获得的任何燃料。生物燃料是指一种或多种的烃、一种或多种的醇类、一种或多种的脂肪酯或其混合物。优选地，使用液态烃。

[0106] “燃料组分”是用来配制燃料组合物的任何化合物或化合物的混合物。有“主燃料组分”及“次燃料组分”。主燃料组分以至少50％体积存在于燃料组合物中，次燃料组分以少于50％存在于燃料组合 物中。燃料添加剂是次燃料组分。本文所公开的类异戊二烯化合物其自身或与其它燃料组分混合可以是主组分或次组分。

[0107] 本文所使用的，作为“基本上纯的”化合物的组合物基本上没有一种或多种其它化合物，即基于该组合物的总体积，该组合物包含多于80vol.％、多于90vol.％、多于95vol.％、多于96vol.％、多于97vol.％、多于98vol.％、多于99vol.％、多于99.5vol.％、多于99.6vol.％、多于99.7vol.％、多于99.8vol.％或多于99.9vol.％的该化合物；
或者少于20vol.％、少于10vol.％、少于5vol.％、少于3vol.％、少于1vol.％、少于
0.5vol.％、少于0.1vol.％或少于0.01vol.％的一种或多种其它化合物。

[0108] 核酸分子：该术语包括RNA和DNA分子，包括但不限于cDNA、基因组DNA和mRNA，且还包括合成核酸分子，例如那些化学合成或重组地产生的核酸分子。该核酸分子可以是双链的或单链的，环状的或线形的。如果是单链的，该核酸分子可以是有义链或反义链。 [0109] 工程核酸：“工程核酸”是包括至少一个与天然存在的核酸分子不同的核酸分子。工程核酸包括所有外源修饰和未修饰的异源序列(即源自该工程核酸植入的生物体或细胞以外的其它生物体或细胞的序列)以及被修饰、突变的或与天然存在的序列相比包含缺失或插入的内源基因、操纵子、编码序列或者非编码序列。工程核酸还包括与它们并非天然地相关的诱导型启动子或其它控制序列连接的所有核酸序列，不论其起源。

[0110] 适当的发酵条件。该术语一般是指使微生物产生碳基目的产物的发酵培养基和可用pH值、温度、通气水平等进行调节的条件，优选地最佳条件。为确定培养条件是否可以使产物产生，可在接种后对微生物培养约24小时至一星期，并可获得和分析样品。测试样品或培养基中的细胞以检验目的产物的存在，其中该细胞在该培养基中生长。

[0111] 分离的：“分离的”核酸或多核苷酸(例如，RNA、DNA或混 合聚合物)是基本上与在其天然宿主细胞中天然地与该原始多核苷酸相伴的其它细胞成分(如与其天然相关的核糖体、聚合酶和基因组序列)分离的核酸或多核苷酸。该术语包含以下的核酸或多核苷酸：(1)已经从它的天然存在环境移除，(2)与该“分离的多核苷酸”天然发现时所在的多核苷酸中的所有或部分不相关，(3)可操作地连接于其在自然界中并未与其连接的多核苷酸，或者(4)在自然界中不存在。术语“分离的”或“基本上纯的”也可以被用于指重组或克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物或者是异源系统生物合成的多核苷酸类似物。然而，“分离的”并不一定要求如此描述的核酸或多核苷酸其本身已经从其原始环境中移除。例如，如果异源序列(即不是天然地与生物体基因组中的内源性核酸序列毗邻的序列)被置于与该内源性核酸序列毗邻以至该内源性核酸序列的表达被改变，则该内源性核酸序列被认为是“分离的”。举例来说，可以用非原始启动子序列取代(如通过同源重组)人体细胞基因组中基因的原始启动子，以至该基因具有改变的表达模式。该基因现在将成为“分离的”，因为它与至少一些天然地位于其侧翼的序列分开。如果核酸包含基因组中相应的核酸非天然地发生的任何变化，该核酸也被认为是“分离的”。例如，内源性编码序列被认为是“分离的”，如果它包含插入、缺失或人工地引入的点突变，例如人为干预。“分离的核酸”还包括在不同位点整合到宿主细胞染色体中的核酸以及作为游离基因存在的核酸构建体。此外，“分离的核酸”可以基本上没有其它细胞物质，或通过重组技术产生时基本上没有培养基，或在化学合成时基本上没有化学前体或者其它的化学物质。该术语也包含在宿主细胞中通过重组表达制备的核酸分子和蛋白质以及化学合成的核酸分子和蛋白质。 [0112] 可操作地连接：当第一个核酸序列处于与第二个核酸序列的功能性关系中时，第一个核酸序列与第二个核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，该启动子与编码序列可操作地连接。一般地，可操作地连接的DNA序列是连续的且必 要时在同一阅读框中结合两个蛋白质编码区域。串联地转录为单个信使RNA的独立基因的构型被称为操纵子。因此，将基因紧密地置于单一启动子的转录调控下(例如，置于质粒载体中)构成合成操纵子。

[0113] 纯化的：术语纯化的不需要绝对的纯度，相反，它是一个相对的术语。因此，例如，纯化产物的制剂是其中该产物比该产物在细胞内的环境中更浓缩的制剂。例如，纯化的蜡是基本上与共可能相伴的细胞成分(核酸、脂类、碳水化合物和其它肽)分离的蜡。在另一个实例中，纯化的蜡的制剂是其中该蜡基本上没有污染物的制剂，如那些发酵后可能存在的污染物。

[0114] 在一个实例中，脂肪酸酯是纯化的，当至少约50％重量的样品由脂肪酸酯组成的，例如当至少约60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％或更多的样品是由脂肪酸酯组成。可用于纯化蜡、脂肪醇和脂肪酸酯的方法的实例是本领域的普通技术人员熟知的，并叙述如下。图4中提供了正链烷烃和脂肪醇合成途径的实例。

[0115] 可检测的：能够具有利用本说明书全文描述的各种分析方法或本领域的普通技术人员熟知的其它方法确定的存在物或存在量。

[0116] 重组：重组核酸分子或蛋白质是具有非天然地存在的序列、具有通过人工组合两个另外分离的序列片段制成的序列，或具有两者的核酸分子或蛋白质。该人工组合可以，例如，通过化学合成或通过人工操纵分离的核酸分子或蛋白质片段(如基因工程技术)而实现。重组也用于描述已被人工操纵但含有该核酸从中分离的生物体中发现的相同调控序列和编码区域的核酸分子。

[0117] 本文所使用的术语“重组宿主细胞”(“表达宿主细胞”、“表达宿主系统”，“表达系统”或简称“宿主细胞”)是指重组载体被引入的细胞，例如，包含酰基CoA合成酶的载体。应该理解，这些术语意在不仅指特定的对象细胞，还指这种细胞的后代。因为可能由于突变或者环境影响而在后续世代中产生特定变化，实际上这些后代可 能与亲本细胞不同，但仍然被包含在本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可能是分离的细胞或培养基中生长的细胞系或可能是驻留在活组织或生物体中的细胞。

[0118] 释放：化合物从细胞内部(细胞内)到细胞外部(细胞外)的移动。该运动可以是主动的或被动的。当释放是主动的，它可以由一个或多个转运肽促进，且在某些实例中可能消耗能量。当释放是被动的，它可以是通过跨膜的扩散，且可以通过不断从细胞外环境收集所需的化合物而促进，从而促进进一步扩散。化合物的释放也可以通过裂解细胞完成。 [0119] 表面活性剂：能够减少他们溶解于其中的液体的表面张力的物质。它们通常由水溶性的头部和烃链或尾部组成。水溶性基团是亲水性的，且可以是离子型的或非离子型的，而烃链是疏水性的。表面活性剂可用于多种产品中，包括洗涤剂和清洁剂，且也用作纺织、皮革和纸张的助剂，用于化学过程中，用在化妆品和药品中，用在食品工业中和农业中。此外，他们可被用于帮助提取和分离原油，原油据发现很难进入环境或作为水乳液。 [0120] 有四种具有不同用途的表面活性剂。阴离子表面活性剂具有类似洗涤剂的活性，且通常被用于清洁用途。阳离子表面活性剂含有长链烃，且常用于处理蛋白质和合成聚合物，或者是织物软化剂和护发剂的成分。两性表面活性剂也含有长链烃并通常用于洗发剂中。非离子型表面活性剂通常用于清洁产品中。

[0121] 载体：本文所使用的术语“载体”是指核酸分子，该核酸分子能够将输送其连接的另一核酸。一种类型的载体是“质粒”，其指环形双链DNA环，另外的DNA片段可被接合到该双链DNA环中。其它载体包括粘粒、细菌人工染色体(BACs)和酵母人工染色体(YACs)。另一种载体类型是病毒载体，其中另外的DNA片段可被接合到该病毒基因组中(下面更详细地讨论)。某些载体能够在其引入的宿主细胞中自我复制(例如，具有复制起点的载体，该复制起点在宿主细胞中起作用)。其它载体可以在引入宿主细胞中时整合到宿主细 胞的基因组中，并从而与宿主基因组一起复制。此外，某些优先的载体能指导与其可操作地连接的基因的表达。这类载体在此被称为“重组表达载体”(或简单地称作“表达载体”)。载体也可以包含一个或多个选择标记基因和本领域已知的其它基因元件。

[0122] 蜡：在一系列确定的物理条件下形成固体或柔韧物质的多种脂肪酸酯。被称为蜡的脂肪酸酯通常具有比非蜡的脂肪酸酯更长的碳链。例如，蜡在室温下通常形成柔韧物质。 [0123] 脂肪酯：包括由脂肪酸形成的任何酯。脂肪酸中的碳链可以包含本文所述修饰的任何组合。例如，碳链可以包含一个或多个不饱和点、一个或多个分支点，包括环状的分支，并可被工程化为短的或长的。任何醇可以用来形成脂肪酸酯，例如从脂肪酸生物合成途径获得的醇，通过非脂肪酸生物合成途径的生产宿主所产生的醇，以及在发酵液中供应的醇。 [0124] 脂肪酸：包括部分地从宿主生物体的脂肪酸生物合成途径形成的产物或其衍生物。脂肪酸生物合成途径包括可以如本文所述工程化以产生脂肪酸衍生物的脂肪酸合成酶，且在一些实例中可以与其它的酶一起表达以产生具有所需的碳链特征的脂肪酸衍生物。典型的脂肪酸衍生物包括，例如，短和长链醇、烃和包括蜡的脂肪酸酯。对微生物工程化以产生碳基产物的一般方法

[0125] 本发明的方法是根据代谢工程的原理并使用例如在如WO 2007/136762和WO2007/139925(其各通过引用整体和全面地引入)中所述的工程化途径以从光合自养生物捕获的能量生产产物。通常，碳基目的产物是通过在如本文所述的光合自养微生物(例如，蓝细菌)中表达如图1所述的基因或一组基因而产生的。如本文的实施例(如施实例1)中所述构建质粒以表达用于产生碳基产物的各种不同的蛋白质。构建体可以合成制备或使用标准分子生物学方法制备，且所有的克隆基因被置于组成型或诱导型启动子的控制下。包含目标基因的质粒被转化到宿主中，并在补充有抗体(如奇霉素、羧苄青霉素等)的LB培养板中选择相应的转化体。使用标准的分子生物 学技术，核酸分子已经引入其中的细胞经转化以表达或过表达所需的基因而其它核酸分子被弱化或功能缺失。可以将核酸分子引入这种细胞的转化技术，包括但不限于用病毒载体转染、接合、用质粒载体转化、以及通过电穿孔、脂质体转染、和粒子枪加速引入裸DNA。将转化体接种到适当的培养基中。含有转化体的样本在振动器上生长在合适的温度下直到他们达到一定的OD。然后这些细胞旋转落下，且悬浮细胞沉淀。分离技术使样本可以进行GC/MS分析。测定总产量。

[0126] 生产碳基目的产物的选择或工程微生物

[0127] 微生物：包括来自于古细菌、细菌和真核生物域的原核的和真核微生物物种，真核生物域包括酵母和丝状真菌、原生生物、藻类或较高等的原生生物。术语“微生物细胞”和“微生物”可以与术语微生物互补使用。

[0128] 可以转化多种宿主生物以产生目的产物。光合自养生物体包括真核植物和藻类，以及原核蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌和紫色非硫细菌。

[0129] 适合的生物包括耐受各种环境参数(如温度、辐射、压力、重力、真空、干燥、盐度、pH值、氧含量以及化学品)的嗜极生物。它们包括超嗜热菌，其生长在80℃或高于80℃下，如延胡索酸火叶菌；嗜热细菌，其生长在60-80℃之间，如Synechococcus lividis；中温菌，其生长在15-60℃之间和低温微生物，其生长在15℃或低于15℃，如嗜冷杆菌(Psychrobacter)和一些昆虫。耐辐射生物体包括耐辐射奇球菌。耐压力生物体包括嗜压微生物或适压微生物，其耐受130MPa的压力。还涉及耐受超重力(如，＞1g)、低重力(例如，＜1g)的生物。真空耐受生物包括节肢动物、昆虫、微生物和种子。干燥耐受的和脱水生活生物体包括耐旱生物如卤虫；线虫、微生物、真菌和地衣。耐盐微生物包括嗜盐生物(如2-5M氯化钠)盐杆菌科和杜氏盐藻。耐pH生物包括嗜碱菌，如嗜盐碱杆菌属、坚强芽孢杆菌OF4、螺旋藻属的种(Spirulina spp.)(例如，pH值＞9)和嗜 酸细菌如Cyanidium caldarium，Ferroplasma sp.(例如，低pH值)。厌氧菌(其不能耐受氧气)如詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)；微需气菌(其能耐受部分氧)如梭菌属(Clostridium)，以及需氧菌(其需要氧气)。耐气生物体(Gas tolerant organism，其耐受纯二氧化碳)包括Cyanidium caldarium和耐金属生物体包括耐金属菌如Ferroplasma acidarmanus(如铜、砷，镉，锌)，雷尔氏菌CH34种(例如，锌，钴，镉，汞，铅)。Gross，Michael.Life on the Edge：Amazing Creatures Thriving in Extreme Environments.New York：Plenum(1998)和Seckbach，J.″Search for Life in the Universe with Terrestrial Microbes Which Thrive Under Extreme Conditions.″In Cristiano Batalli Cosmovici，Stuart Bowyer和Dan Wertheimer，eds.，Astronomical and Biochemical Origins and the Search for Life in the Universe，p.511.Milan：Editrice Compositori(1997)。

[0130] 植物包括但不限于以下属：拟南芥属、甜菜属、大豆属、麻风树属、芒属、黍属、虉草属、杨属、甘蔗属、柳属、油蜡树属和玉蜀黍属。

[0131] 藻类和蓝细菌包括但不限于以下属：

[0132] 刺菊石属、Acanthococcus、Acaryochloris、曲壳藻属、翼硅藻属、星形藻属、Actinochloris、辐环藻属、辐射鼓藻属(Actinotaenium)、双金藻属、前沟藻属、Amphikrikos、双肋藻属、茧形藻属，分须藻属、双眉藻属、鱼腥藻属、项圈藻属、暗额藻属，针连藻属、锚藻属、异菱藻属、虚幻球藻属、束丝藻属、隐球藻属、隐毛藻属、隐杆藻属、梨囊藻属、顶丝藻属、四棘鼓藻属、节旋藻属、Ascochloris、星杆藻属、星球藻属、奥氏藻属、浮生直链藻属、杆状藻属、巴尔比亚藻属、似竹鼓藻属、红毛菜属、Basichlamys、串珠藻属、骈胞藻属、角藻属、盘苔属、Botrdiopsis、气球藻属、葡萄藻属、球葡萄藻属、咸胞藻属、短螺旋体属、海雹菜属、Brebissonia、毛鞘藻属、柱杆藻属、拟杆藻属、美壁藻属、眉藻属、马鞍藻属、盒管藻属、四鞭藻属、Catena、Cavinula、顶刺藻属、Centronella、角藻属、角毛藻属、Chaetochloris、硬毛藻属、 Chaetonella、毛丝藻属、盾毛藻属、胶毛藻属、毛球藻属、管胞藻属、轮藻属(Chara)、Characiochloris、拟小桩藻属、小桩藻属、轮藻目、缘胞藻属、厚胞藻属、Chlamydoblepharis、Chlamydocapsa、衣藻属、Chlamydomonopsis、衣粘藻属、Chlamydonephris、Chlorangiella、拟绿囊藻属、小球藻属、绿葡萄藻属、绿幅藻属、绿点藻属、绿球藻属、绿胶藻属、拟绿胶藻属、绿梭藻属、绿带藻属、拟衣藻属、Chlorophysema、绿藻门(Chlorophyta)、绿胶囊藻属、Chlorosarcina、Choricystis、色植藻属、单鞭金藻属、拟色球藻属、色球藻属、色指藻属、蓝隐藻属、Chroothece、金变形藻属、金网藻属、金星藻属、金囊藻属、Chrysocapsella、Chrysochaete、金色藻属、金颗藻属、Chrysocrinus、Chrysolepidomonas、Chrysolykos、Chrysonebula、金藻门、金钟藻属、Chrysosaccus、Chrysophaerella、金环藻属、刚毛藻属、链孢藻属、拟新月藻属、新月藻属、胶球藻属、卵形藻属、Coelastrella、空星藻属、腔球藻属、Coenochloris、无胶集球藻属、聚囊藻属、柄裸藻属、鞘毛藻属、Collodictyon、Compsogonopsis、弯枝藻属、Conjugatophyta、Conochaete、Coronastrum、鼓藻属、Cosmioneis、胶球鼓藻属、Crateriportula、Craticula、发毛针藻属、十字藻属、卵胞藻属、Cryptoaulax、隐藻属、隐藻门、栉水母门、Cyanodictyon、Cyanonephron、Cyanophora、蓝藻门(Cyanophyta)、蓝杆藻属、Cyanothomonas、环胞藻属、环冠藻属、小环藻属、筒藻属、柱胞鼓藻属、柱孢藻属、细柱藻属、波缘藻属、桥弯藻属、Cymbellonitzschia、胞甲藻属、蓝纤维藻属、单板藻属、细齿藻属、Dermatochrysis、皮果藻属、果菌属、缢带藻属、角丝鼓藻属、Desmococcus、带线藻属、Desmosiphon、长刺藻属、Diacronema、Diadesmis、等片藻属、Diatomella、双细胞藻属、双须藻属、叉球藻属、Dicranochaete、网绿藻属、球网藻属、胶网藻属、泡双吸虫属、Didymogenes、异形藻属、丝藻属、双形藻属、锥囊藻属、球甲藻属、双绿藻属、双壁藻属、Diplostauron、Distrionella、基纹鼓藻属、竹枝藻属、杜氏藻属、孔壳藻属、Ecballocystis、纺锤藻属、Ellerbeckia、双眉藻属、浒苔属、内枝藻属、Entomoneis、石囊藻属、附金藻属、附钟藻 属、窗纹藻属、独球藻属、Euastropsis、凹顶鼓藻属、立方藻属、真卵形藻属、空球藻属、裸藻属、裸藻门、短缝藻属、Eustigmatophyta、双鞭藻属、Fallacia、费氏藻属、脆杆藻属、Fragilariforma、披刺藻属、肋缝藻属、Curcilla、双胞藻属、短水绵属、灰胞藻属、灰色藻门、Glenodiniopsis、薄甲藻属、粘球藻属、Gloeochaete、Gloeochrysis、圆球藻属、胶囊藻属、Gloeodendron、胶胞藻属、Gloeoplax、粘杆藻属、胶丝藻属、胶刺藻属、Gloiodictyon、多芒藻属、拟多芒藻属、孢根藻属、楔桥弯藻属、异极藻属、束球藻属、棒形鼓藻属、Gongrosia、角绿藻属、盘藻属、膝口藻属、粒绿藻属、Granulocystopsis、Groenbladia、裸甲藻属、缢丝鼓藻属、布纹藻属、红球藻属、Hafniomonas、Hallassia、双尖藻属、Hannaea、菱板藻属、软管藻属、Haplotaenium、定鞭藻门、Haslea、半沟藻属、Hemitoma、茸壳藻属、异毛藻属、异线藻属、Hibberdia、胭脂藻属、隐鞭藻属、Holopedium、须藻属、管鞘藻属、皮襟藻属、Hyalobrachion、Hyalocardium、明盘藻属(Hyalodiscus)、透明棱藻属、圆丝鼓藻属、Hydrianum、Hydrococcus、水鞘藻属、水条藻属、水网藻属、水涟藻属、水树藻属、蓝枝藻属、膜胞藻属、细绿藻属、Johannesbaptistia、肾粒藻属、Karayevia、尖眼藻属、Katodinium、金杯藻属、角球藻属、蹄形藻属、克里藻属、Kolbesia、Koliella、Komarekia、Korshikoviella、Kraskella、拉氏藻属、烧瓶藻属、丽枝藻属、鱼子菜属、鳞孔藻属、钩端螺旋体属、Lobococcus、Lobocystis、叶衣藻属、Luticola、鞘丝藻属、Malleochloris、鱼鳞藻属、Mantoniella、射星藻属、Martyana、鞭鞘藻属(Mastigocoleus)、胸隔藻属、直链藻属、平列藻属、Mesostigma、中带鼓藻属、微芒藻属、小星藻属、微毛藻属、微鞘藻属、微胞藻属、软壳藻属、微单胞菌属、微孢藻属、小丛藻属、柄球藻属、单鞭金藻属、蒜头藻属、Monomastix、单针藻属、礁膜属、转板藻属、拟转板藻属、喙藻属、Myromecia、粘囊藻属、瓶丝藻属、微绿球藻属、类球藻属、舟形藻属、Neglectella、长篦藻属、Nephroclamys、肾形藻属、Nephrodiella、肾藻属、梭形鼓藻属、丽藻属、拟丽藻属、菱形藻属、节球藻属、念珠藻属、棕鞭藻属、鞘藻属、Oligochaetophora、棘接鼓藻属、Oocardium、 卵囊藻属、具隙藻属、黄管藻属、Orthoseira、颤藻属、Oxyneis、厚枝藻属、四集藻属、掌网藻属、实球藻属、Pannus、Paralia、巴喧氏藻属、Paulschulzia、盘星藻属、柄钟藻属、平藻属、指藻属、Pelagodictyon、柱形鼓藻属、袋鞭藻属、拟多甲藻属、多甲藻属、Peronia、石藻属、壳衣藻属、扁裸藻属、Phaeaster、褐皮藻属、褐藻门(Phaeophyta)、Phaeosphaera、金枝藻属、席藻属、叶楯藻属、Phyllariochloris、Phyllocardium、Phyllomitas、羽纹藻属、Pitophora、Placoneis、游丝藻属、浮球藻属、Planothidium、织线藻属、杂球藻属、Pleurastrum、厚皮藻属、侧枝藻属、双盘藻属、斜纹藻属、侧链藻属、宽带鼓藻属、Pocillomonas、Podohedra、多鞭藻属、Polychaetophora、多角藻属、多突藻属、Polygoniochloris、Polyepidomonas、Polytaenia、素衣藻属、Polytomella、紫球藻属、Posteriochromonas、Prasinochloris、绿枝藻属、Prasinophyta、溪菜属、Prochlorphyta、原绿发藻属、原皮藻属、原生管属、朴罗藻属、三毛金藻属(Prymnesium)、Psammodictyon、Psammothidium、伪 项 圈 藻 属、Pseudenoclonium、Psuedocarteria、Pseudochate、Pseudocharacium、Pseudococcomyxa、Pseudodictyosphaerium、假金杯藻属、伪瘤皮藻属、Pseudoquadrigula、Pseudosphaerocystis、Pseudostaurastrum、Pseudostaurosira、Pseudotetrastrum、翼膜藻属、Punctastruata、Pyramichlamys、塔胞藻属(Pyramimonas)、甲藻门(Pyrrophyta)、四毛藻属、Quadricoccus、并联藻属、芒球藻属、辐丝藻属、尖头藻属、Raphidocelis、针丝藻属、Raphidophyta、Peimeria、棒条藻属、杆胞藻属、根枝藻属、红胞藻属、红藻门、弯楔藻属、棒杆藻属、胶须藻属、Rosenvingiella、Rossithidium、Roya、栅藻属、Scherffelia、Schizochlamydella、裂壁藻属、裂线藻属、裂须藻属、弓形藻属、Scolioneis、螺翼藻属、Scotiellopsis、Scourfieldia、双歧藻属、月牙藻属、月绿藻属、Sellaphora、Semiorbis、褐胞藻属(Siderocelis)、拟铁囊藻属、Dimonsenia、管线藻属、Sirocladium、链膝藻属、骨条藻属、群星藻属、Spermatozopsis、Sphaerellocystis、拟球藻属、Sphaerodinium、环藻属、瘤接鼓藻属、刺胞藻属、水绵属、螺带 鼓藻属、螺旋藻属、Spondylomorum、顶接鼓藻属、Sporotetras、Spumella、角星鼓藻属、叉链藻属、幅节藻属、十字脆杆藻亚属、Staurosirella、长羽藻属、Stephanocostis、冠盘藻属、冠孔藻属、Stephanosphaera、裂丝藻属、粘胶藻属、毛枝藻属、真枝藻属、柄球藻属、斯特克藻属、陀螺藻属、柄胞藻属、Stylodinium、柱钟藻属、绿柄球藻属、双菱藻属、Sykidion、束藻属、聚球藻属、集胞藻属、针杆藻属、聚赭胞藻属、黄群藻属、平板藻属、Tabularia、Teilingia、切孢藻属、裂顶鼓藻属、四球藻属、四环藻属、四链藻属、Tetraedriella、四角藻属、Tetraselmis、四孢藻属、四星藻属、海链藻属、丛毛藻属、Thermosynechococcus、Thorakochloris、红索藻属、鸟巢藻属、单歧藻属、囊裸藻属、Trachydiscus、共球藻属、橘色藻属、四棘藻属、黄丝藻属、束毛藻属、Trichodiscus、小箍藻属、盘杆藻属、丝藻属、辐尾藻属、尾丝藻属、尾管藻属、尾孢藻属(Urospora)、Uva、周泡藻属、无节藻属、团藻属、Volvulina、韦斯藻属、网甲藻属、多棘鼓藻属、黄藻门、异球藻属、双星藻属、拟双星藻属和Zygonium。

[0133] 绿色非硫细菌，包括但不限于以下属：绿曲挠菌属、绿丝菌属、颤绿菌属、螺丝菌属、滑柱菌属、玫瑰弯菌属和热微菌属。

[0134] 绿色硫细菌，包括但不限于以下属：绿菌属、格状绿菌属和突柄绿菌属。 [0135] 紫色硫细菌包括但不限于以下属：Allochromatium、着色菌属、盐着色菌属、Isochromatium、Marichromatium、小红卵菌属、热着色菌属、荚硫菌属、硫红球菌属和囊硫菌属。

[0136] 紫色非硫细菌，包括但不限于以下属：褐螺菌属、Rhodobaca、红细菌属、红微菌属、红球形菌属、红假单胞菌属、红海菌属、红螺菌属、Rodovibrio和玫瑰螺旋菌属。 [0137] 需氧的化能无机营养菌包括但不限于硝化细菌，如硝化杆菌科的种、硝化细菌属的种、硝化刺菌属的种、硝化球菌属的种、硝化螺菌属的种、亚硝化单胞菌属的种、亚硝化球菌属的种、亚硝化螺菌属的种、亚硝化叶菌属的种、亚硝化弧菌属的种；无色硫细菌，如卵硫 菌属的种、硫杆菌属的种、硫微螺菌属的种、硫球形菌属的种、高温毛发菌属的种；专性化能无机营养氢细菌，如氢杆菌属的种，铁和锰氧化和/或沉淀细菌如铁球菌属的种，和磁性细菌如水螺菌属的种。

[0138] 古细菌包括但不限于产甲烷的古细菌如甲烷杆菌属的种、甲烷短杆菌属的种、甲烷嗜热菌属的种、甲烷球菌属的种、甲烷微菌属的种、甲烷螺菌属的种、产甲烷菌属的种、甲烷八叠球菌属的种、甲烷叶菌属的种、甲烷丝菌属的种、拟甲烷球菌属的种、甲烷盘菌属的种；极端嗜热硫代谢菌，如热变形菌属的种、热网菌属的种、硫化裂片菌属的种、嗜酸菌属的种，及其它微生物如枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、链霉菌属的种、雷尔氏菌属的种、红球菌属的种、棒状杆菌属的种、短杆菌的种、分枝杆菌的种和产油酵母。

[0139] 高光合转换需要大量的基因修饰，因此在优选的实施方式中，可用外源DNA转化母本的光合自养生物体。

[0140] 用于高光合转换的优选生物体包括：拟南芥、柳枝稷、巨芒和玉米(植物)、布朗葡萄藻、莱茵衣藻和杜氏盐藻(海藻)、聚球藻PCC7002种、聚球藻PCC 7942种、集胞藻PCC6803种和Thermosynechococcus elongatusBP-1(蓝细菌)、微温绿菌(绿色硫细菌)、橙色绿屈挠菌(绿色非硫细菌)、微温着色菌和酒色着色菌(紫色硫细菌)、深红红螺菌、荚膜红细菌和沼泽红假单胞菌(紫色非硫细菌)。

[0141] 另外的其它合适的生物体包括合成细胞或者如在Venter等的美国专利公开号2007/0264688中所述的通过合成基因组产生的细胞，以及如在Glass等的美国专利公开号
2007/0269862中所述的细胞样系统或合成细胞。

[0142] 然而，其它合适的生物体包括可被工程化以固定二氧化碳细菌的微生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)、醋酸杆菌(Acetobacter aceti)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酵母和真菌，如扬氏梭菌、热纤梭菌、产黄青霉菌、毕赤酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、荧光假单胞菌或运动发酵单胞菌。

[0143] 选择或对合适的生物体工程化的普遍主题是自养固定碳，如二 氧化碳以产生产物。这包括光合作用和甲烷生成。也包括乙酸生成，其包括3种CO2固定类型：卡尔文循环、乙酰CoA途径和还原TCA途径。利用二氧化碳作为细胞碳唯一来源的能力(自养作用)存在于几乎所有主要的原核生物组中。组之间的二氧化碳固定途径不同，并且四个目前已知的自养途径没有明确的分布模式。Fuchs，G.1989.Alternative pathways of autotrophic CO2 fixation，p.365382.In H.G.Schlegel 和 B.Bowien(ed.)，Autotrophic bacteria.Springer Verlag，Berlin，Germany。还原戊糖磷酸盐循环(Calvin Bassham Benson循环)代表几乎所有的需氧自养细菌(例如，蓝细菌)中的CO2固定途径。所选择的微生物的繁殖 [0144] 用于在液体培养基中和在含琼脂糖的平板上培养光合生物体的方法是该领域的技术人员已知的(见，例如，与ATCC和巴斯德研究所相关的网站)。例如，聚球藻PCC 7002种细胞(由巴斯德研究所蓝细菌培养物保藏中心提供)培养在补充有16μg/L生物素、20mM MgSO4、8mM KCl和300mM NaCl的BG-11培养基中(17.65mM NaNO3，0.18mM K2HPO4，0.3mM MgSO4，0.25mM CaCl2，0.03mM柠檬酸，0.03mM柠檬酸铁铵，0.003mM EDTA，0.19mM Na2CO3，2.86mg/L H3BO3，1.81mg/L MnCl2，0.222mg/L ZnSO4，0.390mg/L Na2MoO4，0.079mg/L CuSO4和
0.049mg/L Co(NO3)2，pH 7.4)(见，例如，与巴斯德研究所相关的网站，和Price GD，Woodger FJ，Badger MR，Howitt SM，Tucker L.“Identification of a SulP-type bicarbonate transporter in marine cyanobacteria.Proc Natl.Acad.Sci.USA(2004)101(52)：
2
18228-33)。通常，培养物被保持在28℃，且在120μmol光子/m/s的光强度下用5％的二氧化碳连续通气。或者，如实施例1所述，如前面所述聚球藻PCC 7002种细胞被培养+
在A 培养基中[Frigaard NU等(2004)“Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp.PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobiumtepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation，”Methods Mol.Biol.，274：325-340]。

[0145] 如前面所述，Thermosynechococcus elongatusBP-1(由Kazusa DNA研究所，日本提供)在补充20mM TES KOH(pH 8.2)的BG11培养基中繁殖[Iwai M，Katoh H，Katayama M，Ikeuchi M.“Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium，Thermosynechococcus elongatus BP-1.”Plant Cell Physiol(2004).45(2)：171-175)]。2
通常，培养物被保持在50℃，并在38μmol光子/m/s的光强度下用5％的二氧化碳连续通+
气。T.elongatus BP-1也可以如实施例2所述生长在A 培养基中。

[0146] 莱茵衣藻(由Duke大学，Durham，North Carolina维持的衣藻菌种保藏中心提供)如所述(Geraghty AM，Anderson JC，Spalding MH.“A 36 kilodalton limiting-CO2 induced polypeptide of Chlamydomonas is distinct from the 37 kilodalton periplasmic anhydrase.”Plant Physiol(1990).93：116-121)生长在由143mg/K K2HPO4，73mg/L KH2PO4，400mg/L NH4NO3，100mg/L MgSO4-7H2O，50mg/L CaCl2-2H2O，1mL/L微量元素原料和用Tris碱滴定到pH 7.6的10mL/L 2.0M MOPS组成的最低盐培养基中。通常，培养物
2
被保持在24℃，并在60μmol光子/m/s的光强度下用5％的空气连续通气。

[0147] 以上定义了典型的繁殖条件。适当情况下，用替代的培养基或气体组成替代的温2
度(5-75℃)和/或光通量(0-5500μmol光子/m/s)进行孵育。

[0148] 光通过各种途径传输，包括自然光照(日光)、标准白炽灯、荧光灯或卤素灯泡，或通过在特别设计的光照培养箱(例如LI15型光照生长箱(Sheldon Manufacturing，Inc.Cornelius，OR))中传播。对于需要特定波长和/或强度的实验，通过发光二极管(LED)分配光，其中波长范围和强度可以被仔细控制(飞利浦)。

[0149] 二氧化碳是通过包括固体培养基添加剂(即碳酸氢钠)或作为通过其分布进入生长孵化器或培养基中的气体提供。大多数实验使用浓缩的二氧化碳气体(浓度在1％至30％之间)进行，其以足以向生物体提供混合的速率直接通入生长培养基中。当利用浓缩二氧 化碳气体时，该气体以纯净形式来源于市售气瓶，或优选源于浓缩源，包括来自煤厂、炼油厂、水泥生产厂、天然气厂、酿造厂等等的废气或烟道气。

[0150] 选择的微生物的转化

[0151] 根据前面描述的优化方案转化聚球藻PCC 7002种细胞[Essich ES，Stevens Jr E，Porter RD“Chromosomal Transformation in the Cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum”.J Bacteriol(1990).172(4)：1916-1922]。细胞在培养基A(18g/L NaCl，5g/L MgSO4.7H2O，30mg/L Na2EDTA，600mg/L KCl，370mg/L CaCl2.2H2O，1g/L NaNO3，50mg/L KH2PO4，1g/L Trizma碱pH 8.2，4μg/L维生素B12，3.89mg/LFeCl3.6H2O，34.3mg/L H3BO3，4.3mg/L MnCl2.4H2O，315μg/L ZnCl2，30μg/L MoO3，3μg/L CuSO4.5H2O，12.2μg/L CoCl2.6H2O)[Stevens SE，Patterson COP和Myers J.“The production of hydrogen peroxide by green algae：a survey.”J.Phycology(1973).9：427-430]加5g/L的NaNO3中生长到约108细胞/毫升。九体积的细胞与在0.15M NaCl/0.015M Na3柠檬酸中的一体积的1-10μg/mL DNA混合，并在27-30℃孵育3小时，然后加入一体积的Dnase I到达终浓度10μg/mL。该细胞涂在45℃下的2.5mL的0.6％培养基A琼脂平板上并孵育。通过用无菌巴斯德吸管铺垫含有适当浓度抗生素的2.0mL的0.6％培养基A琼脂用抗生素激发细胞。3-4天后挑取转化体。一般使用200μg/ml卡那霉素、8μg/ml氯霉素、10μg/ml奇霉素在固体培养基进行选择，而在液体培养基中采用150μg/ml卡那霉素、7μg/ml氯霉素和
5μg/ml奇霉素。

[0152] 根据前面描述的优化方案转化T.elongatus BP-1细胞(Iwai M，Katoh H，Katayama M和Ikeuchi)。

[0153] 利用本领域的技术人员已知的标准技术转化大肠杆菌，包括化学感受态细胞的热激和电穿孔[Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology volume 152Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.；Sambrook等(1989)Molecular Cloning--A Laboratory Manual(2nd ed.)Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；和Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等，eds.，Current Protocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，(遍及并包括1997年增刊)]。 [0154] 本文所述的生物合成途径首先使用上述附加体质粒测试和优化。非限制性优化包括启动子交换和调节、核糖体结合位点操作、基因顺序改变(例如，基因ABC与BAC、CBA、CAB、BCA)、分子伴侣共表达、基因序列的随机或靶向性突变以增加或减少活性、折叠或变构调节、替代物种的基因序列表达、密码子操作、细胞内靶向序列(如信号序列)的添加或移除等等。

[0155] 各个基因或工程核酸被单独地或交替地，平行地进行优化。随后，使用本领域技术人员已知的标准技术，将功能启动子和基因序列整合到大肠杆菌染色体中以能够在没有选择压力(即包含抗生素)的情况下稳定繁殖。

[0156] 图1列出了参与产生碳基目的产物的基因，涉及相关的途径、酶委员会(EC)编号、示例基因名称、源生物体、GenBank登录号以及来自其它来源的同源基因。当母本生物体编码具有所需的酶活性的基因，有利的是过表达如所示的这些成分或至少弱化这些成分。在一个实施方式中，原始酶序列被过表达或弱化。在优选的实施方式中，有利的是过表达或弱化外源基因，其允许在生物过程中更明确地进行调控，和潜在地减轻中心代谢调控影响的手段，其明确地集中在原始基因周围。

[0157] 乙醇的产生

[0158] 一个方面中，产生醇类如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、脂肪醇、其它此类碳基目的产物。图2提供了产生乙醇、琥珀酸及其衍生物的途径。

[0159] 迄今为止，蓝细菌中生产乙醇的目前产量在每天每OD730 1.3mM，其不适合商业化生产(如公开于WO 2007/084477)，或每小时每毫克叶绿素1.7μmol乙醇(如美国专利号6,699,696所示)。

[0160] 因此，本发明提供了制备以商业化水平(如在约48小时时间内在大约50至150g/L之间)产生生物燃料(例如乙醇)的能够固定二氧化碳的宿主细胞的方法。在某些实施方式中，乙醇产率是在约2.5g/L-hr至约5g/L-hr范围内。在一个实施方式中，能够固定二氧化碳的宿主细胞(如蓝细菌聚球藻PCC 7002种)经工程化以表达如所公开的基因，例如pdc和/或adh。这种重组微生物编码PDC活性以将丙酮酸转化为乙酰乙醛和/或ADH活性以将乙酰乙醛转化成乙醇。该转化的微生物固定二氧化碳的能力不需要补充糖或生物质。因此，本发明的微生物是产生生物燃料的有吸引力的替代方案。本发明提供的乙醇的w/v是至少50、或者至少60或至少70或至少80或至少90或至少100或至少125或至少150克/L或其它以商业规模产生的量。

[0161] 酶选择和最佳的酶

[0162] 目前，生物有机体内产生的发酵产物(如乙醇、丁醇、乳酸、甲酸、乙酸)采用NADH依赖性过程。NAD被用于分解葡萄糖或其它糖源以形成NADH。NADH在发酵过程中循环生成+NAD 以便进一步糖降解，其产生发酵副产物。但是，在光合作用过程中，细胞形成NADPH，其大部分用于生物有机体(例如，细胞)中的生物合成作用，用于生长、分裂以及用于建立化学储备如糖原、蔗糖和其它大分子。在光中产生发酵产物，但数量较少。

[0163] 使用利用NADPH而不是NADH作为还原力源的天然的或合成的酶可以允许直接利用光合的还原力以形成正常发酵的副产物。因此，本发明提供了通过表达NADPH依赖性酶产生发酵产物(如乙醇)的方法。这与先前的利用生物体(如藻类)建立化学储备的方法相比是一个改进，该化学储备随后被用于在夜间制造发酵产物，或独立生物体的外源用途。实际上，在光合作用中直接地在光中以较高的效率形成发酵产物。此外，通过直接在白天产生这些产物减少了在白天必须产生高浓度的大分子。

[0164] 正常地产生发酵产物的NADPH依赖性酶在自然界是罕见的。 因此，在本发明的某些方面中，在表达或经修饰以表达穆尔氏菌HUC22-1种或其同源基因的生物体中产生乙醇，其包括至少三种醇脱氢酶如AdhA(NCBI登录号YP_430754)。以前已经证明该酶优先地利用NADP而不是NAD作为辅酶，并以高速率从乙醛产生乙醇[″Characterization of enzymes involved in the ethanol production of Moorella sp.HUC22-1″]。通过在选定的生物体(如蓝细菌)中共表达该基因，可直接在这些生物中使用光合作用过程中形成的NADPH2形成乙醇。或者，可以利用已建立的蛋白质工程技术对天然地利用NADH的酶工程化以需要NADPH2而不是NADH。

[0165] 在特定的实施方式中，源自穆尔氏菌的NADPH依赖性AdhA在蓝细菌中与源自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶共表达，以获得依赖NADPH而不是传统的NADH作为辅助因子的产生乙醇的有效过程。这种转基因生物体能够利用NADPH依赖性过程制造乙醇。分离的多核苷酸

[0166] 因此，本发明提供了用于adhA基因及其变异体的分离的核酸分子。用于该基因的全长核酸序列(编码NADPH依赖性醇脱氢酶EC 1.1.1.2)已确认并测序。SEQ ID NO：1代表本发明的穆尔氏菌HUC22-1种adhA基因的密码子优化和表达优化的编码序列。

[0167] 本发明提供了包含或者由野生型adhA基因的密码子优化和表达优化版本的序列组成的核酸分子。在进一步的实施方式中，本发明提供SEQ ID NO：1的核酸分子以及同源体、变异体和衍生物，其包含或由至少与SEQ ID NO：1具有77.1％的同一性的作为adhA基因的变异体的序列。该核酸序列优选地可以与SEQ ID NO：1具有78％、79％、80％、81％-85％、90％-95％、96％-98％、99％、99.9％或甚至更高的同一性。

[0168] 在另一个实施方式中，本发明提供了编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的核酸分子。

[0169] 本发明还提供了在严格的条件下与上述核酸分子杂交的核酸分子。如上述定义以及如本领域公知的，严格杂交是在一系列特殊 的条件下在低于特定DNA杂交体的熔点(Tm)的约25℃下进行，其中Tm是50％的目标序列与完全匹配的探针杂交的温度。严格的洗涤是在一系列特殊的条件下在低于特定DNA杂交体的熔点(Tm)的约5℃的温度下进行。 [0170] 还提供了包含任何一个上述核酸序列的片段的核酸分子。这些片段优选包含至少20个连续的核苷酸。更优选地，该核酸序列的片段包含至少25、30、35、40、45、50、60、70、
80、90、100个或甚至更多的连续核苷酸。

[0171] 本发明的核酸序列片段在多种系统和方法中起作用。例如，该片段可在各种杂交技术中用作探针。根据该方法，目标核酸序列可以是DNA或RNA。杂交前可以将目标核酸序列分级(例如，通过凝胶电泳)，或杂交可以在样本上原位进行。本领域的技术人员将理解，已知序列的核酸探针可用于确定染色体的结构(例如通过Southern印迹杂交)和测定基因表达(如通过Northern印迹杂交)。在此类实验中，该序列片段优选被可检测地标记，以使得他们与目标序列的特异性杂交可以被检测并任选地定量。本领域的技术人员将理解，本发明的核酸片段可以被用于本文没有具体说明的广泛杂交技术。

[0172] 还应该理解，本文公开的核酸序列片段在固定到微阵列中时也能起到作为探针的效用。通过将核酸沉淀和固定到载体基质上以形成微阵列的方法是本领域熟知的。DNA微阵列的综述：A Practical Approach(Practical Approach Series)，Schena(ed.)，Oxford University Press(1999)(ISBN：0199637768)；Nature Genet.21(1)(suppl)：1-60(1999)；Microarray Biochip：Tools and Technology，Schena(ed.)，Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division(2000)(ISBN：1881299376)，其公开通过引入以其整体引入本文。例如，利用包含括核酸序列片段(如本文公开的核酸序列片段)的微阵列的基因表达分析在细胞和分子生物学领域中是序列片段的公认的用途。固定在微阵列上的序列片段的其它用途描述于Gerhold等，Trends Biochem.Sci.24：168-173(1999)和 Zweiger，Trends Biotechnol.17：429-436(1999)；DNA Microarrays：A Practical Approach(Practical Approach Series)，Schena(ed.)，Oxford University Press(1999)(ISBN：0199637768)；Nature Genet.21(1)(suppl)：1-60(1999)；Microarray Biochip：
Tools and Technology，Schena (ed.)，Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division(2000)(ISBN：1881299376)，其中各文献的公开通过引用整体引入本文。 [0173] 在另一个实施方式中，提供了编码包含醇脱氢酶活性的NADPH依赖性AdhA多肽的分离的核酸分子。如本领域众所周知的，可以用各种不同的方式来测量酶的活性。
例如，可以用分光光谱法追踪OMP的焦磷酸解作用。Grubmeyer等，J.Biol.Chem.268：
20299-20304(1993)。或者，可以用色谱技术追踪酶的活性，如通过高效液相色谱法。Chung和Sloan，J.Chromatogr.371：71-81(1986)。作为另一个选择，可以通过测定由该酶活性产生的产物水平间接测量活性。可以如本领域已知和描述的用包括水性氯仿/甲醇提取的技术测量这些水平(参见M.Kates(1986)Techniques of Lipidology；Isolation，analysis and identification of Lipids.Elsevier Science Publishers，New York(ISBN：
0444807322))。更多的现代技术包括使用与质谱连接的气相色谱(Niessen，W.M.A.(2001).Current practice of gas chromatography--mass spectrometry.New York，N.Y：Marcel Dekker.(ISBN：0824704738))。另外的用于确定重组蛋白质活性和产物的现代技术，包括液相色谱-质谱(LCMS)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)、核磁共振(NMR)、近红外(NIR)光谱、粘度测量法(Knothe，G.，R.O.Dunn 和 M.O.Bagby.1997.Biodiesel：The use of vegetable oils and their derivatives as alternative diesel fuels.Am.Chem.Soc.Symp.Series 666：172-208)、测定游离脂肪酸的滴定(Komers，K.，F.Skopal和R.Stloukal.1997.Determination of the neutralization number for biodiesel fuel production.Fett/Lipid 99(2)： 52-54)、酶 法 (Bailer，J. 和 K.de Hueber.1991.Determination of saponifiable glycerol in“bio-diesel.”Fresenius J.Anal.Chem.340(3)：186)、基于物理性质的方法、湿化学方法等，可用于分析本发明的生物体产生的产物的水平和特性。其它方法和技术也可以适用于酶的活性测定，如本行业的技术人员所知的。

[0174] 如本文进一步描述的，还提供了包含本发明的上述核酸分子的载体(包括表达载体)。在第一个实施方式中，该载体包含上述的分离的核酸分子。在替代的实施方式中，本发明的载体包含可操作的连接于一个或多个表达调控序列的上述核酸分子。本发明的载体因此可被用来表达包含醇脱氢酶活性的NADPH依赖性AdhA多肽。

[0175] 分离的多肽

[0176] 根据本发明的另一个方面，提供了由本发明的核酸分子编码的分离的多肽(包括突变蛋白、等位基因变异体、片断、衍生物以及类似物)。在一个实施方式中，该分离的多肽包含与SEQ ID NO：2相对应的多肽序列。在本发明的替代实施方式中，该分离的多肽包含的多肽序列与SEQ ID NO：2至少71.1％相同。优选地，本发明的分离的多肽具有72％、73％-75％、76％-80％、81％-90％、95％、96％、97％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、
98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、
99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或甚至更高的与SEQ ID NO：2的同一性。 [0177] 根据本发明的其它实施方式，提供了包含上述多肽序列的片段的分离的多肽。这些片段优选包含至少20个连续的氨基酸，更优选至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、
100个或甚至更多的连续氨基酸。

[0178] 本发明的多肽还包括上述多肽序列和异源多肽的融合体。异源序列可以，例如，包括设计为促进净化(例如，组氨酸标签)和/或重组表达的蛋白质的可视化的序列。蛋白融合体的其它非限制实例包括那些允许编码的蛋白质在噬菌体或细胞表面上显示的蛋白融合 体、与内在荧光蛋白(如绿色荧光蛋白(GFP))的融合体以及与IgG的Fc区域的融合体。

[0179] 最优酶的结果

[0180] 乙醇的水平提高通过对宿主细胞工程化以具有NADPH依赖的醇脱氢酶活性而观察到。用于产生增加水平的乙醇的方法包括表达如本文所述的该NADPH依赖的adhA基因。 [0181] 在本发明的某些方面中，乙醇的较高水平是72小时期间内生产至少约249mg/L的乙醇。更加优选地，72小时期间产生至少约297mg/L的乙醇(图12)。

[0182] 在本发明的其它方面中，公开了产生降低的乙醛水平的方法。在优选的实施方式中，产生少于约14mg/L的乙醛(图13)。

[0183] 然而，在本发明的其它方面中，公开了相对于增加的OD产生增加的乙醇量的方法。在优选的实施方式中，产生每OD至少约36mg/L的乙醇。更优选地，产生每OD至少约47mg/L的乙醇(图14)。

[0184] 因此，本文中表明了用于产生发酵产物(如乙醇)的这种NADPH依赖性酶的表达以增加乙醇的水平，降低乙醛的水平并实际上使得随OD的变化乙醇产量根据OD增加。 [0185] 营养独立

[0186] 在另一个方面中，除了二氧化碳和光外，光合自养生物通常需要无机的营养源和维生素。当该生物体实验室规模繁殖时，需要的营养物一般补充到生长培养基中。然而，这样的营养物在工业规模的生物处理中极为昂贵。

[0187] 维生素B12是有利于基于自由基反应的催化作用的维生素辅助因子。许多生物体，包括聚球藻PCC 7002种，需要外部来源的维生素B12进行生长，其在大规模的工业生物处理中极为昂贵。在一个实施方式中，通过光合自养细胞的工程化以表达维生素B12生物合成途径消除对维生素B12的需求，如2008年11月10日提交的PCT/US2008/083056中所公开。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中发现的典型的生物合成途径被过表达，包括但不限 于下列编码如以下所示氨基酸序列的基因：(尿卟啉-III C-转甲基酶(CysG)，EC 2.1.1.107，基因 座NP_462380)、(Sirohydrochlorin cobaltochelatase(CbiK)，EC
4.99.1.3，基因座NP_460970)、(Precorrin-2 C20转甲基酶(CbiL)，EC 2.1.1.130，基因座NP_460969)、(Precorrin3B甲基化酶(CbiH)，EC 2.1.1.131，基因座NP_460972)、(双功能CbiG/precorrin转甲基酶(CbiG)，基因座NP_460973)、(Precorrin-4 C11-转甲基酶(CbiF)，EC 2.1.1.133，基因座NP_460974)、(维生素B12生物合成蛋白质(CbiD)，基因座NP_460977)、(NADPH-依赖性precorrin-6A还原酶(CbiJ)，EC 1.3.1.54，基因座NP_460971)、(Precorrin-6B C5，15-转甲基酶(CbiE)，EC 2.1.1.132，基因座NP_460976)、(Precorrin-6B C12脱羧酶(CbiT)，EC 2.1.1.132，基因座NP_460975)、(Precorrin-
8X-methylmutase(CbiC)，EC 5.4.1.2，基因座NP_460978)、(钴比林酸A，C-二酰胺合成酶(CbiA)，EC 6.3.1.-，基因座NP_460980)、(钴比林酸(I)a，c二酰胺腺苷转移酶(BtuR)，EC 2.5.1.17，基因座NP_460677)、(钴比林酸合酶(CbiP)，EC 6.3.5.10，基因座NP_460964)、(钴啉胺酸脱羧酶(CobD)，EC 4.1.1.81，基因座NP_459636)、(腺苷钴胺素(Adenosylcobinamide)-磷酸合成酶(CbiB)，EC 6.3.1.10，基因座NP_460979)、(α-核唑(ribazole)-5’-P磷酸酶(CobC)，EC 3.1.3.73，基因座NP_459635)、(维生素B12(5’-磷酸)合成酶(CobS)，EC 2.7.8.26，基因座NP_460962)、(钴啉醇酰胺磷酸鸟苷酰转移酶(CobU)，EC2.7.7.62，基因座NP_460963)和(烟酸-核苷酸二甲基苯并咪唑-P转磷酸核糖基酶(CobT)，EC 2.4.2.21，基因座NP_460961)]。

[0188] 此外，为了能够吸收钴并整合入维生素B12，过表达编码钴转运蛋白的基因。在+鼠伤寒沙门氏菌中发现的典型钴转运蛋白被过表达，并且该蛋白质由(ABC型Co2 转运体系，通透酶成分(CbiM)，基因座NP_460968)、(ABC型钴转运系统，周质成分(CbiN)、基因座NP_460967)和(ABC型钴转运系统，通透酶成分(CbiQ)，基因座NP_461989)中所示的氨基酸序列编码。

[0189] 在优选的实施方式中，光合自养生物被工程化以过表达维生素 B12依赖性酶，以完全地避免对该辅酶的需要。在大多数的光合自养生物中，只有蛋氨酸合成酶(EC2.1.1.13)和II型核糖核苷酸还原酶需要维生素B12。因此，过表达来自海栖热孢菌(Thermotoga maritime)的典型的维生素B12独立的蛋氨酸合成酶(EC 2.1.1.14)，如PCT/US2008/083,506(5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶(MetE)，基因座NP_229090)中所示。此外，过表达来自集胞藻PCC 6803种的典型的I型核糖核苷酸还原酶(nrdAB)，编码如(核糖核苷-二磷酸还原酶，α亚基(NrdA)，基因座NP_441654)、(核糖核苷-二磷酸还原酶，β亚基(NrdB)，基因座NP_443040)所示的氨基酸序列。

[0190] 通过用上述和图1中所列的酶对生物体进行工程化，如更具体地如实施例3中所述产生photoethanolgen。因此，本发明在工程化以表达如pdc和/或adh的基因以产生乙醇的能够固定二氧化碳的宿主细胞(如聚球藻PCC 7002种)中提供，该宿主细胞被工程化以成为营养独立的。

[0191] 在连续光照下产生乙醇

[0192] 通常，微生物中糖原是在光中形成的，当黑暗时其将被消耗用于还原力。然而，通过连续光照，积累大量的糖原可能是不利的，其从需要的途径带走碳，尤其是因为没有足够长的黑暗阶段以利用糖原。在某些实施方式中，为了防止在光照期间合成糖原，将编码涉及糖原合成的酶活性的基因弱化或完全地消除至使得该微生物很容易地继续保持在活性状态并在发酵条件中强健的程度。因此，本发明提供至少弱化包括，但不限于以下的酶活性的微生物：葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶(EC 2.7.7.27)、糖原合成酶(EC2.4.1.21和EC2.4.1.11)、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(EC 2.7.7.9)和1，4-α-葡聚糖分支酶(EC2.4.1.18)。

[0193] 在乙醇生产的某些方面中，从二氧化碳固定中得到的碳被尽可能高效地导向丙酮酸。在光照期间，蓝细菌可以利用从卡尔文循环产生的甘油醛-3-磷酸从碳固定合成一些丙酮酸，因为他们仍然必须 由它形成生物合成前体。但是，他们这样做仅仅到达他们生长所需要的程度。为了增加从卡尔文循环中间体至丙酮酸的流量，需要的是从原始宿主或非原始宿主组成性地表达编码糖酵解酶的基因。基因的选择是基于变构调节作用是否设计为在宿主的预期的代谢环境中阻止其运用其全部活性。组成性可以通过在存在转录调控的情况下消除转录调控或通过从通常与其不相关的组成型启动子表达酶实现。因此，本发明提供了包含酶活性的产生乙醇的微生物，该酶活性包括但不限于：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC 1.2.1.12或EC 1.2.1.13)、磷酸甘油酸激酶(EC2.7.2.3)、磷酸甘油酸变位酶(EC5.4，2.1)、烯醇酶(EC4.2.1.11)和丙酮酸激酶(EC2.7.1.40)。

[0194] 本发明还提供了另外的丙酮酸转化为乙醇的酶的活性。在某些实施方式中，该转化可以通过至少四个完全不同的途径实现：1)丙酮酸脱羧酶途径，2)丙酮酸脱氢酶途径，3)丙酮酸氧化酶途径和4)丙酮酸甲酸裂解酶途径。丙酮酸脱羧酶途径所必需的酶活性是：
丙酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.1)和醇脱氢酶(EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2)。丙酮酸脱氢酶途径所必需的酶活性是：乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)和醇脱氢酶(EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2)。
丙酮酸氧化酶途径所必需的酶活性是：丙酮酸氧化酶(EC 1.2.2.2)、乙酰CoA合成酶(EC
6.2.1.1)、乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)和醇脱氢酶(EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2)。丙酮酸甲酸裂解酶途径所必需的酶活性是：丙酮酸甲酸裂解酶(EC2.3.1.54)、甲酸氢裂解酶(没有EC编号)、乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)和醇脱氢酶(EC 1.1.1.1或EC 1.1.1.2)。优选地，这些途径中的一个或多个组成性地表达或在某些其它调控下表达。

[0195] 除了提供具有新的调节的外源基因或内源基因，微生物中产生乙醇的优化优选需要消除或弱化某些宿主酶活性。这些包含但不限于，丙酮酸氧化酶(EC 1.2.2.2)、D-乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.28)、醋酸激酶(EC 2.7.2.1)、磷酸转乙酰酶(EC 2.3.1.8)、柠檬酸合成酶(EC 2.3.3.1)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(EC 4.1.1.31)。这些操作所需要达到的程度是通过生物反应器或摇瓶中观察的副产物决 定的。例如，观察到乙酸表示丙酮酸氧化酶、乙酸激酶和/或磷酸转乙酰酶活性的缺失。在另一个实例中，观察到D-乳酸表示D-乳酸脱氢酶活性的缺失，而观察到琥珀酸、苹果酸、延胡索酸、草酰乙酸盐或柠檬酸表示柠檬酸合成酶和/或PEP羧化酶酶活性的缺失。光暗循环中的乙醇产生

[0196] 在替代的实施方式中，本发明被设计成使得微生物被用于适合在光暗循环(其中数个小时的恒定光照随后是数个小时的相对黑暗)中运行的系统中。使用这样的循环，糖原合成能力的彻底消除可能不是可行的策略，因为细胞会需要一些糖原以在黑暗时期生存。在这种情况下，可以实施两种替代策略之一：1)弱化但不消除糖原合成酶，使得光照阶段仍然产生一些糖原；或2)光照阶段最大化糖原产生。

[0197] 在一个实施方式中，微生物弱化但不消除糖原合成酶的活性。这些方法通过删除原始的糖原合成基因活性并用具有非原始调节和比在原始宿主中低的水平表达的类似物取代他们。

[0198] 在另一个实施方式中，微生物在光照阶段中最大化糖原产生。这些方法通过在该菌株已生长到合适的细胞浓度并随后限制关键营养物(如氮、磷、或钾)之后，在野生型菌株的集合中或者特定菌株的突变体文库中筛选具有最高糖原含量的菌株而实施。最有利的是利用光暗循环以使得糖原合成到在光循环期间以干细胞重量计算可能的最大量的程度，然后在暗循环期间尽可能接近完全地代谢为乙醇。

[0199] 在暗循环期间，糖原被内源性酶转化为丙酮酸，但如在连续光照的情况下，这些酶可以在宿主细胞中被调节以次最佳速率进行整体转化。为了增加这一转化的速率，这种调节可以通过诱变和筛选在黑暗中快速糖原利用的菌株或通过以较高的表达水平向宿主提供必要的酶和/或提供编码比宿主中的酶较少受变构调节的支配的酶的外源基因而失效。因此，达到这种效果的优选的酶活性除了将糖原转化为甘油醛-3-磷酸的酶活性：糖原磷酸化酶(EC 2.4.1.1)、磷酸 葡萄糖变位酶(EC 5.4.2.2)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC5.3.1.9)、磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.11)、果糖-6-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)和丙糖磷酸异构酶(EC 5.3.1.1)外包括以上列出的用于甘油醛-3-磷酸转化成乙醇的酶。

[0200] 在再另一个实施方式中，弱化或功能删除至少一个细胞色素氧化酶的活性。细胞色素氧化酶起到在黑暗中将电子转移到氧气的作用。Howitt等使细胞色素氧化酶(CtaI，CtaII和Cyd)缺失，并能得到在黑暗中不呼吸但在光照中正常生长的菌株。(Quinol and Cytochrome Oxidases in the CyanobacteriumSynechocystis sp.PCC 6803，[Howitt et al.，Biochemistry(1998)37(51)：17944-51]。缺少一种氧化酶的菌株以接近野生型的速率呼吸，而那些同时缺少CtaI和Cyd的不呼吸。无法在黑暗中呼吸意味着更多的发酵产物，包括乙醇和可能还有琥珀酸以及1，4丁二醇。因此，本发明提供了工程化的碳固定生物体(例如，蓝细菌)，其中至少一种细胞色素氧化酶的活性被弱化，其提高了乙醇、琥珀酸和/或1，4丁二醇的产量。

[0201] 乙烯、丙烯、1-丁烯、1，3-丁二烯、丙烯酸等的产生

[0202] 在本发明的另一个方面中，用醇脱水酶(EC 4.2.1.n)产生乙烯，该酶将乙醇转化成乙烯。因此，通过在微生物中表达至少一种脱水酶活性产生乙烯。虽然自然界中存在许多种脱水酶，但是没有一个被证明通过脱水将乙醇转化为乙烯(或丙醇转化为丙烯，丙酸转化成丙烯酸等)。似乎没有不是这种情况的纯机械的理由。存在生物脱水酶的很多实例，如实施例55所示。生物脱水通常与激活的碳原子(即具有比氢更吸电子的取代基的碳原子)毗邻发生，这有助于降低脱水的活化能。

[0203] 此外，热力学似乎不是障碍。通过基团贡献法以及通过在NIST数据库中实验值的查询，乙醇→乙烯+水的反应据发现具有-0.5至-1.0kJ/mol之间的ΔG°，从而使其适度自发发生。水浓度会很高，但乙烯是气体并应自发地从反应物附近移除。反应(例如由EC 4.2.1.54催化的反应)可能特别重要，因为它从乳酰 -CoA(CH3-CHOH-CO-SCoA)产生丙烯酰-CoA(CH2＝CH-CO-SCoA)。用-H取代-CO-SCoA从乙醇(CH3-CH2OH)产生乙烯(CH2＝CH2)。这种酶可以作为定向变换的起点。编码4.2.1.x组中的酶的基因可以通过搜索数据库如GenBank确认，在任何所需的宿主(为简单起见，如大肠杆菌)中表达，而且该宿主可以测定乙醇脱水酶活性。高通量筛选特别用于筛选许多基因和通过诱变产生的基因变异体。然后，乙醇脱水酶基因在发展到适当的活性水平后可以在产乙醇的生物体中表达以产生乙烯。例如，共表达原始的或者进化的乙醇脱水酶基因到已经产生乙醇的生物体中，然后通过尾气的GC分析测试培养物的乙烯产量，该产量明显高于无添加的基因时的产量。可能希望从生产生物体中消除乙醇输出蛋白质，以防止乙醇被分泌到培养基中以及防止其转化为乙烯。

[0204] 优选地，发展了对全细胞的乙烯生产进行的定制的高通量筛选，即采用比色测试，例如Larue和Kurz，1973，Plant Physiol.51：1074-5所描述的。最初，通过数据库DNA序列检索确认的一组未诱变的基因通过在宿主(如大肠杆菌)中的表达测试其活性。这些能够从乙醇产生乙烯的基因是通过诱变进化的(即易错PCR、合成文库、化学诱变等)并进行高通量筛选。

[0205] 或者，表达了来自各种来源的编码乙烯形成酶活性(EfE)的基因，例如菜豆晕疫病菌(D13182)、豌豆细菌性枯萎病菌(AF101061)、青枯雷尔氏菌(AL646053)。优化的产量可能需要进一步的代谢工程(提高α-酮戊二酸(ketogluterate)产量，循环琥珀酸作为两个实例)。图3描述了利用EfE从GAP途径产生乙烯。

[0206] 生产宿主可能属于聚球藻属、Thermosynechococcus、集胞藻属或其它光合微生物，它也可能是常用的工业生物体，如本文公开的大肠杆菌、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)或酿酒酵母等。

[0207] 脂肪酸产生

[0208] 通常，可以修饰二氧化碳固定生物体以增加酰基-ACP或酰基-CoA的产生，减少脂肪酸衍生物及中间体的分解代谢，或降低在生 物合成途径中的特定点的反馈抑制。除了修饰本文所述的基因外，另外的细胞资源可以被转向过度产生脂肪酸，例如乳酸、琥珀酸和/或醋酸途径可以被弱化，且乙酰CoA羧化酶(ACC)可被过表达。对本文所述的生产宿主的修饰可以通过基因组改造、染色体外表达系统或其组合。

[0209] 脂肪酸生物合成途径

[0210] 在一个实施方式中，二氧化碳固定生物体，如蓝细菌，可被工程化以表达某些脂肪酸合成酶活性(FAS)，这是一组催化酰基链的启动和延伸的肽(Marrakchi等，Biochemical Society，30：1050 1055，2002)。该酰基载体蛋白质(ACP)和FAS途径中的酶控制产生的脂肪酸的长度、饱和度和分支，其可以被弱化或过表达。这类酶包括accABCD、FabD、FabH、FabG、FabA、FabZ、FabI、FabK、FabL、FabM、FabB和FabF。

[0211] 例如，脂肪酸合成途径工程化的二氧化碳固定生物体使用前体乙酰CoA和丙二酰CoA。被工程化以过表达这些中间体的宿主细胞可作为随后的基因工程步骤的起点，以提供特定的输出产物如脂肪酸酯、烃、脂肪醇。可对宿主细胞组合地或单独地进行几种不同的修饰以获得增加的乙酰CoA/丙二酰CoA/脂肪酸和脂肪酸衍生物产量。优选地，为了增加乙酰CoA的产量，表达pdh、panK、aceEF，(编码丙酮酸和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1p脱氢酶元件和E2p二氢硫辛酰胺转酰基酶元件)、fabH/fabD/fabG/acpP/fabF，以及在一些实例中表达编码脂肪酰CoA还原酶和乙醛脱羧酶的另外的核酸，其全部在组成性或者另外的可控制启动子的控制下。这些基因的典型的GenBank登录号是：pdh(BAB34380、AAC73227、AAC73226)、panK(也称为coaA，AAC76952)、aceEF(AAC73227、AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、acpP(AAC74178)、fabF(AAC74179)。

[0212] 被敲除或弱化的基因包括通过用包含相应基因的空的或缺失突变的条件复制型或非复制型质粒转化宿主，或通过取代启动子或 增强子序列的fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA和/或ackB。这些基因的典型GenBank登录号是：fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、ldhA(AAC74462)、pflb(AAC73989)、adhE(AAC74323)、pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)和ackB(BAB81430)。

[0213] 所产生的工程微生物可以在理想的环境中生长，例如含有有限的甘油(培养基中低于1％w/v)的环境。如此，这些微生物具有增加的乙酰CoA产生水平。可通过如上所述用编码accABCD(乙酰CoA羧化酶，例如登录号AAC73296、EC6.4.1.2)的核酸对微生物工程化以实现丙二酰CoA的过度产生。可以通过进一步包含编码脂肪酶(例如登录号CAA89087、CAA98876)的核酸实现脂肪酸过度产生。

[0214] 在某些情况下，过表达乙酰CoA羧化酶(ACC)以例如相对于天然表达水平至少2倍，如至少5倍，或至少10倍增加其细胞内浓度。

[0215] 此外，可以用plsB(例如登录号AAC77011)D311E突变来消除对酰基CoA池的限制。

[0216] 此外，可以在生产宿主中包括过表达sfa基因(Fab A的抑制物，例如登录号AAN79592)，以增加单不饱和脂肪酸的产量(Rock等，J.Bacteriology 178：5382-5387，1996)。

[0217] 硫酯酶的表达

[0218] 为了对宿主细胞工程化以产生同质群的脂肪酸衍生物，可弱化或功能缺失一个或多个内源基因和可表达一个或多个硫酯酶。例如，可以通过弱化硫酯酶C18(例如登录号AAC73596和P0ADA1)(其使用C18:1-ACP)产生C10脂肪酸和表达硫酯酶C10(例如登录号Q39513)(其使用C10-ACP)产生C10脂肪酸，因此产生碳链长度为10的相对同质群的脂肪酸。在另一个实例中，可以通过弱化产生非C14脂肪酸的内源性硫酯酶和表达登录号Q39473的硫酯酶(其使用C14-ACP)产生C14脂肪酸衍生物。在再另一个实例中，可以 通过表达使用C12-ACP的硫酯酶(例如登录号Q41635)和弱化产生非-C12脂肪酸的硫酯酶产生C12脂肪酸衍生物。可以使用本领域已知的方法验证乙酰CoA、丙二酰CoA和脂肪酸过度产生，例如通过在细胞裂解后使用放射性前体、HPLC和GC-MS。

[0219] 硫酯酶可如实施例6中所提供的在宿主细胞中表达，。由于上述示例的基因编码优选的氨基酸序列，可以选择或优化类似的基因。酰基CoA合成酶的表达

[0220] 在再另一个方面中，可以在通过表达或过表达酰基CoA合成酶肽(EC 2.3.1.86)工程化的宿主细胞中产生各种不同长度的脂肪酸，其中该酶催化脂肪酸转化为酰基CoA。某些非特异性的酰基CoA合成酶除了脂肪酸外还接受其它底物。

[0221] 脂肪醇形成肽

[0222] 在进一步的方面中，宿主细胞被工程化以将酰基-CoA转化成脂肪醇，该转化是通过表达或过表达脂肪醇形成酰基-CoA还原酶(FAR，EC 1.1.1.*)或酰基-CoA还原酶(实施例18)和醇脱氢酶(EC1.1.1.1)或以上的组合以从酰基-CoA产生脂肪醇。下面，脂肪醇形成酰基-CoA还原酶(FAR，EC 1.1.1.*)，酰基-CoA还原酶(EC1.2.1.50)和醇脱氢酶(EC1.1.1.1)统称为脂肪醇形成肽。某些脂肪醇形成肽是非特异性的且也催化其它反应，例如某些酰基-CoA还原酶肽接受除脂肪酸以外的其它底物。

[0223] 烃基表面活性剂

[0224] 为了产生表面活性剂，宿主细胞(例如，显示出天生的合成高水平的脂质和油形式的表面活性剂前体的能力的宿主细胞)经修饰以包含编码能够将脂肪酸转化为脂肪醛的蛋白质的第一外源核酸序列和编码能够将脂肪醛转化为醇的蛋白质的第二外源核酸序列(参见各种实施例)。在一些实例中，第一外源核酸序列编码脂肪酸还原酶。在其它实例中，第二外源核酸序列编码哺乳动物微粒体醛还原酶或长链醛脱氢酶。在再另一个实例中，第一和第二外源核酸序列来自节细菌(Arthrobacter)AK19、粘红酵母(Rhodotorula glutinins)、 不动杆菌(Acinobacler sp.)M-1株或解脂假丝酵母(Candida lipolytica)的多酶复合体。在一个实施方式中，第一个和第二异源DNA序列来自不动杆菌M-1株或解脂假丝酵母的多酶复合体。

[0225] 可用于生产表面活性剂的编码脂肪酸至长链醇转化蛋白质的其它来源的异源核酸序列包括但不限于，高山被孢霉菌(Mortierella alpina)(ATCC 32222)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)(也称为Apiotricum curvatum)、Alcanivorax jadensis(T9T＝DSM 12718＝ATCC 700854)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)HO 1-N(ATCC 14987)和不透明红球菌(Rhodococcus opacus)(PD630 DSMZ 44193)。

[0226] 在一个实例中，脂肪酸衍生物是饱和或不饱和的表面活性剂产物，其具有的碳原子的含量被限制在6至36个碳原子之间。在另一个实例中，表面活性剂产物具有的碳原子含量被限制在24至32个碳原子之间。

[0227] 不同长度的脂肪酸酯

[0228] 在另一个方面中，工程宿主细胞产生各种不同长度的脂肪酸酯。例如，表达或过表达醇-O-乙酰转移酶肽(EC 2.3.1.84)。这些肽催化乙酰CoA和醇的反应以形成CoA和乙酸酯。在一些实施方式中，该醇-O-乙酰转移酶肽与选择的硫酯酶肽、FAS肽和脂肪醇形成肽共表达，从而使碳链的长度、饱和度和分支程度受到控制。在其它的实施方式中，可以共表达bkd操纵子以使其能够产生分枝脂肪酸前体。

[0229] 醇-O-乙酰转移酶肽催化其它反应，以使得该肽接受除脂肪醇或乙酰CoA硫酯以外的其它底物，例如，其它醇和其它酰基CoA硫酯。这些酶的修饰和用于鉴定特定的醇-O-乙酰转移酶肽活性的分析方法的开发在熟练技术人员的范围内。可以建立具有用于供体酰基基团或受体醇部分的新活性和特征的工程O-乙酰转移酶和O-酰基转移酶。 [0230] 醇乙酰转移酶(AATs，EC 2.3.1.84)(其负责在各种植物中产生乙酸酰基酯)可被用于产生中等链长的蜡，例如辛酸辛酯、辛 酸癸酯、癸酸癸酯等。由中等链的醇(如C6，C8)和中等链的酰基-CoA(或脂肪酸，如C6或C8)合成的脂肪酸酯具有相对低的熔点。例如，己酸己酯具有-55℃的熔点，且辛酸辛酯熔点为-18至-17℃。这些化合物的低熔点使其成为用做生物燃料的良好候选。

[0231] 在一个实施方式中，SAAT基因在生产宿主ΔfadE中与源自大肠杆菌的fadD和acrl(源自A.baylyi ADP1的醇还原酶)共表达。在发酵培养基中提供辛酸。这导致产生辛酸辛酯。类似地，当在生产宿主中表达源自A.baylyi ADP1的蜡合成酶基因而不是SAAT基因时，产生辛酸辛酯。具有低熔点的中等链蜡，如辛酸辛酯和癸酸辛酯，是取代甘油三酯基生物柴油的生物燃料的良好候选。

[0232] 可以根据公开的基因序列(登录号AF 193789)和修饰以消除Ncdl位点，利用DNA2.0(Menlo Park，CA)合成重组SAAT基因。该合成的SAAT基因克隆到载体中，并共转化到宿主中，该宿主携带源自大肠杆菌的afadD基因和源自A.baylyi ADP1的acrl基因。该转化体在LB培养基中生长。在用抗生素诱导和加入0.02％的辛酸后，培养在25℃持续40小时。在此之后，将3毫升乙酸乙酰酯添加到整个培养物中并混合几次。通过GC/MS分析乙酸乙酰酯相。

[0233] 脂肪酸酯(生物柴油和蜡)

[0234] 宿主细胞经工程化以由酰基CoA和醇产生脂肪酸酯(生物柴油和蜡)。在一些实例中，在发酵培养基中提供醇，和在其它实例中，宿主细胞可以如本文所述提供醇。在结构上，脂肪酸酯有A侧和B侧，该酯的A侧用来描述由醇形成的碳链，以及该酯的B侧用来描述由酰基CoA形成的碳链。任一链可以是饱和的或不饱和的，分支的或不分支的。在一些实施方式中，工程宿主细胞产生脂肪醇或短链醇。在替代的实施方式中，宿主细胞经工程化以产生特定的酰基CoA分子。如本文使用的，脂肪酸酯是从脂肪酰基硫酯和醇得到的酯，其中该酯的A侧和B侧可以独立地发生长度变化。通常，酯的A侧至少是1、2、3、4、5、6、7或8个碳长度，而酯的B侧是8、10，12、14、16、18、20、22、24或26个碳长度。该A侧和 B侧可以是直链或支链的、饱和或不饱和的。

[0235] 增加一个或多个蜡合成酶(EC2.3.1.75)的表达导致脂肪酸酯的产生，包括由酰基CoA和醇产生蜡(实施例17)。如本文所使用的，蜡是长链脂肪酸酯，其中该酯的A侧和B侧可以独立地发生长度变化。通常，该酯的A侧至少是8、10、12、14、16、18、20、22、24或26个碳长度。类似地，该酯的B侧是至少8、10、12、14、16、18、20、22、24或26个碳长度。该A侧和B侧可以是单-、二-、三-不饱和的。蜡合成酶肽能够催化酰基硫酯转化为脂肪酸酯，且某些蜡合酶肽将催化其它反应，例如，接受短链酰基CoA和短链醇以产生脂肪酸酯。美国专利号7,118,896中提供了鉴定蜡合成酶活性的方法，其通过引用引入本文。

[0236] 在其它方面中，微生物经修饰以通过表达编码蜡酯合成酶的核酸产生脂肪酸酯基的生物燃料，以至其表达赋予所述微生物合成饱和、非饱和或分支脂肪酸酯的能力。在一些实施方式中，该蜡酯合成蛋白质包括但不限于：脂肪酸延长酶、酰基CoA还原酶、酰基转移酶或蜡合成酶、脂肪酰基转移酶、二酰基甘油酰基转移酶、酰基CoA蜡醇酰基转移酶、双功能蜡酯合成酶/酰基CoA:二酰基甘油酰基转移酶，选自于源自加州希蒙得木(Simmondsia chinensis)、不动杆菌ADP1菌株(以前的醋酸钙不动杆菌)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、Fundibacter jadensis、拟南芥或真养产碱杆菌(Alkaligenes eutrophus)的多酶复合体。在一个实施方式中，该脂肪酸延长酶、酰基CoA还原酶或蜡合酶是源自真养产碱杆菌和文献中已知的产生蜡和脂肪酸酯的其它生物体的多酶复合体。编码用于产生脂肪酸酯的蜡合成蛋白质的另外的核酸包括但不限于，高山被孢霉菌(例如ATCC 32222)、弯曲隐球菌(也称为Apiotricum curvatum)、Alcanivorax jadensis(例如T9T＝DSM 12718＝ATCC700854)、不动杆菌HO 1-N种(例如ATCC 14987)和不透明红球菌(例如PD630DSMZ44193)。

[0237] 产生了各种长度的脂肪酸酯，例如，该脂肪酸酯产物是饱和的 或不饱和的，具有在24至46个碳原子之间；24至32个碳原子之间；或14至20个碳原子之间的碳原子含量的脂肪酸酯产物。在另一个实施方式中，该脂肪酸酯是C18:1的甲基酯；C16:1的乙基酯；C16:1的甲基酯；或辛醇的十八烷基酯。

[0238] 在另一个实施方式中，使用源自不动杆菌ADP1位于基因座AAO17391的蜡酯合成酶(描述于Kalscheuer和Steinbuchel，J.Biol.Chem.278：8075-8082，2003，通过引用引入本文)。在另一个实例中，使用源自加州希蒙得木位于基因座AAD38041的蜡酯合成酶。 [0239] 任选地，使用蜡酯输出蛋白(例如FATP家族的成员)促进蜡或酯释放到细胞外环境中。可使用的蜡酯输出蛋白的一个实例是脂肪酸(长链)转运蛋白质CG7400-PA，源自于果蝇(D.melanogaster)位于基因座NP_524723的异形体A。

[0240] 如本文所述，B侧是由在宿主生物体中从头合成产生的脂肪酸形成的。在其中宿主被另外工程化以形成醇(包括脂肪醇)的某些情况中，A侧也是由宿主生物体产生。在再其它的实例中，A侧可以在培养基中提供。如本文所述，通过选择所需的硫酯酶基因，B侧和(当形成脂肪醇时)A侧可以被设计成具有某些碳链特征。这些特征包括不饱和点、分支和需要的碳链长度。提供了典型的形成长链脂肪酸酯的方法，其中A和B侧是由生产宿主产生的。当A和B侧都是由生产宿主形成且他们利用脂肪酸生物合成途径的中间体产生时，他们将有类似的碳链特征。例如，至少50％、60％、70％或80％的产生的脂肪酸酯具有6、4或2个碳原子长度不同的A侧和B侧。该A侧和B侧也将显示类似的分支和饱和度水平。 [0241] 在一个实施方式中，蜡酯是通过对聚球藻PCC 7002种工程化以表达脂肪醇形成酰基CoA还原酶、硫酯酶和蜡合成酶而产生。因此，生产宿主产生酯的A和B侧，且两侧的结构受硫酯酶基因A.baylyi ADP1(被称为WSadpl，登录号AA017391，EC：2.3.175)的表达所影响。在补充有抗生素(如卡那霉素、羧苄青霉素或奇霉素)的LB平板中转化和筛选宿主。转化体被接种到LB培养基中并在合 适的温度下在摇床中培养。当培养物达到优选的OD时，一等分试样被转移到烧瓶中。然后将培养物放入锥形管中，且细胞旋转沉降。然后细胞沉淀与乙酸乙酯混合。用GC/MS分析乙酸乙酯提取物。

[0242] 除了产生用于形成A侧的脂肪醇外，宿主还可以产生使用该领域熟知的技术整合到A侧的其它短链醇，如乙醇、丙醇、异丙醇、异丁醇和丁醇。例如，可通过宿主生物体形成丁醇。为建立丁醇产生细胞，可以将宿主细胞进一步工程化以表达在表达载体中的来自大肠杆菌K12的atoB(乙酰CoA乙酰转移酶)、来自溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)的β-羟丁酰-CoA脱氢酶、来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的巴豆酸酶、来自拜氏梭菌的丁酰CoA脱氢酶、来自黄枝孢菌(Cladosporium fulvum)的CoA酰化醛脱氢酶(ALDH)以及编码丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的乙醛-醇脱氢酶的adhE。类似地，可以用Kalscheuer等，Microbiology 152：2529 2536，2006教导的方法在生产宿主中产生乙醇，其通过引用引入本文。

[0243] 各种脂肪酸酯的十六烷值(CN)、粘度、熔点和燃烧热已经在例如Knothe，Fuel Processing Technology 86：1059 1070，2005中鉴定，其通过引用引入本文中。使用本文所提供的教导，可以将宿主细胞工程化以产生在Knothe，Fuel Processing Technology 86：1059 1070，2005中描述的任何一种脂肪酸酯。

[0244] 酰基-ACP，酰基CoA至烃

[0245] 已知各种微生物产生烃，如链烷烃、烯烃和类异戊二烯。这些烃中许多是源于脂肪酸生物合成。可以通过控制某些微生物的天然宿主中与脂肪酸生物合成相关的基因控制这些烃的产生。例如，在藻类布朗葡萄藻中的烃生物合成通过脂肪醛脱羰作用发生。脂肪醛是通过脂肪酰基CoA还原酶还原脂肪酰硫酯产生。因此，可以通过将布朗葡萄藻工程化以表达特定的基因(如硫酯酶)控制最后的链烷烃的结构，其中该基因控制被引导到链烷烃生物合成中的脂肪酸的链长度。表达导致布朗葡萄藻中的支链脂肪酸生物合成的酶将导 致产生支链烷烃。引入影响脂肪酸去饱和产生的基因将导致烯烃产生。这些基因的进一步组合可以对产生的烃的最终结构提供进一步的控制。为了产生较高水平的天然的或工程化的烃，可以表达、过度表达或弱化参与脂肪酸及其前体的生物合成或者降解为其它产品的基因。这些途径中可以各应用于在工程微生物(如弗尼斯弧菌M1(Vibrio furnissi)和其功能同源体)中产生链烷烃，其通过还原脂肪醇产生链烷烃。这些途径可以各应用于产生烯烃，其中该烯烃由藤黄微球菌(Micrococcus leuteus)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、Jeogalicoccus sp.(ATCC8456)中的许多菌株产生。这些微生物产生由脂肪酸前体的头-头缩合产生的长链内烯烃。使用本文所述的方法控制脂肪酸前体的结构和水平会导致形成具有不同链长、分支和饱和度水平的烯烃。 [0246] 实施例9、10、11和19提供了对微生物工程化以产生烃(如链烷烃和辛烷)的几种替代方式。

[0247] 也可以使用进化的氧化/还原酶还原伯醇产生烃。已知伯脂肪醇被用于在微生物(如弗尼斯弧菌M1)中产生链烷烃(Myong Ok，J.Bacterial.，187：14261429，2005)。NAD(P)H依赖性氧化/还原酶是负责的催化剂。合成的NAD(P)H依赖性氧化还原酶可以通过使用进化工程产生并在产生宿主中表达以产生脂肪酸衍生物。该领域的普通技术人员可以理解，将脂肪醇还原酶“进化”成具有理想的活性的过程是公知的(Kolkman和Stemmer Nat Biotechnol 19：423-8，2001，Ness 等，Adv Protein Chem.55：26192，2000，Minshull 和Stemmer Curr Opin Chem Biol.3：284-90，1999，Huisman和Gray Curr Opin Biotechnol Aug；13：352-8，2002，以及参见美国专利公开号2006/0195947)。NAD(P)H依赖性氧化还原酶文库是通过标准方法产生，如易错PCR、位点特异性随机诱变、位点特异性饱和诱变或定点特异性诱变。此外，文库可以通过“改组”自然存在的NAD(P)H依赖性氧化还原酶的编码序列建立。该文库在合适的宿主(如大肠杆菌)中被表达。然后分析表达氧化/还原酶文库中不同成员的单个 克隆的可以催化脂肪醇还原的氧化/还原酶的表达。例如，各细胞可作为全细胞生物转化、细胞提取物、通透化细胞或纯化的酶被检测。脂肪醇还原酶通过用分光光度法或荧光分光光度法监测NAD(P)H的脂肪醇依赖性氧化来鉴定。通过GC/MS、TLC或其它方法监测链烷烃产生。将以这种方式鉴定的氧化/还原酶用于产生链烷烃、烯烃及相关支链烃。这在体外或体内实现。后者是通过在如本文所述的产生脂肪醇的生物体中表达进化的脂肪醇还原酶基因实现的。该脂肪醇作为能产生链烷烃的醇还原酶的底物。其它氧化还原酶也可以被工程化以催化这一反应，如那些使用氢分子、谷胱甘肽，FADH或其它还原性辅酶的反应。

[0248] 增加脂肪酸产量

[0249] 可以使用该领域已知的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、接合和转导，将参与产生烃的生物合成途径的异源核酸序列稳定地或瞬时地引入各种宿主细胞中。为了稳定的转化，DNA序列可以进一步包含选择标记(如抗生素抗性，例如抗新霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素的抗性)和补充营养缺陷型缺陷的基因。 [0250] 用于原核宿主细胞中的合适表达控制序列包括但不限于，能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子、噬菌体λ的PR和PL启动子、大肠杆菌的trp、recA、热休克和lacZ启动子、枯草芽胞杆菌的α-淀粉酶和ω特异启动子、芽胞杆菌噬菌体的启动子、链霉菌启动子、噬菌体λ的int启动子、pBR322的β-内酰胺酶基因的bla启动子以及氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。Glick，J.Ind.Microbiol.1：277，1987；Watson等，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENES 4th Ed.，Benjamin Cummins(1987)；和Sambrook等(同上)综述了原核启动子。

[0251] 在真核宿主中使用的合适的真核启动子的非限制实例是病毒起源的，且包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等，J.Mol.Appl.Gen.1：273，1982)；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355， 1982)；SV40早期启动子(Benoist等，Nature(London)290：304，1981)；劳氏肉瘤病毒启动子；巨细胞病毒启动子(Foecking等，Gene 45：101，1980)；
酵母gal4基因启动子(Johnston等，PNAS(USA)79：6971，1982；Silver等，PNAS(USA)81：
5951，1984)；以及IgG的启动子(Orlandi等，PNAS(USA)86：3833，1989)。

[0252] 在某些实例中，遗传修饰的宿主细胞用可操作地与组成型启动子连接的编码生物合成途径基因产物的异源DNA序列基因进行遗传修饰。合适的组成型启动子是该领域内已知的，并包括组成型腺病毒主要晚期启动子、组成型MPSV启动子和组成型CMV启动子。适用于聚球藻PCC 7002种的适当组成型启动子包括例如，PtacI、P-EM7、Paph2和PaadA。 [0253] 微生物宿主细胞可以用编码生物合成途径基因产物的异源核酸序列遗传修饰，其中该序列与诱导型启动子可操作地连接。诱导型启动子是本领域熟知的。合适的诱导型启动子包括但不限于受蛋白质、代谢物或化学物质影响的启动子。这些包括：牛白血病病毒启动子、金属硫蛋白启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、四环素诱导型CMV启动子(例如人类立即早期CMV启动子)，以及来自trp和lac操纵子的启动子。

[0254] 当用编码两个或多个参与生物合成途径中的蛋白质的异源核酸序列遗传修饰宿主细胞以产生碳基目的产物时，该核酸序列可以由单一载体上的单一启动子驱动或者由独立表达载体上的至少一个启动子驱动。

[0255] 在一些实施方式中，可以提高生物合成途径中间体的细胞内浓度(例如，遗传修饰的宿主细胞中的中间体浓度)以进一步增加最终产物的产量。例如，通过增加在生物合成途径中起作用的酶的底物(例如，初级底物)的细胞内量，等等。

[0256] 在一些实例中，脂肪酸或中间体是在细胞的细胞质中产生的。可通过多种方式提高细胞质浓度，包括但不限于，脂肪酸与CoA结合以形成酰基CoA硫酯。此外，可以通过增加CoA在细胞中的生物 合成而增加酰基CoA的浓度，例如通过过表达与泛酸盐生物合成有关的基因(panD)或敲除与谷胱甘肽生物合成相关的基因(谷胱甘肽合成酶)。

[0257] 碳链修饰

[0258] 图1提供了对可被调节以改变脂肪酸衍生产物的结构的各种基因和可被单独或结合使用以产生各种脂肪酸和烃的编码的酶的描述。该产物可以被产生为包含分支点、饱和度水平和碳链的长度，从而使这些产物成为用于许多用途的需要的起始原料。还提供了微生物所产生的各种碳基目的产物。

[0259] 图1还列出了直接地参与碳基产物(包括蜡、脂肪酸酯和/或脂肪醇)的合成的酶。为了提高蜡/脂肪酸酯和脂肪醇的产量，可以过表达或者突变一个或多个的酶以减少反馈抑制。此外，可以使代谢中间体以产生非脂肪酸基产物(副作用)的酶功能缺失或弱化，从而提高通过脂肪酸生物合成途径的碳流量。本文提供的实施例描述了如何对宿主生物体的相应途径中的酶工程化，以产生生成碳基目的产物的工程生物体。

[0260] 在其它实例中，源自不同的物种的外源FAS基因或工程变异体的表达可被引入宿主细胞，从而导致生物合成与天然宿主中的脂肪酸代谢产物在结构上不同(长度、分支、不饱和水平等)的脂肪酸代谢产物。这些异质基因产物也可以被选择或工程化以使他们不受宿主细胞中的天然复杂调节机制的影响，并因此以对于想要的商业化产物更可控的方式发挥功能。例如，可以生产宿主中表达源自枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、链霉菌属、雷尔氏菌、红球菌、棒状杆菌(Corynebacteria)、短杆菌、分枝杆菌、含油酵母等的FAS酶。

[0261] 熟练的技术人员可以理解，当生产宿主经工程化以从脂肪酸生物合成途径产生包含特定水平的不饱和度、分支、或碳链的长度的脂肪酸时，产生的工程脂肪酸可用于产生脂肪酸衍生物。因此，由生产宿主产生的脂肪酸衍生物可以显示出该工程脂肪酸的特性。例如，可以对生产宿主工程化以产生分支的短链脂肪酸。然后，使用 本文提供的涉及脂肪醇产生的教导(即包括醇形成酶如FAR)，生产宿主产生分支的短链脂肪醇。类似地，可以通过对生产宿主工程化以产生具有确定水平的分支、不饱和度和/或碳链长度的脂肪酸，生产烃，因此产生均质的烃群。此外，当需要不饱和醇、脂肪酸酯或烃时，可以对脂肪酸生物合成途径工程化以产生低水平的饱和脂肪酸且可以表达另外的去饱和酶以减少饱和产物的产量。

[0262] 饱和度

[0263] 一个方面，通过过表达fabB或通过在低温下生长宿主(例如低于37℃)，对宿主3
工程化以产生不饱和脂肪酸。FabB偏好顺-δ-癸烯酰-ACP和在大肠杆菌中产生不饱和脂肪酸。过表达FabB导致产生大量的不饱和脂肪酸(de Mendoza等，J.Biol.Chem.，
258：2098101，1983)。然后这些不饱和脂肪酸可以在被工程化以产生脂肪酸的宿主中用作中间体，如脂肪醇、酯类、蜡、烯烃、链烷烃等。本领域的普通技能人员将理解，通过弱化fabA或过表达fabB并表达特定的硫酯酶(如下所述)，可以产生具有所需的碳链长度的不饱和脂肪酸衍生物。或者，可以删除脂肪酸生物合成的阻抑剂，FabR(Genbank登录号NP_418398)，这也将导致在大肠杆菌中不饱和脂肪酸的产量增加(Zhang等，J.Biol.Chem.277：pp.15558，2002.)。不饱和脂肪酸的进一步增加通过过表达FabM(反-2，顺-3-癸烯酰-ACP异构酶，GenBank登录号DAA05501)并控制源自肺炎链球菌(Marrakchi等，J.Biol.Chem.277：44809，2002)的FabK(反-2-烯酰基-ACP还原酶II，GenBank登录号NP_357969)的表达同时删除大肠杆菌Fab I(反-2-烯酰基-ACP还原酶，GenBank登录号NP_415804)实现。此外，为了提高不饱和脂肪酸酯的百分比，微生物也可以过表达fabB(编码β-酮脂酰-ACP合成酶I，登录号：BAA16180，EC：2.3.1.41)、Sfa(编码fabA抑制剂，登录号：AAC44390)和过表达gnsA和gnsB(都编码secG无效突变体抑制剂，又名冷休克蛋白，登录号：ABD 18647.1，AAC74076.1)。在一些实例中，可以弱化内源性fabF基因，因此增加产生的棕榈油酸酸酯(C 16:1)的百分比。

[0264] 可以使用本文所提供的教导(实施例11)产生包含分支点、环状部分及其组合的脂肪酸。

[0265] 通过插入和表达一个或多个外源核酸序列，可以对天然地产生直链脂肪酸(sFAs)的微生物进行工程化以能够固定二氧化碳和产生支链脂肪酸(brFAs)。例如，如大肠杆菌的宿主天然地产生直链脂肪酸(sFAs)。该宿主也可以被工程化以捕获光，如例如2008年9月10日提交的PCT/US2008/075899或2008年11月10日提交的PCT/US2008/083056中所述，且可以引入和表达提供分支前体(bkd操纵子)并允许脂肪酸从分支前体开始生物合成(fabH)的几个基因。此外，生物体可以表达用于brFAs延长的基因(如ACP，FabF)。此外或者可选择地，可以删除正常产生sFAs和与被引入的基因(如FabH，FabF)竞争的相应的大肠杆菌基因。

[0266] 支链的酰基-CoA(2-甲基-丁酰-CoA、异戊酰-CoA和异丁酰-CoA)是brFA的前体。在大多数的含brFA的微生物中，它们由支链氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)分两个步骤(下面详细叙述)合成[Kadena，Microbiol.Rev.55：pp.288，(1991)]。微生物可以工程化以重组地表达或过表达这两个步骤中的一个或更多的酶来产生或过度产生brFAs。在某些情况下，生产宿主可能具有可以完成一个步骤的内源性酶，在这种情况中仅需要重组表达参与第二步骤的酶。

[0267] 形成支链脂肪酸的第一步骤是通过支链氨基酸转氨酶产生相应的α-酮酸。大肠杆菌有这种酶，IlvE(EC2.6.1.42；GenBank登录号YP_026247)。在一些实例中，可能不表达异源的支链氨基酸转氨酶。然而，如果宿主的氨基转移酶反应被证明是限速的，可在宿主微生物中过表达大肠杆菌IlvE或任何其它支链氨基酸转氨酶，例如，源自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的IlvE(GenBank登录号AAF34406)、源自恶臭假单胞菌的ilvE(GenBank登录号NP_745648)或源自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的ilvE(GenBank登录号NP_629657)。

[0268] 第二步骤，将α-酮酸氧化脱羧为相应的支链酰基-CoA是由支 链α-酮酸脱氢酶复合体(bkd；EC1.2.4.4)[Denoya等J.Bacteriol 177：pp.3504，(1995)]催化的，其由Elα/β(脱羧酶)、E2(二氢硫辛酸转酰基酶(dihydrolipoyl transacetylase))和E3(二氢硫辛酸脱氢酶)亚基组成。这些亚基类似于丙酮酸和α-酮戊二酸脱氢酶复合体。图1列出了源自几种微生物的可以在生产宿主中表达以提供支链酰基-CoA前体的潜在bkd基因。基本上，每个具有brFAs的和/或以支链氨基酸生长的微生物可以用作分离在生产宿主如大肠杆菌中表达的bkd基因的来源。此外，大肠杆菌天然地具有E3元件(作为其丙酮酸脱氢酶复合体的部分；lpd，EC 1.8.1.4，GenBank登录号NP_414658)。因此，在大肠杆菌中，只需要表达E1a/β和E2bkd基因。

[0269] 在另一个实例中，可以通过共表达巴豆酰-CoA还原酶(Ccr，EC 1.1.1.9)和异丁酰-CoA变位酶(大亚基IcmA，EC 5.4.99.2；小亚基IcmB，EC5.4.99.13)在生产宿主例如在大肠杆菌中产生异丁酰CoA(Han和Reynolds J.Bacteriol 179：pp.5157，1997)。巴豆酰CoA是在大肠杆菌和其它微生物中的脂肪酸生物合成的中间体。

[0270] 除了表达bkd基因外，brFA生物合成的开始利用β-酮脂酰-酰基-载体蛋白合成酶Ⅲ(FabH，EC2.3.1.41)，其具有对支链酰基CoA的特异性(Li等，J.Bacterial.187：pp.3795，2005)。可以在生产宿主中表达参与任何含brFA的微生物的脂肪酸生物合成的FabH基因。来自不天然地产生brFA的生产宿主的Bkd和FabH酶可能不支持brFA产生。因此，可以在这些宿主中重组表达Bkd和FabH。类似地，如果Bkd和FabH产生的内源性水平不足以产生brFA，这些基因可被过表达。此外，可以表达脂肪酸合成机制的其它成分，包括酰基载体蛋白(ACP)和基因，如β-酮脂酰-酰基-载体蛋白合成酶II(fabF，EC2.3.1.41)。
除了表达这些基因外，在内源性脂肪酸生物合成途径中的一些基因可以在生产宿主中被弱化。例如，在大肠杆菌中干扰brFA生物合成的最可能的候选者是fabH(GenBank登录号NP_415609)和/或fabF基因(GenBank登录号NP_415613)。

[0271] 如上所述，通过组合表达支持brFA合成和醇合成的基因，可以产生支链醇。例如，当醇还原酶如源自Acinetobacter baylyi ADP1的Acrl与bkd操纵子共表达时，大肠杆菌可以合成异戊醇、异丁醇或2-甲基丁醇。类似地，当Acrl与ccr/icm基因共表达时，大肠杆菌可以合成异丁醇。

[0272] 为了将生产宿主(如大肠杆菌)转化成能够合成ω环状脂肪酸(cyFAs)的生物体，需要引入和表达提供环形前体环己基甲酰-CoA的几个基因(Cropp等Nature Biotech.18：pp.980，2000)。然后可以表达基因(fabH、ACP和fabF)以使得ω-环状脂肪酸起始和延长(实施例13)。或者，可以从产生cyFAs的微生物分离同源基因并在大肠杆菌中表达。

[0273] 以下基因的表达足以在大肠杆菌中提供环己基甲酰-CoA：源自Streptomyces collinus的安莎三烯(ansatrienin)基因簇的ansJ、ansK、ansL、chcA和ansM[Chen等，Eur.J.Biochem.261(1999)]或源自链霉菌HK803种的磷内酯霉素(phoslactomycin)B基因簇的plmJ、plmK、plmL、chcA和plmJ、plmK、plm、chcA和plmM[Palaniappan等，J.Biol.Chem.278：35552(2003)]，与源自S.collinus、阿维链霉菌(S.avermitilis)或天蓝色链霉菌的chcB基因一起表达[Patton等，Biochem.，39：7595(2000)]。

[0274] 基因(fabH、ACP和fabF)足以允许ω-环状脂肪酸起始和延长，因为它们具有广泛的底物特异性。在任何这些基因与ansJKLM/chcAB或pmlJKLM/chcAB基因共表达不产生cyFAs的情况下，可以分离(例如，通过使用简并PCR引物或异源DNA探针)和共表达源自产生cyFAs的微生物的fabH、ACP和/或fabF同源基因。

[0275] 糖的产生

[0276] 由生物有机体工业化产生化学产物通常通过糖(如葡萄糖)的厌氧发酵而实现。值得注意的是，光合生物体通常在光合作用过程中产生聚合物如由葡萄糖单体构成的糖原和纤维素。为在光合作用 过程中产生发酵产物具有挑战性，因为其通常需要细胞将流量同时引向糖异生和糖酵解。另一方面，使用日/夜循环使碳累积然后在夜间发酵储存的碳受到细胞的最大碳存储能力的限制。

[0277] 有至少两个主要途径将糖输出至培养基中。在一个实施方式中，输出糖和糖磷酸酯，如葡萄糖或磷酸果糖或磷酸丙糖。磷酸丙糖包括3-磷酸甘油醛(3PGAL)和磷酸二羟丙酮(DHAP)。在这种情况下，需要特定的转运蛋白，其通常作为无机磷酸盐的反向转运体。 [0278] 在另一个实施方式中，为了输出可观量的非磷酸化糖，如葡萄糖，将细胞工程化以使细胞中的磷酸葡萄糖去磷酸化(例如磷酸酶)。通过转运蛋白的扩散使葡萄糖排出细胞。 [0279] 优先地，为了防止其它存储聚合物的累积，在细胞中表达弱化了其形成其它存储聚合物(如糖原、淀粉、蔗糖、纤维素和藻青素的能力的这些蛋白质。

[0280] 在本发明的一个方面中，为了将3PGAL直接运送出细胞，表达了编码有助于将光合产物从宿主细胞内运输到培养基中的酶的基因。例如，为了伴随输入无机磷酸盐将磷酸丙糖运送出细胞外，表达了下面的蛋白质：目的宿主细胞(如蓝细菌)中的拟南芥磷酸丙糖转运蛋白APE2(AT5G46110.4)。

[0281] 在另一个方面中，利用反向转运体或转运蛋白将葡萄糖-6-磷酸或果糖-6-磷酸运输至细胞外。例如，为了伴随无机磷酸盐的输入将葡萄糖-6-磷酸输出到细胞外，在光合生物体中表达一个或多个下列蛋白质：(1)大肠杆菌糖磷酸转运蛋白UhpT(NP_418122.1)、(2)拟南芥葡萄糖-6-磷酸转运蛋白GPT1(AT5G54800.1)或(3)拟南芥葡萄糖-6-磷酸转运蛋白GPT2(AT1G61800.1)。

[0282] 在其它的实施方式中，为有助于D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖-6-磷酸，在细胞中引入果糖-6-磷酸异构酶。例如，向细胞中引入葡萄糖-6-磷酸酶(例如GenBank登录号AAA16222、AAD19898、O43826)以将D-葡萄糖6-磷酸和水转化为D-葡萄糖和磷酸。 [0283] 此外，向宿主细胞中引入磷酸酶的酶活性以在光合生物体中将葡萄糖-6-磷酸和/或葡萄糖-1-磷酸脱磷酸。在一个实施方式中，表达了一个或多个下列蛋白质：(1)人(H.sapiens)葡萄糖-6-磷酸酶G6PC(P35575)、(2)大肠杆菌葡萄糖-1-磷酸酶Agp(P19926)、(3)阴沟肠杆菌(E.cloacae)葡萄糖-1-磷酸酶AgpE(Q6EV19)和(4)大肠杆菌酸性磷酸酶YihX(P0A8Y3)。

[0284] 为了促进通过上述磷酸酶的作用细胞内产生的葡萄糖的扩散外排，表达了一个或多个下列通透酶：(1)人葡萄糖转运蛋白GLUT-1、-3或-7(P11166、P11169、Q6PXP3)、(2)酿酒酵母己糖转运蛋白HXT-1、-4或-6(P32465、P32467、P39003)或(3)运动发酵单胞菌葡萄糖单向转运体Glf(P21906)。在某些实施方式中，表达了如下转运蛋白：2.A.1.1.32葡萄糖/果糖:H+同向转运体，GlcP[Zhang等(1989)]集胞藻的细菌GlcP(P15729)；2.A.1.1.35，主要葡萄糖(或2-脱氧葡萄糖)吸收转运蛋白，GlcP[van Wezel等，(2005)]；和/或Q7BEC，2.A.1.1.24己糖(葡萄糖和果糖)转运蛋白，恶性疟原虫O97467的PfHT1。在其它的实施方式中，在细胞中引入葡萄糖转运蛋白，如Glut-1转运蛋白(例如GenBank登录号S77924)，以促进葡萄糖从细胞内主动分泌到培养基中。扩散机制可能涉及原始细菌转运蛋白(如通常让葡萄糖进入的原始葡萄糖转运蛋白)和/或哺乳动物转运蛋白(如用于葡萄糖扩散外排的Glut-1、Glut-2)。因此，作为光合作用的结果而产生的葡萄糖是从细胞内扩散到培养基中。

[0285] 与上述蛋白质对应的基因以合成方法产生并置于组成型和/或诱导型启动子下游以在光合生物中表达。然后该构建体可以被用来通过连接到阳性选择标记(如抗生素抗性基因)转化生物体。在某些实施方式中，上述基因被整合到宿主细胞(例如，蓝细菌)的染色体中。优选的整合位点包括涉及纤维素、糖原或蔗糖合成的基因组。

[0286] 纤维素、糖原或蔗糖合成的改变

[0287] 在本发明的另一个方面中，细胞经修饰以弱化、破坏或删除纤维素、糖原、蔗糖合成或其组合，如表1所示。

[0288] 表1

[0289]

[0290] CO2的光养固定后是碳化合物快速流动到生物质的产生和维持，以及流动到糖原、纤维素和/或蔗糖形式的可获取碳的储存。在氮充足的培养基条件下，糖原储存可以相当于细胞质量的30％。在氮缺乏的条件下，细胞将更多的碳分配给多达细胞质量60％的糖原产生储存。氮限制可作为糖原碳流的生物控制。

[0291] 糖原是由直链α-1，4-键和支链α-1，6-键构成的葡萄糖聚合物。该聚合体在聚合度(DP)大于约60,000的程度下是不溶的，并形成细胞内颗粒。通过开始于葡萄糖1-磷酸的途径体内合成糖原。可以通过磷酸化至磷酸葡萄糖；通过聚合物内部裂解为麦芽糊精；通过 连续地外切成麦芽糖；或通过将聚合物和麦芽糊精协同水解为麦芽糖和葡萄糖进行水解。

[0292] 在某些方面中，描述了对新陈代谢工程化以生物合成地产生葡萄糖的各种路线。例如，糖原合成可以被打断，和葡萄糖-1-磷酸或葡萄糖-6-磷酸可以被脱去磷酸。磷酸葡萄糖可以通过克隆的或者内源的磷酸酶或己糖激酶在细胞内脱磷酸，并通过克隆的或内源促进载体(facilitating transport)运送出细胞。或者，磷酸葡萄糖可以在外部输送和去磷酸化。磷酸葡萄糖也可以被直接地用作发酵底物。

[0293] 除以上所述外，描述了另一种生物合成地产生葡萄糖的机制。在某些实施方式中，本发明提供了糖原水解酶的克隆基因以将糖原水解为葡萄糖和/或麦芽糖并从细胞运输麦芽糖和葡萄糖。优选的酶列于如下表2中。葡萄糖是通过葡萄糖/己糖转运蛋白运输的。这一替代方式允许细胞天然地累积糖原，但增加酶的活性以使其不断地回复为可作为发酵产物收集的麦芽糖或葡萄糖单元。

[0294] 存在许多潜在的糖原水解酶的候选。酶受限于其用于水解糖原聚合物的1，4-和1，6-键的机制，并且完全的水解需要酶的集合。α-淀粉酶对糖原的大聚合物进行内切，并且水解导致形成较短的平均DP 13的聚合物，其被葡糖淀粉酶以外切形式攻击以产生葡萄糖产物。上述酶都不攻击1，6-支链。因此，天然地进行该水解的支链淀粉酶和其它淀粉-1，
6-糖苷酶被用于将糖原完全地水解为葡萄糖。另一替代方式是β-淀粉酶，其对大聚合物的末端进行外切，并导致释放麦芽糖单元。此外，有很多种葡萄糖-6-磷酸的酶促去磷酸化的可能性，包括碱性或酸性磷酸酶和激酶。在如下表2中列出的以下酶具有糖或糖聚合物去磷酸化的特异性活性。

[0295] 表2：糖原水解的酶

[0296]

[0297]

[0298] 运输/外排基因产物

[0299] 多种运输机制是可能的。大部分细菌细胞具有媒介性主动转运蛋白以将葡萄糖或麦芽糖移动到细胞中。为了积累糖类，这些机制依赖于ATP、质子动力或其它分子物质(例如，磷酸盐)梯度形式的能量耦合。植物叶绿体具有用来促进葡萄糖和麦芽糖流出到植物或藻类细胞质的主动机制。因此，在特定的实施方式中，在内膜中建立 转运蛋白可能涉及能量耦合机制对溶质流量的靶向和装配，以及媒介性(vectoriality)。举例来说，叶绿体中用于运输麦芽糖的麦芽糖外排泵：MEX1；葡萄糖通透酶，低和高Km，葡萄糖:H+同向转运蛋白，葡萄糖/果糖通透酶，用于运输葡萄糖的总糖:H+反向转运体；和葡萄糖-6-磷酸:Pi反向转运体，用于运输葡萄糖-6-磷酸的磷酸丙糖:磷酸反向转运体是本发明预期的运输机制。

[0300] 存在以明显速率分泌麦芽糖和葡萄糖的天然小球藻株。这些藻株通常是共生的，并当新与他们的宿主分离时，显著地分泌其几乎全部光合产物作为细胞外单糖，但是它们几乎总是在被移除后立即失去这种能力。

[0301] 一些小球藻株可以作为无生物污染的培养物生长(倍增时间～12小时，30℃)并且仍然几乎全部地以葡萄糖或麦芽糖的形式在营养缺乏培养基上(类似于在氮缺乏情况中产生糖原)分泌可观部分的(5-40％)光合产物。这些排泄率在黑暗中由光合产物的细胞内储备持续。文献中的一些最佳速率被描述于Fischer等，179：251-256(1989)；和Brechignac等，Adv.Space Res.14：79-88(1994)中。

[0302] 在某些实施方式中，上述糖产生率得到保持，或更优选地超过。在15g/l的生物质密度(～OD 50)下操作，显示～0.05*15＝0.75克糖/升/小时的体积生产率。

[0303] 根据本发明的上述方面的发酵产物是糖，其在光合作用期间作为碳固定的结果被输出至培养基中。随后该糖可被再吸收并发酵、直接分离或被共培养生物体利用。这种方法有几个优点。首先，细胞能够处理的糖的总量不受细胞内最高浓度的限制，因为终产物被输出到培养基中。第二，通过从细胞中移除糖，碳固定反应的平衡被推向产生更多的糖。第三，在光合作用期间，不需要将碳流推向糖酵解。第四，糖比将直接产生的发酵产物潜在地具有低毒性。

[0304] 因此，本发明提供了利用光、水和二氧化碳通过光合作用产生代谢糖类(如葡萄糖)的细胞，随后以高效的、可持续的产量将糖转化为碳基目的产物。在某些实施方式中，光合生物经遗传修饰以产生 光合产物(如葡萄糖)，其产生量大于每升发酵培养基1毫克、100毫克、500毫克、1克、5克、10克、20克、25克、30克、35克、40克、50克、100克、120克或
150克。

[0305] 本发明还提供了根据同样的原理产生其它糖类，如蔗糖、木糖、戊糖、鼠李糖和阿拉伯糖的工程光合生物体。该生物体可以利用这样的糖类作为其主要碳源发酵该糖并产生碳基目的产物，例如，生物燃料，如乙醇(参见Ho等，Appl Environ Microbiol，64：1852-1859(1998)，其描述葡萄糖和木糖用于从纤维素类生物质产生乙醇的用途)。 [0306] 统一的光-发酵

[0307] 本发明的上述方面是作为光合作用的结果直接地产生最终碳基目的产物的替代方式。在这种方式中，碳基目的产物通过支持更易于产生任何特定产物的其它生物体，同时培养作为其碳源的光合生物体而产生。因此，碳基目的产物的发酵和产生可以与光生物反应器中碳源的产生独立地进行。

[0308] 一个方面中，产生这种碳基目的产物的方法包括两个步骤。第一步包括使用光合生物以将二氧化碳转化为光合产物，如葡萄糖。第二步是利用该光合产物作为产生碳基目的产物的细胞的碳源。在一个实施方式中，该两阶段的方法包括包含光合细胞的光生物反应器；包含能发酵的细胞的第二反应器；其中该光合细胞为能发酵的细胞提供碳源(如葡萄糖)以产生碳基目的产物。第二反应器可以包含超过一种类型的微生物。随后分离和/或收集由此产生的碳基目的产物。

[0309] 优选地，将这两个步骤合并成单步骤的过程，从而工程光合生物体将光和CO2直接地转化为葡萄糖，并且这种生物体能够产生多种碳基目的产物。

[0310] 本发明还提供了用于在光合生物体中持续产生葡萄糖的方法和组合物，其中利用光、水和二氧化碳(作为碳源)培养这些或其它利用糖的生物体以产生碳基目的产物。在这样的实施方式中，宿主 细胞能够在生物反应器中以连续或分批补料的方式从细胞内向培养基中分泌糖类，如葡萄糖。

[0311] 用于产生糖的光合宿主细胞(例如蓝细菌)的培养条件的某些变化可以被优化以进行生长。例如，通过光照强度、光照射量、光照时间、昼夜周期、添加补充剂、营养物质、循环速率和保持光-暗比的流动速率对条件进行优化。如本领域的技术人员显而易见的，足以获得最佳生长的条件将随位置、气候和其它环境因素(如昼夜周期、光照强度和光照时间)而异。可能需要其它调节，例如，生物体摄取碳的能力。可以通过气体分布器或通风装置向生物反应中引入增加的二氧化碳形式的碳。

[0312] 统一光-发酵的优点包括其中包括化学终产物(如葡萄糖)分离的过程，终产物之间的空间分离(膜)和时间。此外，与传统的或纤维素生物质产生生物燃料的方法不同，这里不需要预处理、糖化和作物耕作。

[0313] 统一光-发酵过程产生连续的产物。在较佳的实施方式中，该过程包含直接捕捉光到工程前端生物体的产物以产生各种产品，而不需要裂解该生物体。例如，该生物体可以在光中利用3PGAL产生所需的发酵产物，如乙醇。在其它的实施方式中，该生物体可以在光中累积糖原和在黑暗中代谢乙醇以产生更多的发酵产物。与细胞内的产物(如油和纤维素)相反，这些最终产物可以很容易地分泌。在再另外的实施方式中，生物体在光中产生被分泌到培养基中的糖类，并且在黑暗中这些糖被相同或不同的生物体用于发酵过程中，或两者的组合。

[0314] 发酵条件

[0315] 可以通过使用特定的发酵技术提高碳基目的产物的产生和分离。一种最大化产量而同时降低成本的方法是增加被转化为烃产物的碳的百分比。在正常的细胞生命周期中，碳被用于细胞的功能，包括产生脂类、糖类、蛋白质、有机酸以及核酸。减少生长相关活动所需要的碳的量可以增加碳源转化为输出的效率。这可以通过首 先使微生物生长到所需的密度实现，如对数生长期峰值时达到的密度。在该点，可以利用复制关卡基因(checkpoint gene)阻止细胞的生长。具体地，可以使用群体感应机制(quorum sensing mechanism)[综述于Camilli和Bassler，Science 311：1113，(2006)；Venturi FEMS Microbio Rev 30：274-291(2006)；及Reading和Sperandio，FEMS Microbiol Lett，254：1-11，(2006)]激活基因，如p53、p21或其它关卡基因。在大肠杆菌中可以被激活以停止细胞的复制和生长的基因包括umuDC基因，该基因的过表达阻止从稳定期发展到指数增长期的进程[Murli等，J.of Bact.，182：1127，(2000)]。UmuC是可以跨过非编码损伤进行跨损伤合成—大部分紫外线和化学诱变的机制基础-的DNA聚合酶。umuDC基因产物被用于跨损伤合成的过程，也用作DNA损伤检查点。UmuDC基因产物包括UmuC、UmuD、umuD’、UmuD’2C、UmuD’2和UmUD2。
同时，产生产物的基因被激活，从而在产生脂肪酸衍生的同时使复制和维持需使用的途径的需要最小化。

[0316] 一个方面中，被转化为烃产物的输入碳的百分比是高效和廉价的过程。利用二氧化碳作为碳源，以氧气的形式释放氧，这导致～34％(w/w)的最大理论代谢效率(对于脂肪酸衍生产物)。

[0317] 但是，这个数字对于其它烃产物和碳源发生变化。文献中典型的效率是～＜5％。产生烃产物的工程微生物可以具有大于1、3、5、10、15、20、25和30％的效率。在一个实施例中，微生物将显示约10％至约25％的效率。在其它的实施例中，这种微生物将显示约25％至约30％的效率，和在其它的实施例中，这种微生物将显示＞30％的效率。

[0318] 在其中从细胞中释放最终产物的一些实施例中，可以采用连续的过程。在这种方式中，具有产生脂肪酸衍生物的生物体的反应器可以以多种方式进行组装。在一个实施例中，移除一部分培养基并使其分离。从水层分离脂肪酸衍生物，其随之返回到发酵室中。 [0319] 在另一个实施例中，发酵室包含经历连续减少的发酵物。在这种情况下，将建立稳定的还原性环境。电子平衡通过释放氧气维持。 增加NAD/H和NADP/H的措施也可以帮助稳定电子平衡。

[0320] 也可以通过对生产宿主工程化以表达NADH:NADPH转氢酶来增加细胞内NADPH的供应。一个或多个NADH:NADPH转氢酶的表达将糖酵解中产生的NADH转换为NADPH，这增加了脂肪酸衍生物的产生。

[0321] 对于大规模的产物生产，工程微生物以10L、100L或更大批量生长，发酵和诱导适当地表达基于质粒中编码的特定基因的所需的产物。在37℃下，LB培养基(不含甘油)中，在＞200rpm震荡下，携带有工程核酸以过表达或弱化基因产物的细胞由来自10L发酵物的500mL种子培养物(对于100L发酵为5L)进行孵育，直到培养物与卡那霉素、氨苄青霉素等一直孵育达到所需的OD(通常是16小时)。通过在适当的约8.0的pH值下连续补充以维持25mM丙酸钠来处理培养基，以激活工程基因系统进行生产并阻止细胞增殖。用二氧化碳连续补充培养基。每小时移除不超过总细胞体积的10％的等分试样，并使其静止沉降，从而使烃产物上升到表面并发生自发的相分离。然后收集烃成分，并将水相返回反应室中。该反应室是连续地操作的。对于蜡酯的产生，分离后在1M盐酸中简短地洗涤该蜡酯以分裂酯键，并通过用蒸馏水全面洗涤使其返回至pH7。

[0322] 由生产宿主产生和释放脂肪醇

[0323] 本文还公开了通过转运蛋白质连续产生和从重组宿主微生物中输出烃的系统。许多转运和外排蛋白质用于排出多种多样的化合物，并可以进化为对特定类型的脂肪酸具有选择性。因此，在一些实施方式中，重组宿主微生物功能性地表达编码ABC转运蛋白的外源核酸序列，以使微生物将脂肪酸输出至培养基中。在一个实施例中，该ABC转运蛋白是源自秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、拟南芥、真养产碱杆菌或红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)(基因座AAN73268)的ABC转运蛋白。在另一个实施例中，该ABC转运蛋白是选自CER5(基因座g51500或AY734542)、AtMRPS、 AmiS2和AtPGP1的ABC转运蛋白。在一些实施例中，该ABC转运蛋白是CER5。在再另一个实施例中，该CER5基因源自拟南芥属(基因座AtI g51500、AY734542、At3g21090和At Ig51460)。

[0324] 例如，该转运蛋白也可以是选自以下的外排蛋白：来自大肠杆菌的AcrAB、ToIC和AcrEF，或来自Thermosynechococcus elongatus BP-I的tlll618、H11619和U10139。 [0325] 此外，该转运蛋白可以是，例如，选自果蝇(Drosophila melanogaster)、秀丽隐杆线虫、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或酿酒酵母的脂肪酸转运蛋白(FATP)或者任何一种哺乳动物FATP。另外可以用翻转的膜区域再合成FATP以逆转底物的流动方向。具体地，可以反转构成蛋白质的亲水域(或膜域)的氨基酸序列，同时对于各特定的氨基酸保持相同的密码子。这些区域的鉴别是本领域熟知的。

[0326] 也可以针对其释放脂肪酸的内在能力选择生产宿主。产物产生和释放到发酵培养基中的效率可以表示为细胞内的产物与细胞外的产物的比例。在一些实例中，该比例可以是5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4或1∶5。

[0327] 加工与分离

[0328] 可以从发酵培养基中分离二氧化碳固定微生物在发酵过程中产生的碳基产物。可以采用从水性介质中分离脂肪酸衍生物的已知的技术。本文提供的一种典型的分离过程是两相的(双相)分离过程。这一过程涉及，在足以产生例如脂肪酸的条件下发酵遗传修饰的宿主细胞，使脂肪酸聚集在有机相中，以及将该有机相与水性发酵培养基分离。该方法可以用于分批处理和连续发酵的情况中。

[0329] 双相分离利用脂肪酸的相对不混溶性以促进分离。熟练的技术人员可以理解，通过选择发酵培养基和使得产生的脂肪酸衍生物具有高LogP值的有机相，即使在非常低的浓度下，脂肪酸会在发酵容器内分离到有机相中。

[0330] 当使用本文所述的方法生产脂肪酸时，这类产物在发酵培养基 中以及在细胞质中相对不混溶。因此，脂肪酸在细胞内或细胞外聚集在有机相中。产物在有机相中聚集将减轻脂肪酸衍生物对细胞功能的影响，并使生产宿主产生更多的产物。

[0331] 如本文所述产生的脂肪醇、脂肪酸酯、蜡和烃使得能够相对于其它组合物产生均一的化合物，其中产生的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的脂肪醇、脂肪酸酯、蜡和烃的碳链长度的差异少于4个碳、或少于2个碳。也可以产生这些组合物以使得它们相对于其它组合物具有相对均一的饱和度，例如至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的脂肪醇、脂肪酸酯、烃和蜡是单-、2-或3-不饱和的。

[0332] 与类异戊二烯产生相关的途径

[0333] 有两个已知的合成异戊烯基焦磷酸酯(“IPP”)及其异构体，二甲基烯丙基焦磷酸酯(“DMAPP”)，的生物合成途径。植物以外的真核细胞专门地使用甲羟戊酸依赖性(“MEV”)类异戊二烯途径以将乙酰辅酶A(“乙酰-CoA”)转化为IPP，其随后被异构化为DMAPP。原核生物(除了一些例外)使用不依赖甲羟戊酸的或去氧木酮糖-5-磷酸(“DXP”)途径以通过分支点独立地产生IPP和DMAPP。通常，植物同时使用MEV和DXP途径合成IPP。 [0334] MEV途径：通常，该途径包括6个步骤。在第一步中，两分子的乙酰辅酶A酶促结合以形成乙酰乙酰-CoA。已知催化这一步骤的酶是例如，乙酰CoA硫解酶。其实例包括但不限于NC_000913REGION：232413 L.2325315；大肠杆菌，D49362；脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)和L20428；酿酒酵母。

[0335] 在MEV途径的第二步中，乙酰乙酰-CoA与另一个分子的乙酰-CoA酶促缩合以形成3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)。已知催化这一步骤的酶是例如，HMG-CoA合成酶。其实例包括但不限于NC_001 145补体19061..20536；酿酒酵母，X96617；酿酒酵母，X83882；拟南芥，AB037907；Kitasatospora griseola，BT007302；人，和NC_002758，基因座标签SAV2546，GeneID 1 122571；金黄 色葡萄球菌。

[0336] 在第三步中，HMG-CoA被酶促转化为甲羟戊酸。HMG-CoA还原酶是已知催化这一步的酶的实例。来自各种不同的生物体的实例包括但不限于NM_206548；果蝇，NC_002758，基因座标签SAV2545，GeneID 1122570；金黄色葡萄球菌，NM_204485；红原鸡(Gallus gallus)，AB015627；链霉菌KO3988种，AF542543；烟草(Nicotiana attenuata)，AB037907；Kitasatospora griseola，AX128213，提供编码缩短的HMGR的序列；酿酒酵母，和NC_001145：补体115734..1 18898；酿酒酵母。

[0337] 在第四步中，甲羟戊酸被酶促磷酸化以形成甲羟戊酸5-磷酸。已知催化这一步的酶是例如，甲羟戊酸激酶。其实例包括但不限于L77688；拟南芥，和X55875；酿酒酵母。 [0338] 在第五步中，第二个磷酸基团被酶促添加到甲羟戊酸-5-磷酸上以形成甲羟戊酸-5-焦磷酸。已知催化这一步骤的酶是例如，磷酸甲羟戊酸激酶。其实例包括但不限于AF429385；巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)，NM_006556；人以及NC_001 145补体712315..713670；酿酒酵母。

[0339] 在第六步中，甲羟戊酸-5-焦磷酸被酶促转化为IPP。已知催化这一步骤的酶是例如，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶。其实例包括但不限于X97557；酿酒酵母，AF290095；屎肠球菌和U49260；人。

[0340] 如果使用甲羟戊酸途径将IPP转化为DMAPP，则需要第七步。已知催化这一步骤的酶是例如，IPP异构酶。其实例包括但不限于NC_000913、3031087、3031635；大肠杆菌和AF082326；雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)。

[0341] DXP途径：通常，DXP途径包含7个步骤，第一步中，丙酮酸与D-甘油醛3-磷酸缩合以形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化这一步骤的酶是例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶。其实例包括但不限于AF035440；大肠杆菌，NC_002947，基因座标签PP0527；恶臭假单胞菌KT2440，CP000026，基因座标签SPA2301；副伤寒沙 门氏菌(Salmonella enterica Paratyphi)，见ATCC 9150，NC_007493，基因座标签RSP_0254；球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1，NC_005296，基因座标签RPA0952；沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009，(NC_004556，基因座标签PD1293；苛求木杆菌(Xylellafastidiosa)Temeculal和NC_003076，基因座标签AT5G11380；拟南芥。 [0342] 在第二步中，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸被转化为2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸。已知催化这一步骤的酶是例如，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶。其实例包括但不限于AB013300；大肠杆菌，AF148852；拟南芥，NC_002947，基因座标签PP 1597；恶臭假单胞菌KT2440，AL939124，基因座标签SCO5694；天蓝色链霉菌A3(2)，(NC_007493)，基因座标签RSP_2709；球形红细菌2.4.1和NC_007492，基因座标签Pfl_1107；荧光假单胞菌PfO-1。 [0343] 第三步中，2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸被转化为4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇。已知催化这一步的酶是例如，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合成酶。其实例包括但不限于AF230736；大肠杆菌，NC_007493，基因座_标签RSP_2835；球形红细菌2.4.1，NC_003071，基因座_标签AT2G02500；拟南芥和NC 002947，基因座_标签PP1614；恶臭假单胞菌KT2440。

[0344] 第四步中，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇被转化为4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸。已知催化这一步的酶是例如，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇激酶。其实例包括但不限于AF216300；大肠杆菌和NC_007493，基因座_标签RSP_1779；球形红细菌2.4.1。

[0345] 第五步中，4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸被转化为2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环焦磷酸。已知催化这一步的酶是例如，2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环焦磷酸合成酶。其实例包括但不限于AF230738；大肠杆菌，NC_007493，基因座_标签RSP_6071；球形红细菌2.4.1和NC_002947，基因座_标签PP1 618；恶臭假单胞菌 KT2440。

[0346] 第六步中，2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环焦磷酸被转化换为1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸。已知催化这一步骤的酶是例如，1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶。其实例包括但不限于AY033515；大肠杆菌，NC_002947，基因座_标签PP0853；恶臭假单胞菌KT2440和NC007493，基因座_标签RSP_2982；球形红细菌2.4.1。 [0347] 第七步中，1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸被转化成IPP或其异构体DMAPP。已知催化这一步骤的酶是例如，异戊基/二甲基烯丙基焦磷酸合成酶。其实例包括但不限于AY062212；大肠杆菌和NC_002947，基因座_标签PP0606；恶臭假单胞菌KT2440。 [0348] 类异戊二烯的产生

[0349] 本发明的实施中可以使用本文所述的任何合适的宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是遗传修饰的宿主微生物，其中核酸分子已插入、删除或修饰(即突变，如通过插入、删除、置换和/或核苷酸倒置)以产生所需的类异戊二烯化合物或原料，或提高所需的类异戊二烯化合物或原料的产量。在另一个实施方式中，宿主细胞能够在液体生长培养基中生长。

[0350] 本文提供了在用异戊二烯焦磷酸途径酶工程化的二氧化碳固定宿主中产生类异戊二烯的方法。类异戊二烯的一些实例包括：半萜(衍生自1个异戊二烯单元)如异戊二烯；单萜(衍生自2个异戊二烯单元)如月桂烯；倍半萜(衍生自3个异戊二烯单元)如紫穗槐-4，11-二烯(amorpha-4，11-diene)；二萜(衍生自4个异戊二烯单元)如紫杉二烯(taxadiene)；三萜(衍生自6个异戊二烯单元)如角鲨烯；四萜(衍生自8个类异戊二烯)如β胡萝卜素以及多萜(衍生自超过8个异戊二烯单元)如聚异戊二烯。在公开的PCT申请WO2007/139925和WO/2007/140339中也较详细地描述了类异戊二烯的产生。 [0351] 在一个方面中，产生类异戊二烯的宿主细胞涉及的步骤是，选 择能够或者可以被修饰以产生用于形成异戊烯基焦磷酸的酶途径的宿主细胞，其中所有的途径酶受表达调控序列控制；和在适宜的条件下在培养基中培养宿主细胞使其生长。在一些实施方式中，该途径是甲羟戊酸途径。在其它的实施方式中，该条途径是DXP途径。

[0352] 在一些实施方式中，最小化或者完全消除宿主细胞本身的代谢过程和与IPP的产生相关的这些过程之间的“交叉串扰”(或干扰)。例如，当宿主微生物专门地依赖于DXP途径合成IPP时，交叉串扰被最小化或者完全消除，并引入MEV途径以提供另外的IPP。这种宿主生物体不会有能力改变MEV途径酶的表达或处理与MEV途径相关的中间体。专门地或者主要地依赖于DXP途径的生物体包括，例如大肠杆菌。

[0353] 在一些实施方式中，宿主细胞专门地或与DXP途径结合地通过MEV途径产生IPP。在其它的实施方式中，宿主细胞的DXP途径功能丧失，以致该宿主细胞专门地通过异源引入的MEV途径产生IPP。DXP途径的功能丧失可以通过使基因不能表达或者阻止DXP途径中的一个或更多的酶的功能实现。

[0354] 在一些实施方式中，宿主细胞专门地或与MEV途径结合地通过DXP途径产生IPP。在其它的实施方式中，宿主细胞的MEV途径功能丧失，以致该宿主细胞专门地通过异源引入的DXP途径产生IPP。MEV途径的功能丧失可以通过使基因不能表达或者阻止MEV途径中的一个或更多的酶的功能实现。

[0355] 在再另一个实施方式中，用于产生类异戊二烯或类异戊二烯前体的方法包括步骤：(i)进行发酵反应，该反应包含发酵培养基和多种遗传修饰的二氧化碳固定宿主细胞，该宿主细胞在以下条件下产生类异戊二烯：(a)发酵培养基保持在低于达到所述宿主细胞的最大比生长速率所提供的温度的温度下；(b)发酵培养基包含二氧化碳；和/或(c)发酵培养基包含以低于所述宿主细胞达到最大比生长速率所提供的量的氮源；(ii)回收在一个或多个(a)至(c)中所列条件下产生的类异戊二烯产物。一个方面中，在至少两个(a) 至(c)中所列条件下产生类异戊二烯。在另一个方面中，在全部(a)至(c)中所列条件下产生类异戊二烯。

[0356] 在本发明的进一步的方面中，提供了通过利用在至少一个异源调控子或发酵条件的控制下(单独地或组合地)的异戊烯基焦磷酸途径的酶稳定地产生类异戊二烯的组合物和方法。

[0357] 在再另一个方面中，产生类异戊二烯的方法包括步骤：(a)选择或获得遗传修饰的二氧化碳固定宿主细胞，该细胞包含产生异戊烯基焦磷酸的酶促途径，其中该途径中所有的酶受到至少一个异源转录调控子的控制；和(b)在与为宿主细胞提供最大比生长速率的条件相比次最优的条件下在培养基中培养该宿主细胞。在一些实施方式中，该途径是甲羟戊酸途径。在其它的实施方式中，该途径是DXP途径。在其它的实施方式中，该途径的酶受控于表达调控序列。

[0358] 在一些实施方式中，该途径包含编码甲羟戊酸途径酶的核酸序列，其中该酶来自具有内源性甲羟戊酸途径的原核生物。具有内源性甲羟戊酸途径的典型的原核生物包括但不限于，肠球菌属、假单胞菌属和葡萄球菌属。在一个实施方式中，该甲羟戊酸途径酶选自于乙酰CoA硫解酶、HMG CoA合成酶、HMG CoA还原酶和甲羟戊酸激酶。在另一实施方式中，该异源核酸序列编码II类HMG CoA还原酶。在其它的实施方式中，宿主细胞(如蓝细菌)被工程化以异源表达甲羟戊酸途径。

[0359] 在某些实施方式中，宿主细胞产生的类异戊二烯化合物的量基于生物燃料的总体积为至少30％体积。

[0360] 在另一个实施方式中，宿主细胞被培养在其中营养物质和/或温度水平保持在低于为宿主细胞提供最大比生长速率的水平的培养基中。在另一个实施方式中，培养该宿主细胞的培养基中碳源被保持在提供低于最大比生长速率的约90％、75％、50％、25％、10％或90％和10％之间的任何速率的水平。在另一实施方式中，培养该宿主细胞的培养基中氮源被保持在提供低于最大比生长速率的约90 ％、75％、50％、25％、10％或90％和10％之间的任何速率的水平。在另一实施方式中，培养该宿主细胞的培养基中温度被保持在提供低于最大比生长速率的约90％、75％、50％、25％、10％或90％和10％之间的任何速率的水平。在另一实施方式中，培养基温度被保持在低于提供最大比生长速率的温度以下至少约2℃、4℃、5℃、6℃、8℃、10℃、15℃或20℃。

[0361] 燃料组合物

[0362] 通过二氧化碳固定生物体产生的上述组合物、碳基产物(如乙醇、脂肪酸、链烷烃、类异戊二烯)可以用作燃料。例如，使用本文所描述的方法可以产生具有所需的燃料质量的包含相对均质的脂肪酸衍生物的燃料。当与石油衍生燃料或源自甘油三酯的生物柴油相比时，这种燃料的特点在于碳指纹、缺乏杂质，而且脂肪酸基燃料可以与其它燃料或燃料添加剂结合以产生具有所需特性的燃料。

[0363] 与源自脂肪酸的燃料相似，本发明包括包含燃料成分和生物工程的C5类异戊二烯化合物的燃料组合物。

[0364] 在另一方面中，本发明包括通过利用二氧化碳固定微生物制备3-甲基-3-丁烯-1-醇并在燃料中加入3-甲基-3-丁烯-1-醇产生的燃料组合物。

[0365] 在另一方面中，本发明包括通过利用微生物制备3-甲基-2-丁烯-1-醇并在燃料中加入3-甲基-2-丁烯-1-醇产生的燃料组合物。

[0366] 在另一方面中，本发明包括通过利用微生物制备3-甲基-3-丁烯-1-醇，从3-甲基-3-丁烯-1-醇制备异戊醇，并在燃料中加入异戊醇产生的燃料组合物。

[0367] 在另一方面中，本发明包括通过利用微生物制备3-甲基-2-丁烯-1-醇，从3-甲基-2-丁烯-1-醇制备异戊醇，并在燃料中加入异戊醇产生的燃料组合物。

[0368] 在一些实施方式中，重组宿主细胞经修饰以增加对异戊烯基焦磷酸酯(IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)酶或其组合向异戊烯醇的酶促转化。

[0369] 在某些实施方式中，生物燃料包含3-甲基-3-丁烯-1-醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇、3-甲基-1-丁醇或其组合。在进一步的实施方式中，3-甲基-3-丁烯-1-醇、
3-甲基-2-丁烯-1-醇或3-甲基-1-丁醇的量为至少约2％。

[0370] 实施例20中描述了利用一种或多种微生物制备类异戊二烯化合物的方法。在某些实施方式中，燃料组合物通过利用一种或多种微生物制备3-甲基-3-丁烯-1-醇，从3-甲基-3-丁烯-1-醇制备3-甲基-1-丁醇，以及在该燃料组合物中加入3-甲基-1-丁醇产生。在其它的实施方式中，燃料组合物通过利用一种或多种微生物制备3-甲基-2-丁烯-1-醇，从3-甲基-2-丁烯-1-醇制备3-甲基-1-丁醇，以及在该燃料组合物中加入
3-甲基-1-丁醇产生。

[0371] 杂质

[0372] 在某些方面中，本文产生的碳基产物(例如乙醇、脂肪酸、链烷烃、类异戊二烯)包含与通常与源自甘油三酯的生物燃料(如源自植物油和脂肪的燃料)相比更少的杂质。例如，本文描述的粗脂肪酸生物燃料(将脂肪酸衍生物与其它燃料(如石化柴油或生物柴油)混合之前)可以包含与从甘油三酯制得的生物燃料相比较少的甘油(或丙三醇)，粗生物燃料可以包含与从甘油三酸酯制得的生物柴油相比较少的游离醇(即，用于产生酯的醇)。生物燃料与石油衍生的柴油相比特征性地具有低浓度的硫。

[0373] 在一个方面中，本文所描述的粗脂肪酸生物燃料(将脂肪酸衍生物与其它燃料如传统燃料混合之前)可以包含比石化柴油或生物柴油更少的酯交换催化剂。优选地，脂肪酸衍生物可以包含少于约2％、1.5％、1.0％、0.5％、0.3％、0.1％、0.05％或0％的酯交换催化剂或由酯交换催化剂、甘油、游离醇或硫产生的杂质。酯交换催化剂包括，例如，氢氧化物催化剂如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂，和酸性催化剂如无机酸催化剂和路易斯酸催化剂。由酯交换催化剂产生的催化剂和杂质包括但不限于，锡、铅、汞、镉、锌、钛、锆、铪、硼、铝、磷、砷、锑、铋、钙、镁、锶、铀、钾、钠、锂及其 组合。

[0374] 为了产生均匀的产物，汽油组成的差异可能需要来自几个成分流的产物的必要混合。各个流的性质可能显著地发生变化，从而极大地影响产物汽油。混合工艺相对简单，但是确定包含在混合中的各个成分的量困难得多。

[0375] 在某些实施方式中，本文公开的燃料组合物没有或者基本上没有第二种醇，其中第二种醇不是3-甲基-3-丁烯-1-醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇或其组合。在进一步的实施方式中，该第二种醇是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、仲戊醇、叔戊醇、正己醇、异己醇、仲己醇、叔己醇、庚醇类、辛醇类、壬醇类、癸醇类或其组合。在一些实施方式中，本文公开的燃料组合物没有或者基本上没有芳香族化合物。在其它的实施方式中，本文公开的燃料组合物没有或者基本上没有烷基胺、脂肪酸酯或脂肪酸盐。 [0376] 在某些实施方式中，本文公开的燃料组合物进一步包含，基于燃料组合物的总体积，1％至95％体积的石油基的燃料。在一些实施方式中，石油基的燃料是汽油。在进一步的实施方式中，存在的C5类异戊二烯化合物的量基于燃料组合物的总体积为约1％至约5％体积，约1％到约10％的体积，约1％至约12.5％体积，约2.5％至约12.5％体积或约5％至约12.5％体积。

[0377] 添加剂

[0378] 通常，使用燃料添加剂加强燃料或发动机的性能。例如，可以使用燃料添加剂改变冰点/胶凝点、浊点、润滑性、粘度、氧化稳定性、点火质量、辛烷值水平和闪点。熟练的技术人员能理解，本文所述的脂肪酸可以与其他燃料(如源自甘油三酯的生物柴油)、各种醇类(如乙醇和丁醇)以及石油衍生产物(如汽油)混合。在一些实例中，产生具有低凝胶点的脂肪酸，如C16:1乙基酯或C18:1乙基酯。这种低凝胶点的脂肪酸衍生物与从甘油三酯制得的生物柴油混合以降低燃料的整体胶凝点。类似地，脂肪酸衍生物如C16:1乙基酯或C18:1乙基酯可以与石油来源的柴油混合以提供至少和通常大于5％的生 物柴油的混合物。在一些实例中，该混合物包含至少20％或更多的脂肪酸。

[0379] 例如，生物燃料组合物可被制成包含至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的脂肪酸，其中该脂肪酸包含8:0、10:0、12:0、14:0、14:1、16:0、
16:1、18:0、18:1、18:2、18:3、20:0、20:1、20:2、20:3、22:0、22:1或22:3的碳链。这种生物燃料组合物可以另外包含至少一种选自于可以将浊点降低到低于约5℃或0℃的浊点降低添加剂、表面活性剂或微乳液的添加剂、至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、
60％、70％或80％、85％、90％或95％的源自甘油三酯的柴油燃料、石油来源的汽油或源自石油的柴油燃料。

[0380] 在某些实施方式中，生物燃料进一步包含石油基的燃料、燃料添加剂或其组合。在进一步的实施方式中，石油基的燃料是汽油、喷气燃料、煤油、柴油燃料或其组合。 [0381] 本文公开的燃料组合物中C5类异戊二烯化合物或其衍生物的量，基于燃料组合物的总量，可能是从0.5％至99％、从0.5％至98％、从1％至97％、从1％至96％、从2％至95％、从2％至90％、从3％至85％或从5％至80％。在某些实施方式中，该C5类异戊二烯或其衍生物是C5环烃。该C5环烃的量，基于燃料组合物的总量，超过1％、超过2％、超过
3％、超过4％、超过5％、超过10％、超过15％、超过20％、超过25％、超过30％、超过35％、超过40％、超过45％、超过50％、超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％或超过95％。在一些实施方式中，该量是基于燃料组合物总重量的wt.％。在其它的实施方式中，该量是基于燃料组合物总体积的vol.％。在某些实施方式中，该燃料组合物是汽油燃料组合物。

[0382] 本文公开的燃料组合物中石油基燃料成分的量，基于燃料组合物的总量，可能是从0.1％至99％、从1％至95％、从2％至90％、从3％至85％、从5％至80％、从5％至70％、从5％至60％或从5 ％至50％。在某些实施方式中，该石油基燃料成分的量，基于燃料组合物的总量，是小于95％、小于90％、小于85％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、低于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、低于4％、小于3％、小于2％、小于1％或小于0.5％。在一些实施方式中，该量是基于燃料组合物总重量的wt.％。在其它的实施方式中，该量是基于燃料组合物总体积的vol.％。在某些实施方式中，该燃料组合物是汽油燃料组合物。 [0383] 在某些实施方式中，本文公开的燃料组合物中的燃料添加剂选自于充氧剂、抗氧化剂、热稳定改进剂、十六烷值改进剂、稳定剂、低温流动性改进剂、燃烧促进剂、消泡剂、抗雾化剂、腐蚀抑制剂、润滑性改进剂、防冻剂、喷油嘴清洁添加剂、抑烟剂、减阻添加剂、金属钝化剂、分散剂、去垢剂、反乳化剂、染料、标志物、静电消散剂(static dissipater)、生物杀灭剂及其组合。在进一步的实施方式中，该燃料添加剂的量，基于燃料组合物的总重量或体积，为约0.1％至约20％重量或体积。

[0384] 最常见的喷气燃料是被归类为Jet A-1的煤油/石蜡油基燃料，其是根据一套国际标准化规范生产。仅在美国，也使用被称为Jet A的Jet A-1型号。另一种在民用航空中普遍使用的喷气燃料被称为Jet B。Jet B是石脑油-煤油(naptha-kerosene)区的轻质燃料，用于增强低温气候下的性能。在ASTM规范D.1655-68中详述了Jet A、Jet A-1和Jet B。或者，世界各地的军队用不同的JP码系统为喷气燃料分类。有些几乎与其民用版相同，并且仅仅在少数的添加剂的量上不同。例如，Jet A-1与JP-8相似，以及Jet-B与JP-4相似。或者，喷气燃料也可以被归类为煤油型或石脑油型。煤油型喷气燃料的一些非限制的实例包括Jet A、Jet A1、JP-5和JP-8。石脑油型喷气燃料的一些非限制的实例包括Jet B和JP-4。Jet A在美国使用，而世界其它大部分地方使用Jet A-1。Jet A和Jet A-1之间的重要区别是最高冰点。Jet A-1具有-47℃的较低的最高冰点，而Jet A具有-40℃的最高冰点。 与Jet A-1相同，Jet A具有相当高的最低38℃的闪点，自燃温度为210℃。 [0385] 本文公开的燃料组合物中各传统燃料添加剂的量，基于燃料组合物的总量，可能是从0.1％至少于50％、0.2％至40％、0.3％至30％、0.4％至20％、0.5％至15％或0.5％至10％。在某些实施方式中，各传统的燃料添加剂的量，基于燃料组合物的总量，为小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于
10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％或小于0.5％。在一些实施方式中，该量是基于燃料组合物总重量的wt％。在其它的实施方式中，该量是基于燃料组合物总体积的体积％。

[0386] 汽车工程师协会，国际SAE，1995(ISBN：1560916451)的“汽油：添加剂，排放和性能(Gasoline：Additives，Emissions，and Performance)”中已经描述了一些传统的燃料添加剂，其通过引用而引入本文中。此外，以下美国专利公开了可以被作为添加剂用于本发明的实施方式中的各种燃料添加剂：6,054,420、6,051,039、5,997,593、5,997,592、5,993,498、5,968,211、5,958,089、5,931,977、5,891,203、5,882,364、5,880,075、
5,880,072、5,855,629、5,853,436、5,743,922、5,630,852、5,529,706、5,505,867、
5,492,544、5,490,864、5,484,462、5,321,172和5,284,492。以上所有在先美国专利的公开内容通过引用整体和全面地引入本文中。

[0387] 可使用任何增加本文公开的燃料组合物中氧的重量％的充氧剂。通常，充氧剂是可以划分为两类有机化合物(即，醇和醚)的包含碳、氢和氧的可燃液体。适当的充氧剂的一些非限制的实例包括乙醇、甲基叔丁基醚(MTBE)、叔戊基甲基醚(TAME)和乙基叔丁基醚(ETBE)。

[0388] 可以使用任何提高燃料润滑性的润滑性改进剂。在一些实施方式中，一种或多种的润滑性改进剂与本文公开的燃料组合物混合。通常，燃料中润滑性改进剂的浓度在1至50,000ppm的范围内，优 选地约10至20,000ppm，更优选地25至10,000ppm。润滑性改进剂的一些非限制的实例包括脂肪酸的酯。

[0389] 可使用能够提高本文公开的燃油组合物的质量燃烧速率的任何燃烧促进剂。燃烧促进剂的非限制的一些实例包括二茂铁(联环戊二烯基铁)、铁基燃烧促进剂(如来自TMTurbotect公司，Tomball，Texas(美国)的TURBOTECT ER 18)、钡基燃烧促进剂、铈基燃烧促进剂，以及铁和镁基燃烧促进剂(如来自Turbotect公司，Tomball，Texas(美国)的TM
TURBOTECT 703)。基于燃料组合物的总重量，该燃烧促进剂可以以约0.001至1wt％的浓度存在于燃料组合物中，并且在一个实施方式中，从0.01至1％重量。

[0390] 在一些实施方式中，该燃料组合物包含抗氧化剂。本发明可以使用能防止由储存燃料的氧化引起的燃油系统成分形成胶状沉淀和/或在某些燃料组合物中抑制过氧化物形成的任何抗氧化剂。基于燃料组合物的总重量，抗氧化剂可以以约0.001至5wt％的浓度存在于燃料组合物中，并且在一个实施方式中，从0.01至1％重量。

[0391] 在其它实施方式中，燃料组合物包含静电消散剂。静电消散剂降低了由燃料通过高流速的燃料输送系统的运动产生的静电的作用。基于燃料组合物的总重量，静电消散剂可以以约0.001至5wt％的浓度存在于燃料组合物中，并且在一个实施方式中，从0.01至1％重量。

[0392] 在进一步的实施方式中，燃料组合物包含腐蚀抑制剂。腐蚀抑制剂保护燃料处理系统(如管道和储油罐)中的铁类金属不受腐蚀。在需要另外的润滑性的情况下，可使用还提高组合物的润滑性的腐蚀抑制剂。基于燃料组合物的总重量，该腐蚀抑制剂可以以约0.001至5wt％的浓度存在于燃料组合物中，并且在一个实施方式中，从0.01至1％重量。 [0393] 在特定的实施方式中，燃料组合物包含燃料系统结冰抑制剂(也称为防冻添加剂)。燃料系统结冰抑制剂降低由于在高海拔冷却而从喷气燃料沉淀的水的凝固点和防止限制燃料流向发动机的冰 晶的形成。某些燃料系统结冰抑制剂也可以作为生物杀灭剂起作用。基于燃料组合物的总重量，该燃料系统结冰抑制剂可以以约0.001至5wt％的浓度存在于燃料组合物中，并且在一个实施方式中，从0.01至1％重量。

[0394] 在另一系列实施方式中，燃料组合物进一步包含生物杀灭剂。生物杀灭剂是用来防止微生物在燃料组合物中生长。基于燃料组合物的总重量，该生物杀灭剂可以以约0.001至5wt％的浓度存在于燃料组合物中，并且在一个实施方式中，从0.01至1％重量。 [0395] 在另一系列实施方式中，燃料组合物进一步包含金属钝化剂。该金属钝化剂抑制某些金属(特别是铜)对燃料氧化的催化作用。基于燃料组合物的总重量，该金属钝化剂可以以约0.001至5wt％的浓度存在于燃料组合物中，并且在一个实施方式中，从0.01至1％重量。

[0396] 在另一系列实施方式中，该燃料组合物进一步包含热稳定改进剂。该热稳定改进剂是用来抑制飞机燃油系统在高温区域形成沉淀。基于燃料组合物的总重量，该热稳定改进剂可以以约0.001至5wt％的浓度存在于燃料组合物中，并且在一个实施方式中，从0.01至1％重量。

[0397] 挥发性是汽油的重要属性，并且是确保引擎在寒冷的天气启动的必要条件。在冬季，通过添加更多的易挥发的丁烷和戊烷提高挥发性并降低闪点。为了防止在温暖的天气中的汽阻，减少较易挥发的成分的量以产生不会在燃料管线中汽化的混合物。

[0398] 检测与分析

[0399] 通常，由本文所述的“太阳能生物工厂”产生的目的产物可以通过任何标准的分析方法进行分析，例如气相色谱分析(GC)、质谱分析(MS)、气相色谱-质谱法(GCMS)和液相色谱-质谱法(LCMS)、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳、基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱(MALDI-TOF MS)、核磁共振(NMR)、近红外(NIR)光谱、粘度测定法[Knothe等，Am.Chem.Soc.Symp.Series，666：172-208(1997)]、用于测定游离脂肪酸的滴定法[Komers等， Fett/Lipid 99(2)：52-54(1997)]、酶 学 方 法[Bailer 等，J.Anal.Chem.340(3)：186(1991)]、基于物理性质的方法、湿化学方法等。

[0400] 碳指纹

[0401] 生物产生的碳基产物(如乙醇、脂肪酸、链烷烃、类异戊二烯)代表了用于燃料(如酒精、柴油和汽油)的新商品。这些生物燃料不是使用生物质，而是使用二氧化碳作为碳源产生的。这些新燃料可以基于双碳同位素指纹区别于源自石化碳的燃料。这些产物、14
衍生物及其混合物可以基于 C(fM)和双碳同位素完全地区别于其石化衍生的对应物，从而表明新的物质组成。

[0402] 碳有三个天然存在的同位素：12C、13C和14C。这些同位素占地面总碳的分数分别是-12 12 13 140.989、0.011和10 。同位素 C和 C是稳定的，而 C在半衰期是5730年的过程中自然
14 14
地衰变为 N、β粒子和反中微子。同位素 C起源于大气中，主要由于最终由宇宙辐射引
14 14
起的 N的中子轰击而产生。由于其相对较短的半衰期(在地质学的角度)，C在化石碳中
50
以极低的水平存在。在1百万年时间内不暴露于大气的情况下，只有10 分之一的部分保
14
持为 C。

[0403] 13C∶12C的比例自然的碳源中轻微地但可测量地发生变化。通常，这些差异被表13 12
示为与标准物质中 C∶ C比例的偏差。碳的国际标准是Pee Dee Belemnite，一种在南
13 13 12
卡罗来纳州发现的石灰岩形式，具有0.0112372的 C分数。对于碳源a，其 C∶ C比例与PeeDee Belemnite的偏差表示为：

[0404] δa＝(Ra/Rs)-1，其中Ra ＝天然源 中的13C∶12C比 例，和Rs ＝Pee Dee13 12
Belemnite(标准品)中的 C∶ C比例。

[0405] 为了方便，用千分比或‰表示δa。δa的负值表明与Pee Dee Belemnite相比偏12 13 14
向 C而不是 C。表3显示了几种天然碳源的δa和 C的分数。

[0406] 表3：

[0407] 天然碳源中的13C∶12C变化

[0408]

[0409]地下煤炭 32.5 Farquhar等
化石燃料 26 Farquhar等
海洋DIC* 0-1.5 Goericke等，Ivlev
大气层的CO2 6-8 Ivlev，Farquhar等
淡水的DIC* 6-14 Dettman等
Pee Dee Belemnite 0 Ivlev
*

[0410] DIC＝溶解的无机碳14 14

[0411] 生物过程中碳同位素常常表现不同。 C的自然丰度非常小，因此对 C的偏好或13 12
排斥是难以测量的。但是，良好地证明了 C和 C之间的生物区分。对于生物产物p，我们可以定义与上述类似的量：
13 12

[0412] δp＝(Rp/Rs)-1，其中Rp＝生物产物中的 C∶ C比例，和R＝Pee Dee13 12
Belemnite(标准品)中的 C∶ C比例。
13 12

[0413] 表4显示了一些生物产物中测量的 C∶ C比例变化。13 12

[0414] 表4：选定的生物产物中的 C∶ C变化

[0415]

[0416]

[0417] *D＝生物过程利用12C对13C的区别(见正文)

[0418] 表2引入了新的量，D。这是生物过程利用12C对13C的区别。我们将D定义如下：D＝(Rp/Ra)-1。

[0419] 除了我们现在将生物产物直接与碳源比较而不是与标准品比较以外，这个量与δa和δp非常相似。利用D，我们可以将碳源和生物过程的偏倚效应结合以获得生物产物与标准品相比的偏差。求解δp，我们得到：δp＝(D)(δa)+D+δa，而且由于(D)(δa)与其它项相比通常非常小，因此δp≈δa+D。

[0420] 因此对于具有其中D已知的生产过程的生物产物，我们可以通过δa和D相加估算δp。我们假设D运算与碳源无关。

[0421] 表2中已经对从化石碳产生的蓝细菌脂质和生物质这一处理。如上表中所示，从化石碳制得的蓝细菌产物(例如，废气或其它排放物的形式)将比那些从其它来源制得的相当生物产物具有较高的δp，从而在物质组成上将它们与这些其它的生物产物区分开。此14
外，任何仅仅从化石碳衍生的产物将具有可忽视分数的 C，而从地上碳制得的产物将具有-12 14
约为10 的 C分数。

[0422] 因此，在某些方面中，本发明提供了各种碳基目的产物，其特征在于约63.5至约66的-δp(‰)以及约37.5至约40的-D(‰)。

[0423] 参考资料

[0424] 1.Goericke，R.，Montoya，J.P. 和 Fry，B.Physiology of isotopic fractionation in algae and cyanobacteria.第九章，在“Stable Isotopes in Ecology and Environmental Science”中，K.Lajtha和R.H.Michener，Blackwell出版社，1994.Goericke。

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[0426] 3.Abelseon，P.H. 和 Hoering，T.C.Carbon isotope fractionation in formation of amino acids by photosynthetic organisms.Proc.Natl.Acad.Sci.47：623-32(1961)。

[0427] 4.Sakata，S.，Hayes，J.M.，McTaggart，A.R.，Evans，R.A.，Leckrone，K.J. 和Togasaki，R.K.Carbon isotopic fractionation associated with lipid biosynthesis by a cyanobacterium：relevance for interpretation of biomarker records.Geochim.Cosmochim.Acta 61：5379-89(1997)。

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[0429] 6.Farquhar，G.D.，Ehleringer，J.R. 和 Hubick，K.T.Carbon isotope discrimination and photosynthesis.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.40：503-37(1989)。

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[0431] 8.Dettman，D.L.，Reische，A.K.， 和 K.C.Lohmann.Controls on the stable isotope composition of seasonal growth bands in aragonitic fresh-water bivalves(unionidae).Geochim.Cosmochim.Acta 63：1049-1057(1999)。

[0432] 本文引用的所有出版物和专利文件在这里通过引用整体和全面地引入，就象各文献单独地表明通过引用引入一样。

[0433] 实施例

[0434] 本文所提供的下面的实例是用于说明性目的，并不意在限制。

[0435] 实施例1

[0436] 聚球藻PCC 7002种的质粒构建

[0437] pJB5的构建：以pJB5基质粒被设计为用于重组到聚球藻PCC7002种中的空表达载体。两个同源区域，即上游同源区域(UHR)和下游同源区域被设计为侧邻构建体。这些500bp的同源区域分别对应于UHR和DHR的3301-3800位和3801-4300位(Genbank登录号：NC_005025)。该aadA启动子、基因序列和终止子被设计成为 集成的构建体提供对奇霉素和链霉素的抗性。例如，pJB5被设计成具有aph2卡那霉素抗性盒启动子和核糖体结合位点(RBS)。在该启动子和RBS的下游，我们设计并插入NdeI和EcoRI的限制性核酸内切酶识别位点以及XhoI、BamHI、SpeI和PacI的位点。在EcoRI位点之后，包括来自于运动发酵单胞菌的醇脱氢酶(adhII)基因的天然终止子。方便的xbaI限制性酶切位点侧邻UHR和DHR，其允许意图用于重组的DNA与载体的其余部分切割分离。通过DNA2.0(Menlo Park、CA)的定制合成构建pJB5。

[0438] pJB5-PdcAdhII的构建：丙酮酸脱羧酶(pdc)和醇脱氢酶(adhII)基因通过以下步骤克隆到pJB5质粒中。来自于运动发酵单胞菌(Genbank：DD161475、M15394)的pdc adhII基因设计为具有NdeI位点，其取代了pdc编码区的起始点。在pdc基因之后，我们设计了两个限制性核酸内切酶位点(XhoI和BamHI)。接下来，adhII序列被设计为整个在限制性内切位点之后。最后，也包括天然的adhII终止子在插入的EcoRI位点的下游。这个构建体是通过从DNA2.0(Menlo Park、CA)的定制合成构建的，且通过NdeI和EcoRI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)的限制性消化而插入pJB5和插入序列上，然后用快速接合试剂盒(New England Biolabs；Ipswitch，MA)接合。将该接合的构建体转化到NEB 5-α F’Iq感受态大肠杆菌(高效率)(New England Biolabs：Ipswitch，MA)中。

[0439] pJB5-PdcAdhII(TS)：将源自于Zymobacter palmae的丙酮酸脱羧酶基因(pdc)(GenBank：AF474145) 和 如 Rellos 等，(1998)“Thermostable variants of Zymomonas mobilis alcohol dehydrogenase obtained using PCR-mediated random mutagenesis”Protein Expr Purif 12：61-61)中所描述的醇脱氢酶TS42(adhII)基因通过如下的步骤克隆到pJB5质粒中。这些基因被设计为具有取代pdc编码区域的起始点的NdeI位点。在pdc基因之后和adhII基因之前，存在包含XhoI和BamHI位点的间隙，以使随后插入的启动子(间隙总长度：39bp)和用于源自运动发酵单胞菌的adhII的原始RBS。adhII(运动发酵单 胞菌)基因具有后面存在的原始终止子，其中在adhII基因和终止子之间设置了EcoRI位点。在终止子之后，存在SpeI和PacI位点用于克隆。这个构建体是通过DNA2.0(Menlo Park、CA)定制合成构建的，并通过NdeI和EcoRI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)的限制性消化而插入pJB5和插入序列上，然后用快速接合试剂盒(New England Biolabs；Ipswitch，MA)接合。将该接合的构建体转化到NEB5-αF’Iq感受态大肠杆菌(高效率)(New England Biolabs：Ipswitch，MA)中。

[0440] pJB5Pdc：通过以下步骤将丙酮酸脱羧酶(pdc)基因克隆到pJB5质粒中。用BamHI和EcoRI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)消化来自实施例2的pJB5-PdcAdhII构建体。用快速平端(blunting)试剂盒(New England Biolabs，MA)将不相容的5’和3’DNA突出末端除去。然后用快速接合试剂盒(New England Biolabs；Ipswitch，MA)接合。 [0441] pJB5-AdhII：通过以下步骤将醇脱氢酶(adhII)基因克隆到pJB5质粒中。用NdeI和BamHI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)消化来自实施例2的pJB5-PdcAdhII构建体。用快速平端试剂盒(New England Biolabs，MA)将不相容的5’和3’DNA突出末端除去。然后用快速接合试剂盒(New England Biolabs；Ipswitch，MA)接合。

[0442] pJB5-metE(大肠杆菌)：通过以下步骤将源自大肠杆菌的维生素B12非依赖型蛋氨酸合成酶(metE)基因(Genbank：NP_418273.1)克隆到质粒pJB5中。通过DNA2.0(Menlo Park，CA)的定制合成构建体以包含替代metE基因起始点的NdeI位点，且包括位于基因末端的EcoRI位点。该构建体是通过NdeI和EcoRI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)的限制性消化插入pJB5和插入序列上，然后用快速接合试剂盒(New England Biolabs；Ipswitch，MA)接合。将该接合的构建体转化到NEB 5-αF’Iq感受态大肠杆菌(高效率)(New England Biolabs：Ipswitch，MA)中。

[0443] pJB5-metE(T.elongates BP-1)： 源 自 Thermosynechococcus elongates BP-1(Genbank：NP_681881)的维生素B12非依赖性蛋氨酸合成酶(metE)基因通过以下步骤被克隆到质粒pJB5中。通过DNA2.0(Menlo Park、CA)的定制合成来合成构建体以包含替代metE基因起始点的NdeI位点和位于基因末端的EcoRI位点。这个构建体通过NdeI和EcoRI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)的限制性消化而插入pJB5和插入序列上，然后用快速接合试剂盒(New England Biolabs；Ipswitch，MA)接合。将该接合的构建体转化到NEB 5-αF’Iq感受态大肠杆菌(高效率)(New England Biolabs：Ipswitch，MA)中。 [0444] 实施例2

[0445] 用于Thermosynechococcus elongates BP-1的质粒构建

[0446] Thermosynechococcus elongates BP-1被选择为另一个典型的二氧化碳固定生产宿主，并被工程核酸修饰为功能缺失某些基因和/或表达、过表达某些基因。

[0447] 四个质粒(pJB18、pJB19、pJB20和pJB21)(都是pJB5的衍生物)被构建成使其能同源重组到细长聚球藻BP-1基因组的四个不同位点中。具体地，用于pJB5中聚球菌PCC 7002种同源重组的0.5kb的上游同源(UH)和下游同源(DH)区域被下
列大约2.5kb的T.elongatus BP-1(登录号NC_004113)区域取代：对于pJB18，配合
831908-834231(UH)和834232-836607(DH)基因组；对于pJB19，配合454847-457252(UH)和457252-459740(DH)；对于pJB20，配合481310-483712(UH)和483709-486109(DH)；和对于pJB21，配合787356-789654(UH)791080-793494(DH)。前三个同源区域是基于被描述于Onai K.等，(2004).“Natural transformation of the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1：a simple and efficient method for gene transfer.”Mol.Gen.Genomics 271：50-59中整合位点TS1、TS3和TS4。最后一个被设计成完全缺失编 码糖原合成酶的glgA开放阅读框：该缺失的目的是，一旦产生乙醇的基因被整合到染色体中，使竞争性流向糖原的固定碳流最小化。

[0448] 所有的T.elongatus BP-1同源区域是按照制造商的说明使用PhusionTM热启动高保真DNA聚合酶(Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase)(由Finnzymes Oy开发及制造，由New England Biolabs，Ipswitch，MA销售)，通过PCR产生的。UH正向PCR引物有5′末端SbfI限制性位点，UH反向PCR引物有5′末端NotI限制性位点，DH正向PCR引物有5′末端AscI限制性位点，以及DH反向PCR引物有5′末端FseI限制性位点。对于pJB18、pJB19、pJB20和pJB21，首先通过用SbfI和NotI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)限制性消化载体和PCR产生的插入序列将UM区域插入pJB5中，然后使用快速接合试剂盒(New England Biolabs；Ipswitch，MA)接合。将该接合的构建体转化到NEB 5-α感受态大肠杆菌(高效率)(New England Biolabs：Ipswitch，MA)中。通过用GENEWIZ(South Plainfield，NJ)的定制测序验证pHB5中UM区域的序列。对于pJB18、pJB19、pJB20和pJB21，然后如对UM区域所做的一样将DH区域精确地插入pJB5-UH区域构建体中，除了使用限制性酶AscI和FseI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)。通过GENEWIZ(South Plainfield，NJ)的定制测序验证DH区域的序列。

[0449] 将两个不同类型的丙酮酸脱羧酶(pdc)/醇脱氢酶(adhII)操纵子各克隆到pJB18、pJB19、pJB20和pJB21中，从而建立一系列准备用于整合到T.elongatus BP-1基因组中的8个质粒。在每一种情况下，选择标记是编码抗厅霉素和链霉素抗性的pJB5 aadA基因。第一种类型的操纵子包含源自运动发酵单胞菌的pdc和adhII基因(Genbank：DD161475，M15394)，并被设计成具有覆盖pdc编码序列的起始密码子的NdeI位点。pdc基因之后顺序为：XhoI限制性内切位点、BamHI限制性内切位点、adhII编码序列、天然运动发酵单胞菌adhII终止子和最后的EcoRI限制性内切位点。第二种类型的操纵子设计成编码相对更耐热类型的丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶，包含源自 Zymobacter palmae的pdc基因(GenBank：AF474145)和在Rellos等，Protein Expr.Purif.，12：61-61(1998)中所描述的adhII突变体TS42，并且另外在所有其它方面与第一构建体相同。这两种构建体都是通过DNA2.0(Menlo Park，CA)的定制合成制备的，并通过使用NdeI和EcoRI(New England Biolabs：Ipswitch，MA)的限制性消化插入pJB18、pJB19、pJB20和pJB21中，然后用快速接合试剂盒(New England Biolabs；Ipswitch，MA)接合。通过这种方法，构建了8个pdc-adhII操纵子质粒：分别基于pJB18、pJB19、pJB20和pJB21的包含操纵子类型1的pJB22、pJB23、pJB24和pJB25，以及分别基于pJB18、pJB19、pJB20和pJB21的包含操纵子类型2的pJB26，pJB27、pJB28和pJB29。

[0450] 在质粒pJB22、pJB23、pJB24、pJB25、pJB26、pJB27、pJB28和pJB29中，pdc-adhII操纵子通过组成型PaphII启动子表达，该启动子侧邻特有的NotI和NdeI限制性内切位点。这些位点允许其它组成型启动子代替PaphII启动子克隆到其中，以防该启动子在整合到T.elongates BP-1基因组中时不能提供操纵子的充分表达。构建单独的质粒(pJB9、pJB10、pJB11、pJB12、pJB13、pJB14、pJB15、pJB16和pJB17)，其全部是通过定制合成(例如，DNA2.0(Menlo Park，CA))制备，各携带侧邻NotI和NdeI位点的9个候选的替代组成型启动子之一，以使他们能够通过标准的克隆方法取代PaphII启动子。这些启动子中的七个是原始的T.elongates BP-1启动子，对应于下列基因上游序列：cpcC、apcA、tsr2142、psaA、rbcL、hsp33和trnE_UUC，且两个是大肠杆菌型启动子：Ptac(如De Boer等，Proc Natl Acad USA80：21-25(1983)中所述)和合成的PEM7启动子。

[0451] 实施例3

[0452] 产生乙醇的工程微生物

[0453] 遗传修饰的聚球藻PCC7002种：使用下列方案将如实施例1中所描述的各个构建体整合到聚球藻PCC 7002种的基因组中。聚球藻 7002在30℃、1％CO2下，在孵育振荡烧瓶中从菌落生长48小时，至在如Frigaard NU等(2004)“Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp.PCC 7002 and the green sulfurbacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural +
transformation”Methods Mol Biol 274：325-340.中所描述的A 培养基中OD730为1。
对于各构建体，将500μL培养物添加到具有30μL的由Qiagen Qiaprep Spin Miniprep Kit(Valencia，CA)制备的1-5μg的DNA的试管中。细胞在1％的二氧化碳中以大约每2+
秒1个气泡的速率通气孵育4小时。将200μL细胞平铺在具有1.5％琼脂糖的A 培养基平板上，并在30℃在弱光中生长2天。在平板上铺垫10μg/mL的奇霉素。7-10天可观察到抗性菌落。

[0454] 穆尔氏菌HUC22-1种AdhA的菌株构建和表达：穆尔氏菌HUC22-1种AdhA序列已经被证明是利用NADP的醇脱氢酶，其也是热稳定的并且优先还原乙醛[Inokuma等，Arch.Microbiol.，188：37-45(2007)]。虽然该序列尚未公开，但其与源自热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)的AdhIV(登录号：ABC20211)的氨基酸相似性为100％。源自热醋穆尔氏菌的AdhIV(登录号：CP000232)的核酸序列对于表达进行了密码子优化，并由DNA 2.0构建和被命名为SEQ ID NO：1(编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：2)。该序列在5′端侧邻CTCGAGTTGGATCC(其编码Xho和BamHI限制性位点)，以及在3′端侧邻3′端的TTTCAAAACAGGAATTC(类似于pJB5-3)，其包含用于克隆到表达载体中的EcoRI位点。 [0455] 然后将穆尔氏菌adhA克隆到两个丙酮酸脱羧酶基因的(一个源自运动发酵单胞菌(登录号：AAV89984)和一个源自Zymobacter palmae(登录号：AAM49566))下游以分别形成表达质粒pJB136和pJB133。作为对照，构建了用于具有运动发酵单胞菌adhII的运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因(登录号：YP_163331)和具有改进的耐热adhII TS42的Z.palmae丙酮酸脱羧酶基因[Rellos等，Protein Expression and Purification，12：
61-66(1998)]的表达质粒以分别形成 pJB5-3和pJB5-4。

[0456] 使用标准的过程将质粒pJB5-3、pJB5-4、pJB133、pJB136克隆到聚球藻PCC7002(JCC1)种中，并分别命名为JCC136、JCC137、JCC445、JCC446(表5)。

[0457] 表5

[0458]

[0459] JCC1、JCC136、JCC137、JCC445、JCC446生长在A+培养平板(1.5％琼脂)上，其中100ug/mL奇霉素用于转基因株。单菌落生长在浸泡在37℃水浴中的试管中具有+100ug/mL奇霉素的10mLA 中，用1％二氧化碳通气。培养物生长至OD730nm为5.0或更高(Molecular Devices Spectramax M2e，预先确定OD730nm为1等于～0.3克CDW)，然后离心+
沉降(21,000RCF，20℃，5分钟)，在新鲜的A 培养基中重悬浮至原来的浓度，然后在125mL+
长颈振荡烧瓶中的25mL A 中适当地回稀释至OD730nm为0.2。各时间点(稀释后0、6、24、
48、72小时，由于时间间隔的原因，没有对6小时的时间点制图)取大约1mL培养物，记录OD730nm(适当地稀释至读数在0.04和0.4之间，其预先确定为Spectramax M2e的最精确的范围)。立即将样品在4℃以21,000RCF离心沉降10分钟。将上清液置于新的试管中，并在-80℃冷冻直至准备分析。

[0460] 通过使用配备顶空分析仪和火焰离子化检测器(Agilent)的 Agilent 7890气相色谱仪用J&W Scientific DB-ALC1(目录编号：123-9134；长度：30米，内径：0.320毫米，薄膜厚度：1.80um)分析各时间点的上清液的乙醇和乙醛。对100uL的各样品进行顶空分+析。测量单独的A 作为对照以及测量购自Sigma的乙醇和乙醛标准品的系列稀释液以获得标准曲线。

[0461] 为了测量光密度，将乙醇和乙醛浓缩物、培养物从OD730nm为5或更高回稀释至起始OD730nm并于设定稀释后0、24、48、72小时的时间点。

[0462] 显示了野生型和各种转基因聚球藻培养物的光学密度(图11)。曲线显示了在各个时间点的OD730nm测量值的绘图。表6中显示了获得的OD测量值。

[0463] 表6

[0464]

[0465] 对上清液中培养物的乙醇浓度绘图，从而表明在各种不同的转基因聚球藻种培养物中乙醇浓度相对于时间增加(图12)。明显地，在用穆尔氏菌adhA转化的JCC445中72小时时测量出了较高的乙醇浓度(表7)。

[0466] 表7

[0467]

[0468]

[0469] 此外，在各个不同的时间点观察用穆尔氏菌adhA转化的菌株中降低的乙醛浓度(图13和表8)。

[0470] 表8

[0471]

[0472] 在稍后的时间点，用穆尔氏菌adhA转化的菌株(JCC445和JCC446)随时间变化的培养物中所示的与基于运动发酵单胞菌的醇脱氢酶相比显示出明显的乙醇对乙醛比例的增加(图14和表9)。

[0473] 表9

[0474]

[0475]

[0476] 图15描绘了随着时间变化的培养物的乙醇-OD730nm比率。绘制了各时间点上清液中乙醇浓度与OD730nm的比率。用运动发酵单胞菌adh转化的菌株(JCC136和JCC137)的比率迅速地达到稳态，而用穆尔氏菌adhA构建体转化的菌株(JCC445和JCC446)的比例随着时间增加(表10)。

[0477] 表10

[0478]

[0479] 遗传修饰的Thermosynechococcus elongatus BP-1：从实施例2中，使用Onai K. 等 (2004).“Natural transformation of the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1：a simple and efficient method for gene transfer.”Mol.Gen.Genomics 271：50-59中详细描述的转化方法通过同源重组将pJB22、pJB23、pJB24、pJB25、pJB26、pJB27、pJB28和pJB29整合到T.elongatus BP-1的染色体中。使用的选择抗生素是奇霉素加链霉素。

[0480] 实施例4

[0481] 产生丁醇的工程微生物

[0482] 酶β-酮硫解酶(真养雷尔氏菌(R.eutropha)phaA)(EC2.3.1.16)将两个乙酰-CoA转化成乙酰乙酰-CoA和CoA。乙酰乙酰-CoA还原酶(真养雷尔氏菌phaB)(EC1.1.1.36)从乙酰乙酰-CoA和NADPH生成3-羟基丁酰CoA。烯酰基-CoA水合酶(大肠杆菌maoC)(EC 4.2.1.{17，55})从3-羟丁酰-CoA生成巴豆酰-CoA。丁酰-CoA脱氢酶(C.acetobutylicum bcd)(EC1.3.99.2)从巴豆酰-CoA生成丁酰-CoA和NAD(P)H。丁酸CoA-转移酶(真养雷尔氏菌pct)(EC2.8.3.1)从丁酰-CoA和醋酸盐生成丁酸盐和乙酰-CoA。乙醛脱氢酶(大肠杆菌adhE)(EC 1.2.1.{3，4})从丁酸盐和NADH产生丁醛。乙醇脱氢酶(大肠杆菌adhE)(EC 1.1.1.{1，2})从丁醛和NADH，NADPH生成1-丁醇。工程化宿主细胞通过表达上述酶的活性而获得生产1-丁醇能力。

[0483] 实施例5

[0484] 烷烃流增长者

[0485] 宿主生物中选择和修饰以下酶活性中的至少一个。乙酰CoA羧化酶(大肠杆菌accABCD)(EC6.4.1.2，AAN73296)将乙酰CoA和二氧化碳转化成丙二酰-CoA。酰基-CoA合成酶(大肠杆菌fadD)(EC2.3.1.86)将脂肪酸和CoA转化成酰基-CoA。酶TGL2和LipA(酿酒酵母三酰基甘油酯(triacylglycerides)脂肪酶)(EC3.1.1.3，ANCAA98876)由脂肪酸和甘油产生三酰基甘油酯。脂肪酶(酿酒酵母LipA)(EC3.1.1.3，CAA89087)也由脂肪酸和甘油产生三酰基甘油酯，并起到fabA抑制剂的作用。大肠杆菌K12 plsB D311E(AAC77011)的突变消除了对宿主生物体中酰基-CoA库的限制。删除大肠杆菌fabR(NP_418398)(脂肪酸生物合成的抑制剂)以增加不饱和脂肪酸的产生(Zhang等，J.Biol.Chem.277：pp.15558，2002)。

[0486] 实施例6

[0487] 特定长度的脂肪酸的产生

[0488] 为了产生特定的碳链长度，在宿主生物体中修饰以下酶活性的至少一个。硫酯酶(EC 3.1.2.14)从脂肪酸和ACP生成酰基-ACP。通常敲除酶大肠杆菌tesA(AAC73596，P0ADA1)以使用替代的脂肪酸C-18:1硫酯酶。根据需要产生的脂肪酸长度，表达或弱化下面的一个或多个：拟南芥fatA(NP 189147，NP 193041)；大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)fatA，C-18:1硫酯酶(CAC39106)；萼距花(Cuphea hookeriana)fatA，C-18:1硫酯酶(AAC72883)；拟南芥fatB，C-16:1硫酯酶(CAA85388)；萼距花fatB2，C-8:0至C-10:0硫酯酶(Q39513)；萼距花fatB3 C-14:0至C-16:0硫酯酶(AAC49269)；Cinnamonum camphorum fatB C-14:0硫酯酶(Q39473)；加利福尼亚桂树(Umbellularia california)fatB C-12:0硫酯酶(Q41635)。

[0489] 实施例7

[0490] 不饱和脂肪酸增加

[0491] 大肠杆菌fabM(DAA05501)的过表达可能增加不饱和脂肪酸(反-2，顺-3-癸烯酰-ACP异构酶)的产量。肺炎链球菌fabK(NP_357969)的控制表达也可以增加不饱和脂肪酸的产生(反式-2-烯酰基-ACP还原酶II)。此外，弱化或者删除大肠杆菌fabI(NP_415804)(反式-2-烯酰基-ACP还原酶)以增加不饱和脂肪酸产生。过表达fabB导致产生很大比例的不饱和脂肪酸(de Mendoza等，J.Biol.Chem.，258：2098-101(1983))。 [0492] 实施例8

[0493] 不饱和脂肪酸酯

[0494] 过表达fabA的大肠杆 菌sfa(AAN79592，AAC44390)-抑制剂，大肠杆 菌fabB(EC3.2.1.41，BAA16180)(B-酮酯酰-ACP合成酶I)、secG无效突变体抑制剂(冷休克蛋白)如大肠杆菌gnsA(ABD18647.1)和大肠杆菌gnsB(AAC74076.1)可以增加不饱和脂肪酸的产生。弱化类似于大肠杆菌fabF(YP_852193)的基因以 增加产生的C16:1的百分比。 [0495] 实施例9

[0496] 脂肪醛向烷烃的转化

[0497] 脱羰基酶将脂肪醛转化为烷烃和CO。例如，表达拟南芥cer1(NP_171723)或水稻(Oryza sativa)cer1(AAD29719)。

[0498] 实施例10

[0499] 脂肪醇向烷烃的转化

[0500] 末端醇氧化还原酶，例如，弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)M1，可以将脂肪醇转化为烷烃酰基末端醇和NADPH，再转化为烷烃。

[0501] 实施例11

[0502] 支链烷烃的产生

[0503] 步骤1涉及表达支链氨基酸氨基转移酶，如大肠杆菌ilvE(EC2.6.1.42，YP_026247)、乳酸乳球菌ilvE(EC2.6.1.42，AAF24406)、恶臭假单胞菌ilvE(EC2.6.1.42，NP_745648)、天蓝色链霉菌ilvE(EC2.6.1.42，NP_629657)。

[0504] 步骤2涉及α-酮酸氧化脱羧为支链酰基-CoA的表达，如天蓝色链霉菌bkdA1(EC1.2.4.4，NP_628006)E1α(脱羧酶元件)、天蓝色链霉菌bkdB2(EC1.2.4.4，NP_628005)E1β(脱羧酶元件)、天蓝色链霉菌bkdA3(EC1.2.4.4，NP_638004)E2(二氢硫辛酸转酰基酶(dihydrolipoyl transacylase))；或天蓝色链霉菌bkdA2(EC1.2.4.4，NP_733618)E1α(脱羧酶元件)、天蓝色链霉菌bkdB2(EC1.2.4.4，NP_628019)E1β(脱羧酶元件)、天蓝色链霉菌bkdC2(EC1.2.4.4，NP_628018)E2(二氢硫辛酸转酰基酶)；或阿维链霉菌bkdA(EC1.2.4.4，BAC72074)E1α(脱羧酶元件)、阿维链霉菌bkdB(EC1.2.4.4，BAC72075)E1β(脱羧酶元件)、阿维链霉菌bkdC(EC1.2.4.4，BAC72076)E2(二氢硫辛酸转酰基酶)；阿维链霉菌 bkdF(EC1.2.4.4，BAC72088)E1α(脱羧酶元件)、阿维链霉菌bkdG(EC1.2.4.4，BAC72089)E1β(脱羧酶元件)，阿维链霉菌bkdH(EC1.2.4.4，BAC72090)E2(二氢硫辛酸转酰基酶)；枯草芽胞杆菌bkdAA(EC1.2.4.4，NP_390288)E1α(脱羧酶元件)、枯草芽胞杆菌bkdAB(EC1.2.4.4，NP_390288)E1β(脱羧酶元件)、枯草芽胞杆菌bkdB(EC1.2.4.4，NP_390288)E2(二氢硫辛酸转酰基酶)；或恶臭假单胞菌bkdA1(EC1.2.4.4，AAA65614)E1α(脱羧酶元件)、恶臭假单胞菌bkdA2(EC1.2.4.4，AAA65615)E1β(脱羧酶元件)、恶臭假单胞菌bkdC(EC1.2.4.4，AAA65617)E2(二氢硫辛酸转酰基酶)；和大肠杆菌lpd(EC1.8.1.4，NP_414658)E3(二氢硫辛酸脱氢酶)。

[0505] 如果原始脂肪酸合成酶不能使用支链酰基CoA，可以与ACP表达具有支链酰基CoA特异性的fabH(EC2.3.1.41)β-酮脂酰-ACP(酰基载体蛋白质)合成酶III。另一种方法是与ACP表达具有支链酰基CoA特异性的FabF(EC2.3.1.41)β-酮脂酰-ACP合成酶II。 [0506] 或者，fabH与bkd基因(EC 1.2.4.4)(Denoya等，J.Bacteriol 177：pp.3504，1995)表达，其由E1α/β(脱羧酶)、E2(二氢硫辛酸转酰基酶)和E3(二氢硫辛酸脱氢酶)亚基组成，它们类似于丙酮酸和α-酮戊二酸脱氢酶复合体。

[0507] 为形成支链酰基-CoA，表达了一个或多个下列基因：

[0508] 天蓝色链霉菌fabH1 NP_626634；天蓝色链霉菌ACP NP_626635；天蓝色链霉菌fabF NP_626636；阿维链霉菌fabH3 NP_823466；阿维链霉菌fabC3 NP_823467；阿维链霉菌fabF NP_823468；枯草芽胞杆菌fabH_A NP_389015；枯草芽胞杆菌fabH_BNP_388898；枯草芽胞杆菌ACP NP_389474；枯草芽胞杆菌fabFNP_389016；嗜麦芽寡养单胞菌
SmalDRAFT_0818 ZP_01643059；嗜麦芽寡养单胞菌SmalDRAFT_0821 ZP_01643063；嗜麦芽寡养单胞菌SmalDRAFT_0822 ZP_01643064；嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)fabH YP_123672；嗜肺军团菌ACP YP_123675和嗜肺 军团菌fabF YP_123676。

[0509] 可以被表达的其它产生支链烷烃的基因包括天蓝色链霉菌CCR(EC1.1.19，NP_630556)巴豆酰-CoA还原酶、天蓝色链霉菌icmA(EC5.4.99.2，NP_629554)异丁酰(isobuturyl)-CoA变位酶大亚基和天蓝色链霉菌icmB(EC5.4.99.13，NP_630904)异丁酰-CoA变位酶小亚基；或肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)ccr(EC1.1.19，AAD53915)巴豆酰-CoA还原酶、肉桂地链霉菌icmA(EC5.4.99.2，AAC08713)异丁酰-CoA变位酶大亚基和肉桂地链霉菌icmB(EC5.4.99.13，AJ246005)异丁酰-CoA变位酶小亚基。 [0510] 步骤3包括表达支链烷烃的上述3个基因ccrr、icmA和icmB，、用bkd操纵子表达的醇还原酶活性A.baylyi acr1，其产生异戊醇、异丁醇或2-甲基丁醇。

[0511] 类似地，表达与上述基因(A.baylyi acr1醇还原酶，与上述ccr/icm基因途径表达)相关的基因产生异丁醇。

[0512] 实施例12

[0513] 可干扰支链FAS的宿主中基因的脂肪酸产生

[0514] 为了增加支链FAS，低表达fabH(EC2.3.1.41)β-酮脂酰-ACP合成酶III或低表达fabF(EC2.3.1.41)β-酮脂酰-ACP合成酶II。

[0515] 实施例13

[0516] ω-环状脂肪酸的产生

[0517] 需要表达提供环状前体环己基甲酰基CoA并可与分支容忍FAS基因一起表达的基因包括，例如，bkdC、lpd、fabH，ACP、fabF、fabH1，ACP、fabF、fabH3、fabC3、fabF、fabH_A、fabH_B，ACP。

[0518] 实施例14

[0519] 安莎三烯基因簇

[0520] 表达2-环己基甲酰基CoA异构酶Streptomyces collinus ansJK (AF268489)、S.collinusansL(AF268489)、1-环己基甲酰基CoA还原酶S.collinuschcA(U72144)和酰基CoA异构酶S.collinuschcB(AF268489)。

[0521] 实施例15

[0522] 磷氮霉素(Phoslactomycin)基因簇

[0523] 下面的基因与源自S.collinus、天蓝色链霉菌或阿维链霉菌的chcB共表达：表达源自链霉菌HK803的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶plmJK(AAQ84158)、源自链霉菌HK803的酰基CoA脱氢酶plmL(AAQ84159)、源自链霉菌HK803的烯酰基-(ACP)还原酶chcA(AAQ84160)、源自链霉菌HK803的2，4-二烯酰基-CoA还原酶plmM(AAQ84161)以及源自天蓝色链霉菌的酰基CoA异构酶chcB/caiD(NP_629292)。

[0524] 实施例16

[0525] 脂肪酸/烷烃输出

[0526] 表达烷烃转运蛋白如红串红球菌(Rhodococcus erythopolis)ansP(AAN73268)，cer5、ABC转运蛋白如拟南芥At1g51500(AY734542)、多重药物外排蛋白大肠杆菌acrAB(NP_414996.1，NP_414995.1)、外排蛋白大肠杆菌tolC(NP_417507.2)、多重药物外排蛋白大肠杆菌AcrEF(NP_417731.1，NP_417732.1)、T.elongatus BP-1 tll1618，(NP_682408.1)、T.1longatus BP-1 tll1619(NP_682409.1)、T.elongatus BP-1 tll0139(NP_680930.1)、源自果蝇、秀丽隐杆线虫的哺乳动物脂肪酸转运蛋白(FATP)、源自结核分枝杆菌的脂肪酸转运蛋白(FATP)、源自酿酒酵母的哺乳动物脂肪酸转运蛋白(FATP)、转运体不动细菌H01-N。

[0527] 实施例17

[0528] 生物柴油样生物合成

[0529] 用携带源自A.baylyi的蜡合成酶(EC：2.3.175)基因、源自萼距花的硫酯酶(EC AAC72883)基因和源自大肠杆菌的fadD基因的质粒转化蓝细菌菌株。这一重组菌株在合适的培养基中一定条件下生长在最佳温度下。通过离心将细胞和用过的培养基分离。将细胞团重新悬浮，然后用乙酸乙酯萃取细胞悬浮液和用过的培养基。对由此产生的细胞悬液和上清液的乙酸乙酯相进行GC-MS分析。用商用棕榈酸乙酯作为基准定量脂肪酸酯。也利用本文所述的方法制造脂肪酸酯，除了将甲醇或异丙醇添加到发酵培养基中，并产生预期的脂肪酸酯。

[0530] 蜡合成酶(EC2.3.1.75)由酰基-CoA和末端酰基-OH生成酰基酯。乙酰转移酶(EC2.3.1.84)将醇和乙酰CoA转化为醋酸酯和CoA。以下是将表达的典型基因：

[0531] 源自Fundibacter jadensis DSM 12178的wst9

[0532] 源自不动细菌H01-N的wshn

[0533] 源自Acinetobacter baylyi ADP1的wsadp1

[0534] 源自人的mWS

[0535] 源自小鼠(Mus musculus)(Q6E1M8)的mWS

[0536] 源自凤梨草莓(Fragaria xananassa)的SAAT

[0537] 源自苹果(Malus xdomestica)的mpAAT

[0538] 源自加州希蒙得木的JjWS

[0539] 其它用于产生生物柴油的基因示于如下的表11中：

[0540] 表11

[0541]

[0542]

[0543]

[0544] 基因和质粒：具有靶向除去酶(Genbank#NC_000913，参考：Chot和Cronan，1993)、大肠杆菌酰基-CoA合成酶fadD(Genbank #NC_000913，参考：Kameda和Nunn，1981)和源自Acinetobacter baylyi菌株的蜡合成酶(＝蜡)(Genbank#AF529086.1，参考：等，2005)的先导序列的大肠杆菌硫酯酶tesA基因购自DNA2.0接着密码子优化，检查二级结构效应，并移除除任何不需要的限制性位点(NdeI、XhoI、BamHI、NgoMIV、NcoI、SacI、BsrGI、AvrII、BmtI、MluI、EcoRI、SbfI、NotI、SpeI、XbaI、PacI、AscI、FseI)。这些基因被接收到pJ201载体上，并组装到在PaphII卡那霉素抗性盒启动子控制下的具有重组载体pJB5上的侧翼NdeI-EcoRI位点的三基因操纵子(tesA-fadD-wax，SEQ ID NO：3)中。构建另一个质粒， 其中PaphII启动子被lacIq阻抑剂(SEQ ID NO：4)控制下的Ptrc启动子取代。还制备了只具有在PaphII启动子控制下的tesA的对照质粒。这三个质粒的Joule质粒号分别是pJB494、pJB532和pJB413。

[0545] 基于pJB5的载体被设计为重组到聚球藻PCC 7002中的空表达载体。两个同源区域(上游同源区域(UHR)和下游同源区域(DHR))被设计为侧邻该构建体。这些500bp的同源区域对于UHR和DHR分别对应于位置3301-3800和3801-4300(GenBank登录号NC_005025)。该aadA启动子、基因序列和终A子被设计成赋予该整合的构建体奇霉素和链霉素抗性。为了表达，pJB5被设计成具有aph2卡那霉素抗性盒启动子和核糖体结合位点(RBS)。在该启动子和RBS的下游，我们设计和插入了NdeI和EcoRI的限制性内切酶识别位点，以及用于SpeI和PacI的位点。在EcoRI位点之后，包含源自运动发酵单胞菌(adhII)终止子的醇脱氢酶基因的天然终止子。方便的XbaI限制性内切位点侧邻UHR和DHR，从而使意图用于重组的DNA与载体的剩余部分切割。该pJB5载体的构建是通过DNA2.0(Menlo Park，CA)的定制合成。

[0546] 菌株构建：使用下列的方案将如上所述的构建体整合到聚球藻PCC 7002中的质粒pAQ1上。在培养摇瓶中，在37℃和2％的二氧化碳中，聚球藻7002由菌落生长48小时+至在如Frigaard等，Methods Mol.Biol.，274：325-340(2004)所述的A 培养基中OD730为
1。将450μL培养物添加到具有50μL的经XbaI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)消化的5μg质粒DNA的epi-管中，其中限制性消化后没有纯化。细胞在黑暗中在37℃孵育+
4小时。将全部容积的细胞平铺在具有1.5％琼脂糖的A 培养平板上，并在37℃的光照孵化器(40-60μE/m2/s PAR，用LI-250A光测量仪(LI-COR)测定)中生长约24小时。平板中垫铺25μg/mL的奇霉素。进一步孵育后7-10天可见抗性菌落，通过利用内部和外部引物的PCR确定重组菌株，以检查基因插入和确定基因在菌株中pAQ1上的位置(表12)。 [0547] 表12

[0548] 具有原始质粒pAQ1上插入基因的聚球藻7002重组菌株的

[0549] Joule培养物保藏中心(JCC)编号

[0550]JCC# 启动子 基因 标记
JCC879 PaphII --- aadA
JCC750 PaphII tesA aadA
JCC723 PaphII tesA-fadD-wax aadA
JCC803 lacIq Ptrc tesA-fadD-wax aadA

[0551] 产生乙酯的培养条件：将4个菌株中各菌株的一个菌落(表12)接种在含有+50μg/ml奇霉素和1％的乙醇(v/v)的10ml A 培养基中。将这些培养物在光(40-50μE/m2/s PAR，用LI-250A光测量仪(LI-COR)测量)下，在37℃以大约每2秒钟1-2个1％CO2/空气气泡的通气管中培养约4天。然后稀释培养物，使它们在下一天具有2-6的OD730。
用2x10ml JB 2.1/spec200清洗这些细胞，并接种到一式两份的JB 2.1/spec200+1％乙醇(v/v)中的28ml培养物中达到OD730＝0.07。将IPTG添加到JCC803培养物中至终浓度为0.5mM。将这些培养物在150rpm的振荡孵化器中于37℃，2％CO2/空气中和连续光
2
照(70-130μE m/s PAR，用LI-250A光测量仪(LI-COR)测定)下培养10天。添加无菌Milli-Q水补充经蒸发导致的水损失。每48小时向培养物添加0.5％(v/v)的乙醇以补充因蒸发造成的损失。在68和236小时时，分别从各个烧瓶中移出5ml和3ml培养物用于乙酯分析。表13中给出了培养物达到的OD730。

[0552] 表13

[0553] 聚球藻PPC 7002重组菌株在时间点68和236小时时达到的OD730

[0554]

[0555]

[0556] 用Sorvall RC6+超高速离心机(Thermo Electron Corp)和F13S-14X50CY转子(5000rpm，10分钟)使培养物试样沉淀。移除用过的培养基上清液，并将细胞重悬浮在1ml Milli-Q水中。使用台式离心机再次将这些细胞沉淀，丢弃上清液，并将细胞团保存在-80℃直至分析乙酯的存在。

[0557] 检测及定量菌株中的乙基酯：解冻细胞团，并添加含有100mg/L丁基化羟基甲苯(Sigma-Aldrich B1378)和50mg/L戊酸乙酯(Fluka 30784)的1ml等份试样的丙酮(Acros Organics 326570010)。使用巴斯德吸液管将细胞团与丙酮混合，并且10秒钟涡旋两次(总的萃取时间1-2分钟)。将该悬浮液离心5分钟以沉淀碎片，并且上清液用巴斯德吸液管移出，然后通过利用火焰离子化检测的气相色谱(GC/FID)进行分析。

[0558] 使用配备7683系列自动进样器的Agilent 7890A GC/FID检测乙基酯。将1μL的各个样品注入气相色谱入口(分流5∶1，压力：20psi，脉冲时间：0.3分钟，冲洗时间：0.2分钟，冲洗流速：15ml/min)和进样温度为280℃。色谱柱是HP-5MS(Agilent，30m×0.25mm×0.25μm)和载气为1.0ml/min的氦。在GC炉温程序为50℃，保持一分钟；
10℃/分钟提高至280℃；保持10分钟。GC/MS接口为290℃，和监测的MS范围为25至
600amu。基于C4-C24偶数碳饱和脂肪酸乙基酯的标准混合物(Supelco 49454-U)的对比，确认豆蔻酸乙酯[保留时间(rt)：17.8分钟]、棕榈酸乙酯(rt：19.8分钟)和硬脂酸乙酯(rt：21.6分钟)。通过与油酸乙酯标准(Sigma Aldrich 268011)对比确定油酸乙酯(rt：
21.4分钟)。这些确定经GC/MS(见下面详细描述的甲基酯产生)验证。使用商购的标准品建立这些乙基酯的标准曲线，并测定提取物中存在的乙基酯的浓度和将其对于戊酸乙酯(内标)的浓度标准化。

[0559] 在JCC723和JCC803的提取物中发现四种不同的乙基酯(表 14)。通常，JCC803产生JCC723的2-10倍量的各乙基酯，但是所有这些培养物中豆蔻酸乙酯仅以1mg/L或更少的量产生。在JCC879或JCC750提取物中没有发现乙基酯，表明该菌株不能天然地产生乙基酯和仅表达tesA不足以提供产生乙基酯的能力(图20)。

[0560] 表14

[0561] 以mg/L培养基给出的

[0562] JCC723的细胞沉淀提取物中发现的各乙基酯的量

[0563]

[0564] 产生甲基酯的培养条件：将JCC803的一个菌落(表1)接种在含有50μg/ml奇霉+素和1％的乙醇(v/v)的10ml A 培养基中。在光(40-50μE/m2/s PAR，用LI-250A光测量仪(LI-COR)测量)中将该培养物在37℃下，以大约每2秒钟1-2个1％CO2/空气的气泡通气的通气管中孵育3天。在含200μg/ml奇霉素和0.5mM的IPTG与0.5％甲醇或0.5％的+
乙醇(v/v)的A 培养基中，将该培养物接种到两个烧瓶中至终体积20.5ml和OD730＝0.08。
2
将这些培养物在150rpm的振动孵化器中，在37℃，2％CO2/空气和连续光照(70-130μE m/PAR，用LI-250A光测量仪(LI-COR)测量)下孵育3天。通过添加无菌Milli-Q水补充经蒸发的水损失。5ml的这些培养基(OD730＝5-6)用于分析乙基酯或甲基酯的存在。 [0565] 检测乙基-或甲基-酯：解冻细胞团，并添加含有100mg/L丁基化羟基甲苯(Sigma-Aldrich B1378)和50mg/L戊酸乙酯(Fluka 30784)的1ml等份试样的丙酮(Acros Organics 326570010)。使用巴斯德吸液管将细胞团与丙酮混合，并且10秒钟涡旋两次(总的萃取时间1-2分钟)。将该悬浮液离心5分钟以沉淀碎片，并且上清液用巴斯德吸液管移出，然后通过利用质谱检测的气相色谱(GC/MS)进行分析。

[0566] 使用配备7683系列自动进样器的Agilent 7890A GC/FID检测乙基酯。使用脉冲不分流进样将1μL各个样品注入气相色谱入口(压力：20psi，脉冲时间：0.3分钟，清洗时间：0.2分钟，清洗流速：15ml/min)和入口温度为280℃。色谱柱是HP-5MS(Agilent，30m×0.25mm×0.25μm)和载气为1.0ml/min的氦。GC炉温程序为50℃，保持一分钟；
10℃/分钟提高至280℃；保持10分钟。GC/MS接口为290℃，和监测的MS范围为25至
600amu。通过将实验确定的质谱与峰相关的质谱与在NIST 08 MS数据库中检索发现的质谱匹配峰匹配，鉴定总离子色谱中存在的峰表示的化合物。

[0567] 与乙醇一起孵育的JCC803的培养物包含棕榈酸乙酯[保留时间(rt)：18.5分钟]、十七烷酸乙酯(rt：19.4分钟)、油酸乙酯(rt：20.1分钟)和硬脂酸乙酯(rt：20.3分钟)。在与甲醇一起孵育的菌株中没有检测到乙基酯。相反，发现了棕榈酸甲酯(rt：17.8分钟)、十七烷酸甲酯(rt：18.8分钟)和硬脂酸甲酯(图21)。该菌株显然具有根据使用的醇产生甲基酯和乙基酯的能力。已知在该菌株中使用的蜡合成酶基因具有非常广泛的底物特异性( 等，2005；Kalscheuer等，2006a；Kalscheuer等，2006b)，因此JCC803可以利用各种各样的醇产生各种脂肪酸酯。

[0568] 参考资料

[0569] Cho，H. 和 Cronan，J.E.1993.Escherichia coli thioesterase I，molecular cloning and sequencing of the structural gene and identification as aperiplasmic enzyme.The Journal of Biological Chemistry 268：9238-9245. [0570] Kalscheuer，R.， T. 和 Steinbüchel，A.2006a.Microdiesel：
Escherichia coli engineered for fuel production.Microbiology 152：2529-2536. [0571] Kalscheuer，R.， T.，Luftman，H.，Malkus，U.，Reichelt，R. 和
Steinbüchel，A.2006b.Neutral lipid biosynthesis in engineered Escherichia coli：jajoba oil-like wax esters andf fatty acid butyl esters.Applied and Environmental Microbiology 72：1373-1379.

[0572] Kameda，K.和Nunn，W.D.1981.Purification and characterization of the acyl Coenzyme A synthetase from Escherichia coli.The Journal of Biological Chemistry256：5702-5707.

[0573] T.，Kalscheuer，R.，Malkus，U.，Reichelt，R. 和 Steinbüchel，A.2005.The wax ester synthase/acyl coenzyme A：diacylglycerol acyltransferase from Acinetobacter sp.strain ADP1：characterization of a novel type of acyltransferase.Journal of Bacteriology 187：1369-1376.

[0574] 实施例18

[0575] 脂肪醇生产者

[0576] 酰基CoA还原酶(EC1.2.1.50)将酰基CoA和NADPH转化为脂肪醇和CoA。表达的基因的实例包括：源自家蚕(Bombyx mori)的bfar(Q8R079)；源自Acinetobacter baylyi ADP1的acr1(AAC45217)；源自加州希蒙得木的jjfar；源自小麦(Triticum aestivum)的非特异性酰基-CoA还原酶；源自小鼠的mfar1；源自小鼠的mfar2；源自不动细菌M1的acrM1；和源自人的hfar。

[0577] 实施例19

[0578] 产生辛烷的工程微生物

[0579] 为产生特定的烷烃如辛烷，将如图1中确定的几个基因引入选定的微生物中。乙酰-CoA:ACP酰基转移酶(大肠杆菌fabH)(EC2.3.1.38)由乙酰CoA和ACP生成乙酰
基-ACP+CoA。乙酰-CoA 羧化酶(大肠杆菌accBCAD)(EC6.4.1.2)由乙酰-CoA、ATP和二氧化碳生成丙二酰-CoA。丙二酰-CoA:ACP酰基转移酶(大肠杆菌fabD)(EC2.3.1.39)从丙二酰-CoA和ACP生成丙二酰-ACP和CoA。3-酮脂酰-ACP合成酶(大肠杆菌fabB)
(EC2.3.1.41)由酰基-ACP和丙二酰-ACP生成二氧化碳和3-酮脂酰-ACP。3-酮脂酰-ACP还原酶(大肠杆菌fabG)(EC1.1.1.100)由3-酮脂酰-ACP和NADPH生成3-羟酰基-ACP。
3-羟酰基-ACP脱水酶(大肠杆菌fabA)(EC4.2.1.60)由3-羟酰基-ACP生成烯酰基-ACP。
烯酰在-ACP还原酶(大肠杆菌fabI)(EC1.3.1.{9，10})从烯酰基-ACP和NADH、NADPH生成酰基-ACP。酰基-ACP水解酶(酿酒酵母fas1)(EC3.1.2.14)从酰基-ACP生成脂肪酸和ACP。在绿脓杆菌中发现的几个醛脱氢酶(EC1.2.1.{3，4})从辛酸和NADH、NADPH生成辛醛。醇脱氢酶(运动发酵单胞菌adhI)(EC1.1.1.{1，2})由辛醛和NADH、NADPH生成1-辛醇。然后烷烃1-加单氧酶(荧光假单胞菌alkB)(EC1.14.15.3)从1-辛醇生成正辛烷、NAD(P)H和氧气。产生正辛烷为工程宿主细胞赋予上述酶的活性的表达。

[0580] 实施例20

[0581] 生产类异戊二烯

[0582] 为了产生用于生产3-甲基-丁-3-烯-1-醇和3-甲基-丁-2-烯-1-醇蓝细菌菌株，通过向载体内插入聚球藻PCC 7002的基因组DNA片段(其中包含nudF基因的编码序列和上游的基因组序列)产生质粒。

[0583] 在孵育振荡烧瓶中，在30℃和1％的CO2下，将聚球藻7002从菌落培养48小时至+在如Frigaard等，Methods Mol.Biol.274：325-340(2004)中描述的A 培养基中OD730为1。
对于各个构建体，将500μL培养物添加到具有30μL的由Qiagen Qiaprep Spin Miniprep Kit(Valencia，CA)制备的1-5μg DNA的试管中。将细胞以约每2秒1个气泡通气的1％+
二氧化碳中孵育4小时。将200μL细胞接种在含有1.5％琼脂糖的A 培养平板上，并在弱光中30℃下生长2天。10 μg/ml的奇霉素铺垫在平板上。7-10天可见抗性菌落。该培养物在旋转振荡器上振荡生长过夜。测量各培养物的OD600，并移取样品。向各个移取的样品中添加乙酸乙酯并振荡该样品。将一部分上层的乙酸乙酯相转移到干净的玻璃瓶中，用于气相色谱-质谱分析。

[0584] 用GC/MS分析样品。在使用DB-5柱(Agilent Technologies，Inc.，Palo Alto，CA)和氦载气的气相色谱上将1μL样品分离。对于各个样品的炉循环为60℃进行3分钟，以60℃/分钟增加温度到300℃的温度，在300℃保持2分钟。总的运行时间为9分钟。用质量选择检测仪，按照先前使用此GC方案测量的3-甲基-3-丁烯-1-醇和3-甲基-2-丁烯-1-醇质谱的保留时间分析该解析的样品。

[0585] 可以分别利用California Reformulated Gasoline Blendstock for Oxygen Blending(CARBOB)混合3-甲基-3-丁烯-1-醇和异戊醇以形成具有2wt％、2.7wt.％或3.5wt.％的氧含量的各种混合物。类似地，1-丁醇、乙醇、甲基叔丁基醚(MTBE)和乙基叔丁基醚(ETBE)也可以分别与CARBOB混合以形成具有2wt％、2.7wt.％或3.5wt.％的氧含量的各种混合物。检验混合物的API重力值、研究法辛烷值、马达法辛烷值、抗爆指数、蒸气压数据、净燃烧热、耐水性数据和蒸汽-液体比。

[0586] 实施例21

[0587] 生产对苯二甲酸的工程微生物

[0588] 2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸(2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonate)醛缩酶大肠杆菌aroF(EC2.5.1.54)从PEP和D-赤藓糖-4-磷酸生成3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸(heptulosonate)-7-磷酸。3-脱氢奎尼酸合成酶大肠杆菌aroB(EC4.2.3.4)从3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸生成3-脱氢奎尼酸。3-脱氢奎尼酸脱水酶大肠杆菌aroD(EC4.2.1.10)从3-脱氢奎尼酸生成3-脱氢莽草酸。源自不动细菌ADP1的3-脱氢莽草酸脱水酶quiC(EC 4.2.1.n)从3-脱氢莽草酸生成原儿茶酸。源自红球菌RHA1的β-酮己二酸单酰CoA合成酶pcaF(EC 2.3.1.174)从 乙酰-CoA和琥珀酰-CoA生成β-酮己二酸单酰CoA和CoA。源自恶臭假单胞菌的β-酮己二酸CoA转移酶pcaIJ(EC2.8.3.6)从β-酮己二酸单酰-CoA和琥珀酸生成β-酮己二酸和琥珀酰-CoA。3-氧代己二酸烯醇内酯水解酶红球菌RHA1 pcaL EC3.1.1.24从β-酮己二酸生成β-酮己二酸烯醇内酯。
4-羧基粘康酸内酯脱羧酶红球菌RHA1 pcaL(EC4.1.1.44)从β-酮己二酸烯醇内酯和CO2生成γ-羧基-粘康酸内酯。γ-羧基-顺，顺-粘康酸酯环异构酶红球菌RHA1pcaB(EC
5.5.1.2)从γ-羧基-粘康酸内酯生成β-羧基-顺，顺-粘康酸。源自红球菌RHA1的原儿茶酸3，4-加双氧酶pcaGH(EC1.13.11.3)从β-羧基-顺，顺-粘康酸生成原儿茶酸。
原儿茶酸1，2-顺-二氢二醇脱氢酶红球菌RHA1tpaC(EC1.3.1.n)从原儿茶酸、二氧化碳和NADPH生成DDT。对苯二甲酸1，2-加双氧酶红球菌RHA1 tpaAB(EC 1.14.12.15)将DDT转化为对苯二酸、NADH和氧气。

[0589] 实施例22

[0590] 生产1，3-丙二醇的工程微生物

[0591] sn-甘油-3-P脱氢酶酿酒酵母dar1(EC 1.1.1.{8，94})从二羟基丙酮-P和{NADH、NADPH}生成sn-甘油-3-P。sn-甘油-3磷酸酶酿酒酵母gpp2(EC3.1.3.21)从sn-甘油-3-P生成甘油。甘油脱水酶肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)dhaB1-3(EC4.2.1.30)从甘油生成3-羟基丙醛。1，3-丙二醇氧化还原酶肺炎克雷伯氏菌dhaT(EC 1.1.1.202)将3-羟基丙醛和NADH转化成1，3-丙二醇。

[0592] 实施例23

[0593] 生产1，4-丁二醇的工程微生物

[0594] 琥珀酰CoA脱氢酶克氏梭菌(C.Kluyveri)sucD(EC1.2.1.n)由琥珀酰CoA和NADPH生成琥珀酸。4-羟基丁酸脱氢酶拟南芥ghbdh(EC1.1.1.2)由琥珀酸半醛和NADPH生成4-羟基丁酸。谷氨酸脱氢酶大肠杆菌gdhA(EC1.4.1.4)从α-酮戊二酸、NH3和NADPH生 成谷氨酸。谷氨酸脱羧酶大肠杆菌gadA(EC4.1.1.15)从谷氨酸生成4-氨基丁酸和二氧化碳。4-氨基丁酸转氨酶大肠杆菌gabT(EC2.6.1.19)由4-氨基丁酸和α-酮戊二酸生成谷氨酸和琥珀酸半醛。醛脱氢酶大肠杆菌aldH(EC1.1.1.n)由4-羟基丁酸和NADH生成4-羟基丁醛。1，3-丙二醇氧化还原酶肺炎克雷伯氏菌dhaT(EC1.1.1.202)从4-羟基丁醛和NADH生成1，4-丁二醇。该方案在图8中图示。图8还图示了可以被敲除(如果已存在于宿主细胞中)以提高1，4-丁二醇合成效率的基因。这些基因通过“X”识别。将被过表达的基因在图8中用彩色箭头标示。

[0595] 实施例24

[0596] 产生PHB的工程微生物

[0597] B-酮硫解酶(真养雷尔氏菌phaA)(EC2.3.1.16)将2个乙酰CoA转化成乙酰乙酰CoA和CoA。乙酰乙酰CoA还原酶(真养雷尔氏菌phaB)(EC1.1.1.36)从乙酰乙酰CoA和NADPH生成3-羟基丁酰CoA。PHA合成酶(真养雷尔氏菌phaC)从3-羟基丁酰CoA生成PHB和CoA。

[0598] 产生聚羟基丁酸酯(PHB)：自然界中PHB由微生物作为碳储备产生，其通常在碳充足和其它某些营养物受到限制的条件下产生。在所有已知的实例中，PHB是在细胞内合成，而不分泌到培养基中。PHB在三步的酶促途径中由乙酰CoA产生，其中该途径由将两分子的乙酰CoA转化成一分子的乙酰乙酰CoA和一分子的游离CoA乙酰CoA:乙酰CoA C-乙酰基转移酶(EC2.3.1.9)、以NADPH为代价将乙酰乙酰CoA还原成(R)-3-羟基丁酰-CoA+的(R)-3-羟酰基-CoA:NADP 氧化还原酶(EC1.1.1.36)和通过将添加各(R)-3-羟基丁酰-CoA单元到增长的链上并释放游离的CoA而聚合(R)-3-羟基丁酰-CoA单元的聚羟基链烷酸合成酶(EC2.3.1.-)组成。

[0599] 天然地生产PHB的微生物也具有通过一个或多个聚[(R)-3-羟基丁酸]水解酶(EC3.1.1.75)酶(更普遍地称为解聚酶)降解它的能 力。当出现适当的条件(如碳限制)时，表达或激活这些酶以利用储存的碳和能量。在非天然的生产者中PHB途径的表达往往导致不可逆的PHB积累，因为该非天然生产者缺乏解聚酶活性。

[0600] 检测PHB的方法：可以通过从整个细胞溶剂萃取和酯化聚合物测量细胞内PHB。通常，用甲醇-氯仿(以10％盐酸作为催化剂)提取冻干的生物质。氯仿溶解聚合物，且甲醇在盐酸存在下酯化聚合物。用水提取由此产生的混合物以去除亲水性物质，并用气相色谱分析有机相。

[0601] 产生PHB的工程微生物：在适当的启动子的控制下，在宿主细胞中表达源自真养雷尔氏菌H16的phaCAB操纵子。这类启动子的实例包括aphII、cpcB、cI和lacIq trc启动子。该操纵子通过同源重组被置于pAQ1、pAQ7上或位于染色体上的合适位点。 [0602] pJB528的构建：从GenBank(NC008313，真养雷尔氏菌H16染色体1)获得编码真养雷尔氏菌H16的PHB操纵子的DNA序列(phaCAB)。单个基因(基因基因座标签H16_A1437，H16_A1438和H16_A1439)各进行密码子优化以用于在大肠杆菌中表达。然后，将这些基因重组(recast)成phaCAB形式的操纵子，但在基因之间有合适的限制性内切位点。该优化的phaCAB操纵子是通过DNA 2.0(Menlo Park，CA)的定制合成而获得的。该phaCAB操纵子被设计为具有包含部分起始密码子的NdeI位点和位于终止密码子之后的EcoRI位点。通过用NdeI和EcoRI限制性消化将该构建体从其主架载体移除，并通过接合将其插入已经用同样的酶消化的pAQ1插入载体pJB496(SEQ ID NO：5)中。将该接合的构建体，pJB528，转化到大肠杆菌CopyCutter(Epicentre；Madison，WI)。随后转化到大肠杆菌NEB5α(New England Biolabs；Ipswich，MA)中产生用光学显微镜通过肉眼检查很明显的细胞内PHB颗粒。

[0603] 实施例25

[0604] 产生丙烯酸的工程微生物

[0605] 烯酰其-CoA水合酶(大肠杆菌paaF)(EC4.2.1.17)将3-羟基丙酰-CoA转化为丙烯酰-CoA。丙烯酸CoA-转移酶(真养雷尔氏菌pct)(EC2.8.3.n)由丙烯酰-CoA和乙酸生成丙烯酸+乙酰CoA。

[0606] 实施例26

[0607] 产生ε-己内酯的工程微生物

[0608] 乙酰-CoA:ACP转酰酶大肠杆菌fabH(EC2.3.1.38)从乙酰-CoA和ACP生成乙酰-ACP和CoA。乙酰CoA羧化酶大肠杆菌accBCAD(EC6.4.1.2)生成丙二酰-CoA乙酰-CoA、ATP和二氧化碳。丙二酰CoA:ACP转酰酶大肠杆菌fabD(EC2.3.1.39)从丙二酰-CoA和ACP生成丙二酰-ACP和CoA。3-酮脂酰-ACP合成酶大肠杆菌fabB(EC2.3.1.41)从酰基-ACP和丙二酰-ACP生成二氧化碳和3-酮脂酰-ACP。3-酮脂酰-ACP还原酶大肠杆菌fabG(EC1.1.1.100)从3-酮脂酰-ACP和NADPH生成3-羟酰基-ACP。3-羟酰基-ACP脱
水酶大肠杆菌fabA(EC4.2.1.60)从3-羟酰基-ACP生成烯酰基-ACP。烯酰基-ACP还原酶大肠杆菌fabI(EC 1.3.1.{9，10})从烯酰基-ACP和{NADH、NADPH}生成酰基-ACP。酰基-ACP水解酶酿酒酵母FAS1(EC 3.1.2.14)从酰基-ACP生成脂肪酸和ACP。脂肪酸加单氧酶食油假单胞菌(P.oleovorans)alkB(EC1.14.15.3)从脂肪酸、NADPH和氧气生成ω-羟基链烷酸。1，6-内酯酶(EC 3.1.1.n)将6羟基己酸转化成ε-己内酯。

[0609] 实施例27

[0610] 产生异戊二烯的工程微生物

[0611] 1-脱氧D-木酮糖-5-磷酸合成酶大肠杆菌dxs(EC2.2.1.7)从丙酮酸和D-甘油醛-3-P生成1-脱氧D-木酮糖-5-P和二氧化碳。1-脱氧D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶大肠杆菌dxr(EC 1.1.1.267)从1-脱氧-D-木酮糖-5-P+NADPH生成2-C-甲基-D-赤藓醇-4-P。2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胞苷酰转移酶大肠杆菌ispD(EC2.7.7.60)从CTP+2-C-甲 基-D-赤藓醇-4-P生成4-(胞苷-5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇。4-(胞
苷-5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶大肠杆菌ispE(EC2.7.1.148)从ATP和4-(胞苷-5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇生成2-P-4-(胞苷-5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇。
2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合成酶大肠杆菌ispF(EC4.6.1.12)从2-P-4-(胞苷
5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇生成2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环-PP+CMP。4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶大肠杆菌ispG(EC1.17.4.3)从2-C-甲基-D-赤藓醇-2，
4-环-PP生成(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-PP。4-羟基-3-甲基丁-2-烯基
二磷酸还原酶大肠杆菌ispH(EC1.17.1.2)从(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-PP
和NADPH生成异戊烯基-PP和NADP。4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶大肠杆菌ispH(EC1.17.1.2)从(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-PP和NADPH生成二甲基烯丙基-PP+NADP。异戊烯基-二磷酸Δ-异构酶大肠杆菌isi(EC5.3.3.2)将二甲基烯丙基-PP转化成异戊烯基-PP。

[0612] 实施例28

[0613] 产生橡胶的工程微生物

[0614] 橡胶是通过来自巴西橡胶树的顺聚异二烯顺转移酶(EC2.5.1.20)产生的，其中该酶将异戊烯基-PP转化为橡胶。

[0615] 实施例29

[0616] 产生乳酸的工程微生物

[0617] 乳酸脱氢酶大肠杆菌ldhA(EC1.1.1.28)将NADH和丙酮酸转化为D-乳酸。 [0618] 实施例30

[0619] 产生DHA的工程微生物

[0620] DHA激酶弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)dhaK(EC2.7.1.29)将二羟基丙酮和ATP转化为二羟丙酮-P。

[0621] 实施例31

[0622] 产生3-羟基丙酸的工程微生物

[0623] 乙酰-CoA羧化酶大肠杆菌accBCAD(EC6.4.1.2)由乙酰CoA、ATP和二氧化碳生成丙二酰-CoA(参见，例如，图5中所示的途径)。源自橙色绿曲挠菌(C.aurantiacus)的双功能丙二酰-CoA还原酶(EC1.2.1.18，1.1.1.59)将丙二酰-CoA和2NADPH转化成3-羟基丙酸和CoA。

[0624] 实施例32

[0625] 产生γ-戊内酯的工程微生物

[0626] 源自巴斯德梭菌(C.pasteurianum)的2-氧代丁酸合成酶(EC 1.2.7.2)将丙酰-CoA、二氧化碳和2个Fdred转化成2-氧代丁酸、CoA和2个FDox。源自酿酒酵母的2-乙基苹果酸合成酶(EC2.3.3.6)从2-氧代丁酸和乙酰CoA生成(R)-2-乙基苹果酸+CoA。乌头酸酶类似物由(R)-2-乙基苹果酸生成3-羧基-4-羟基戊酸。异柠檬酸脱氢酶将3-羧基-4-羟基戊酸转化成乙酰丙酸。乙酰乙酰CoA还原酶类似物真养雷尔氏菌ler从乙酰丙酸和NAD(P)H生成4-羟基戊酸。源自褐鼠(R.norvegicus)的1，4-内酯酶(EC3.1.1.25)从4-羟基戊酸生成γ-戊内酯。

[0627] 或者，乙酰-CoA羧化酶大肠杆菌accBCAD(EC6.4.1.2)将乙酰CoA、ATP和二氧化碳转化成丙二酰CoA。源自橙色绿曲挠菌的双功能丙二酰-CoA还原酶(EC1.2.1.18，1.1.1.59)将丙二酰CoA和2NADPH转化成3-羟基丙酸和CoA。烯酰基-CoA水合酶大肠杆菌paaF(EC4.2.1.17)从3-羟基丙酰-CoA生成丙烯酰-CoA。酰基-CoA脱氢酶拟南芥At3G06810(EC1.3.99.3)从丙烯酰-CoA和FADH2生成丙酰-CoA。β-酮硫解酶真养雷尔氏菌bktB(EC2.3.1.16)从丙酰-CoA和乙酰-CoA生成3-酮戊酰-CoA和CoA。乙酰乙酰CoA还原酶真养雷尔氏菌phaB(EC 1.1.1.36)从3-酮戊酰-CoA和NADPH生成(R)-3-羟基戊酰-CoA。3-羟基丁酰-CoA脱氢酶地毯草黄单胞菌(X.axonopodis)crt(EC4.2.1.55)从(R)-3-羟基戊酰-CoA生成3-戊烯酰-CoA。乙烯基 乙酰-CoAΔ-异构酶艰难梭菌
(C.difficile)abfD(EC5.3.3.3)从3-戊烯酰-CoA生成4-羟基戊酰-CoA。4-羟基丁
酰-CoA转移酶克氏梭菌orfZ(EC2.8.3.n)将4-羟基戊酰-CoA和乙酸转化成乙酰CoA和
4-羟基戊酸。源自褐鼠的1，4-内酯酶(EC 3.1.1.25)从4-羟基戊酸生成γ-戊内酯。 [0628] 实施例33

[0629] 产生赖氨酸的工程微生物

[0630] 天门冬氨酸氨基转移酶大肠杆菌aspC(EC2.6.1.1)从草酰乙酸和L-谷氨酸生成L-天门冬氨酸和α-酮戊二酸。天门冬氨酸激酶大肠杆菌lysC(EC2.3.3.14)从L-天门冬氨酸和ATP生成L-天冬氨酰-4-P。天门冬氨酸半醛脱氢酶大肠杆菌
asd(EC1.2.1.11)从L-天门冬氨酸-半醛生成NADPH+L-天冬氨酰-4-磷酸。二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶大肠杆菌dapA(EC4.2.1.52)从丙酮酸和L-天门冬氨酸半醛生成L-2，3-二氢吡啶二羧酸。二氢吡啶二羧酸还原酶大肠杆菌dapB(EC1.3.1.26)由L-2，3-二氢吡啶二羧酸和NADPH生成四氢吡啶二羧酸(tetrahydrodipicolinate)。四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶大肠杆菌dapD(EC2.3.1.117)从四氢吡啶二羧酸和琥珀酰-CoA生成N-琥珀酰-2-氨基-6-酮庚二酸和CoA。N-琥珀酰二氨基庚二酸-氨基转移酶大肠杆菌argD(EC2.6.1.17)从L-谷氨酸和N-琥珀酰-2-氨基-6-酮庚二酸生成α-酮戊二酸和N-琥珀酰-L，L-2，6-二氨基庚二酸。N-琥珀酰-L-二氨基庚二酸脱琥珀酰酶大肠杆菌dapE(EC3.5.1.18)从N-琥珀酰-L，L-2，6-二氨基庚二酸生成L，L-二氨基庚二酸和琥珀酸。二氨基庚二酸差向异构酶大肠杆菌dapF(EC5.1.1.7)从L，L-二氨基庚二酸生成内消旋-二氨基庚二酸。二氨基庚二酸脱羧酶大肠杆菌lysA(EC4.1.1.20)从内消旋-二氨基庚二酸生成L-赖氨酸和二氧化碳。

[0631] 或者，代替dapD(EC2.3.1.117)、argD(EC2.6.1.17)、dapE(EC3.5.1.18)，利用LL-二氨基庚二酸氨基转移酶拟南芥At4g33680(EC2.6.1.83)从四氢吡啶二羧酸和α-酮戊二酸生成L，L-二氨基庚二酸和L-谷氨酸。高柠檬酸合成酶酿酒酵母lys21(EC2.3.3.14)从乙 酰CoA和α-酮戊二酸生成高柠檬酸和CoA。顺乌头酸酶酿酒酵母lys4、lys3(EC4.2.1.36)从高柠檬酸和高-顺-乌头酸生成同分异构柠檬酸(homoisocitrate)。
同分异构柠檬酸脱氢酶酿酒酵母ly12、lys11、lys10(EC1.1.1.87)从同分异构柠檬酸生成
2-氧代己二酸和二氧化碳+NADH。2-氨基己二酸转氨酶酿酒酵母ARO8(EC2.6.1.39)从
2-氧代己二酸和L-谷氨酸生成L-2-氨基己二酸和α-酮戊二酸。2-氨基己二酸还原酶酿酒酵母lys2、lys5(EC1.2.1.31)从L-2-氨基己二酸和NAD(P)H生成L-2-氨基己二酸
6-半醛。氨基己二酸半醛-谷氨酸还原酶酿酒酵母lys9、lys13(EC1.5.1.10)由L-谷氨酸和L-2-氨基己二酸6-半醛和NADPH生成N6-(L-1，3-二羧基丙基)-L-赖氨酸和NADP。赖氨酸-2-氧工戊二酸还原酶酿酒酵母lys1(EC1.5.1.7)从N6-(L-1，3-二羧基丙基)-L-赖氨酸生成L-赖氨酸和α-酮戊二酸和NADH。

[0632] 实施例34

[0633] 产生丝氨酸的工程微生物

[0634] 磷酸甘油酸酯脱氢酶大肠杆菌serA(EC1.1.1.95)从3-P-D-甘油酸生成3-膦酰氧基丙酮酸和NADH。磷酸丝氨酸转氨酶大肠杆菌serC(EC2.6.1.52)从-P-L-丝氨酸+α-酮戊二酸生成3-膦酰基氧基丙酮酸+L-谷氨酸。磷酸丝氨酸磷酸酶大肠杆菌serB(EC3.1.3.3)将正-P-L-丝氨酸转化成L-丝氨酸。

[0635] 实施例35

[0636] 产生天门冬氨酸的工程微生物

[0637] 天门冬氨酸氨基转移酶大肠杆菌aspC(EC2.6.1.1)将草酰乙酸和L-谷氨酸转化成L-天门冬氨酸和α-酮戊二酸。

[0638] 实施例36

[0639] 产生山梨醇的工程微生物

[0640] 山梨醇(来自F6P)葡萄糖-6-磷酸异构酶大肠杆菌pgi (EC5.3.1.9)将D-β-果糖-6-磷酸转化成D-α-葡萄糖-6-磷酸。

[0641] 磷酸葡萄糖变位酶大肠杆菌pgm(EC5.4.2.2)将D-α-葡萄糖-6-磷酸转化为D-α-葡萄糖-1-磷酸。葡萄糖-1-磷酸酶大肠杆菌agp(EC3.1.3.10)将转换D-α-葡萄糖-1-磷酸转化为D-α-葡萄糖。

[0642] 或者外，醛糖-1-差向异构酶大肠杆菌galM(EC5.1.3.3)将D-β-葡萄糖转化为D-α-葡萄糖。多元醇脱氢酶酿酒酵母GRE3(EC1.1.1.21)从D-α-葡萄糖和NADPH生成D-山梨醇。

[0643] 实施例37

[0644] 产生抗坏血酸的工程微生物

[0645] α-D-葡萄糖-6-磷酸酮醇异构酶拟南芥PGI1(EC5.3.1.9)从D-α-葡萄糖-6-磷酸生成β-D-果糖-6磷酸。D-甘露糖-6-磷酸酮醇异构酶拟南芥din9(EC5.3.1.8)将β-D-果糖-6-P转化为D-甘露糖-6-P。D-甘露糖-6-磷酸1，6-磷酸变位酶拟南芥atpmm(EC5.4.2.8)将D-甘露糖-6-P转化为D-甘露糖-1-P。甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶拟南芥cyt(EC2.7.7.22)将D-甘露糖-1-P转化为GDP-甘露糖。GDP-甘露糖3，5-差向异构酶拟南芥gme(EC5.1.3.18)将GDP-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖。半乳糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶拟南芥VTC2(EC2.7.n.n)将GDP-L-半乳糖转化为L-半乳糖-1-P。L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶拟南芥VTC4(EC3.1.3.n)将L-半乳糖-1-P转化为L-半乳糖。L-半乳糖脱氢酶拟南芥At4G33670(EC1.1.1.122)将L-半乳糖转化为L-1，4-半乳糖酸内酯和NADH。L-半乳糖酸内酯氧化酶酿酒酵母ATGLDH(EC1.3.3.12)将L-1，4-半乳糖酸内酯和O2转化为抗坏血酸和H2O2。过氧化氢酶大肠杆菌katE(EC1.11.1.6)(2H2O2＝＞O2)将过氧化氢转化为氧气。

[0646] 实施例38

[0647] 产生头孢菌素的工程微生物

[0648] 高柠檬酸合成酶酿酒酵母lys21(EC2.3.3.14)将乙酰-CoA和α-酮戊二酸转化为高柠檬酸和CoA。

[0649] 顺乌头酸酶酿酒酵母lys4、lys3(EC4.2.1.36)生成高柠檬酸或高-顺-乌头酸酯或同分异构柠檬酸。同分异构柠檬酸脱氢酶酿酒酵母lys12、lys11、lys10(EC 1.1.1.87)从同分异构柠檬酸生成2-氧代己二酸和二氧化碳和NADH。2-氨基己二酸转氨酶酿酒酵母aro8(EC2.6.1.39)将2-氧代己二酸和L-谷氨酸转化为L-2-氨基己二酸和α-酮戊二酸。磷酸甘油酸脱氢酶大肠杆菌serA(EC1.1.1.95)将3-P-D-甘油酸转化为3-膦酰氧基丙酮酸和NADH。磷酸丝氨酸转氨酶大肠杆菌serC(EC2.6.1.52)将正-P-L-丝氨酸和α-酮戊二酸转化为3-膦酰氧基丙酮酸和L-谷氨酸。磷酸丝氨酸磷酸酶大肠杆菌serB(EC3.1.3.3)将正-P-L-丝氨酸转化为L-丝氨酸。丝氨酸O-乙酰基转移酶拟南芥AtSerat2；
1(EC2.3.1.30)将乙酰-CoA和L-丝氨酸转化为CoA和O-乙酰基-L-丝氨酸。半胱氨酸合成酶拟南芥At1G55880(EC2.5.1.47)将O-乙酰基-L-丝氨酸转化为L-半胱氨酸和乙酸。乙酰乳酸合成酶大肠杆菌ilvN，ilvB(EC2.2.1.6)将丙酮酸转化为二氧化碳和2-乙酰乳酸。乙酰羟酸异构还原酶大肠杆菌ilvC(EC1.1.1.86)将2-乙酰乳酸和NADPH转化为2，3-二羟基异戊酸。二羟酸脱水酶大肠杆菌ilvD(EC4.2.1.9)将2，3-二羟基异戊酸转化为2-酮异戊酸。缬氨酸转氨酶大肠杆菌ilvE(EC2.6.1.42)将2-酮异戊酸和L-谷氨酸转化为α-酮戊二酸和L-缬氨酸。ACV合成酶多变鱼腥藻(A.variabilis)Ava_1613(EC6.3.2.26)将3ATP、L-2-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸转化为N-[L-5-氨基-5-羧基戊酰基]-L-半胱氨酰-D-缬氨酸。异青霉素-N合成酶多变鱼腥藻Ava_5009将N-[L-5-氨基-5-羧基戊酰基]-L-半胱氨酰-D-缬氨酸和O2转化为异青霉素-N。异青霉素-N差向异构酶黄色粘球菌(M.xanthus)cefD(EC5.1.1.17)将异青霉素-N转化为青霉素-N。头孢菌素生物合成扩环酶/羟化酶顶头孢霉菌(C.acremonium)cefEF(EC1.14.20.1，1.14.11.26)将青霉素-N、
2个α-酮戊二酸和2个O2转化为去乙酰头孢菌素C、2个琥珀酸酯和2个二氧化碳。然后去乙酰头孢菌素-C乙酰基转移酶顶头孢霉菌cefG(EC2.3.1.175)从乙酰CoA和去乙酰头孢菌素C生成CoA和头孢菌素C。

[0650] 实施例39

[0651] 产生异戊烯醇的工程微生物

[0652] 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶大肠杆菌dxs(EC2.2.1.7)将丙酮酸和D-甘油醛-3-P转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-P和二氧化碳。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶大肠杆菌dxr(EC1.1.1.267)将1-脱氧-D-木酮糖-5-P和NADPH转化为2-C-甲基-D-赤藓醇-4-P。2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶大肠杆菌ispD(EC2.7.7.60)将CTP和2-C-甲基-D-赤藓醇4-P转化为4-(胞苷-5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇。
4-(胞苷-5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶大肠杆菌ispE(EC2.7.1.148)将ATP和
4-(胞苷-5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇转化为2-P-4-(胞苷5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇。2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合成酶大肠杆菌ispF(EC4.6.1.12)将2-P-4-(胞苷-5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇转化为2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环-PP和CMP。4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶大肠杆菌ispG(EC1.17.4.3)将2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环-PP转化为(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-PP。4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶大肠杆菌ispH(EC1.17.1.2)将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-PP和NADPH转化为异戊烯基-PP。4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶大肠杆菌
ispH(EC1.17.1.2)将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-PP和NADPH转化为二甲基烯丙基-PP。异戊烯基-二磷酸Δ-异构酶大肠杆菌idi(EC5.3.3.2)将二甲基烯丙基-PP转化为异戊烯基-PP。异戊烯基-PP焦磷酸酶将异戊烯基-PP转化为异戊烯醇。异戊烯醇双激酶将异戊烯基-PP转化为异戊烯醇和ATP。

[0653] 羟甲基戊二酰-CoA合成酶酿酒酵母erg13(EC2.3.3.10)将乙酰CoA和乙酰乙酰CoA转化为成(S)-3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA和CoA。羟甲基戊二酰-CoA还原酶酿酒酵母hmg2(EC1.1.1.34)将(R)-甲羟戊酸和CoA转化为(S)-3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA和2NADPH。甲羟戊酸激酶酿酒酵母erg12(EC2.7.1.36)将ATP和(R)-甲羟戊酸转化为(R)-5-P-甲羟戊酸。磷酸甲羟戊酸激酶酿酒酵母erg8(EC2.7.4.2) 将ATP和(R)-5-P-甲羟戊酸转化为(R)-5-PP-甲羟戊酸。二磷酸甲羟戊酸脱羧酶酿酒酵母mvd1(EC4.1.1.33)将ATP和(R)-5-PP-甲羟戊酸转化为异戊烯基-PP和二氧化碳。

[0654] 实施例40

[0655] 产生羊毛甾醇的工程微生物

[0656] 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶大肠杆菌dxs(EC2.2.1.7)将丙酮酸和D-甘油醛-3-P转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-P和二氧化碳。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶大肠杆菌dxr(EC1.1.1.267)将1-脱氧-D-木酮糖-5-P和NADPH转化为2-C-甲基-D-赤藓醇-4-P。2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶大肠杆菌ispD(EC2.7.7.60)将CTP和2-C-甲基-D-赤藓醇-4-P转化为4-(胞苷-5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇。
4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶大肠杆菌ispE(EC2.7.1.148)将ATP和
4-(胞苷-5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇转化为2-P-4-(胞苷5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇。2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合成酶大肠杆菌ispF(EC4.6.1.12)将2-P-4-(胞苷5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇转化为2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环-PP和CMP。
4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶大肠杆菌ispG(EC1.17.4.3)将2-C-甲
基-D-赤藓醇-2，4-环-PP转化为(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-PP。4-羟
基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶大肠杆菌ispH(EC1.17.1.2)将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-PP和NADPH转化为异戊烯基-PP。4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶大肠杆菌isp(EC1.17.1.2)转化(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-PP+NADPH＝二甲基烯丙基-PP。异戊烯基-二磷酸Δ-异构酶大肠杆菌idi(EC5.3.3.2)将二甲基烯丙基-PP转化为异戊烯基-PP。香叶酰香叶酰焦磷酸合成酶集胞藻PCC6803crtE(EC2.5.1.29)将二甲基烯丙基-PP和2个异戊烯基-PP转化为法呢基-PP。角鲨烯合成酶集胞藻
PCC6803s110513(EC2.5.1.21)将2个法呢基-PP和NADPH转化为角鲨烯。角鲨烯加单氧酶酿酒酵母erg1(EC1.14.99.7)将角鲨烯、NADPH和氧气转化为(S)-角鲨烯-2，3- 环氧化物。羊毛甾醇合成酶酿酒酵母ERG7(EC5.4.99.7)将(S)-角鲨烯-2，3-环氧化物转化为羊毛甾醇。

[0657] 实施例41

[0658] 产生ω-3DHA的工程微生物

[0659] 为了工程化产生ω3-DHA的微生物，必要的基因是pfaABCDE，其中一些是多功能的。乙酰-CoA:ACP转酰酶S.pneumatophori(EC2.3.1.38)将乙酰CoA和ACP转化为乙酰ACP+CoA。乙酰CoA羧化酶大肠杆菌(EC6.4.1.2)将乙酰CoA、ATP和二氧化碳转化为丙二酰-CoA。丙二酰-CoA:ACP转酰酶大肠杆菌(EC2.3.1.39)将丙二酰-CoA和ACP转化为丙二酰ACP和CoA。3-酮脂酰-ACP合成酶大肠杆菌(EC2.3.1.41)将酰基-ACP和丙二酰-ACP转化为二氧化碳和3-酮脂酰-ACP。3-酮脂酰-ACP还原酶大肠杆菌(EC1.1.1.100)将3-酮脂酰-ACP和NADPH转化为3-羟酰基-ACP。3-羟酰基-ACP脱水酶大肠杆菌(EC4.2.1.60)将3-羟酰基-ACP转化为烯酰基-ACP。烯酰基-ACP还原酶大肠杆菌(EC 1.3.1.{9，10})将烯酰基-ACP和{NADH，NADPH}转化为酰基-ACP。去饱和酶S.pneumatophori(EC1.14.19.n)将m:n脂肪酸、NADPH和O2转化为m:(n+1)脂肪酸。酰基-ACP水解酶酿酒酵母FAS1(EC3.1.2.14)将酰基-ACP转化为脂肪酸和ACP。

[0660] 实施例42

[0661] 产生番茄红素的工程微生物

[0662] 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶大肠杆菌dxs(EC2.2.1.7)将丙酮酸和D-甘油醛-3-P转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-P和二氧化碳。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶大肠杆菌dxr(EC1.1.1.267)将1-脱氧-D-木酮糖-5-P和NADPH转化为2-C-甲基-D-赤藓醇-4-P。2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胞苷酰转移酶大肠杆菌ispD(EC2.7.7.60)将CTP和2-C-甲基-D-赤藓醇4-P转化为4-(胞苷-5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇。4-(胞苷5’-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶大肠杆菌ispE (EC2.7.1.148)将ATP+4-(胞苷-5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇转化为2-P-4-(胞苷5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇。2-C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合成酶大肠杆菌ispF(EC4.6.1.12)将2-P-4-(胞苷
5’-PP)-2-C-甲基-D-赤藓醇转化为2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环-PP和CMP。4-羟
基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合成酶大肠杆菌ispG(EC1.17.4.3)将2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环-PP转化为(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-PP。4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶大肠杆菌ispH(EC1.17.1.2)将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-PP和NADPH转化为异戊烯基-PP。4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶大肠杆菌
ispH(EC1.17.1.2)将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基-PP和NADPH转化为二甲基烯丙基-PP。异戊烯基-二磷酸Δ-异构酶大肠杆菌idi(EC5.3.3.2)将二甲基烯丙基-PP转化为异戊烯基-PP。香叶酰香叶酰焦磷酸合成酶集胞藻PCC6803crtE(EC2.5.1.29)将二甲基烯丙基-PP和2个异戊烯基-PP转化为法呢基-PP。香叶酰香叶酰焦磷酸合成酶集胞藻PCC6803 crtE(EC2.5.1.29)将异戊烯基-PP和法呢基-PP转化为(全反式)-香叶酰香叶酰-pp。八氢番茄红素合成酶集胞藻PCC6803 crtB(EC2.5.1.32)将2个香叶酰香叶酰-PP转化为八氢番茄红素。八氢番茄红素氧化还原酶集胞藻PCC6803 crtI(EC1.14.99.n)将八氢番茄红素、2个NADPH和2个O2转化成ζ-胡萝卜素。ζ-胡萝卜素氧化还原酶集胞藻PCC6803crtQ-2(EC1.14.99.30)将ζ-胡萝卜素、2个NADPH和2个O2转化为番茄红素。 [0663] 实施例43

[0664] 产生衣康酸的工程微生物

[0665] 源自土曲霉(A.terreus)(EC4.1.1.6)的乌头酸脱羧酶将顺-乌头酸转化为衣康酸和二氧化碳。衣康酸可以随后被转化为各种其它碳基目的产物，例如，根据图7中提出的方案。

[0666] 实施例44

[0667] 产生1，3丁二烯或谷氨酸的工程微生物

[0668] 琥珀酰-CoA脱氢酶克氏梭菌sucD(EC1.2.1.n)将琥珀酰-CoA和NADPH转化为琥珀酸半醛和CoA。4-羟基丁酸脱氢酶拟南芥ghbdh(EC1.1.1.2)将琥珀酸半醛和NADPH转化为至4-羟基丁酸。谷氨酸脱氢酶大肠杆菌gdhA(EC1.4.1.4)将α-酮戊二酸、NH3和NADPH转化为谷氨酸。谷氨酸脱羧酶大肠杆菌gadA(EC4.1.1.15)将谷氨酸转化为4-氨基丁酸和二氧化碳。4-氨基丁酸转氨酶大肠杆菌gabT(EC2.6.1.19)将4-氨基丁酸和α-酮戊二酸转化为谷氨酸和琥珀酸半醛。醛脱氢酶大肠杆菌aldH(EC1.1.1.n)将4-羟基丁酸和NADH转化为4-羟基丁醛。1，3-丙二醇氧化还原酶肺炎克雷伯氏菌dhaT(EC1.1.1.202)将4-羟基丁醛和NADH转化为1，4-丁二醇。醇脱水酶(EC4.2.1.n)将1，4-丁二醇转化为1，3-丁二烯。

[0669] 实施例45

[0670] 产生丙烯的工程微生物

[0671] 乙酰-CoA羧化酶大肠杆菌accBCAD(EC6.4.1.2)将乙酰CoA、ATP和二氧化碳转化为丙二酰-CoA。双功能的丙二酰-CoA还原酶橙色绿曲挠菌(EC1.2.1.18，1.1.1.59)将丙二酰-CoA和2个NADPH转化为3-羟基丙酸和CoA。3-羟基丙酰-CoA转移酶克氏梭菌orfZ(EC2.8.3.n)将3-羟基丙酸和乙酰-CoA转化为3-羟基丙酰-CoA和醋酸。3-羟基丙酰-CoA脱氢酶橙色绿曲挠菌(EC4.2.1.17)将3-羟基丙酰-CoA转化为丙烯酰-CoA。丙烯酰CoA还原酶橙色绿曲挠菌(EC1.3.1.n)将丙烯酰-CoA和NADPH转化为丙酰-CoA。丙酰-CoA转移酶真养雷尔氏菌pct(EC2.8.3.1)将丙酰-CoA和醋酸转化为乙酰-CoA和丙酸。醛脱氢酶大肠杆菌adhE(EC 1.2.1.{3，4})将丙酸和NADPH转化为丙醛。醇脱氢酶大肠杆菌adhE(EC 1.1.1.{1，2})将丙醛和NADPH转化为1-丙醇。脱水酶(EC4.2.1.n)将1-丙醇转化为丙烯。

[0672] 实施例46

[0673] 产生琥珀酸、柠檬酸、谷氨酸、苹果酸的工程微生物

[0674] 从甘油醛-3-磷酸(GAP)、NAD+和Pi开始，磷酸丙糖脱氢酶将GAP转化为1，3-二磷酸甘油酸、NADH和H+。磷酸甘油酸激酶将1，3-二磷酸甘油酸和ADP转化为3-P-甘油酸和ATP。变位酶将3-P-甘油酸转化为2-P-甘油酸。烯醇酶将2-P-甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和水。然后磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶将PEP转化为草酰乙酸(OAA)。通过两种方式之一将OAA转化为琥珀酸。OAA、H2O和乙酰-CoA通过柠檬酸合成酶转化为柠檬酸和CoASH，柠檬酸转化为水和顺-乌头酸(一种酶结合中间体)，其随后被异柠檬酸裂合酶转化为琥珀酸。或者，顺-乌头酸和水被乌头酸酶转化为异柠檬酸。异柠檬酸和NADP+被异柠檬酸脱氢酶转化为草酰琥珀酸、NADPH和H+。然后草酰琥珀酸被异柠檬酸脱氢酶转化为α-酮戊二酸和二氧化碳。α-酮戊二酸、NAD+和CoASH被α-酮戊二酸脱氢酶转化为琥珀酰-CoA、二氧化碳、NADH和H+。琥珀酸硫激酶将琥珀酰CoA、ADP和Pi转化为琥珀酸、ATP和CoASH。

[0675] 在其中上面的化学物质已经是其中心代谢的一部分的那些微生物中，它们被工程化以将化学物质从细胞中输出。在一定条件下(如厌氧发酵)，由于抑制了柠檬酸循环，琥珀酸可在细胞中积累。一旦发生这种情况，已知作为C4-二羧酸载体的酶家族中的一个或多个成员用于将琥珀酸从细胞输出到培养基中。Janausch等，Biochimica et Biophysica Acta 1553：39-56(2002)；Kim等，J.Bacteriol，March 2007，p.1597-1603。在本发明的某些方面中，琥珀酸可如，例如图6中所示被转化为其它各种化学物质。

[0676] 实施例47

[0677] 检测3-HPA的分析方法

[0678] 比色：为了获得标准曲线，将0-6μmol新蒸馏的丙烯醛(Fluka，Buchs，Switzerland)添加至6ml蒸馏水中。然后，立即加入4.5ml 的DL-色氨酸(Fluka)溶液(在0.05M盐酸中的0.01M溶液，用几滴甲苯稳定)和18ml的37％盐酸。对于3-HPA定量，将1ml样品与0.75ml的DL-色氨酸溶液和3ml的37％盐酸混合。将含有样品和标准品的混合物在37℃的水浴中孵育20分钟，并在560nm(OD560)下测量光密度。在与试剂混合前，用蒸馏水稀释3-HPA样品以确保最终OD560＜1。该方法被证明，能够利用丙烯醛作为标准对3-HPA精确定量(Lüthi Peng等，2002a，b)。将同样的色氨酸溶液用于标准曲线和所有3-HPA定量和报告的数据用于重复的分析。ApplMicrobiol Biotechnol(2005)68：467-474。

[0679] GC-MS：为确定细菌的聚酯含量，根据Brandl等(1988)，在存在3或15％(v/v)硫酸的情况下用甲醇分解对冻干的3至5mg细胞材料进行处理。在这些条件下，细胞内的聚(3-羟基链烷酸)被降解为组成其的3-羟基链烷酸甲酯。用配备Permaphase PEG 25Mx毛细管柱(25m x 0.32ram，Bodenseewerk Perkin Elmer，Uberlingen，FRG)和火焰离子化检测器的Perkin-Elmer8420气体色谱仪通过气相色谱测定甲基酯。分流进样后分析2-1al部分的有机相(分流比1∶40)，且氦气(35厘米/分)作为载气使用。注射器和检测器的温度分别是230℃和275℃。为了不同3-羟基链烷酸甲基酯的高效分离，使用下面的温度程序：120℃保持5分钟，每分钟(rain)8℃的温度梯度，180℃保持12分钟。用合成的具有4至12个碳原子的标准3-羟基链烷酸甲基酯进行校准(Brandl等1988)。在这些条件下，不同的3-羟基链烷酸甲基酯的保留时间如最近所描述(Timm等，1990)。通过将所有检测的羟基链烷酸单体的绝对量相加确定每细胞干重的PHA总量。Arch Microbiol(1991)155：
415-421。

[0680] 为确定冻干的整个细胞的聚合物含量，将大约4mg的这些细胞与含有1ml氯仿，0.85ml甲醇和0.15ml硫酸的溶液在有带螺丝盖的试管中，在100℃的恒温油浴箱(3；
Lageveen，dissertation)内反应40分钟。该方法通过甲醇分解成组成成分P-羟基羧酸甲酯将细胞内PHA降解。反应之后，加入0.5ml的蒸馏水，并将该管剧烈振摇 1分钟。相分离后，将有机相(底层)移除并转移到小的带螺丝盖的玻璃小瓶中。将样品保存在-70℃冰箱中直到进一步分析。用配备Durabond Carbowax-M15 megabore毛细管柱(CR注：类似DB-Wax柱)(15m x 0.54mm；J & W Scientific)和火焰离子化检测器的Perkin-Elmer
8500检测器通过气相色谱(GC)测定甲基酯。在不分流注射后，分析2μL部分的有机相。
氦气(17ml/分)作为载气。注射器和检测器的温度分别是230和275℃。使用高效分离不同的-羟基链烷酸甲酯的温度程序(80℃保持4分钟，每分钟8℃的升温梯度，160℃保持6分钟)。在这些条件下，不同的β-羟基链烷酸甲酯标准品的保留时间如下(分钟)：
C-4，4.22；C-5，5.82；C-6，7.40；C-7，9.19；C-8，10.71；C-10，13.46；C-11，14.81；C-12，
16.61(C-x代表具有链长为x碳原子的P-羟基链烷酸甲酯)。

[0681] 实施例48

[0682] 检测1，3-PDL的分析方法

[0683] 通过使用配备FID、大孔柱DB-5(CR注：与HP-5相同的树脂)(15m×530μm I.D.)(膜厚度为1.5μm)的HP 5890A的气相色谱检测1，3-PDL的存在。校准和检测的仪器条件如下：氦气、氢气和空气流速分别为8.5、30和400ml/min；进样口温度为220℃；检测器温度为260℃。柱从40至220℃进行程序加温如下：初始温度(40℃)保持5分钟，然后温度以每分钟5℃从40增加到150℃，并在150℃保持1分钟，然后以每分钟10℃从150升高至220℃。注射前用蒸馏水将样品稀释10倍。参见例如，Appl.Microbiol.Biotechnol.，59：
289-296(2002)。

[0684] 实施例49

[0685] 检测琥珀酸的分析方法

[0686] 采用配备紫外线监测仪(210nm)和反射率检测器的Hewlett-Packard HPLC(HP1090系列II)测定有机酸和葡萄糖浓度。 通过使用Bio-Rad HPX-87H柱(10_l注射)和以4mM H2SO4为流动相(0.4ml_min_l，45℃)分离产物。参考：T.B.Causey等，PNAS 100：
825-832(2003)

[0687] 实施例50

[0688] 检测脂质的分析方法

[0689] FAME分析结合直接注射GC/EI-MS定量。两个示例方案：

[0690] 用200μL乙酸酸化4.5ml的大肠杆菌培养物，添加0.1mg的十五烷酸作为内标，并通过加入1∶1 CHCl3∶MeOH分相。有机层蒸发至接近干燥，在1ml的5％H2SO4甲醇溶液中重悬浮，并在90℃孵育2小时。在添加0.9％wt/vol NaCl的水溶液后，用300μL己烷萃取FAME。对1μL的己烷溶液进行EI GC-MS。

[0691] 用于产生脂质的细菌的被称为“最有效的”不同方案包括，在3ml的10/1/1 v/v甲醇/浓盐酸/氯仿混合物中在90℃处理冻干细胞60分钟。然后添加1ml水，通过用2ml的4/1己烷/氯仿振荡3x萃取甲基酯(J.Microbiol.Meth.2000，43，107)。

[0692] 来自2种不同的蓝细菌：将新收获的藻团粒(8克)在5mL的异丙醇中煮沸2分钟以抑制脂肪酶的活性，然后在氮气下干燥。在氯仿-甲醇(1∶2v/v)中匀浆干燥的团粒达到终体积15ml，脂质萃取溶剂系统中加入0.01％BHT作为抗氧化剂。将脂质取物在2000g离心5分钟以去除细胞碎片。向上清液中添加总共0.8ml的蒸馏水，然后在分液漏斗加入5ml氯仿和5ml 0.88％氯化钾实现氯仿-甲醇-水比例1∶1∶0.9。将该混合物剧烈摇晃5分钟，并使其分离30分钟。收集该溶剂相并在氮气下浓缩。将干燥的脂质提取物在
5.0mL氯仿中再溶解，并用于对不同类的脂质定量测定。根据Christie(20)的方法制备脂肪酸甲基酯用于气相色谱(GC)分析。将内标(1mM十七烷酸)添加到脂质样品中，并在甲酸-HCl存在下在68-708℃下进行甲醇分解2小时。用3个连续部分的己烷萃取甲基酯，并用5ml饱和碳酸氢钠溶液处理和用5ml蒸馏水清洗。在氮气帮助下将上层 (己烷)溶液在
35-408℃的水浴中蒸发至干。将甲基酯置于小体积的新鲜己烷中并将2lL样品注入气相色谱仪的(GC Nucon)的进样口。Photochemistry and Photobiology，2006，82：702-710。 [0693] 实施例51

[0694] 检测氨基酸的分析方法

[0695] 从Waters网站，据称行业标准氨基酸dev/HPLC荧光检测器的组合：如在Waters网站上所述，地址/WatersDivision/ContentD.asp？watersit＝JDRS 5LTH9Q&WT.svl＝1。

[0696] 衍生化：AccQTag方法基于特别对于氨基酸分析开发的衍生化试剂。Waters AccQFluor试剂(6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯，或ACQ)是N-羟基琥珀酰亚胺活化的杂环氨基甲酸酯，一类新的胺-衍生化合物。Waters AccQFluor试剂是高反应性化合物，6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)，其与伯或仲氨基酸在数秒钟内形成稳定的衍生物。采用Waters AccQTag氨基酸分析系统在不到35分钟内很容易通过反相HPLC分离衍生物。过量试剂在反应过程中消耗以形成氨基喹啉(AMQ)。AMQ与任何衍生的氨基酸具有显著地不同的光谱特性，它使得能够对检测器波长进行编程以最大化衍生物的光谱发射响应，同时最小化AMQ的响应。AQC衍生氨基酸的检测限范围从38至320fmol。荧光检测具有激发波长250nm，发射波长395nm或低灵敏的紫外检测波长为248nm。

[0697] GC-MS法：用二甲基-叔丁基-甲硅烷基-三氟-乙酰胺转化为叔丁基-二甲基甲硅烷(TBDMS)衍生物之后，通过GC-MS测定细胞外丙氨酸，缬氨酸和赖氨酸的标记模式。为此，将100μL培养上清液冻干。将冷冻干燥的残留物重悬浮在40μL二甲基甲酰胺(0.1％吡啶)和40μL N-甲基-叔丁基-二甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺(Macherey
和Nagel，Easton，Pa.)中，并在80℃孵育1小时。通过连接到具有70eV的电子碰撞电离的Hewlett-Packard 5971四极杆质 量选择检测器(Agilent Technologies，Waldbronn，Germany)的Hewlett-Packard 5890系列II气相色谱仪进行GC-MS分析，和RTX-5MS柱(95％二甲基-5％二苯基聚硅氧烷；30m；内径320μm；Restek，Bellefonte，Pa.)采用
70kPa的柱头压和使用氦气作为载气。柱温最初在120℃保持5分钟，随后按10℃/分钟达到270℃，并在此温度下保持4分钟。其它温度设置为270℃(进口)，280℃(接口)和
280℃(四极)。对于分析，注入1μL的样品。7、12和22分钟后分别洗脱TBDMS衍生化的丙氨酸、缬氨酸和赖氨酸。所有的化合物由于从衍生残留释放叔丁基基团对于通过m-57的质量损失从母本自由基获得的碎片离子显示出高信号强度。因此该碎片离子包含了相应的分析物的整个碳骨架。为了提高灵敏度，通过在m/z 260至262(TBDMS-丙氨酸)，在m/z288至290(TBDMS-缬氨酸)和在m/z 431到433(TBDMS-赖氨酸)选择性离子监测相应的离子簇，对质量同位素分数m、m+1和m+2进行定量。所有的测量进行了三次。参考：
Applied and Environmental Microbiology，December 2002，p.5843-5859，Vol.68，No.12.参 见 Journal of Bioscience and Bioengineering 2006，102：413-424，APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，June 2007，p.3859-3864对于其它系列的氨基酸(所有的除了半胱氨酸、色氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺)的GC/MS分析。

[0698] 实施例52

[0699] 检测脂质的分析方法

[0700] 一般光合色素分析(不包括类胡萝卜素)。培养物以8000g离心15分钟后收集蓝细菌细胞。丢弃上清并将藻细胞团在冻干机(Snijders，Holland)中冻干。在均浆器中用1mL 80％vol/vol甲醇在48℃弱光下提取总共0.1克的冻干藻细胞，随后在48℃下6000g离心10分钟。在HPLC分析前，用0.2微米过滤器过滤样品。通过HPLC用反相柱(Waters Spherisorb ODS，25lm34.6mm3250mm)(CR注：Agilent建议尝试用Zorbax SB-C18柱作为替代品， 884950-567)和PDA检测器(Waters 2996)根据Sharma和Hall描述的方法分离色素。将总计20μL的过滤样品注入HPLC。分离梯度为25分钟内乙腈-水(9∶1vol/vol)中的0-100％的乙酸乙酯，流速1.2mL/min。利用β胡萝卜素作为外标，从峰面积值计算色素量。通过将保留时间与标准值对比以及用PDA检测器在400-700nm范围内分析单个峰的光谱曲线对色素进行鉴定。Photochemistry and Photobiology，2006，82：702-710。 [0701] 实施例53

[0702] 检测脂类藻胆体的分析方法(定量藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白)

[0703] 通过在6000g离心15分钟浓缩细胞样品，将0.1g细胞团重悬浮在5mL的20mM的醋酸钠缓冲液中(pH 5.5)并使用超声波仪(Bandelin UW 2200，Germany)在50％功率下破碎细胞，9个循环1分钟。通过用1％硫酸链霉素(wt/vol)在48℃孵育30分钟沉淀藻胆体，并通过在48℃下8000g离心30分钟重新收集。根据Liotenberg等，(15).Photochemistry and Photobiology，2006，82：702-710.的方法计算藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和藻红蛋白的量。 [0704] 实施例54

[0705] 检测红霉素A的分析方法(生物分析和HPLC)

[0706] 采用常规的生物测定，用市售红霉素(Sigma)作为标准，测定由工业红霉糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)菌株产生的红霉素的滴度。将部分(20ml)测试培养基(5g蛋白胨1-1，3g牛肉提取物1-1，3g磷酸氢二钾1-1，15g琼脂1-1)倾倒在平板培养皿(90mm)上。当培养基凝固时，平铺由具有0.1％的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)[CMCC(B)63202]的5ml测试培养基组成的第二层。从发酵液中提取ErA及其遗传修饰的衍生物，并根据Tsuji和Goetz(1978)通过HPLC法进行测定。参考：Yong Wang等Improved production of erythromycin A by expression of a heterologous gene encoding S-adenosylmethionine synthetase.Appl Microbiol Biotechnol(2007)75：837-842。 [0707] 发展了新的HPLC-UV方法用于测定红霉素杂质情况。相对于在欧洲药典中描述的液相色谱法，该分析可以在25℃的温度下进行。采用32mM钾磷酸盐缓冲液pH8.0和乙腈/甲醇(75∶25)梯度洗脱，在表面上在用氰丙基基团封端的RP相上段分析红霉素样品。在由真空脱气器、通过静态混合器形成高压梯度的二元泵系统(600-900μl的延迟体积)、自动进样器、恒温柱箱、紫外-可见光二极管阵列检测器(检测波长215nm)和配备HP Kayak XM600和3D软件(版本8.04)的LC 3D ChemStation组成的Agilent System 1100 LC( Germany)上对红霉素进行液相色谱分析。作为固定相，使用Nucleodur CN-RP色谱柱(5μm，250mm×4.0mm内径)(Macherey Nagel，Düren，Germany)。参见例如，Deubel等，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，43：493498(2007)。 [0708] 实施例55

[0709] 产生乙烯的工程微生物

[0710] 醇脱水酶(EC 4.2.1.n)将乙醇转化为乙烯。下面的表15给出了醇脱水酶及其天然底物的列表。

[0711] 表15

[0712]EC编号 天然底物
4.2.1.2 苹果酸
4.2.1.3，4.2.1.4 柠檬酸
4.2.1.11 2-磷酸-D-甘油酸
4.2.1.17，4.2.1.55 3-羟基丁酰-CoA
4.2.1.33 3-异丙基苹果酸
4.2.1.34，4.2.1.35 {(R)，(S)}-2-甲基苹果酸
4.2.1.54 乳酰-CoA
4.2.1.58 3-羟基丁酰-ACP
4.2.1.60 3-羟基癸酰-CoA
4.2.1.68 L-岩藻糖酸(fuconate)
4.2.1.74 羟酰基-CoA
4.2.1.79 甲基柠檬酸

[0713]

[0714] 源自各种来源(如菜豆晕疫病菌D13182、豌豆细菌性枯萎病菌AF101061、青枯雷尔氏菌AL646053)的编码乙烯形成酶(EfE)的基因可能在微生物中表达。

[0715] pJB5-efe_rs的 构建：从GenBank中(AL646053，(SEQ ID NO：6)；蛋 白 质：CAD18680.1)获得青枯雷尔氏菌的乙烯形成酶的DNA序列(efe_rs)并进行密码子优化以用于大肠杆菌(SEQ ID NO：7)。对于用于大肠杆菌的基因密码子优化的实例，见Chandler等，Mol.Plant，1：285-94(2008)；Xue等，Enzyme and Microbial Technol.42：58-64(2007)；
和Chun等，J Biol Chem.，282：17486-500(2007)。为了利于克隆实验，从基因中移除pJB5载体中用于克隆的所有冲突的限制性内切位点。这种优化的基因是通过DNA2.0(Menlo Park，CA)的定制合成获得的。该efe_rs基因被设计具有包含部分起始密码子的NdeI位点和位于终止密码子之后的EcoRI位点。这一基因通过用NdeI和EcoRI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)对pJB5和插入序列进行限制性消化而插入，然后用快速接合试剂盒(New England Biolabs；Ipswitch，MA)接合。将该接合的构建体转化到NEB 5-αF’Iq感受态大肠杆菌(高效率)(New England Biolabs：Ipswitch，MA)中。

[0716] 实施例56

[0717] 具有pJB5 efe_rs的产生乙烯的工程微生物

[0718] 遗传修饰的聚球藻PPC 7002(7002/efe_rs)：使用下面的方案，将如实施例55中所述的构建体整合到聚球藻PPC 7002(聚球藻7002或7002)的基因组上。聚球藻7002在30℃、2％CO2下，在孵育振荡烧瓶中从菌落生长48小时至在如Frigaard NU等(2004)“Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp.PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation”Methods Mol Biol 274：325-340.中所述的A+培养基中OD730为
1。将900μL培养物加入具有50μL的10μg的DNA的试管中，该DNA用xbaI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)消化，并加入细胞而不进一步纯化。对于各构建体，DNA是由Qiagen Qiaprep Spin Miniprep Kit(Valencia，CA)制备。将细胞在37℃黑暗中孵育4小时。将+
100μL细胞平铺在具有1.5％琼脂糖的A 培养平板上，并在30℃在弱光中生长2天。在平板上铺垫10μg/mL的奇霉素。7-10天可见抗性菌落。将500μL与消化的DNA一起孵育+
的剩余细胞添加到20ml A 培养基中，并用1％CO2在光下以大约每2秒钟1个气泡通气24+
小时。2小时后，将2ml培养物转入含有10μg/ml奇霉素的20ml A 培养基中。五天后，培养物变成绿色，并将1ml培养物传代到25μg/mL奇霉素中并在光下用1％CO2以大约每2秒钟1个气泡通气24小时。在18小时的一段时间后，细胞已经达到OD730＝7.4(干重1.6克/升)。将1ml的该培养物置于10ml的空顶小瓶(Agilent Technologies)中并将1ml的7002野生型培养物置于另一10ml的空顶小瓶中作为对照。将该两种培养物在振荡孵化器中光照下孵育1小时。然后通过将该培养物在80℃孵育5分钟杀死他们，并分析乙烯的存在。

[0719] 通过顶空气相色谱用火焰离子化检测测量乙烯：可以使用具有火焰离子化检测的顶空气相色谱(顶空GC-FID)来分析从被包含在用隔膜覆盖的气密小瓶内的液体或固体样品放出的气体。通过用注射器针头穿刺该隔膜获得气体样品，然后将气体样品注入控制温度 的GC柱中。该混合物及随后其单个成分被以恒定流速流动的加压惰性载气携带流过色谱柱。由于混合物的不同成分以不同的速率通过柱子，它们在不同的时间从柱末端洗脱。当他们出现时，他们立即进入FID，其中氢火焰将它们离子化。这一离子化产生可量化的电子流，其与被离子化的物质的量相关。可以通过它们在柱中停留的时间量确认其成分。 [0720] 分析细菌培养物产生的乙烯。由于乙烯的极低分子量(28.05)和极小的极性，通过顶空气相色谱分析它需要使用合适的柱以将其与进行顶空分析的气体混合物中的其它成分分离。对于这种分析，在气相色谱仪(Agilent 7890A)中安装J&W HP-PLOT/Q毛细管柱，其长度为30m，直径为0.53mm，和涂层厚度为40微米。载气为流速4.2ml/分钟的氦气。柱温保持在60℃。样品注入柱中的GC入口保持在150℃，分流比为20。其中首先从柱中洗脱的成分的FID部分保持在250℃。

[0721] 虽然可以如上所述手动地完成顶空分析，但这里使用自动化的系统(Agilent G1888)。小瓶在恒温箱中在50℃温度平衡2分钟而不振摇。随后，进样环(其被保持在60℃)填充0.15分钟，平衡0.1分钟。然后，气体样品通过保持在70℃的传输管线0.5分钟转移到GC入口。

[0722] 乙烯从柱中洗脱的保留时间为2.52分钟。该时间与柱制造商(即，J&W)报道的使用相同条件的保留时间2.41分钟极其一致。在含7002/efe_rs的小瓶中乙烯近似量为0.75nM/小瓶。图9显示了对照7002菌株的GC/FID色谱图。图10显示了7002/efe_rs重组菌株的GC/FID色谱图。使用多重顶空萃取[Kolb等，Static Headspace-Gas nd
Chromatography，2 Ed，John Wiley & Sons(2006)，pp.45-49]和用于乙烯的FID摩尔响应因子(RF)定量乙烯。用于乙烯的摩尔RF是从1-己烯、1庚烯和1-辛烯的摩尔响应因子推导出来的[Ackman，J Gas Chromatography，6(1968)497]。使用多重顶空萃取测定这三个化合物的应答因子。

[0723] 实施例57

[0724] 产生葡萄糖的工程微生物

[0725] 用以下方式构建pJB336。通过侧翼的PacI和AscI限制性内切位点将合成的DNA kan盒(DNA2.0)亚克隆到载体pJB303中。该kan盒包含在大肠杆菌和JCC1中都有活性的启动子，从而在两种生物体中驱动赋予对卡那霉素抗性的基因aph的表达。pJB303含有合成的DNA区域(DNA2.0)，其包含侧邻多重克隆区域(包括PacI和AscI位点)的上游同源性区域(UHR)和下游同源性区域(DHR)。分别地，UHR对应于JCC1基因组(GenBank登录NC_010475)的坐标1615342至1615841，DHR对应JCC1基因组(GenBank登录NC_010475)的坐标1617346至1617845。该UHR和DHR介导这些区域侧邻的异源DNA的同源重组整合到JCC1染色体中。在SfiI-线性化的pJB336的情况下，重组发生在这样的方式中，其中编码糖原合成酶1(SYNPCC7002_A1532；GenBank登录号YP_001734779)的JCC1 glgA1基因被删除，并以kan盒取代。包含在pJB336中的SfiI-两侧的DNA序列如SEQ ID NO：8中所示。

[0726] 用以下方式构建pJB342。通过侧邻PacI和AscI限制性内切位点将合成的DNA spec盒(DNA2.0)亚克隆到载体pJB301中，从而产生载体pJB330。该spec盒包含在大肠杆菌和JCC1中都有活性的启动子，从而在两种生物体中驱动赋予奇霉素和链霉素抗性的基因aadA的表达。pJB301含有合成的DNA区域(DNA2.0)，其包含侧邻多重克隆区域(其包括PacI和AscI位点)的上游同源性区域(UHR)和下游同源性区域(DHR)。分别地，UHR对应于JCC1基因组(GenBank登录号NC_010475)的坐标2207877至2208376，DHR对应于JCC1基因组(GenBank登录号NC_010475)的坐标2209929至2210428。该UHR和DHR介导这些区域侧邻的异源DNA同源重组整合到JCC1染色体中。与pJB330的构建相类似，通过侧邻NdeI和EcoRI限制性内切位点将合成的TPT基因(DNA2.0)亚克隆到载 体pJB168中，从而产生载体pJB171。TPT编码源自拟南芥的磷酸盐/丙糖-磷酸反向转位分子(UniProt Q9ZSR7)[Flügge U-I.，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.50：27-45(1999)]，并被密码子优化用于在大肠杆菌中表达，从而检查二级结构效应并移除在体组装策略中利用的限制性内切位点；编码叶绿体信号肽的前77个氨基酸被移除。选定该基因因为它编码非葡萄糖转运蛋白基因，并因此用作评估糖转运的阴性对照。pJB168含有合成的DNA区域(DNA2.0)，其q包含编码LacI阻遏蛋白并由位于被抑制的LacI的上游的lacI 启动子(IPTG-诱导型Ptrc启动子)驱动的大肠杆菌lacI基因；在pJB171中，该启动子控制TPT的表达。通过NotI和SpeI限制性内切位点，pJB171的lacI/Ptrc-TPT片段被亚克隆至UHR和pJB330的spec盒之间，以构建质粒pJB342。在SfiI-线性化的pJB342的情况下，重组以这样的方式发生，其中编码糖原合成酶2(SYNPCC7002_A2125；GenBank登录号YP_001735362)的JCC1 glgA2基因被缺失，并以lacI/Ptrc-TPT/spec盒取代。包含在pJB342中的SfiI-侧邻DNA序列是SEQ ID NO：9。

[0727] 用以下方式构建pJB345。通过侧邻NdeI和EcoRI限制性内切位点将合成的yihX基因(DNA2.0)亚克隆到载体pJB168中，从而产生载体pJB179。yihX编码源自大肠杆菌K12的α-D-葡萄糖-1-磷酸酶(UniProt P0A8Y3)(Kuznetsova E等(2006).Genome-wide Analysis of Substrate Specificities of the Escherichia coli Haloacid Dehalogenase-like Phosphatase Family.J.Biol.Chem.281：36149-36161)。通过侧邻MfeI和SpeI限制性内切位点将合成的GLUT1基因(DNA2.0)亚克隆到载体pJB179中(用EcoRI和SpeI消化)，从而产生载体pJB185。GLUT1编码源自人的葡萄糖转运蛋白GLUT-1(UniProt P11166)(Zhao F-Q和Keating AF(2007).Functional Properties and Genomics of Glucose Transporters.Current Genomics 8：113-128)，并被密码子优化以用于在大肠杆菌中表达，从而检查二级结构效应并移除在构建体组装策略中利用的限制性内切位点。在质粒pJB185中， 因此将yihX-GLUT1操纵子置于Ptrc启动子的控制下，其自身受上游lacI基因的调控。然后通过NotI和SpeI限制性内切位点，pJB185的lacI/Ptrc-yihX-GLUT1片段被亚克隆至UHR和pJB330的spec盒之间，以构建质粒pJB345。在SfiI-线性化的pJB345的情况下，重组以这样的方式发生，其中编码糖原合成酶2的JCC1 glgA2基因被删除，并以lacI/Ptrc-yihX-GLUT1/spec盒取代。包含在pJB345中的SfiI-侧邻DNA序列如SEQ ID NO：10中所示。

[0728] 用以下方式构建pJB348。通过侧邻MfeI和SpeI限制性内切位点将合成的glf基因(DNA2.0)亚克隆到载体pJB179中(用EcoRI和SpeI消化)，从而构建成载体pJB188。glf编码源自运动发酵单胞菌的葡萄糖辅助扩散转运蛋白Glf(UniProt P21906)[Weisser P等，J.Bacteriol.177：3351-3354(1995)]，并被密码子优化以用于在大肠杆菌中表达，从而检查二级结构效应和移除在构建体组装策略中有用的限制性内切位点。因此在质粒pJB188中，将yihX-glf操纵子置于Ptrc启动子的控制下，其自身受上游lacI基因的调控。通过NotI和SpeI限制性内切位点，然后pJB188的lacI/Ptrc-yihX-glf片段被亚克隆至UHR和pJB330的spec盒之间，以构建质粒pJB348。在SfiI-线性化的pJB348的情况下，重组以这样的方式发生，其中编码糖原合成酶2的JCC1 glgA2基因被删除，并以lacI/Ptrc-yihX-glf/spec盒取代。包含在pJB348中的SfiI-侧邻DNA序列如SEQ ID NO：11中所示。

[0729] 菌株构建：用下列的方法将pJB336、pJB342、pJB345和pJB348的UHR/DHR-侧翼片段整合到JCC1(pJB336)或JCC475(pJB342、pJB345和pJB348)的染色体中。首先考虑JCC1+转化。JCC1培养物生长在A 培养基中在150rpm的振动孵化器(Infors)中在2％二氧化碳的大气中，在37℃进行培养至OD730约为。将0.5ml的该培养物与约5μg SfiI-消化的质-2 -1
粒pJB336(在消化后未经净化而使用)在37℃弱光(约2μE m 秒 光合活性辐射(PAR))环境中在振荡孵化器中(250rpm)孵育4个小时。将细胞-DNA混合物浓缩至50μl并将其+ -2 -1
整体铺在A 琼脂板上，其随后在37℃的光培养箱(Percival；～50 μE m sec PAR)中在不存在富CO2的情况下孵育大约24小时。此时，铺垫卡那霉素至琼脂中的最后扩散后浓度-1
25μg ml ，从而对整合体进行选择。大约5天后可见卡那霉素抗性菌落，此时将平板转移-2 -1
到具有1％CO2空气的37℃的光培养箱(Percival；～50μE m sec PAR)中，并再孵育两天。

[0730] 为了充分隔离重组体，将来自最初平板的小群体(10-20)卡那霉素抗性菌落划线+ -1到A50μg ml 卡那霉素平板上，并如上培养；然后将来自该第二平板的小群体(10-20)卡+ -1
那霉素抗性菌落划线到A75μg ml 卡那霉素平板上，并如上生长。从来自该第三平板的单个候选JCC475菌落制备基因组DNA，并通过PCR检查完全隔离。对于pJB336和所有其它构建体，这包括检测(i)上游重组接头，(ii)下游重组接头和(iii)异源基因的存在及缺失的野生型基因(glgA1或glgA2)的不存在。如上所述将pJB342、pJB345和pJB348转化到JCC475中，除了在所有平板中包含卡那霉素以在JCC475中保持glgA1::kan破坏的选择，以-1 -1 -1
及奇霉素用作选择抗生素—首先在25μgml ，然后在50μg ml ，并最终在75μg ml 。 [0731] 用这种方式，构建如表16中所示的ΔglgA1::kan ΔglgA2::specJCC1衍生菌株： [0732] 表16

[0733] 用于产生糖的ΔglgA1::kan ΔglgA2::spec JCC1衍生重组菌株

[0734]

[0735] 参照上表，JCC543和JCC545独立地代表源自最后隔离平板的分离菌落，选择两个以评估出现的任何产糖显型的基因型重复性。 如通过PCR所测定的，JCC543、JCC545和JCC547被完全地和如实地隔离，其中他们产生预期的上游接头、下游接头和异源基因扩增子，以及缺少对应于glgA2-内部序列(不像JCC1)的扩增子。尽管如预期的JCC342c不能给予对应于glgA2的扩增子，它只产生下游接头扩增子，表明尽管glgA2已被成功地从该菌株中删除并且该spec盒位于相对于DHR的预期的位置，lacI/Ptrc-TPT区域已经被某种方式损坏，最可能由于甚至低TPT表达水平的毒性。尽管如此，JCC342c凭借作为ΔglgA1::kan ΔglgA2::spec以及凭借其与JCC543、JCC545和JCC547以同样的方式和同时地制备，用作用于测定该3种菌株是否能够向培养基中输出或增加输出糖的理想阴性对照。请注意，因为所有菌株缺乏所有编码糖原合成酶的基因，所以其被设计成为不能产生糖原。 [0736] 糖产生：通过酶学方法和通过气相色谱质谱法(GC-MS)测定JCC342c、JCC543、JCC545和JCC547的培养基中的葡萄糖。下面分别处理这两种方法，其得出一致的结果。 [0737] 酶学分析：将各JCC342c、JCC543、JCC545和JCC547的单菌落接种到10ml的A+培养基中，其含有75μg/ml卡那霉素和75μg/ml奇霉素。将这些培养物在37℃孵育大约3天，在大约50μE m-2sec-1PAR中用富含1％二氧化碳的空气缓慢地和连续地通气。用含有75μg/ml卡那霉素、75μg/ml奇霉素和0.5mM IPTG的10ml的A+培养基洗涤细胞两次，并接种到相同培养基的30ml培养中，其初始OD730为0.07。将这些培养物在2％的二氧化碳气氛和连续光照(约100μE m-2sec-1PAR)中在振荡光培养箱(Infors)中以150rpm在37℃孵育15天。每2天用适当量的无菌Milli-Q水补充水蒸发损失。在第7、11、12和15天采样0.2ml的培养物；通过离心将细胞沉淀，并将培养上清液冷冻在-20℃直到准备用于葡萄糖测定。培养上清液都在同一时间检测。

[0738] 使用麦芽糖和葡萄糖检测试剂盒(Biovision；目录号K618-100)测定培养上清液中的葡萄糖浓度。在平底96孔板的孔中，将10μL 培养上清液与86μL葡萄糖测定缓冲液(GAB；K618-100-1)、2μLDMSO溶解的葡萄糖探针(K618-100-2)和2μL GAB溶解的葡萄糖酶混合物(K618-100-5)混合。将这些100μL反应混合物在37℃在黑暗中孵育1小时。然后用读板仪(SpectraMax)测量OD570。为了将OD570与绝对的D-葡萄糖浓度相关联，在上述+ -1反应混合物组装的同时，将溶解在A 中的已知葡萄糖浓度从0至54mgL 的10μL D-葡萄糖溶液以同样的方式测定。从而将培养上清液的OD570测量结果转化为D-葡萄糖浓度。 [0739] 如表17中所示，当所有三种培养物在相当的细胞密度(OD73013-15)时，JCC543和 JCC545( 复 制 ΔglgA1::kanΔglgA2::lacI-Ptrc-yihX-GLUT1-spec 菌 株 ) 比 对照ΔglgA1::kan ΔglgA2::spec JCC342c菌株产生5倍以上的葡萄糖。JCC547(该
ΔglgA1::kan ΔglgA2::lacI-Ptrc-yihX-glf-spec菌株)比其它3株显著慢地生长，从而在实验过程中生长不超过OD7309.6，在该OD730下，JCC547的培养上清液的葡萄糖浓度与JCC342c的相当。

[0740] 表17

[0741] 通过酶学分析测定的JCC342c、JCC547、JCC543和JCC545的培养基中产生的葡萄糖

[0742]

[0743] GC-MS分析：在与酶学分析部分中所述的实验分离的生长实验中，将各JCC342c、JCC543、JCC545和JCC547的单菌落接种到 10ml的A+培养基中，其中该A+培养基含有75μg/ml卡那霉素和75μg/ml奇霉素。将这些培养物在大约50μE m-2sec-1PAR中在37℃孵育大约3天，用富含1％二氧化碳的空气缓慢地和连续地通气。用含有75μg/ml卡那霉素、75μg/ml奇霉素和0.5mM IPTG的10ml的A+培养基洗涤细胞两次，并接种到相同培养基的30ml培养基中，其初始OD730为0.05。将这些培养物在2％的二氧化碳气氛和连续光照(约100μE m-2sec-1PAR)下在振荡光培养箱(Infors)中以150rpm在37℃孵育8天。在最后一天采样2ml培养基。通过离心将细胞沉淀，用0.2μm过滤器过滤培养上清液以移除任何残留的细胞。将0.9ml过滤的培养上清液冻干过夜，准备用于GC-MS的衍生化。 [0744] 通过大力振摇将冻干的残留物部分溶解在200μL无水吡啶中，向其中加入1.0ml甲硅烷化试剂(BSA+TMCS+TMSI，3∶2∶3；Supelco，Bellefonte，PA)。对混合物进行充分振摇，然后在70℃放置2小时并伴随偶尔的振摇。冷却到室温后，将衍生化的样品转移到玻璃自动进样器小瓶中以备使用配备5975C电子冲击MS的Agilent7890A GC进行GC-MS分析。用配备10μL注射器的7683自动液体进样器将1.0μL衍生样品注入GC中。GC入口温度为280℃，和分流比为5。毛细管柱是Agilent HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)。载气-1
为氦气，流速为1ml min 。GC炉温度程序为50℃，保持1分钟，以10℃每分钟至280℃，保持10分钟。GC-MS接口温度为290℃，质谱仪源温度为230℃和四极温度为150℃。质量范围为25-1000amu。通过其保留时间，利用权威的标准品(Sigma-Aldrich)和通过检索NIST MS数据库(2008版)确认总离子谱图中存在的糖峰。

[0745] 如表18中所示，JCC543和JCC545比对照的JCC342c菌株产生超过两倍的葡萄糖，尽管前者的细胞密度(OD7309.7和10.8)比后者的(OD73015.1)低。JCC547产生了基础量的葡萄糖。图16显示了在TMS-衍生的α-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖洗脱的保留时间窗中JCC342c、JCC545和JCC547的总离子谱图(TIC)，由此获得表18中的复合峰面积。 [0746] 表18

[0747] 通过GC-MS分析看到的如葡萄糖的总离子流谱图峰面积测定的JCC342c、JCC547、JCC543和JCC545的培养基中产生的葡萄糖

[0748]

[0749] 这些GC-MS数据证实了在前面章节中报道的独立酶学分析的数据，即是Ptrc-yihX-GLUT1盒，而不是JCC547中的Ptrc-yihX-glf盒，导致葡萄糖产量显著地比在等基因对照菌株中观察到的高。

[0750] 虽然GC-MS分析表明JCC547生长培养基中只存在基础水平的葡萄糖，但是显然仅在该菌株中，而不是在JCC342c、JCC543或JCC545中，有几个其它离子色谱峰存在，或以更大的面积存在。如表19和图17中所示，基于权威标准分析，这些峰之一被肯定地鉴定为蔗糖。基于在权威标准分析中使用的蔗糖浓度并假设观察的TIC峰面积与该已知的蔗糖浓度呈线性比例，据估计该JCC547培养基含有大约600mg每升的蔗糖，是JCC342c、JCC543或JCC545中看到的约100倍。在任何该4株的培养基中没有观察到麦芽糖。

[0751] 表19

[0752] 如利用GC-MS分析观察到的m/z 361诊断二糖离子的提取离子谱图峰面积确定的，

[0753] JCC342c、JCC547、JCC543和JCC545的培养基中产生的蔗糖

[0754]

[0755] 因此JCC547中的Ptrc-yihX-glf盒导致比同基因对照菌株中观察到的蔗糖产量显著地高。产生这个的可能原因是，Glf转运蛋白能够介导细胞内天然合成的蔗糖的输出并另外的细胞内维持。没有能够介质双糖如蔗糖转运的Glf的报道。Glf已经被报道为能够介导葡萄糖以及(以小得多的程度)果糖的转运。然而，Glf-介导的双糖输出的观点得到JCC547培养基的GC-MS分析的支持。如上所述，GC-MS表明仅存在，或以较大的面积存在，在该菌株中而不是在JCC342c、JCC543或JCC545中的几个离子谱图峰。与这些代表双糖的峰一致，这些峰中的许多特征在于显性m/z 361离子，其是TMS-衍生双糖的诊断特征[Molnár-Perl等，Chem.Mater.Sci.，45：321-327(1997)]，如表20中所示。由于所用使用的权威的二糖标准没有在上表中显示的时间洗脱，这些对应的峰都不可以确定地鉴定。然而，假定全部存在m/z 361离子，这些峰很可能代表二糖或二糖样分子，最有可能在细胞内天然合成的。

[0756] 表20

[0757] 如利用GC-MS分析观察到的m/z 361诊断二糖离子的提取离子谱图峰面积测定*的，JCC547产生的二糖和/或二糖样分子

[0758]

[0759] *这些峰还没有明确地与确定的化学物质关联。

[0760] 实施例58

[0761] 具有淀粉酶表达质粒的产生麦芽糖的工程微生物

[0762] 淀粉酶表达质粒的构建：从GenBank中获得大豆(Gylcine max)(AMY_gm)、蜡状芽孢杆菌(AMY_bc)的淀粉酶基因和源自拟南芥(MEX1)和大肠杆菌(setA)的转运蛋白基因的DNA序列。优化该密码子序列用于大肠杆菌。本文提供了密码子优化的序列和氨基酸序列，用于BAA34650(分别为SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)、CAA50551(分别为SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15)、AAF04350(分别为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17)以及YP_025293(分别为SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19)。从GenBank中获得aphII、amt2和trc启动子的DNA序列，并密码子优化用于大肠杆菌(分别为SEQ ID NO：20、SEQ ID qNO：21和SEQ ID NO：22)。trc启动子用组成型表达的上游lacI 基因工程化。对于用于大肠杆菌的基因密码子优化的实例，见Chandler等，Characterization of Gibberellin receptor mutants of Barley(Hordeum vulgare L.)，Mol.Plant 2008 1：285-94；Xue等，Improved production of p-hydroxycinnamic acid from tyrosine using a novel thermostable phenylalanine/tyrosine ammonia lyase enzyme，Enzyme and Microbial Technol.2007 42：58-64.；和Chun等，Electron transport pathway for a Streptomyces cytochrome P450：cytochrome P450 105D5-catalyzed fatty acid hydroxylation in Streptomyces coelicolor A3(2).J Biol Chem.2007282：17486-500。这些优化的基因通过DNA 2.0(Menlo Park，CA)的定制合成获得。此外，通过DNA 2.0(Menlo Park，CA)的定制合成获得含有2个750bp同源区域经设计以从移除源自聚球藻PPC7002的天然glgB(pJB315)或限制内切位点(pJB318)的质粒。使用pJB315和pJB318作为载体，通过执行4个连续的克隆对该构建体进行工程化：使用PacI和IAscI插入aadA，使用NdeI和EcoRI插入淀粉酶/转运蛋白盒，用NotI和NdeI插入启动子-cat盒，和使用SfiI移除cat基因。所有限制性内切和连接酶从New England Biolabs(Ipswich，MA)获得。接合的构建体被转化到NEB 5-α感受态大肠杆菌(High Efficiency)(New England Biolabs：Ipswich，MA)或Copy Cutter EPI400感受态大肠杆菌(Epicentre Biotechnologies：Madison，WI)。 [0763] 遗传修饰的聚球藻PCC7002(7002/淀粉酶_转动蛋白)：使用下面的方案将如上所述的构建体整合到聚球藻PPC 7002(聚球藻7002或7002)的基因组上。聚球藻7002在37℃、1％CO2下，在孵育振荡烧瓶中生长至在如Frigaard NU等，Methods Mol.Biol.，+
274：325-340(2004)中所述的A 培养基中OD730为1.2。将1000μL培养物加入具有50μL的2μgDNA的试管中，该DNA用xbaI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)消化并加入细胞中而不进一步纯化。对于各构建体，该DNA是由Qiagen Qiaprep Spin微量提取试剂盒(Valencia，CA)制备。将细胞在37℃黑暗中孵育2小时。将全部体积的细胞接种在具有+
1.5％琼脂糖的A 培养基平板上，并在37℃的光照培养箱(40-60μE/m2/s PAR，用LI-250A光测量仪(LI-COR)测量)中生长大约24小时。在平板上铺垫25μg/mL的奇霉素。在进一步孵育后，5天可见抗性菌落。18个培养物(JCC724-741)中各培养物的单菌落再 划线到具+
有1.5％琼脂糖和50μg/ml奇霉素的A 培养基平板上。然后将来自这些平板的菌落接种+
于含25μg/ml奇霉素的5ml A 培养基中。将这种培养物接种，在37℃在光中(40-50μE/m2/s PAR，用LI-250A光测量仪(LI-COR)测量)以每两秒大约1-2个1％CO2/空气的气泡通气的通气管中。在OD7301.04至9.44的范围内收获含有组成型表达下的淀粉酶-转运蛋白构建体的菌株。在OD7303.76到8.15之间孵育含有trc表达下的淀粉酶-转运蛋白构建体的菌株。收获1ml的这些未诱导的培养物。将剩余的培养基稀释至OD730为1，用0.05mM IPTG诱导，并孵育24小时。为了收获细胞，将培养物在14800rpm离心1分钟。随后对上清液进行GC/MS分析。

[0764] 用气相色谱法测定麦芽糖：在添加1.0ml甲硅烷化试剂(BSA+TMCS+TMSI3∶2∶3(Supelco；Bellefonte PA))前，将样品部分溶解在300μL无水吡啶(Sigma Aldrich；St Louis MO)中。各次添加后，将样品进行剧烈振摇。然后将样品在70℃加热两个小时，冷却，转移到自动进样小瓶中，并且用GC/MS测量。α-麦芽糖和β-麦芽糖的以分钟计的保留时间通过其质谱和其保留时间确认。

[0765] 使用配备7683系列自动进样器的Agilent7890A GC/5975CEI-MS检测麦芽糖。GC入口被设置分流比为5.0和入口温度为280℃。将1μL样品注入HP-5MS柱(Agilent，
30m×0.25mm×0.25μm)。载气为氦气。GC炉温程序为50℃，保持一分钟，每分钟10℃提高至280℃，保持10分钟。GC-MS接口被设置为290℃，并且MS质量范围为25至1000amu。
通过保留时间分析和通过用相关的质谱搜索NIST MS检索数据库版本2.0(2008)，鉴定总离子谱图中存在的峰。用来自Fluka的权威标准品确定以分钟计的α-麦芽糖(24.73分钟)和β-麦芽糖(25.06分钟)的保留时间，并在图18中表示。

[0766] 在JCC726，729，735和738中检测麦芽糖(图19)。只在淀粉酶-转运蛋白操纵子的表达由trc启动子控制的菌株中产生麦芽糖。

[0767] 实施例59

[0768] 工程化的甲烷生成途径

[0769] 将目的宿主细胞工程化成产生甲烷。优选地，将宿主选择或工程化为具有产生甲烷的特性。

[0770] 表21

[0771]

[0772] 实施例60

[0773] 工程化的乙酸生成途径

[0774] 将目的宿主细胞工程化成产生乙酸。优选地，将宿主细胞选择或工程化为具有生成乙酸的特性。

[0775] 表22

[0776]

[0777]

[0778] 实施例61

[0779] 工程化的还原TCA循环

[0780] 将目的宿主细胞工程化成具有还原TCA循环。优选地，将宿主选择或工程化为具有光合特性。

[0781] 表22

[0782]

[0783] 实施例62

[0784] 工程化的卡尔文循环

[0785] 将目的宿主细胞工程化成具有卡尔文循环。优选地，将宿主选择或工程化为具有光合的特性。

[0786] 表23

[0787]

[0788] 实施例63

[0789] 工程化的3-HPA循环

[0790] 将目的宿主细胞改造成具有3-HPA循环。优选地，将宿主选择或改造为具有光合特性。

[0791] 表24

[0792]酶 EC No. 示例生物体，基因
乙酰-CoA羧化酶 6.4.1.2 橙色绿曲挠菌
丙二酸半醛脱氢酶(NADP-酰化) 1.2.1.18 橙色绿曲挠菌
3-羟基丙酸脱氢酶(NADP+) 1.1.1.- 橙色绿曲挠菌
3-羟基丙酸-CoA连接酶 6.2.1.- 橙色绿曲挠菌
丙烯酰-CoA水合酶 4.2.1.- 橙色绿曲挠菌
丙烯酰-CoA还原酶(NADPH) 1.3.1.- 橙色绿曲挠菌
丙酰-CoA羧化酶 6.4.1.3 橙色绿曲挠菌
甲基丙二酰-CoA差向异构酶 5.1.99.1 橙色绿曲挠菌
甲基丙二酰-CoA变位酶 5.4.99.2 橙色绿曲挠菌
琥珀酰-CoA:苹果酸CoA-转移酶 2.8.3.- 橙色绿曲挠菌
琥珀酸脱氢酶(生理受体未知) 1.3.99.1 橙色绿曲挠菌
富马酸水合酶 4.2.1.2 橙色绿曲挠菌
苹果酰-CoA裂合酶 4.1.3.24 橙色绿曲挠菌
核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 4.1.1.39 橙色绿曲挠菌
CO脱氢酶/乙酰-CoA合成酶 1.2.99.2 橙色绿曲挠菌
丙酮酸合成酶 1.2.7.1 橙色绿曲挠菌
2-酮戊二酸合成酶 1.2.7.3 橙色绿曲挠菌
ATP柠檬酸(原-3s)-裂合酶 4.1.3.8 橙色绿曲挠菌
磷酸核酮糖激酶 2.7.1.19 橙色绿曲挠菌
苹果酸-CoA连接酶 6.2.1.9 橙色绿曲挠菌
琥珀酸-CoA连接酶 6.2.13 橙色绿曲挠菌
异柠檬酸裂合酶 4.1.3.1 橙色绿曲挠菌

[0793]

[0794] 实施例64

[0795] 工程化的3HP/4HB循环

[0796] 将目的宿主细胞改造成具有3HP/4HB循环(Berg等，Science 318：1782(2007))。在更加优选的实施方案中，移除卡尔文循环，并将3HP/4HB循环工程化到宿主细胞中。优选地，将宿主选择或工程化为具有光合特性。

[0797] 表25

[0798]酶 示例生物体，基因
乙酰-CoA羧化酶 Metallosphaera sedula
丙二酰-CoA还原酶(NADPH) Metallosphaera sedula
丙二酸半醛还原酶(NADPH) Metallosphaera sedula
3-羟基丙酰-CoA合成酶 Metallosphaera sedula
(AMP-形成)
3-羟基丙酰-CoA脱水酶 Metallosphaera sedula
丙烯酰-CoA还原酶(NADPH) Metallosphaera sedula
丙酰-CoA羧化酶 Metallosphaera sedula
甲基丙二酰-CoA差向异构酶 Metallosphaera sedula
甲基丙二酰-CoA变位酶 Metallosphaera sedula
琥珀酰-CoA还原酶(NADPH) Metallosphaera sedula
琥珀酸半醛还原酶(NADPH) Metallosphaera sedula
4-羟基丁酰-CoA合成酶 Metallosphaera sedula
(AMP-形成)
4-羟基丁酰-CoA脱氢酶 Metallosphaera sedula
巴豆酰基-CoA水合酶 Metallosphaera sedula
3-羟基丁酰-CoA脱氢酶 Metallosphaera sedula
(NAD+)
乙酰乙酰-CoA b-酮硫解酶 Metallosphaera sedula
丙酮酸合成酶 Metallosphaera sedula

[0799]

[0800] 实施例65

[0801] 工程化的柠檬烯生产

[0802] 将目的宿主细胞工程化成产生柠檬烯。优选地，将宿主选择或工程化为具有光合特性。在更加优选的实施方案中，移除卡尔文循环，并将3HP/4HB循环工程化到宿主细胞中。 [0803] 表26

[0804] 通向(R)-或(S)-柠檬烯的甲羟戊酸途径

[0805]

[0806] 通向(R)-或(S)-柠檬烯的非-甲羟戊酸

[0807] 途径

[0808]

[0809] 实施例66

[0810] 脂肪酸酯的增强分泌

[0811] fadL的克隆和用于在蓝细菌中表达fadL的载体的构建：根据生产商的说明，通过使用PhusionTM热启动高保真DNA聚合酶(由Finnzymes Oy开发和制造，由New England Biolabs，Ipswitch，MA分销)，由大肠杆菌(Migula)菌株基因组DNA(ATCC#700926)通过PCR产生fadL(SEQ ID NO：24)。用于此反应中的正向引物(fadl_FP)包含5’NdeI限制酶切位点和反向引物(fadl_RP)包含5’EcoRI限制酶切位点。随后使用Qiagen凝胶提取试剂盒方案(Qiagen)通过凝胶电泳接着琼脂糖纯化来纯化扩增的DNA。纯化的DNA产物和载体pJB41(基于含有NdeI和EcoRI克隆位点的DNA 2.0 pJ204载体的载体)经NdeI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)和EcoRI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)消化，接着使 用T4连接酶(New England Biolabs；Ipswitch，MA)进行连接过夜。连接的构建体被转化到NEB EPI400 CopyCutter感受态大肠杆菌(NEB EPI400 CopyCutter competent E.coli)(New England Biolabs：Ipswitch，MA)中。随后在LB培养基中培养菌落，并通过使用上述相同的引物的PCR筛选插入片段。通过序列验证GENEWIZ(South Plainfield，NJ)确认选择的构建体。

[0812] 将这种fadL插入片段克隆到适于插入到包含几个元件的聚球藻PCC 7002种(Synechococcus sp.7002)中的重组载体中。上游同源区(UHR；参见，例如，SEQ ID NO：26)和下游同源区(DHR；参见，例如，SEQ ID NO：26)存在于fadL插入片段中，允许重组到pAQ7(pAQ7质粒序列，参见Genbank#CP000957)中。同源区侧邻多克隆位点(mcs)和在大肠杆菌和聚球藻PCC 7002种中提供抗性的卡那霉素盒。存在于UHR的上游和DHR的下游的XbaI位点允许fadL插入片段的线性化，以便于转化和整合到宿主生物体中。

[0813] 已经制备了在不同强度的启动子控制下的携带fadL的几种变异体。在SEQ ID NO：26中提出了一个这样的启动子(来自JCC160的amt1)。已经构建的其他变异体包括具有受Thermosynechococcus elongatus BP-1启动子(例如，tsr2142或psaA)控制的fadL的构建体。

[0814] fadL表达构建体的评估。使用以下的方案将fadL构建体整合到工程化的聚球藻菌株JCC803的pAQ7(pAQ1：lacIq Ptrc-tesA-fadD-蜡合成酶(wax synthase)-aadA)上。+
在37℃、2％CO2下温孵的摇瓶中，在补充有200mg/L的大观霉素(spectinomyin)的A 培养基中，该菌株由菌落生长至1的OD730。对于用xbaI(New England Biolabs；Ipswitch，MA)消化后的各个构建体，将500μL的培养物添加到具有50μL的由Qiagen Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(Valencia，CA)制备的1-5μg的DNA的微量离心管中。将细胞在37℃下黑暗中在摇动的孵育器中温孵4小时。将200μL的细胞接种在具有1.5％琼脂糖和100μg/+
ml的大观霉素的A 培养板上，在37℃光照下温孵24小时。将50μg/mL的卡那霉素铺垫在板上，抗性菌落在7-10天后可见。

[0815] 例如，如本文(如实施例17)所述，测量和比较包含fadL表达构建体的菌株中的乙基酯的表达和分泌。此外，使用有机溶剂(如异辛烷或乙酸乙酯)分配(partition)培养物，和如实施例17中详述的通过GC/MS分析有机溶剂部分，以检测和量化培养基中存在的酯。本领域的技术人员已知的其他技术也可以用来测量分泌到培养基中的乙基酯的量。 [0816] 根据用于表达和/或分泌的特定的环境和/或目的，可以期望不同水平的表达和/或分泌。因此实现一定范围的表达水平的各种构建体是需要的。除了来自大肠杆菌的fadL之外，将其他转运体(包括来自拟南芥的CER5蜡转运体(Q9C8K2；SEQ ID NO：23)和来自假单胞菌的XylN(Q8VMI2；SEQ ID NO：25))合并到构建体中，并测量它们对于乙基酯分泌的促进作用。在某些实施方式中，可以将两种或多种相异的转运体合并到单一菌株中，以实现大于使用单一转运体实现的分泌水平的生物燃料分泌水平。此外，重组转运体可以被修饰或突变以调节(增加或减少)实现的分泌水平，或改变转运体的特异性以使得相对于未修饰的转运体形式，另外类型的分子的转运增加或减少。这种修饰的转运体可以具有与本文公开的转运体至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。除了上面提到的那些启动子，包括apcA、EM7、tRNA-Glu、lacIq-Ptrc、nblA、hsp33、rbcL、cpcC、cpcB、rpsU、PaphII、Pci和nirA的其他启动子也可以用于本文中。如同转运体序列一样，可以对任何启动子序列进行修饰来调节受其控制的转运体的表达水平。

[0817] 实施例67

[0818] 增强的乙醇生产

[0819] 本实施例提供了在工程化的生物体中可以如何提高乙醇产量和通过改变参与乙醇生产的酶的表达水平和/或其本身使得乙醇生产更有效的例证。具体地，构建含有受不同强度的启动子控制的穆尔氏菌醇脱氢酶(adh)基因的一系列pAQ7Δldh靶向质粒。这些质粒转化到JCC445中(见表5)，检查产生的菌株的乙醇生产。通过几种不同质粒转化JCC445 表明乙醇生产提高，但只有一个质粒PcI_adhAM导致伴随乙醛水平下降的乙醇水平提高。

[0820] 菌株的构建：

[0821] 表27

[0822]

[0823] 4μg的质粒DNA经XmaI消化，并用于使用本文所述的转化方案转化400μl的+JCC445(OD730＝1.15)。将整个转化混合物接种于A 琼脂板上，并在空气中在37℃(～
50μE)下温孵。24小时后，将该板用卡那霉素作底(50μg/ml的终浓度)并如上温孵。5R
天后，背景生长减弱，且Km 菌落开始可见，此时该板被转移到37℃(～50μE)+1％CO2下。
R +Km50Sp100
3天后，将来自各个转化的2个Km 菌落在A 琼脂板上划线用于单菌落分离。在空气中在37℃(～50μE)下温孵划线的板4天，然后转移到37℃(～50μE)+1％CO2下温孵另外3天。

[0824] 在烧瓶中的批次生产乙醇：将来自各个转化的原始划线平板的一个克隆的单个菌+Km50Sp100落接种到16mM x 150mM塑料盖培养管中的5ml A 液体培养基中，并在Infors孵育
器(37℃，150rpm，2％CO2)中以～60°角温孵。3天后，将培养物转移到带泡沫塞的含有Km50Sp100
30ml JB2.1 的125-ml的锥形烧瓶中，至OD730＝～0.1。确定每个烧瓶培养物的初始重量，使得可以在取样时间添加无菌dH2O以补偿蒸发的量。在各个取样点，移除300μl的培养物，并用等量的新鲜JB2.1培养基补充培养物。以大约24小时的间隔，采样用于生长速度和乙醇/乙醛测定。OD730 测量和所得的生长曲线如图22所示。如本文所述，测定培养基中的乙醇和乙醛的水平，且数据分别在图23和图24中显示。

[0825] 从这些图可以看出，JCC445+782中的乙醇水平最高，另外的adhAM在λcI启动子控制下表达。由该菌株产生的乙醇的累积水平为大约4g/L。在任何给定的时间点，乙醇的测量水平显著高于在JC445或JCC445+773中测量的乙醇水平；在某些情况下，几乎为两倍高。此外，与JC445或JCC445+773(表达受PaphII启动子控制的adhAM)相比，同样的菌株只产生50％(或更少)的乙醛。因此，本实施例不仅证明提高的乙醇水平和降低的有毒中间体水平可以由控制adhAM表达的启动子的改变导致，而且还提供了具有增强的乙醇生产能力的工程化的蓝细菌的具体例子(JCC445+773)。

[0826] 出于所有目的，将本文提及的所有出版物、专利文献和序列完整引入本文中，正如其各单独地表示引入本文中一样。

[0827] 非正式序列表

[0828] SEQ ID NO：1

[0829] 密码子优化的穆尔氏菌属adhA基因

[0830] ATGTGGGAAACTAAGATTAATATCAACGAAGTCCGTGAGATCCGCGCGAAAACCACCGTTTACTTTGGTGTTGGTGCTATCAAGAAAATTGATGATATCGCTCGCGAGTTCAAAGAAAAAGGTTACGATCGCATCATCGTGATCACCGGTAAAGGCGCTTACAAAGCGACCGGTGCATGGGAATACATCGTGCCTGCTCTGAACAAAAACCAGATTACGTATATCCATTATGATCAGGTGACCCCGAACCCGACCGTAGATCAGGTTGACGAAGCGACCAAACAGGCCCGTGAATTTGGCGCTCGCGCAGTACTGGCTATTGGTGGCGGTTCCCCGATCGACGCAGCCAAATCTGTGGCGGTGCTGCTGTCTTATCCGGACAAAAACGCTCGTCAGCTGTACCAGCTGGAGTTTACCCCGGTAAAAGCAGCGCCGATCATCGCCATCAACCTGACCCACGGTACGGGCACCGAAGCGGACCGCTTCGCGGTTGTATCTATCCCGGAGAAGGCCTACAAACCGGCTATCGCTTACGATTGCATCTACCCGCTGTACTCTATTGACGACCCGGCTCTGATGGTTAAACTGCCGAGCGACCAGACGGCGTACGTTAGCGTGGATGCCCTGAACCATGTTGTTGAAGCTGCGACCTCCAAAGTTGCATCTCCGTACACTATTATCCTGGCAAAAGAAACGGTCCGTCTCATCGCACGCTACCTGCCTCAGGCCCTGTCTCACCCTGCAGACCTGACCGCGCGTTATTACCTCCTGTATGCCTCTCTGATCGCCGGTATTGCGTTTGATAACGGCCTGCTGCATTTCACCCACGCACTGGAACACCCGCTGTCTGCCGTGAAACCTGAACTGGCTCATGGCCTGGGTCTGGGTATGCTCCTGCCTGCGGTAGTTAAACAAATTTATCCGGCTACCCCGGAGGTACTGGCGGAAATCCTGGAACCAATCGTACCGGATCTGAAAGGCGTTCCGGGCGAGGCTGAGAAAGCGGCGTCTGGCGTGGCGAAATGGCTGGCTGGTGCAGGCATCACTATGAAACTGAAAGACGCGGGTTTCCAGGCTGAAGATATCGCGCGTCTGACCGACCTGGCCTTCACCACTCCATCCCTGGAACTCCTGCTGTCTATGGCACCAGTAACTGCTGATCGTGAGCGTGTGAAAGCAATTTACCAGGACGCATTTTGA

[0831] SEQ ID NO：2

[0832] 穆尔氏菌HUC22-1种和热醋穆尔氏菌的氨基酸序列

[0833] MWETKININEVREIRAKTTVYFGVGAIKKIDDIAREFKEKGYDRIIVITGKGAYKATGAWEYIVPALNKNQITYIHYDQVTPNPTVDQVDEATKQAREFGARAVLAIGGGSPIDAAKSVAVLLSYPDKNARQLYQLEFTPVKAAPIIAINLTHGTGTEADRFAVVSIPEKAYKPAIAYDCIYPLYSIDDPALMVKLPSDQTAYVSVDALNHVVEAATSKVASPYTIILAKETVRLIARYLPQALSHPADLTARYYLLYASLIAGIAFDNGLLHFTHALEHPLSAVKPELAHGLGLGMLLPAVVKQIYPATPEVLAEILEPIVPDLKGVPGEAEKAASGVAKWLAGAGITMKLKDAGFQAEDIARLTDLAFTTPSLELLLSMAPVTADRERVKAIYQDAF

[0834] SEQ ID NO：3

[0835] 下划线是PaphII；tesA、fadD和蜡用粗体表示，并依次跟随启动子

[0836]

[0837]

[0838]

[0839] SEQ ID NO：4

[0840] pJB532

[0841] GGCCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTGACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGCTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCAC CACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCATATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCACCATTCGATGGTGTCAACGTAAATGCATGCCGCTTCGCCTTCCAATTGGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCAT [0842] SEQ ID NO：5

[0843] pJB496

[0844] TTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGGCGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAGTGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAACGCTGTTTTTCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGTGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAAGCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATATTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGAACATTATCGCGAGCCCATTTATACCTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGACTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGCCCGGGCTAATTAGGGGGTGTCGCCCTTCTGAAGTGGGGCCTGCAGGCTCTCACCAAAGATTCACCTGTTAGAGCTACTCAACATCCATCAGTTCTTAAAACCAGGGGTGACATTCACCGGGGCGAGCCTTGAAGGGTTCAAGGAAAATTGTTTGCGGTATGCCAAGCCGATCAAGTGGATTCTTGGCAGAACGATCACCGACAAAATGAGCCCGCTCGAAATTGCTCAGGCGCTCCTAGGCAAGCTTGACCGGAAATTGGAATACAAGGGGCGCTTTGGATCGCGGGATAACCGTCAGCGGGTCTATGAGGCGATCGCCCCTAACGATCAGCGCGAAAAGGTCTTTGCTCATTGGTTACAGCGTGACCAAGCAAAATTAGGGGCCGTGTCCAACCCCTGTATAAATAGATTTATTCAGGAGGCTTAGACCCGTGATCGAGCGGCCGCTCATATGTAACAGGAATTCGGTTACTAGTTTTTAATTAACGAATCCATGTGGGAGTTTATTCTTGACACAGATATTTATGATATAATAACTGAGTAAGCTTAACATAAGGAGGAAAAACTAATGTTACGCAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAGGTGGCTCAAGTATGGGCATCATTCGCACATGTAGGCTCGGCCCTGACCAAGTCAAATCCATGCGGGCTGCTCTTGATCTTTTCGGTCGTGAGTTCGGAGACGTAGCCACCTACTCCCAACATCAGC CGGACTCCGATTACCTCGGGAACTTGCTCCGTAGTAAGACATTCATCGCGCTTGCTGCCTTCGACCAAGAAGCGGTTGTTGGCGCTCTCGCGGCTTACGTTCTGCCCAAGTTTGAGCAGCCGCGTAGTGAGATCTATATCTATGATCTCGCAGTCTCCGGCGAGCACCGGAGGCAGGGCATTGCCACCGCGCTCATCAATCTCCTCAAGCATGAGGCCAACGCGCTTGGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATCCCGCAGTGGCTCTCTATACAAAGTTGGGCATACGGGAAGAAGTGATGCACTTTGATATCGACCCAAGTACCGCCACCTAGGCGCGCCGCAAGGCACAATGTCTTTCTCTTATGCACAGATGGGGACTGGAAACCACACGCACAATTCCCTTAAAAAGCAACCGCAAAATAACCATCAAAATAAAACTGGACAAATTCTCATGTGTTCTTCTCAATTTCCACACTGTTTATCCACAGGAAATTAAGGGGCTGTAGCGTTGGTGCTACAGAATAAATGTAGGGATCGCCCATAGCTTTATTGCTAGCCACAGTGCTATGGGGAAAAGGAAAAGAAAAAATACCACCATGAATGGGGGTGTCAAATCTTTTGGATACTGTAAAATGATAGAGACTTTCTTAGGCGATCCCATGACGACTAGACCGAATAAGAATTTAAAATCAGCGAGCGCGGTTCGTTTTCCCCCACTCATGTACAGCGCGGCTACTAAAAAAGCCAATGAGCAAGGCTTAAATTTCAGCGACTATATCCGGGAGCTTGTTTTACGAGATTTGCTCGAAGTCTATAACAATGATGAGGCGGATCAAGATGCTGCCTAAACACGAGAAAACCCCGGCCGGCCAACGTCAAAAGGGCGACACAAAATTTATTCTAAATGCATAATAAATACTGATAACATCTTATAGTTTGTATTATATTTTGTATTATCGTTGACATGTATAATTTTGATATCAAAAACTGATTTTCCCTTTATTATTTTCGAGATTTATTTTCTTAATTCTCTTTAACAAACTAGAAATATTGTATATACAAAAAATCATAAATAATAGATGAATAGTTTAATTATAGGTGTTCATCAATCGAAAAAGCAACGTATCTTATTTAAAGTGCGTTGCTTTTTTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTCTCATATATCAAGCAAAGTGACAGGCGCCCTTAAATATTCTGACAAATGCTCTTTCCCTAAACTCCCCCCATAAAAAAACCCGCCGAAGCGGGTTTTTACGTTATTTGCGGATTAACGATTACTCGTTATCAGAACCGCCCAGGGGGCCCGAGCTTAAGACTGGCCGTCGTTTTACAACACAGAAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGGGCCTTCTGCTTAGTTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGGCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGACGCGCGCGTAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGCTTGCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCTT

[0845] SEQ ID NO：6

[0846] 青枯雷尔氏菌的乙烯形成酶(efe_rs)

[0847] ATGACCGATCTGACGACATTCCATTTGCCCGAACGCATTACCAACACGGAAGCCCACCGCGAGCTCGGGCAGGCCATGGTCAAGGCGTGGCGAACGGACGGCATTTTCCAGATCACTTTATCGAAACCCCAGGAACAGACCACGGACGAGGCTTTCGCGGAAAGCCGGCAATTTTTCTCGCAGGATTTCGAAACCAAGAGCCGCCATGTCAGCGCGCTCACCTACAGCGGCTATATCGCTTCGCGCGAGGAAGTCACGGCCGGCGAGGCGGACTATTCCGAGATCTTCACGATCTGCCCGGACATCGGCCTGGAGGATGCCCGCGTGCGGGAAAACCTGCCGTGCCACGGCCCGGTGCCCTGGCCCGGCGCGGCCTATCGGGATCGCATGAAGGCCTTCATGGGCATGCTCGGCACGTTCGGCGAGCGCCTGCTCCAGCTCATCGCGCTGGGCCTCGACCTGGACGACATGGACACGTTCACCCGCCTGACCCAGGACGGCTGGCACCATATGCGCGTGCTGCGCTTCCCCACGGTGCAGTCGTCGGAGAACGCGCGGGGCATCGGGGCGCATACCGACTACGGCATGCTCGTCATCGCGGCGCAGGACGATGTGGGCGGCCTGTATGTCCGCCCGCCGATCGAGGGCGAACGGCGCAACCGCAACTGGCTGCCATCGGAAAGCACCGCGGGGGTGTACGAGCATGACGACGGCTGGAACTTCATCAAGCCGATGCCCGCCGTGCTGACGGTCTTCCCCGGCGACTTCCTGCAATTCCTGACGGGCGGCCATCTGCTGTCGACGCCGCACAAGGTCCGCCTGAACACGCGCGAGCGCTTTGCCATGGCCTACTTCCATGAGCCGAACTTCGACGCGTGGGTCGAGCCCCTGGAGGCGGACGCCGCCGTGGCCCCCATCCACTACGGCACGCACTTCACCAACATGTTCATGCGCTGCTACCCGAAGCGCATCACCACCCGGCGGATCATGGAGAACGGGCTGCTGGACAAGCTGCCCACGCTGAGCGAACTGGCCTAG

[0848] SEQ ID NO：7

[0849] 对于大肠杆菌密码子优化的青枯雷尔氏菌乙烯形成酶(efe_rs)

[0850] ATGACTGATCTGACTACTTTTCACCTGCCGGAGCGTATTACTAACACTGAAGCTCATCGTGAACTGGGTCAGGCTATGGTGAAGGCTTGGCGTACTGATGGTATTTTCCAGATCACCCTGAGCAAACCGCAGGAACAAACGACCGATGAGGCTTTTGCAGAATCTCGTCAATTTTTCAGCCAGGACTTCGAAACGAAGTCTCGTCATGTGAGCGCACTGACCTACTCTGGTTACATCGCGTCTCGTGAGGAAGTGACTGCAGGTGAAGCGGACTACTCTGAAATCTTCACCATTTGTCCTGATATCGGCCTGGAAGATGCGCGTGTACGTGAAAACCTGCCGTGTCACGGCCCGGTTCCGTGGCCGGGTGCGGCATACCGTGATCGTATGAAAGCATTTATGGGTATGCTGGGTACTTTTGGCGAGCGCCTGCTGCAACTCATCGCTCTGGGTCTGGATCTCGATGATATGGATACCTTCACCCGTCTGACTCAGGACGGTTGGCACCACATGCGTGTTCTCCGTTTCCCAACGGTACAGTCCTCCGAAAACGCTCGCGGTATCGGCGCCCACACGGACTACGGCATGCTGGTTATCGCGGCTCAGGACGACGTGGGCGGTCTGTACGTTCGTCCGCCGATCGAGGGCGAACGTCGCAACCGCAATTGGCTCCCGTCTGAGTCTACTGCAGGCGTTTACGAACATGACGATGGTTGGAACTTCATCAAACCGATGCCAGCTGTACTGACTGTTTTCCCGGGCGATTTCCTGCAGTTTCTGACCGGTGGTCATCTGCTGTCCACCCCGCACAAGGTTCGTCTGAACACCCGCGAACGTTTCGCAATGGCTTACTTTCACGAGCCGAACTTTGACGCTTGGGTGGAGCCGCTGGAGGCTGACGCAGCCGTTGCGCCAATCCACTACGGCACCCATTTCACCAACATGTTCATGCGCTGCTATCCGAAACGTATTACCACGCGCCGTATTATGGAAAATGGCCTGCTGGATAAACTGCCGACCCTGTCTGAGCTGGCGTAG

[0851] SEQ ID NO：8

[0852] 质粒pJB336的SfiI-侧翼序列。SfiI位点是小写字母，UHR和DHR为 斜体(按顺序)，和反向互补的kan盒编码序列为粗体。

[0853]

[0854] SEQ ID NO：9

[0855] 质粒pJB342的SfiI-侧翼序列。SfiI位点是小写字母，UHR和DHR为斜体(按顺序)，lacI和TPT编码序列为加粗(按顺序)，Ptrc启动子加下划线，和spec盒编码序列为加粗并加下划线

[0856]

[0857]

[0858]

[0859] SEQ ID NO：10

[0860] 质粒pJB345的SfiI-侧翼序列。SfiI位点是小写字母，UHR和DHR为斜体(按顺序)，lacI、yihX和GLUT1编码序列为加粗(按顺序)，Ptrc启动子加下划线，和spec盒编码序列为加粗和加下划线。

[0861] pJB345；SfiI-侧翼序列

[0862]

[0863]

[0864]

[0865] SEQ ID NO：11

[0866] 质粒pJB348的SfiI-侧翼序列。SfiI位点是小写字母，UHR和DHR为斜体(按顺序)，lacI、yihX和glf编码序列为加粗(按顺序)，Ptrc启动子为加下划线，和spec盒编码序列为加粗和灰色突出显示。

[0867]

[0868]

[0869]

[0870] SEQ ID NO：12

[0871] AMY_bc

[0872] 密码子优化的DNA序列

[0873] ATGAAGAATCAATTCCAGTATTGTTGTATTGTTATTTTGAGCGTTGTTATGCTGTTTGTGAGCCTGCTGATTCCGCAAGCGTCCTCCGCAGCGGTTAATGGTAAGGGCATGAACCCAGACTATAAGGCTTACCTGATGGCACCGCTGAAAAAGATCCCAGAGGTTACGAATTGGGAAACCTTCGAAAATGACCTGCGTTGGGCGAAACAAAACGGCTTTTATGCAATCACGGTTGACTTCTGGTGGGGCGACATGGAGAAAAACGGCGACCAGCAATTTGACTTCAGCTATGCACAGCGCTTCGCGCAGTCTGTGAAAAATGCGGGTATGAAGATGATTCCGATCATCAGCACTCATCAATGCGGTGGTAATGTTGGCGATGATTGCAACGTGCCGATCCCGAGCTGGGTCTGGAATCAAAAATCCGACGACTCCCTGTACTTTAAAAGCGAAACCGGTACGGTTAATAAAGAAACCCTGAACCCGCTGGCGAGCGACGTGATCCGTAAGGAGTACGGCGAGCTGTATACTGCGTTCGCAGCCGCAATGAAGCCGTATAAGGACGTTATCGCGAAAATTTACTTGTCCGGTGGTCCGGCTGGTGAGCTGCGCTACCCGAGCTATACGACGAGCGATGGCACGGGCTATCCAAGCCGTGGTAAATTTCAGGCATATACCGAGTTCGCTAAGAGCAAATTCCGTCTGTGGGTGCTGAACAAGTACGGCAGCCTGAACGAGGTCAATAAGGCATGGGGCACCAAACTGATTAGCGAGCTGGCAATCCTGCCACCGTCCGACGGCGAGCAATTCCTGATGAATGGTTACCTGAGCATGTATGGCAAAGATTACTTGGAATGGTACCAGGGCATTCTGGAGAATCACACCAAGCTGATTGGTGAATTGGCGCATAATGCCTTCGACACGACCTTCCAGGTCCCGATCGGCGCGAAGATTGCGGGTGTGCACTGGCAGTACAACAACCCGACCATTCCTCACGGTGCTGAAAAACCGGCTGGTTACAATGACTATAGCCATCTGCTGGATGCATTCAAAAGCGCTAAGCTGGACGTCACCTTTACGTGTCTGGAAATGACCGACAAGGGCAGCTACCCGGAATATAGCATGCCGAAGACGCTGGTGCAAAACATTGCGACGCTGGCGAACGAGAAAGGCATCGTGCTGAATGGCGAGAACGCTCTGAGCATTGGTAATGAAGAGGAATATAAGCGTGTTGCGGAGATGGCATTCAACTACAATTTCGCGGGCTTTACCCTGCTGCGTTACCAGGACGTGATGTATAATAACAGCCTGATGGGTAAATTCAAGGACTTGCTGGGCGTGACCCCAGTCATGCAGACCATTGTGGTGAAAAACGTCCCGACCACGATCGGTGATACCGTCTACATCACCGGTAACCGTGCGGAGCTGGGTAGCTGGGATACCAAACAATATCCTATCCAGCTGTATTATGATAGCCACTCCAACGACTGGCGTGGCAACGTCGTGCTGCCGGCGGAGCGTAACATTGAATTTAAGGCATTTATCAAGTCTAAAGACGGCACCGTGAAAAGCTGGCAGACCATCCAGCAAAGCTGGAACCCGGTCCCGCTGAAGACCACCAGCCACACCAGCTCTTGGTAA

[0874] SEQ ID NO：13

[0875] BAA34650 AMY_bc蛋白质序列

[0876] mknqfqyccivilsvvmlfvsllipqassaavngkgmnpdykaylmaplkkipevtnwet fendlrwakqngfyaitvdfwwgdmekngdqqfdfsyaqrfaqsvknagmkmipiisthqcggnvgddcnvpipswvwnqksddslyfksetgtvnketlnplasdvirkeygelytafaaamkpykdviakiylsggpagelrypsyttsdgtgypsrgkfqaytefakskfrlwvlnkygslnevnkawgtkliselailppsdgeqflmngylsmygkdylewyqgilenhtkligelahnafdtt fqvpigakiagvhwqynnptiphgaekpagyndyshlldafksakldvtftclemtdkgsypeysmpktlvqniatlanekgivlngenalsigneeeykrvaemafnynfagftllryqdvmynnslmgkfkdllgvtpvmqtivvknvpttigdtvyitgnraelgswdtkqypiqlyydshsndwrgnvvlpaerniefkafikskdgtvkswqtiqqswnpvplkttshtssw

[0877] SEQ ID NO：14

[0878] AMY_gm

[0879] 密码子优化的DNA序列

[0880] ATGGCGACGTCTGACTCCAATATGCTGCTGAATTATGTGCCTGTGTATGTCATGTTGCCTCTGGGTGTGGTCAATGTGGACAACGTTTTTGAAGATCCGGATGGTCTGAAGGAACAACTGTTGCAATTGCGTGCGGCGGGTGTGGACGGTGTTATGGTGGATGTGTGGTGGGGCATTATCGAGCTGAAGGGTCCGAAACAGTACGACTGGCGTGCGTATCGTTCCCTGTTTCAGCTGGTTCAGGAATGTGGTCTGACTCTGCAGGCGATCATGAGCTTCCATCAATGCGGCGGTAACGTTGGTGATATCGTGAATATTCCGATCCCGCAATGGGTTCTGGATATTGGTGAATCTAACCACGACATCTTCTATACGAATCGCAGCGGTACGCGTAATAAGGAATACCTGACCGTCGGCGTCGATAACGAGCCGATTTTTCATGGCCGTACCGCTATTGAGATTTACAGCGACTACATGAAGAGCTTCCGCGAAAATATGAGCGACTTCCTGGAGTCCGGCCTGATCATTGACATTGAAGTTGGCCTGGGTCCGGCAGGTGAACTGCGCTACCCGAGCTACCCGCAGAGCCAAGGCTGGGAATTTCCGCGTATTGGCGAATTTCAATGCTACGATAAGTATCTGAAAGCAGACTTTAAAGCTGCGGTTGCGCGTGCGGGCCATCCGGAATGGGAACTGCCAGACGACGCCGGTAAGTATAACGACGTTCCGGAGAGCACTGGCTTCTTTAAGAGCAATGGTACGTACGTGACGGAAAAGGGTAAGTTTTTCCTGACCTGGTACAGCAATAAGTTGTTGAACCACGGTGACCAGATCCTGGACGAGGCGAATAAGGCCTTTCTGGGTTGTAAAGTTAAACTGGCGATCAAAGTGAGCGGCATTCACTGGTGGTATAAAGTGGAGAACCACGCCGCCGAACTGACGGCCGGTTATTACAATCTGAATGACCGTGACGGCTACCGTCCTATTGCGCGTATGCTGAGCCGCCATCACGCAATCCTGAATTTTACGTGCTTGGAGATGCGTGACAGCGAACAGCCGAGCGACGCAAAGTCTGGCCCGCAGGAATTGGTTCAGCAGGTCCTGAGCGGCGGCTGGCGCGAGGACATTCGCGTTGCCGGCGAAAATGCACTGCCGCGTTACGATGCAACCGCATATAATCAGATCATTCTGAATGCGAAGCCGCAAGGTGTCAATAACAATGGTCCGCCGAAACTGAGCATGTTCGGTGTTACGTATCTGCGTCTGAGCGACGATCTGCTGCAAAAGTCTAATTTCAATATTTTCAAGAAATTTGTCTTGAAGATGCACGCGGACCAGGACTATTGCGCAAATCCGCAGAAATACAATCACGCCATTACCCCGCTGAAGCCGAGCGCACCGAAGATCCCGATTGAGGTCCTGTTGGAAGCGACCAAACCAACCCTGCCGTTTCCGTGGCTGCCGGAGACGGACATGAAGGTTGATGGTTAA

[0881] SEQ ID NO：15

[0882] CAA50551(AMY_gm)蛋白质序列

[0883] matsdsnmllnyvpvyvmlplgvvnvdnvfedpdglkeqllqlraagvdgvmvdvwwgiielkgpkqydwrayrslfqlvqecgltlqaimsfhqcggnvgdivnipipqwvldigesnhdifytnrsgtrnkeyltvgvdnepifhgrtaieiysdymksfrenmsdflesgliidievglgpagelrypsypqsqgwefprigefqcydkylkadfkaavaraghpewelpddagkyndvpestgffksngtyvtekgkffltwysnkllnhgdqildeankaflgckvklaikvsgihwwykvenhaaeltagyynlndrdgyrpiarmlsrhhailnftclemrdseqpsdaksgpqelvqqvlsggwredirvagenalprydataynqiilnakpqgvnnngppklsmfgvtylrlsddllqksnfnifkkfvlkmhadqdycanpqkynhaitplkpsapkipievlleatkptlp fpwlpetdmkvdg

[0884] SEQ ID NO：16

[0885] Mex1

[0886] 密码子优化的DNA序列

[0887] ATGGAGGGCAAAGCAATTGCAACTTCTCTGGGTGGTGACCGTGTTCTGATCTTTCCATGCTCCCCGCGTAGCAGCTTCGTTTTCACCTCTCGTTTGTCTTCCTTGCCGCTGAAGCGTGCCAGCATCGGTGGTGCAGTGAGCTGTAGCGGTGTCAATGGCCTGACCCGCTGGAATAGCATTGTGAGCACCCGTCGCCTGGTCCCGGTCCGCAGCATCAATAGCGAGAGCGATAGCGACAGCGATTTCCCGCATGAGAATCAGCAAGGTAACCCGGGTCTGGGTAAGTTTAAAGAGTACCAAGAATGGGACAGCTGGACCGCTAAATTCAGCGGCGGTGCAAATATTCCGTTCCTGATGCTGCAATTGCCGCAGATCATCCTGAATACGCAGAATCTGCTGGCAGGTAATAACACGGCGCTGTCGGCCGTGCCGTGGCTGGGTATGTTGACCGGCCTGCTGGGTAATCTGTCCTTGCTGAGCTATTTCGCAAAGAAGCGTGAAAAGGAGGCAGCGGTCGTTCAGACCCTGGGTGTCGTGTCTACGCACATTGTGCTGGCGCAGCTGACTATGGCCGAGGCGATGCCAATCCAATACTTCGTTGCAACCAGCGCTGTCGTGACGATCGGTCTGATTGTGAACTGCCTGTATTACTTTGGTAAGCTGTCCAAGACTGTGTGGCAACTGTGGGAAGACGTGATCACCATCGGTGGCCTGAGCGTCCTGCCGCAAATTATGTGGTCTACCTTCGTGCCTTTGGTTCCAAATAGCATCTTGCCGGGTACGACCGCGTTCGGTATCGCGGTTGCTGCGATTATCATGGCTCGCACCGGTAAACTGAGCGAGAAGGGCGTGCGTTTTGTTGGTTCCCTGAGCGGCTGGACGGCCACCCTGATGTTCATGTGGATGCCGGTTAGCCAAATGTGGACCAATTTTCTGAACCCGGATAACATTAAAGGTCTGAGCAGCATCACCATGCTGCTGTCCATGATGGGCAACGGCCTGATGATCCCGCGTGCTCTGTTCATTCGTGATCTGATGTGGCTGACCGGTTCGTTGTGGGCGACCTTGTTCTACGGTTACGGTAATATTCTGTGTTTGTATCTGGTGAACTGTACCAGCCAAAGCTTCTTTGTTGCGGCAACCATCGGCCTGATCAGCTGGATTGGCCTGGCGCTGTGGCGCGACGCGGTGGCGTACGGTCACAACAGCCCGTTTCGTTCCTTGAAAGAACTGGTGTTCGGTCCGTAA

[0888] SEQ ID NO：17

[0889] AAF04350(Mex1)蛋白质序列

[0890] megkaiatslggdrvlifpcsprssfvftsrlsslplkrasiggavscsgvngltrwnsivstrrlvpvrsinsesdsdsdfphenqqgnpglgkfkeyqewdswtakfsgganipflmlqlpqiilntqnllagnntalsavpwlgmltgllgnlsllsyfakkrekeaavvqtlgvvsthivlaqltmaeampiqyfvatsavvtiglivnclyyfgklsktvwqlwedvitigglsvlpqimwstfvplvpnsilpgttafgiavaaiimartgklsekgvrfvgslsgwtatlmfmwmpvsqmwtnflnpdnikglssitmllsmmgnglmipralfirdlmwltgslwatlfygygnilclylvnctsqs ffvaatigliswiglalwrdavayghnsp frslkelvfgp

[0891] SEQ ID NO：18

[0892] setA

[0893] 密码子优化的DNA序列

[0894] ATGATCTGGATCATGACGATGGCACGCCGTATGAACGGTGTCTACGCCGCCTTTATGCTGGTGGCGTTTATGATGGGTGTCGCCGGTGCGCTGCAGGCGCCAACGCTGAGCCTGTTTCTGTCTCGTGAAGTCGGTGCGCAGCCGTTCTGGATTGGTTTGTTCTACACGGTTAACGCGATCGCAGGTATTGGTGTGAGCCTGTGGCTGGCTAAGCGTTCCGACTCGCAGGGTGACCGCCGCAAACTGATCATTTTCTGTTGCCTGATGGCGATTGGTAATGCGCTGCTGTTTGCGTTTAACCGTCATTACTTGACCTTGATCACGTGCGGCGTTCTGCTGGCGAGCCTGGCAAACACCGCTATGCCGCAGCTGTTCGCGCTGGCGCGCGAGTATGCTGATAACAGCGCGC GTGAGGTGGTTATGTTTAGCTCGGTGATGCGCGCACAGTTGTCTCTGGCTTGGGTCATCGGTCCGCCGCTGGCGTTCATGCTGGCGTTGAATTATGGTTTCACGGTGATGTTCAGCATCGCAGCCGGCATCTTCACCCTGAGCCTGGTGTTGATTGCATTCATGCTGCCGAGCGTCGCGCGCGTGGAGCTGCCGTCCGAAAACGCCCTGAGCATGCAAGGTGGCTGGCAAGATTCTAATGTTCGTATGCTGTTCGTGGCAAGCACCCTGATGTGGACTTGCAACACGATGTATATCATCGACATGCCGCTGTGGATCAGCAGCGAACTGGGTCTGCCAGACAAACTGGCGGGCTTTCTGATGGGTACTGCGGCGGGTCTGGAGATTCCGGCAATGATCTTGGCGGGTTATTACGTTAAGCGTTATGGTAAACGCCGCATGATGGTCATCGCGGTTGCAGCGGGCGTGCTGTTCTATACGGGCCTGATCTTCTTTAACTCCCGTATGGCCCTGATGACGTTGCAACTGTTCAATGCTGTCTTCATTGGCATTGTGGCGGGCATTGGTATGCTGTGGTTCCAGGACCTGATGCCGGGTCGTGCTGGTGCAGCGACGACCTTGTTCACCAATTCCATTTCGACCGGTGTCATCCTGGCGGGTGTGATCCAGGGTGCGATTGCACAGAGCTGGGGTCACTTCGCAGTGTACTGGGTTATTGCGGTTATTTCCGTGGTTGCGCTGTTTCTGACGGCGAAGGTTAAGGATGTGTAA

[0895] SEQ ID NO：19

[0896] YP_025293(setA)蛋白质序列

[0897] miwimtmarrmngvyaafmlvafmmgvagalqaptlslflsrevgaqp fwigl fytvnaiagigvslwlakrsdsqgdrrkliifcclmaignallfafnrhyltlitcgvllaslantampqlfalareyadnsarevvmfssvmraqlslawvigpplafmlalnygftvmfsiaagiftlslvliafmlpsvarvelpsenalsmqggwqdsnvrmlfvastlmwtcntmyiidmplwisselglpdklagflmgtaagleipamilagyyvkrygkrrmmviavaagvlfytgliffnsrmalmtlqlfnavfigivagigmlwfqdlmpgragaattlftnsistgvilagviqgaiaqswghfavywviavisvvalfltakvkdv

[0898] SEQ ID NO：20

[0899] PaphII

[0900] 密码子优化的DNA序列

[0901] GGGGGGGGGGGGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGT

[0902] SEQ ID NO：21

[0903] Pamt2

[0904] 密码子优化的DNA序列

[0905] AGAGCGTTACTGCCGATGCTAATGCTTTGCAGAAGAGGATTCATTCCCCTCTTTTTCAGTGTACCGTGCACTTCCTCGTTCCACTAGATTGGAGCCCAAATATCATCAGAGTACTGCTTTTCCCGGGCCGGCAAATTGTGGACAAACAGTAACAAAAGTTGGCAGTGAACAATTCATTCCCTCCTAAGATGCCATCTTGAGAAAAATTTCACTTTTCCAGGGAGTTGATTTAGTATAGGC

[0906] SEQ ID NO：22

[0907] lacIq-Ptrc

[0908] 密码子优化的DNA序列

[0909] CTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTGACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGCTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCATATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCACCATTCGATGGTGTCAACGTAAATGCATGCCGCTTCGCCTTCCAATTGGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCAT

[0910] SEQ ID NO：23

[0911] 来自拟南芥的CER5蜡转运体(Q9C8K2)

[0912] MELESTSNGRRPPPPAEIGRGAYLAWEDLTVVIPNFSGGPTRRLLDGLNGHAEPGRIMAIMGPSGSGKSTLLDSLAGRLARNVIMTGNLLLNGKKARLDYGLVAYVTQEDILMGTLTVRETITYSAHLRLSSDLTKEEVNDIVEGTIIELGLQDCADRVIGNWHSRGVSGGERKRVSVALEILTRPQILFLDEPTSGLDSASAFFVIQALRNIARDGGRTVVSSIHQPSSEVFALFDDLFLLSSGETVYFGESKFAVEFFAEAGFPCPKKRNPSDHFLRCINSDFDTVTATLKGSQRIRETPATSDPLMNLATSEIKARLVENYRRSVYAKSAKSRIRELASIEGHHGMEVRKGSEATWFKQLRTLTKRSFVNMCRDIGYYWSRIVIYIVVSFCVGTIFYDVGHSYTSILARVSCGGFITGFMTFMSIGGFPSFIEEMKVFYKERLSGYYGVSVYIISNYVSSFPFLVAIALITGSITYNMVKFRPGVSHWAFFCLNIFFSVSVIESLMMVVASLVPNFLMGLITGAGIIGIIMMTSGFFRLLPDLPKVFWRYPISFMSYGSWAIQGAYKNDFLGLEFDPMFAGEPKMTGEQVINKIFGVQVTHSKWWDLSAIVLILVCYRILFFIVLKLKERAEPALKAIQAKRTMKSLKKRPSFKKVPSLSSLSSRRHQPLHSLSSQEGLTSPIN

[0913] SEQ ID NO：24

[0914] 来自大肠杆菌的fadL(NP_416846.2)

[0915] MSQKTLFTKSALAVAVALISTQAWSAGFQLNEFSSSGLGRAYSGEGAIADDAGNVSRNPALITMFDRPTFSAGAVYIDPDVNISGTSPSGRSLKADNIAPTAWVPNMHFVAPINDQFGWGASITSNYGLATEFNDTYAGGSVGGTTDLETMNLNLSGAYRLNNAWSFGLGFNAVYARAKIERFAGDLGQLVAGQIMQSPAGQTQQGQALAATANGIDSNTKIAHLNGNQWGFGWNAGILYELDKNNRYALTYRSEVKIDFKGNYSSDLNRAFNNYGLPIPTATGGATQSGYLTLNLPEMWEVSGYNRVDPQWAIHYSLAYTSWSQFQQLKATSTSGDTLFQKHEGFKDAYRIALGTTYYYDDNWTFRTGIAFDDSPVPAQNRSISIPDQDRFWLSAGTTYAFNKDASVDVGVSYMHGQSVKINEGPYQFESEGKAWLFGTNFNYAF

[0916] SEQ ID NO：25

[0917] 来自假单胞菌的XylN(Q8VMI2)

[0918] MKIKNLPNKVISGAILGIASSHAIATDGLFLEGFGAISRSMGGTAVAHYVGPASMMVNPATMDLSDSAGELLLGFDLITTDIGATNPETGQHVS SSDHSNNRGPYVAPQFAYIHKVSNWTFGAGVFAQAGVGVEYGNDSFLSRGDVGGKGYAAGADTGLENASRLFILDIPFAASFKVNDRLAIGGSLDAKWTGLNLDYLLGMNQLGSLAGDGRASGSLMGVIGTLPDPRGVHLSVSKNKEMSSGVDGWGYSARLGLLYKVAPTTNVGVSYMFKSHMNDLKGKGTVTAVDGIAGNVPIEGEVRFLDFNTPAKLDVGISHQVTDKWLIAFDVSRVFWKDALKDIKLGFASGMGDVDLKLPQDAKDQTIMAIGTSYSVTPRLTLRAGYRHATQPFNDEGLLALIPAVLQDHASLGFSYQLSKSGRFDAAYSHAFKESMTNRSAYNTSSPVKSSIAQDNFVLAYNYSF

[0919] SEQ ID NO：26

[0920] 促进脂肪酸酯分泌的构建体

[0921] 所使用的UHR和DHR序列以黑体突出显示。amt1_160启动子加下划线，而大肠杆菌fadL基因、转录终止子(来自运动发酵单胞菌的adhII终止子)和kan盒部分为斜体。 [0922]

[0923]

[0924] SEQ ID NO：27

[0925] JCC782中adhAM上游的序列

[0926] λcI启动子序列为简单小写字母；大写A是转录起始位点；斜体序列是来自PCC7002的rbcL 5’UTR序列；加下划线的、大写字母表示基因中的第一密码子

[0927]