소화효소들을 함유하는 고형 조성물들의 용해 시험 방법

소화효소들을 함유하는 고형 조성물들의 용해 시험 방법{METHOD FOR DISSOLUTION TESTING OF SOLID COMPOSITIONS CONTAINING DIGESTIVE ENZYMES}

본 발명은 형광 분광법에 의해 용해 배지 내에서 고형 조성물로부터 방출된 소화 효소들의 양을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 판크레리파아제를 포함하는 고형 조성물의 용해 및 위저항(gastroresistance) 둘 다를 측정하기 위한 결합된 방법에 관한 것이다.

정제 또는 캡슐과 같은 고형 약학적 조성물 또는 제형은 일반적으로 유효 성분(들) 및 부형제(들)의 혼합물로 이루어진다. 경구 투여 후 고형 조성물 형태로부터의 유효 성분(약물)의 흡수의 재현성은 조성물로부터의 약물의 방출 및 생리학적 조건들 하에서의 약물의 용해 또는 가용성과 같은 여러 요소들에 의존한다. 조성물로부터의 약물의 방출 및 약물의 용해 또는 가용성의 한계 특성 때문에, 용해 테스트는 약물의 생체 내 성능의 예측에 매우 크게 관련된다. FDA 및 EMA와 같은 약물 승인청들은 종종 제약 기업들에게 승인을 얻기 위해 어떠한 신규 약학적 조성물의 약물 방출 특성을 결정할 것을 요구한다. 이러한 테스트들은 또한, 제품들을 허가하거나, 생물학적 등가성 요건들을 포기하거나, 권장되는 것과 다른 생물학적 등가성 요건들에 대한 요구들을 지지하는 데 있어서, 약학적 조성물의 배치간(batch-to-batch) 품질을 평가하기 위한 USP 품질 파라미터로서 요구될 수 있다.

다양한 프로토콜들이 시험관 내 용해 테스트들을 실시하기 위해 개발되었으며 제품 개발 및 품질 제어 둘 다를 위해 정기적으로 적용된다. 약물 용해 테스트는 대부분 미국 약전(US Pharmacopoeia) 및 유럽 약전(European Pharmacopoeia), 예를 들어, USP 34 <711> 및 EP 7.2, 2.9.3와 같은 권장 전서 방법들 및 장치들을 사용하여 실시된다. 이러한 테스트들에 일반적으로 사용되는 용해 배지는 예를 들어, 물 및 인산염 버퍼 또는 시트르산염 버퍼와 같은 버퍼이다. 다른 교반 방법들에 근거한 다른 유형의 용해 장치들이 상업적으로 입수가능하며 전서 방법들에 의해 인지된다. 이러한 장치들은 다음을 포함한다: 패들, 바스켓, 플로우-스루(flow-through), 및 왕복 실린더. 정확한 과정들(프로토콜들) 및 장치들이 다르지만, 모든 약물 용해 테스트 방법들은, 테스트 하에서 약물의 분해 및 용해를 촉진시키기 위해 용해 배지 내로 약학적 조성물 또는 제형을 위치시키고 용해 배지에 몇몇 교반을 적용하는 것을 포함한다.

용해 배지 및 용해 배지 내에서의 방출된 약물의 양을 결정하기 위한 검출 방법은 약물의 화학적 성질에 좌우되며(그에 따라 선택됨), 물리적 고려사항들 및 안정성 고려사항들 또한 적합한 선택을 하기 위해 매우 중요하다.

판크레리파아제 서방성 캡슐과 같은 약학적 경구 제형으로부터의 소화 효소들 방출의 결정을 위한 USP 모노그래프인 판크레리파아제 서방성 캡슐(Delayed Release Capsule)에 포함된 테스트는 리파아제 활성의 특정한 측정에 근거한다. 이러한 방법은 긴 분석 시간이 요구되며 여러 문제점들에 의해 영향을 받는다. 주요 문제점은 용해 배지, 좀 더 정확하게는 장 단계(enteric stage) 버퍼(pH 6.0) 용해 배지 내에서의 마커-리파아제의 불안정성이다. 리파아제 분해의 규모는 확립될 필요가 있으며 그런 다음 테스트 동안 리파아제 활성 손실을 해명하기 위한 용해 계산으로 교정 인자가 도입된다. 게다가, 방법의 복잡성(시약/기질들 제제 내 및 분석적 결정 둘 다)은 결과들의 다양성을 상당히 증가시키며 실험실 간/실험실 내 결과의 재현성을 악화시킨다. 게다가, 리파아제 검정은 좁은 선형성 범위(8 내지 16 USP 단위/mL)를 갖는다. 즉, 이러한 검정은 6,400 내지 12,800 USP UI/캡슐 범위의 캡슐 강도만을 다루므로 상당한 제약을 나타내며, 따라서 단일 단위 테스트 접근법은 실행될 수 없다. 현재 방법에서의 긴 분석 시간은 다중-점 용해 프로필을 결정하기 위해 이를 사용하는 가능성을 제한한다.

고형 조성물로부터의 소화 효소들의 방출을 측정시 이러한 문제점들을 어떻게 해소할지를 기재하고 있는 방법/과정은 없다.

판크레리파아제 및 다른 췌장 효소 제품들(pancreatic emzymes product, PEP)과 같은 소화 효소들은 외분비 췌장 부전증(exocrine pancreatic insufficiency, EPI)을 앓고 있는 환자들에게 투여될 수 있다. 소화 효소 보조제의 투여는 환자들이 그들의 식사를 좀더 효과적으로 소화시킬 수 있도록 한다.

200,000명 이상의 미국인들이 앓고 있는 것으로 FDA에 의해 평가되고 있는 외분비 췌장 부전증(EPI)은 개인들이 그들의 췌장으로부터 만들어지는 소화 효소들의 부족으로 인해 음식물을 적절히 소화시키지 못하는 생리학적 장애를 포함한다. 소화 효소들의 이러한 손실은 소화불량 및 영양소들의 흡수 불량과 같은 장애들을 야기하며, 이는 영양실조 및 이에 관련된 결과적인 바람직하지 않은 생리학적 증상들을 야기한다. 이러한 장애들은 낭포성 섬유증(cystic fibrosis, CF) 및 췌장암, 췌장 절제 및 췌장염과 같은 췌장의 외분비 기능이 제대로 발휘되지 않는 다른 증상들을 앓고 있는 이들에게 일반적이다. 영양실조는 특히 영유아및 CF 환자들의 경우에, 치료받지 않고 방치한다면 생명을 위협할 수 있으며 장애는 손상된 성장, 위태로운 면역 반응 및 단축된 기대 수명을 야기할 수 있다.

판크레리파아제 및 다른 췌장 효소 제품(PEP)과 같은 소화 효소들은 적어도 부분적으로 EPI를 치료하기 위해 투여될 수 있다. 투여된 소화 효소들은 환자들이 자신들의 음식물을 좀 더 효과적으로 소화시킬 수 있도록 한다.

손실된 소화 기능을 보상하기 위해 EPI의 치료에 사용되어온 췌장 효소는 60년 이상 동안 사용되어 왔다. 최근까지 이들의 사용은 안정성 및 효능에 근거한 약물 승인 및 제조 제어를 관리하는 현대 규제 가이드라인으로 다뤄지지 않았다. 최근, 췌장 효소 대체 요법이, 시판 췌장 효소 제품들이 상업적으로 유지하기 위해 현재 약물 승인 과정을 통과하는 것을 요구하는 미국 및 유럽 규제 권한 계획의 대상이 되어 왔다. Zenpep®, Creon® 및 Pancreaze®은 FDA가 정한 공정을 성공적으로 통과한 세 개의 제품들로서 미국에서 판매가 허용된다. 유사한 계획들이 여전히 진행중이거나 아직까지 시행되고 있는 다른 지역/국가에서, 다양한 췌장 효소 제품들이 여전히 입수가능하다.

판크레리파아제와 같은 소화 효소들을 함유하는 캡슐들이 경구 투여용으로 개발되었다. 그러나, 환자가 캡슐을 삼키기 힘들다면, 각 캡슐은 개방되어 내용물이 소량의 음식물, 일반적으로 부드러운 산성 음식물(예컨대 상업적으로 구입가능한 사과소스)에 뿌려져 환자에게 스푼으로 경구적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 이러한 약들은 투여가 잘 받아들여질 수 있도록 배지 내에 현탁된 내용물들을 함유하는 주사기 장치를 사용하여 영유아 및 아동에게 경구적으로 투여될 수 있다.

판크레리파아제 제품들은 일반적으로 세 부류의 효소인 리파아제, 아밀라아제, 및 프로테아제를 포함하는 것으로 표지되며, 그 함유량 또는 효능이 열거 된다. 이러한 효소는 지방을 글리세롤 및 지방산들로, 전분을 덱스트린 및 당류로, 및 단백질들을 아미노산 및 유래 성분들로 가수분해하는 것을 촉매한다. 그러나, 소화는 모든 범위의 소화 산물들의 적절한 소화 기능 및 생성에 기여하는 많은 다른 효소 및 기질과 관련되어 있다. 판크레리파아제에 포함되는 다른 효소는, 특히 트립신, 카르복시펩티다아제, 엘라스타아제, 포스포리파아제, 및 콜레스테라아제 및 다양한 공동-인자와 보효소를 포함한다. 이러한 기질들은 췌장에서 자연적으로 생성되며 또한 적절한 소화 기능에 기여한다.

판크레리파아제는 일반적으로 돼지의 췌장샘들로부터 제조되나, 다른 소스, 예를 들어, 본원에 다목적으로 이의 전체가 참고문헌으로 각각 통합된, US 6,051,220, US 2004/0057944, US 2001/0046493, 및 WO2006044529에 기재된 것들 또한 사용될 수 있다.

췌장 효소는 거의 중성 및 약간 알칼리인 조건들 하에서 최적 활성을 보인다. 위(gastric) 조건들 하에서, 췌장 효소는 불활성화되어 생물학적 활성의 손실을 야기할 수 있다. 그러므로, 외인성 투여된 효소는 일반적으로 위(gastric) 불활성화에 대항하여 보호되어 위를 통과하여 십이지장으로 이동하는 동안 온전히 유지된다. 그러므로, 췌장 효소를 코팅하는 것이 바람직하다. 췌장 리파아제는 위(gastric) 불활성화에 가장 민감하며 흡수불량의 치료에 중요한 효소이다. 리파아제 활성은 일반적으로 리파아제를 함유하는 효소 조성물의 안정성을 결정하기 위해 평가된다. Ortenzi 등에 허여된 US 7,658,918의 전체 내용은 다목적으로 이의 전체가 본원에 명확히 통합되었으며, 안정적인 소화 효소 조성물들을 기재하고 경구적으로 투여된 특정 미립자 약물들이 환자의 위를 통과한 후 장 내로 방출되도록 설계됨을 설명한다. 환자, 특히 영유아 및 아동에게 이러한 미립자 약물들의 적정 투여량을 투여하는 것은 가능한 한 정확해야 할 것이다.

불행하게도, 다른 실험실에서 실시될 준비가 된, 우수한 정확도 및 우수한 민감도로 고형 약학적 조성물 또는 제형으로부터 방출되는 소화 효소들의 양을 측정하기 위한 방법은 기재되지 않았다.

본 발명은 형광 분광법에 의해 용해 배지 내의 고형 조성물로부터 방출된 소화 효소들의 양을 측정하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 판크레리파아제를 포함하는 고형 조성물들의 용해 및 위저항 둘 다를 측정하기 위한 결합된 방법에 관한 것이다.

도 1은 판크레리파아제 비드들(Zenpep® 미니정제들)의 용해 프로필을 프로테아제 검정(평균 곡선)으로 나타낸 것이다.
도 2는 판크레리파아제 비드들(Zenpep® 미니정제들)의 용해 프로필을리파아제 검정(평균 곡선)으로 나타낸 것이다.
도 3은 판크레리파아제 비드들(Zenpep® 미니정제들)의 용해 프로필을 형광 분광법에 의한 총 단백질들 검정(평균 곡선)으로 나타낸 것이다.
도 4a는 판크레리파아제 비드들(Zenpep® 미니정제들)의 용해 프로필을 효소-특이 측정 vs 총 단백질들 함량의 형광 측정으로 나타낸 것이다.
도 4b는 판크레리파아제 비드들(Zenpep® 미니정제들)의 용해 프로필을 리파아제 검정 vs 총 단백질들 함량의 형광 측정으로 나타낸 것이다.
도 4c는 판크레리파아제 비드들의 용해 프로필들(Zenpep® 미니정제들)을 프로테아제 검정 vs 총 단백질들 함량의 형광 측정으로 나타낸 것이다.
도 5는 판크레리파아제 조성물들의 용해 프로필들(Zenpep® and Creon®)을 나타낸 것이다.

본 발명은 형광 분광법에 의해 용해 배지 내에서 고형 조성물로부터 방출된 소화 효소들의 양을 측정하는 방법에 관한 것이다. 양은 고형 조성물 또는 제형 또는 단일 단위 형태로부터 방출된 소화 효소들의 %로서 측정된다.

본 발명의 방법의 다른 구현예에서, 고형 조성물은 판크레리파아제를 포함하는 제형이며, 좀 더 구체적으로는 약학적으로 불활성인 부형제들을 포함하는 장용 코팅된 판크레리파아제 조성물이다.

다른 구현예에서, 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 용해 배지 내에서 고형 판크레리파아제 조성물이 소화 효소들을 방출하도록 하는 단계, (b) 형광을 판독하여 배지 내의 소화 효소들의 양을 측정하는 단계.

본 발명의 다른 구현예에서, 용해 배지는 물, HCl 용액, 유사 위액, 버퍼 용액, 유사 장액, 또는 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는 수성 또는 버퍼 용액이다.

다른 구현예에서, 용해 배지는 연속적으로 적용되는 적어도 두 개의 배지들로 이루어진다. 두 단계의 용해 테스트가 또한 본 발명의 방법에서 실행될 수 있다. 제1 단계는 산성 단계이며 용해 배지는 약 1 내지 약 4.5의 범위, 또는 약 1 내지 약 2의 범위, 또는 약 1.2의 pH와 같은 산성 pH를 갖는 수성 배지이다. 제2 단계는 5초과, 또는 약 5.5 내지 약 6.8, 또는 약 6의 pH를 갖는 수성 버퍼 용액인 제2 용해 배지 내에서 실시된다.

본 발명에 따른 방법에서, 용해 배지 내에서 조성물로부터 방출된 소화 효소들을 검출하기 위해 사용된 기술은 형광 분광법이다.

분자들은 에너지 수준으로 언급되는 다양한 상태들을 갖는다. 형광 분광법은 주로 전자 및 진동 상태들에 관련되어 있다. 일반적으로, 실험될 종들은 기저 전자 상태(ground electronic state), 및 더 높은 에너지의 여기된 전자 상태를 갖는다. 이러한 각 전자 상태들 내에서 다양한 진동 상태들이 존재한다. 형광 분광법에서 종들은 우선 이의 기저 전자 상태로부터 여기된 전자 상태에서의 다양한 진동 상태들 중 하나로, 광자 흡수에 의해, 우선 여기된다. 그런 다음 분자는 기저 전자 상태의 다양한 진동 수준들 중 하나로 다시 떨어지며, 이 과정에서 광자를 발산한다. 분자들이 기저 상태에서의 여러 진동 수준들 중 어느 것으로 떨어짐에 따라, 발산된 광자들이 서로 다른 에너지들 및 이에 의한 주파수들을 가질 것이다. 단백질의 형광 반응은 방향족 성분(moiety)을 함유하는 아미노산들(트립토판, 티로신 또는 페닐알라닌)의 존재에 기인한 것이다. 단백질의 형광 반응은 일반적으로 280 nm의 여기 파장으로 수득된다. 단백질들에서의 형광 발광의 대부분은 트립토판 잔기들의 여기에 기인한 것이며, 이 때 티로신 및 페닐알라닌의 기여는 미미하다.

본원에 기재된 형광분석 방법은 상기 효소들을 포함하는 조성물 또는 제형으로부터 용해 배지 내에 방출된 소화 효소들(판크레리파아제, API)의 총 단백질 함량의 측정에 근거한다. 본원에서 사용된 용어 "총 단백질들"은 약물 제품에 의해 방출되는 단백질들 모두를 확인하는 것으로, 이는 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제와 같은 출발 고형 조성물 내에 존재하는 모든 단백질이다. 방출된 API의 직접 수치(direct value)를 얻기 위해, 바람직하게는 이 방법에서 사용된 표준이 테스트된 약물 제품와 동일한 무리로 제조되었으나, 용해된 100% API를 얻기 위해 동일한 용해 배지 내로 분쇄되고 부어졌다. 테스트된 배치의 용해는 표준 제제를 향한 분획 백분율로서 측정되었다.

본 발명의 방법은 소화 효소들을 함유하는 임의의 적합한 경구 제형과 같은, 약학적으로 불활성인 부형제들을 포함할 수 있는 판크레리파아제 고형 조성물들에 적용될 수 있다. 적합한 제형들의 비제한적 예들은 정제, 캡슐, 사세(sachet) 또는 단일 단위들을 포함한다. 특정 구현예에서, 제형은 캡슐이다. 각 제형은 API(약물)의 소화 효소 비드들(또한 단위들로 명명됨)을 포함한다. 본 발명에서, 소화 효소 비드들은 임의의 종류의 미립자들이다. 용어 "비드"는 과립, 입자, 정제, 스피어, 미니정제, 마이크로정제, 미세입자, 마이크로스피어, 미니마이크로스피어, 마이크로캡슐, 및 마이크로펠렛을 포함한다. 비드는 임의의 적합한 입자 크기 또는 모양을 가질 수 있다. 비드는 특히 약 50 내지 약 5,000 ㎛ 범위의 크기를 가지며, 더 구체적으로 이들은 약 2 내지 약 5 mm, 또는 약 2 mm 미만, 예를 들어 약 1~2 mm 범위의 명목상(예를 들어, 평균) 입자 직경을 가질 수 있다. "미니마이크로스피어"는 1.15 mm의 가장 작은 중간값 크기를 갖거나 "마이크로정제"는 본 발명의 방법에서 역시 적합한 가장 큰 2.63 mm의 중간값 크기를 갖는다. 비드들은 약 800 ㎛ 미만, 바람직하게는 500 ㎛ 미만, 바람직하게는 약 400 ㎛ 내지 약 600 ㎛ 또는 약 250 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 평균 크기를 가질 수 있다. 이러한 비드들은 적어도400 ㎛의 부피 직경(volume diameter)(d(v,0.1)(부피 분포의 10%가 이 수치 미만이고 부피 분포의 90%가 이 수치 이상인 직경으로서 규정됨) 및 900 ㎛ 이하의 부피 직경 d(v,0.9),(부피 분포의 90%가 이 수치 미만이고 부피 분포의 10%가 이 수치 이상인 직경으로서 규정됨)을 갖는다.

약학적 제품들의 조제에 적합한 모든 소화 효소들 비드들, 더 구체적으로 판크레리파아제 효소 비드들은 장용성 층(enteric layer)에 의해 코팅될 수 있다. 판크레리파아제 코어가 장용 코팅에 의해 둘러싸인 구현예에서, 코팅은 장벽으로서 작용하여 위의 산성 환경으로부터 약물을 보호하여 약물이 소장에 도달하기 전에 약물의 방출을 상당히 예방한다. 다른 코팅 조성물들과 장용 코팅 조성물들의 적합한 조합들이 약물 방출에 있어서 바람직한 유형의 제어 또는 치료 효과들을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 장용 코팅은 적어도 하나의 장용 폴리머(enteric polymer) 및 추가로 부형제들을 포함한다. 용어 "장용 폴리머"는 위 내용물들로부터 소화 효소들을 보호하는 폴리머를 의미하며, 예를 들어, 산성 pH에서 안정적이지만 더 높은 pH에서 급속히 분해될 수 있는 폴리머, 또는 나머지 위장관과는 대조적으로 소화 효소들이 위 내에 있는 동안 소화 효소들과 위 내용물들의 접촉이 상대적으로 적도록 보장하기에 수화 또는 침식 속도가 충분히 느린 폴리머를 의미한다. 위저항(gastro-resistant) 폴리머들의 비제한적 예들은 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스프탈레이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트, 폴리비닐아세테이트 프탈레이트, 메타크릴산의 공중합체, 메틸메타크릴레이트의 에스테르들, 및 셸락이다. 이러한 폴리머들은 다음과 같은 여러 가지 상품명으로 상업적으로 입수가능하다: Cellacefate®(셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트), Eudragit® L100, S100, L30D, FS30D, L100-55(메타크릴산의 공중합체), Aquateric®(셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트), Aqoat®(히드록시프로필 메틸셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트), HP55®(히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트). 바람직하게는 장용 코팅은 10~20 wt%의 적어도 하나의 장용 폴리머를 포함하며, 여기에서 wt%는 코팅된 입자들의 총 중량에 근거한다. 코팅은 지방족 카르복실산 및 알코올로부터 선택된 C6-C30 친유성 저분자량 분자와 같은 친유성 제제, 바람직하게는 스테아르산, 미리스트산, 미리스트 알코올 또는 스테아릴 알코올과 같은 C14-C18 카르복실산 또는 알코올을 더 포함할 수 있다. 코팅의 다른 선택적 성분들은 가소제, 항-점착제(anti-tacking agent)(예를 들어, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 콜로이드성 이산화규소 및 이의 조합들; 추가로 선택적으로 저점도 에틸셀룰로오스)이다. 적합한 가소제의 비제한적 예는 트리아세틴, 트리부틸 시트레이트, 트리에틸 시트레이트, 아세틸 트리-n-부틸 시트레이트, 디에틸 프탈레이트, 디부틸 세바케이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 피마자유, 아세틸화 모노- 및 디-글리세리드, 세틸 알코올, 미리스틸 알코올 및 이의 혼합물들을 포함한다. 바람직한 가소제는 비-프탈레이트 가소제 또는 이의 혼합물들이다.

그런 다음, 코팅된 안정화 소화 효소 입자들은 캡슐들 내로 제형화될 수 있다. 안정화 소화 효소 입자들의 특정 제형은 장용 코팅된 판크레리파아제 효소 비드들로 채워진 캡슐이다. 약 6 wt% 이하의 물 함량을 갖는 히드록시프로필메틸셀룰로오스를 포함하는 장용 코팅된 판크레리파아제 효소들을 함유하는 캡슐들은 투여를 위한 특별한 구현예이다(더 구체적으로 약 4 wt% 이하의 물 함량을 가지며; 더 구체적으로 약 2 wt% 이하의 물 함량을 가짐).

본원에서 사용된 용어 "소화 효소"는 음식물의 성분들이 분해되어 유기체에 의해 받아들여지거나 흡수될 수 있도록 하는 소화관 내의 효소를 의미한다. 소화 효소들의 비제한적 예들은 판크레리파아제(판크레아틴으로도 명명됨), 리파아제, 코-리파아제, 트립신, 키모트립신, 키모트립신 B, 판크레아토펩티다아제, 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 B, 글리세롤 에스테르 가수분해효소, 포스포리파아제, 스테롤 에스테르 가수분해효소, 엘라스타제, 키니노게나아제(kininogenase), 리보누클레아제, 디옥시리보누클레아제, α-아밀라아제, 파파인, 키모파파인, 글루테나제, 브로멜라인(bromelain), 피신(ficin), β-아밀라아제, 셀룰라아제, β-갈락토시다아제, 이소말타아제, 및 이의 혼합물들을 포함한다. 이들은 췌장 또는 췌장액들로부터 추출을 통해 수득되거나 인공적으로 제조되거나 미생물, 박테리아, 사상균, 균류, 식물 또는 다른 동물 조직들, 유전적으로 변이된 미생물, 균류 또는 식물로부터와 같은 췌장 이외의 다른 소스들로부터 수득된다.

용어 "판크레리파아제" 또는 "판크레리파아제 효소" 또는 "판크레아틴"은 췌장 기원을 갖는 아밀라아제, 리파아제, 및 프로테아제 효소, 또는 이의 혼합물을 포함하는 여러 유형의 효소들의 혼합물을 의미한다. 판크레리파아제는 예를 들어 Nordmark Arzneimittel GmbH, Scientific Protein Laboratories LLC 또는 Sigma Aldrich로부터 상업적으로 입수가능하며, 돼지, 소 또는 다른 포유동물 소스들로부터의 유사한 추출물들이 사용될 수 있다. 상업적 판크레리파아제 제형들의 예들은 Zenpep, Viokace, Ultrase, Creon, Pancreaze, 및 Panzytrat를 포함하며, 더 구체적으로, 경구 투여용 Zenpep 캡슐은 장용 코팅된 비드들(750, 3,000, 5,000 USP 리파아제 단위들에서 1.8~1.9 mm, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000 및 40,000 USP 리파아제 단위들에서 2.2~2.5 mm)를 포함한다.

용어 "리파아제"는 글리세롤 및 단순 지방산들로의 지질의 가수분해를 촉매하는 효소를 의미한다. 본 발명에 적합한 리파아제들의 예들은 동물 리파아제(예를 들어, 돼지 리파아제), 박테리아 리파아제(예를 들어, 슈도모나스 리파아제 및/또는 버크홀데리아 리파아제), 균류 리파아제, 식물 리파아제, 재조합 리파아제(예를 들어, 배양된 미생물, 박테리아, 효모, 균류, 식물, 곤충 또는 포유동물 숙주 세포들 중 어느 하나로부터 선택된 적합한 숙주 세포에 의해 재조합 DNA 기술을 통해 제조된 것, 또는 천연 서열과 상동이거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 리파아제, 천연 리파아제-암호화 핵산과 상동이거나 실질적으로 동일한 핵산에 의해 암호화된 리파아제 등), 합성 리파아제, 화학적-변이 리파아제, 및 이의 혼합물들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 용어 "지질"은 대략 지방, 왁스, 스테롤, 지용성 비타민(예를 들어, 비타민 A, D, E 및 K) 모노글리세리드, 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질 등을 포함하는 천연 분자들을 포함한다.

용어 "아밀라아제"는 전분을 분해하는 글리코사이드 가수분해효소 효소들, 예를 들어, α-아밀라아제, β-아밀라아제, γ-아밀라아제, 산 α-글루코시다제, 프티알린(ptyalin)과 같은 타액 아밀라아제 등을 의미한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 아밀라아제는 동물 아밀라아제, 박테리아 아밀라아제, 균류 아밀라아제(예를 들어, 아스페르길루스 아밀라아제, 예를 들어, 아스페르길루스 오리재 아밀라아제), 식물 아밀라아제, 재조합 아밀라아제(예를 들어, 배양된 미생물, 박테리아, 효모, 균류, 식물, 곤충 또는 포유동물 숙주 세포들 중 어느 하나로부터 선택된 적합한 숙주 세포에 의해 재조합 DNA 기술을 통해 제조된 것, 또는 천연 서열과 상동이거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 아밀라아제, 천연 아밀라아제-암호화 핵산과 상동이거나 실질적으로 동일한 핵산에 의해 암호화된 아밀라아제 등), 화학적으로 변이된 아밀라아제, 및 이의 혼합물들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "프로테아제"는 일반적으로 단백질의 아미노산들 사이의 펩티드 결합을 깨트리는 효소(예를 들어, 프로테이나아제, 펩티다아제, 또는 단백질 분해 효소)를 의미한다. 프로테아제는 일반적으로 이들의 촉매 유형, 예를 들어, 아스파르트산 펩티다아제, 시스테인(티올) 펩티다아제, 메탈로펩티다아제, 세린 펩티다아제, 트레오닌 펩티다아제, 알칼리 또는 세미-알칼리 프로테아제, 중성 및 알려지지 않은 촉매 메카니즘의 펩티다아제에 의해 확인된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 프로테아제의 비제한적 예들은 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제(예를 들어, 플라스멥신), 메탈로프로테아제 및 글루탐산 프로테아제를 포함한다. 게다가, 본 발명에 사용하기에 적합한 프로테아제는 동물 프로테아제, 박테리아 프로테아제, 균류 프로테아제(예를 들어, 아스페르길루스 멜레우스 프로테아제), 식물 프로테아제, 재조합 프로테아제(예를 들어, 배양된 박테리아, 효모, 균류, 식물, 곤충 또는 포유동물 숙주 세포들 중 어느 하나로부터 선택된 적합한 숙주 세포에 의해 재조합 DNA 기술을 통해 제조된 것, 또는 천연 서열과 상동이거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 프로테아제, 천연 프로테아제-암호화 핵산과 상동이거나 실질적으로 동일한 핵산에 의해 암호화된 프로테아제 등), 화학적으로 변이된 프로테아제, 및 이의 혼합물들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 분석된 조성물들 또는 경구 제형들의 판크레리파아제 효소는 하나 이상의 리파아제(즉, 하나의 리파아제, 또는 둘 이상의 리파아제), 또는 하나 이상의 아밀라아제(즉, 하나의 아밀라아제, 또는 둘 이상의 아밀라아제), 또는 하나 이상의 프로테아제(즉, 하나의 프로테아제, 또는 둘 이상의 프로테아제)뿐만 아니라 다른 조합들 및 비율들의 이러한 효소들의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 분석될 조성물들 또는 제형들의 리파아제 활성은 약 650 내지 약 45,000 IU(USP 방법), 약 675 내지 약 825 IU, 약 2,700 내지 약 3,300 IU, 약 4,500 내지 약 5,500 IU, 약 9,000 내지 약 11,000 IU, 약 13,500 내지 약 16,500 IU, 약 18,000 내지 약 22,000 IU, 약 22,500 내지 약 27,500 IU, 약 36,000 내지 약 44,000 IU 및 이들 수치 사이의 모든 범위들 및 부분범위들일 수 있다. 리파아제 활성들은 약 750, 약 3,000, 약 4,200, 약 5,000, 약 6,000, 약 10,000, 약 10,500, 약 15,000, 약 16,800, 약 20,000, 약 21,000, 약 24,000, 또는 약 25,000, 또는 약 40,000 IU(USP 방법) 또는 이의 복수일 수 있다. 조성물들 또는 제형들 내의 아밀라아제 활성들은 약 1,600 내지 약 6,575 IU(USP 방법), 약 6,000 내지 약 225,000 IU, 예를 들어, 약 6,400 내지 약 26,300 IU, 약 10,700 내지 약 43,800 IU, 약 21,500 내지 약 87,500 IU, 약 32,100 내지 약 131,300 IU, 약 42,900 내지 약 175,000 IU, 약 53,600 내지 약 218,700 IU 및 이들 수치 사이의 모든 범위들 및 부분범위들일 수 있다. 조성물들 또는 제형들 내의 프로테아제 활성들은 약 1,250 내지 약 3,850 IU(USP 방법), 약 5,000 내지 약 130,000 IU, 예를 들어, 약 5,000 내지 약 15,400 IU, 약 8,400 내지 약 25,700 IU, 약 16,800 내지 약 51,300 IU, 약 25,000 내지 약 77,000 IU, 약 33,500 내지 약 102,600 IU, 약 41,800 IU 내지 약 128,300 IU 및 이들 수치 사이의 모든 범위들 및 부분범위들일 수 있다. 조합된 효소 조성물들은 다음을 포함한다: (A) 리파아제 활성은 약 675 내지 약 825 IU의 범위일 수 있고, 아밀라아제 활성은 약 1,600 내지 약 6,575 IU 범위일 수 있고, 프로테아제 활성은 약 1,250 내지 약 3,850 IU 범위일 수 있다(USP 방법); (B) 리파아제 활성은 약 2,700 내지 약 3,300 IU 범위일 수 있고, 아밀라아제 활성은 약 6,400 내지 약 26,300 IU 범위일 수 있고, 프로테아제 활성은 약 5,000 내지 약 15,400 IU 범위일 수 있 다(USP 방법); (C) 리파아제 활성은 약 4,500 내지 약 5,500 IU 범위일 수 있고, 아밀라아제 활성은 약 10,700 내지 약 43,800 IU 범위일 수 있고, 프로테아제 활성은 약 8,400 내지 약 25,700 IU 범위일 수 있다(USP 방법); (D) 리파아제 활성은 약 9,000 내지 약 11,000 IU 범위일 수 있고, 아밀라아제 활성은 약 21,500 내지 약 87,500 IU 범위일 수 있고, 프로테아제 활성은 약 16,800 내지 약 51,300 IU 범위일 수 있다(USP 방법); (E) 리파아제 활성은 약 13,500 내지 약 16,500 IU 범위일 수 있고, 아밀라아제 활성은 약 32,100 내지 약 131,300 IU 범위일 수 있고, 프로테아제 활성은 약 25,000 내지 약 77,000 IU 범위일 수 있다(USP); (F) 리파아제 활성은 약 18,000 내지 약 22,000 IU 범위일 수 있고, 아밀라아제 활성은 약 42,900 내지 약 175,000 IU 범위일 수 있고, 프로테아제 활성은 약 33,500 내지 약 102,600 IU 범위일 수 있다(USP); 및 (G) 리파아제 활성은 약 22,500 내지 약 27,500 IU 범위일 수 있고, 아밀라아제 활성은 약 53,600 내지 약 218,700 IU범위일 수 있고, 및 프로테아제 활성은 약 41,800 IU 내지 약 128,300 IU범위일 수 있다(USP). 또한, 본 발명의 방법에 의해 분석될 조성물들 또는 제형들 내의 리파아제 활성은 약 5,000 PhEur 리파아제 단위들 내지 약 40,000 PhEur 리파아제 단위들일 수 있으며, 이는 약 5,000, 또는 약 10,000, 또는 약 15,000 또는 약 20,000 또는 약 30,000 또는 약 40,000 PhEur 리파아제 단위들일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 열거된 아밀라아제 활성들의 분획을 함유하는 단일 단위들 또한 본 발명의 과정으로 분석될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 열거된 아밀라아제 활성들의 분획을 함유하는 단일 단위들 또한 본 발명의 방법으로 분석될 수 있다.

조성물들 또는 제형 내 아밀라아제/리파아제 활성들의 비율은 약 1 내지 약 10의 범위, 예컨대 약 2.38 내지 약 8.75일 수 있다(효소 검정은 USP에 따라 실시됨). 이러한 비율은 약 1 내지 약 8의 범위, 예컨대 약 1.86 내지 약 5.13(효소 검정은 USP에 따라 실시됨)일 수 있거나, 비율은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10일 수 있다.

제품의 불활성 성분들은 크로스카멜로스 소듐(croscarmellose sodium), 경화 피마자유, 콜로드성 이산화규소, 미세결정질 셀룰로오스, 마그네슘 스테아레이트, 하이프로멜로스 프탈레이트, 탈크, 및 트리에틸 시트레이트를 포함한다. Aptalis Pharma의 제제들의 매 투여량은 이들의 매우 안정적인 제형에 기인하여 환자 및 의사에게 주요 췌장 효소인 리파아제, 프로테아제, 및 아밀라아제의 일관된 양을 제공한다. 캡슐들은 개봉될 수 있으며 내용물을 투여량으로 개별적으로 적정하여 나눌 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 고형 판크레리파아제 조성물이 용해 배지 내로 소화 효소들의 양을 방출하도록 하는 단계, (b) 형광을 판독하여 효소를 검출하고 배지 내의 소화 효소들을 측정하는 단계. 용해 테스트는 전서 USP 또는 EMA 방법들에 기재된 용해 장비들을 사용하거나 본 분야의 숙련자에 의해 알려지고 적용된 이러한 모든 장비들 및 프로토콜들을 사용하여 실시된다. 용해 배지는 물, HCl 용액, 유사 위액, 버퍼 용액, 유사 장액, 계면활성제를 함유하는 수성 또는 버퍼 용액과 같은 총 단백질 용해를 시험하기에 적합한 다른 용액들 중에서 선택된다. 버퍼 용액는 예를 들어, 인산염 버퍼 또는 시트르산염 버퍼일 수 있다.

특정 구현예에서, 용해 배지는 연속적으로 사용되는(두 단계) 적어도 두 개의 용해 배지로 이루어진다. 제1 용해 배지는 약 1 내지 4.5, 구체적으로 약 1 내지 약 2, 더 구체적으로 약 1.2의 산 pH를 갖는 수성 배지이며(산 단계) 제2 용해 배지는 약 5.0 초과, 구체적으로 약 5.5 내지 약 6.8, 더 구체적으로 약 6의 pH를 갖는 수성 용액이다(버퍼 장 단계).

본 발명의 다른 구현예에서, 제1 용해 배지는 약 1 내지 약 4.5의 pH를 갖는 수성 배지이고 제2 용해 배지는 약 5 초과의 pH를 갖는 수성 버퍼 용액이다.

다른 구현예에서, 제1 용해 배지는 약 1 내지 약 4.5의 pH를 갖는 수성 배지이고 제2 용해 배지는 약 5.5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 수성 버퍼 용액이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 제1 용해 배지는 약 1 내지 약 2의 pH를 갖는 수성 배지이고 제2 용해 배지는 약 5 초과의 pH를 갖는 수성 버퍼 용액이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 제1 용해 배지는 약 1 내지 약 2의 pH를 갖는 수성 배지이고 제2 용해 배지는 약 5.5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 수성 버퍼 용액이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 제1 용해 배지는 약 1.2의 pH를 갖는 수성 배지이고 제2 용해 배지는 약 6의 pH를 갖는 수성 버퍼 용액이다.

추가 구현예에서, 방법은 a) 제1 용해 배지 내에 고형 판크레리파아제 조성물을 첨가하는 단계(산 단계), b) 제2 용해 배지로 현탁액을 옮기는 단계(장 단계), c) 소화 효소들의 방출을 허용하는 단계, d) 용해 배지의 분취량을 시료화하는 단계, e) 346 nm에서 형광을 판독하는 단계, d) 방출된 소화 효소들의 양을 계산하는 단계를 포함한다. 계산은 실시예들에서 보고된 바와 같이 실시된다.

용해 테스트들을 약물 제품에 적용할 때, USP는 "Q" 값들의 계산을 요구한다. 이러한 Q 값들은 표지된 효능에 관련되며 현재 승인 기준은 리파아제 표지 활성의 75%로 고정된다.

본 발명의 형광분석은, 비록 효소 활성 측정에 특이적이지 않더라도, 효소 용해 프로필들에 완전한 상관관계를 보이므로, 총 단백질들 방출이 효소 방출과 엄격하게 관련되어 있음을 입증한다. 그러므로 "Q" 값은 하기 방식으로 본 발명에 대해 계산될 수 있다: 형광 측정을 수반한 용해 방법에서의 "Q" 값:

Q = % 용해 x 배치 리파아제 검정(USP-U/cps)

표지된 리파아제 활성(USP-U/cps)

위 식에서: % 용해는 분석 과정에서 나타낸 바와 같이 계산된, 방출된 API의 %이다; 배치 리파아제 검정은 배치 리파아제 활성이다; 표지된 리파아제 활성: 약물 제품 라벨에 표시된 리파아제 활성.

본원에 기재된 형광분석 방법이 판크레리파아제 조성물들의 버퍼 장 단계 용해 테스트를 실시하는 동안 효소 활성 측정과 완전한 상관관계를 보이므로 리파아제 활성 효소 테스트를 대체하는 방법으로서 제안되나, 이 방법은, 이것이 리파아제 검정이므로 총 단백질들 형광 측정이 막을 통한 산 투과에 의해 영향을 받지 않기 때문에, 산 단계에서 용해 동안에 발생하는 어떠한 위저항 문제를 검출할 수 없다. 리파아제 활성은 보호막을 통해 산성액이 투과할 경우 매우 감소된다. 현재 USP 테스트(리파아제 활성 측정)는 버퍼 장 단계에서 용해의 마지막에 리파아제 용해를 수반하는 산성 단계에서의 잠재적인 약한 장-저항성의 효과 및 버퍼 장 단계에서 발생하는 분해 현상을 축적한다.

그러므로, 본 발명의 다른 구현예는 위저항 테스트와 결합된 형광 분광법에 의한 용액 배지 내에서 고형 판크레리파아제 조성물로부터 방출된 소화 효소들의 양(%)을 측정하기 위한 방법이이며, 위저항은 산성 배지 노출(산 단계) 후에 특이 리파아제 검정 방법에 의해 제품의 잔여 리파아제 활성을 결정함으로써 측정된다. 이러한 구현예에서, 두 테스트들(용해 FL 테스트 및 위저항 GR 테스트)은 각 순서로 실시될 수 있다.

FL 테스트: 용해 테스트는 두 단계들(산 및 장)에서 실시된다. 제1 산 단계에서, 용해 배지는 약 1 내지 약 4.5의 산 pH, 바람직하게는 약 1 내지 약 2의 pH, 바람직하게는 약 1.2의 pH를 갖는 수성 배지이고(산 단계); 제2 장 단계에서, 용해 배지는 약 5 초과의 pH, 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.8의 pH, 바람직하게는 약 6의 pH를 갖는 수성 버퍼 용액이다(버퍼 장 단계). 장-저항 테스트는 약 1 내지 약 4.5의 산 pH, 바람직하게는 약 1 내지 약 2의 pH, 바람직하게는 약 1.2의 pH를 갖는 수성 배지 내에서 실시된다. 형광분석 테스트는 장 단계의 마지막에서 방출된 소화 효소들(API 또는 약물)을 측정한다. 승인 기준에서, Q 값은 배치 방출된 리파아제 활성 / 표지된 리파아제 활성의 비율에 의해 계산될 수 있다.

GR 테스트: 위저항 테스트는 용해 테스트의 산 단계의 조건들(용해 배지는 약 1 내지 약 4.5의 산성 pH, 구체적으로 약 1 내지 약 2의 pH, 더 구체적으로 약 1.2의 pH를 갖는 수성 용액임) 하에서 실시되고, 여기에서 위저항 %는 산성 배지에 노출시킨 후 리파아제 검정 방법으로 제품의 잔여 리파아제 활성의 결정에 의해 측정되며, 승인 기준은 USP에서 서방성 제형의 산 단계에 대해 나타낸 것들일 것이다.

상술된 기재 및 실험 부분으로부터, 본 발명의 형광분석 방법이 여러 중요한 장점들을 제공한다는 것을 알 수 있다.

본 발명은, 시약들의 조제에서 요구되는 시간이 상당이 감소되고 효소 검정에서 특이적인 분석 전문지식이 요구되지 않기 때문에 간단하고 신속한 과정을 제공한다. 따라서, 분석 전달이 매우 용이하다. 제안된 방법은 리파아제 검정보다 실행하기에 더 용이하고 신속하며 시약들의 조제에 요구되는 시간이 상당히 감소된다.

마커(총 단백질들)는 용해 배지 내에서 안정적이므로 분해에 대한 보상을 위한 교정 인자(리파아제 검정 방법에서 요구됨)가 계산시 필요하지 않다. 사실 형광 측정에서 검정된 마커(총 단백질들)은 37℃에서 pH 6의 장 단계 배지 버퍼 내에서 30 분 후에 3% 미만의 분해를 보였으나, 현재의 방법으로 측정된 리파아제 효소 활성은 37℃에서 pH 6의 장 단계 배지 버퍼 내에서 약 11%의 분해를 보인다.

신규한 방법은 또한 정확하며 우수한 민감도를 가지고 있어 정량 한계/선형성 범위가 단일 단위 테스팅에도 적합하다. 형광분석 방법은 작동 농도에서 0.3 리파아제 USP 단위들 ≒ 3 ㎍ 판크레리파아제/mL로서 리파아제 효소 검정보다 더 나은 성능 특징을 나타내며, 이는 리파아제 검정의 작동 농도의 약 1/50이다. 선형성 범위는 작동 농도의 10~200%이며, 정밀성은 반복성 및 중간 정밀성(intermediate precision)에서도 2.0%를 넘지 않는다(판크레리파아제 제형들, Zenpep®의 여섯 가지의 다른 로트의 용해 결과들에서 측정됨).

게다가, 이러한 방법으로 다중-점(>3) 용해 프로필이 시험될 수 있다.

총 단백질들 함량의 검출을 위한 발명된 형광분석 비-특이 과정은, 세 개의 측정 방법들을 사용하여 얻어진 용해 프로필들의 비교에 근거하여, 프로테아제 활성 및 리파아제 활성에 기초한 두 개의 효소-특이 검정들(현재 전서 방법)과 성능면에서 동등함이 실험 부분에서 또한 보여졌다.

상술한 일반 기재 및 하기 상세한 기재 둘 다 본 발명의 예시이나 제한적이지 않음이 이해될 것이다.

실시예

장비들, 재료들 및 방법들

장비: LS 50B Fluorescence Spectometer(Perkin Elmer), LS 55 Fluorescence Spectometer(Perkin Elmer), 람다 20 UV-VIS Spectometer (Perkin Elmer), 786 Titrando Potentiometric Titration System(Metrohm), VK-7025 용해 바스(Vankel), Premier 5100 용해 바스(Distek), USP Apparatus 1-바스켓(산 단계에서); USP Apparatus 2-패들(장 단계에서).

용해 테스트용 시약들. 산 단계 배지(pH 1.2): 800 mL의 정제수 내에 2.00 g의 염화나트륨을 위치시키고 완전히 용해될 때까지 교반한다. 7 mL의 37% HCl을 첨가하고 혼합한다. 용액의 pH를 1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용해 1.20 ± 0.05로 조정한다. 정제수를 사용하여 1000 mL로 희석한다; pH를 확인하고 필요할 경우 1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용하여 1.20 ± 0.05로 조정한다.

용해 테스트용 시약들. 장 단계 배지(pH 6.0): 9.20 g의 제1 인산칼륨 및 2.00 g의 염화나트륨을 800 mL의 정제수 내에 위치시키고 완전히 용해될 때까지 교반한다. 용액의 pH를 1 N NaOH를 사용하여 6.00 ± 0.05로 조정한다. 정제수를 사용하여 1000 mL로 희석한다; pH를 확인하고 필요한 경우1 N HCl 또는 1 N NaOH를 사용하여 6.00 ± 0.05로 조정한다.

모든 실시예들은 판크레리파아제 미니정제들(MT) 또는 마이크로정제들(MCT) 중 어느 하나의 장용 코팅된 판크레리파아제 비드들을 사용하여 실시되며, 상기 비드들은 장용 폴리머 하이프로멜로스 프탈레이트(HP55)로 코팅된 판크레리파아제 원료 및 부형제(예를 들어, 크로스카멜로오스 소듐, 경화 피마자유, 콜로이드성 이산화규소, 미세결정질 셀룰로오스, 및 마그네슘 스테아레이트)의 블렌드이다. 이러한 MT 및 MCT는 HPMC 캡슐들 내에 포함되며 Zenpep®라는 이름 하에 판매된다. 숙련자들은 대안적인 장용 폴리머들 및 부형제들이 장용 코팅된 판크레리파아제 비드들 내에서 사용될 수 있음을 인지할 것이다.

지질 분해 활성의 측정은, pH-스탯 방법에 의해서, 사용된 기질(올리브유) 내의 에스테르화 지방산의 가수분해로부터 형성된 유리 지방산의 적정(titration)에 기초한 판크레리파아제 USP 모노그래프에 기재된 리파아제 검정의 전서 과정에 근거한 방법으로 실시된다. 이는 하기 원리에 근거한다: 리파아제는 유리 지방산(free fatty acid, FFA)의 형성을 야기하는 트리글리세리드의 가수분해를 촉매한다. 시간에 따른 형성된 FFA의 적정은 리파아제의 효소 활성의 결정을 제공하며, 이는 단위들 : 1 U = 분 당 형성된 FFA의 1 μmole로서 표현될 수 있다. pH값이 고정값(pH 스탯 방법)에 비해 변할 때 NaOH(적정제)의 첨가를 제공하는 실험 시스템을 통해 꾸준한 pH값을 유지함으로써 반응이 일어난다. 시간에 따라 첨가된 적정제의 양은 트리글리세리드 상에서의 리파아제의 활동에 의해 형성된 FFA의 양에 상응한다. 적정량의 기질을 수반하고 효소가 안정적인 실험 조건들 하에서 작동할 때, 시간에 따른 FFA 형성에 대한 선형 동역학이 수득될 수 있다. 곡선 기울기{첨가된 적정제 = f(부피(mL)/시간(분))}는 리파아제 효소 활성을 제공한다.

단백질 분해 활성의 측정은 판크레리파아제 USP 모노그래프에 기재된 전서 과정에 따라 실시된다.

실시예 1 약물 제품의 표준 용액의 제조

표준 용액은 분석 하에서 제형 내에 존재하는 약물 제품의 동일 로트로 제조된다. 7,000 USP 리파아제 단위들과 등가의 판크레리파아제 비드(Zenpep® 미니탭들 또는 마이크로탭들)의 양은 막자사발 내에서 정확하게 계량된다. 5~6 mL의 장 단계 배지를 첨가하고 제품이 완전히 분산될 때까지 분쇄한다. 현탁액은 500 mL 메스 플라스크 내로 옮겨진다. 막자사발은 수 mL의 장 단계 배지로 2~3회 세척되고 액체는 상기 500 mL 메스 플라스크 내로 옮겨진다. 장 단계 배지는 최종적으로 총 500 mL가 될 때까지 상기 메스 플라스크 내로 옮겨지고 혼합물은 10분 동안 교반된다. 용해 배지로부터 시료화된 분취량들은 장 단계 배지로 1:50으로 더 희석된다. 이러한 희석으로 API의 최종 농도는 약 0.3 USP 리파아제 단위들(약 3 ㎍ 판크레리파아제/mL)이다. 이러한 마지막 희석은 용해 테스트(오직 종점에서만) 및 용해 테스트(다점)(용해 프로필)에서 실시된다.

실시예 2. 용해 테스트

800 mL의 산 단계 배지가 바스켓 장비가 장착된 용해 바스의 각 용기 내에 첨가되며, 용해 배지는 37℃에서 평형이 유지된다. 11,200 USP 리파아제 단위들(14 USP 리파아제 단위들/mL)과 등가의 판크레리파아제 비드(Zenpep 미니탭들 또는 마이크로탭들)의 양이 계량되고 6 개의 독립적인 샘플들이 이러한 방식으로 제조되어 바스켓들 내에 위치된다. 상기 장비는 100 rpm에서 작동된다. 1시간 후, 바스켓들은 배지로부터 제거되고 수 밀리리터의 물로 세척되고 각 바스켓의 내용물은 패들 장비가 부착된 37℃의 용해 바스에서 800 mL의 장 단계 배지를 함유하는 상응 용기 내로 옮겨진다. 장비는 100 rpm에서 작동된다. 30분 후 각 용기로부터 분취량의 용해 배지가 방출된 API를 측정하기 위해 시료화된다. 용해 프로필의 결정에서, 장 단계에서 용해 배지의 2.5 mL 분취량들은 10, 12, 15, 18, 30분에 시료화된다. 테스트 동안 배지 교체는 이루어지지 않으며, 부피 손실은 하기 교정 인자들에 의해 계산시 고려된다.

[표 1]

실시예 3. 형광 분광법(총 단백질들 검정)에 의한 용해 테스트에서 방출된 소화 효소들(API, 유효 성분)의 결정

실시예 2에 기재된 바와 같이 각 바스켓으로부터 시료화된 용해 배지의 각 분취량은 장 단계 배지로 1:50으로 희석된다. 희석된 용액들은 하기 작동 파라미터들을 갖는 형광 스펙트로미터에서 판독된다: 1 cm 통로길이 석영 큐벳; 여기 파장: 280 nm; 발광 파장(측정): 346 nm, 여기 슬릿: 6.0. 종점에서의 마커(API = 판크레리파아제; 100% 방출)의 표적 농도: 0.3 USP 리파아제 단위들/mL 또는 약 3 ㎍ 판크레리파아제/mL는 하기 계산으로 수득된다:

방출된 API의 양은 실시예 1에 기재된 바와 같이 동일 로트의 약물 제품들로 제조된 표준 용액에 대해 결정된다.

용해 테스트(종점)에서, 계산은 하기 식으로 실행된다.

용해 테스트(다점)(용해 프로필)에서, 계산은 하기 식으로 실행된다:

위 식에서: E _SMP 는 블랭크(blank)는 뺀, 샘플의 형광 판독(346 nm에서 발광)이다; E _STD 는 블랭크는 뺀, 표준의 형광 판독(346 nm에서 발광)이다; W _SMP 는 샘플 중량(mg)이다; W _STD 는 표준 중량(mg)이다; V _SMP 는 샘플의 희석 부피(mL)이다; V _STD 는 표준의 부피(mL)이다; FC는 교정 인자이다(표 1 참조).

실시예 4. 형광 분광법에 의한 총 단백질들 검정의 검증 연구

용해 테스트에서 판크레리파아제 조성물(Zenpep® 제형)로부터 방출된 API 내 총 단백질들 함량의 형광 결정의 성능 특성들은 하기 파라미터들, 즉 특이성, 선형성, 정확성, 정밀성, 정량 한계, 샘플 및 표준 용액의 안정성, 표준 용액의 제조시 추출의 완성도의 입증 에 의해 평가되며, 결과는 표 2에 나타냈다.

[표 2]

형광분석 방법의 검증 데이터

수득된 검증 데이터로, 판크레리파아제 제형들(Zenpep® 제형)의 용해 테스트에서 총 단백질들 함량의 결정을 위한 제안된 형광분석 방법이 의도된 용도에 적합함이 본원에서 보여진다.

실시예 5. 세 개의 측정 방법들을 갖는 판크레리파아제 비드들(Zenpep® 미니탭들)의 용해 프로필: 형광 분광법에 의한 총 단백질들 함량(비-특이 검정), 프로테아제 검정에 의한 단백질 분해 활성(효소 특이 검정), 및 리파아제 검정에 의한 지질 분해 활성(효소 특이 검정)

용해 테스트는 10, 12, 15, 18 및 30 분에 2.5 mL 분취량들을 시료화함에 의해 상기 기재된 방법(실시예 2 참조)에 따라 실행된다. 테스트 동안 배지 교체는 일어나지 않는다. 세 방법들의 비교는 f2 테스트에 의한 용해 프로필들의 유사성의 입증을 위해 SUPAC 접근 (Guidance for Industry "SUPAC MR: Modified release oral dosage forms. Scale-up and postapproval changes: chemistry, manufacturing, and controls, in vitro dissolution testing, and in vivo bioequivalence documentation" Center for Drug Evaluation and Research(CDER), September 1997) 에 따라 실시된다. 세 개의 측정 방법들 각각에 대한 요구되는 수의 데이터를 생성하기 위해 12 개의 독립적인 샘플들(샘플 = 11,200 UI와 등가인 판크레리파아제 비드들, Zenpep® 미니탭들의 양)이 총 4회 실행으로, 실행 당 세 샘플의 군들에서 분석된다.

실시예 5.1 프로테아제 검정에 의한 판크레리파아제 비드들(Zenpep ^® 미니정제들)의 용해 프로필

각 시험된 시점에서의 개별적인 용해 수치들 및 전체 평균은 표 3에 요약되며, 평균 곡선은 도 1에 보여진다.

[표 3]

용해 프로필 데이터(프로테아제 검정)

실시예 5.2. 리파아제 검정에 의한 판크레리파아제 비드들(Zenpep® 미니정제들)의 용해 프로필

각 시험된 시점에서의 개별적인 용해 수치들 및 전체 평균은 표 4에 요약되며, 평균 곡선은 도 2에 보여진다. 1.125의 교정 인자는 용해 테스트 동안 리파아제 분해를 보상하기 위해 계산에 사용된다.

[표 4]

용해 프로필 데이터(리파아제 검정)

실시예 5.3 총 단백질들 함량의 형광분석 결정에 의한 판크레리파아제 비드들(Zenpep® 미니정제들)의 용해 프로필

각 시험된 시점에서의 개별적인 용해 수치들 및 전체 평균은 표 5에 요약되며, 평균 곡선은 도 3에 보여진다.

[표 5]

용해 프로필 데이터(형광 분광법에 의한 총 단백질들 검정)

실시예 5.4 세 측정 방법들로 얻어진 용해 프로필들의 비교

세 개의 검정 방법들에서 각 시점에 측정된, 판크레리파아제 비드들(Zenpep® 미니정제들)의 평균 용해 데이터는 표 6에 요약된다.

[표 6]

리파아제 검정, 프로테아제 검정, 및 총 단백질들의 형광분석 결정으로 얻어진 판크레리파아제 비드들(Zenpep ^® 미니정제들)의 평균 용해 데이터

세 용해 프로필들은 도 4a 내지 도 4c의 그래프 비교에서 도시된 바와 같이, 거의 완전히 겹침을 보인다. 특히, 리파아제 검정 및 형광분석 검정 평균 곡선들은 완전히 중첩가능하며, 프로테아제 평균 곡선만 > 100%의 값을 보이는 종점에서 차이가 있다. 또한, 데이터의 각 시리즈들의 CV들은 세 측정 방법들 중에서 형광분석 검정에 의해 나타내지는 더 낮은 값들과상당히 유사하다.

변화 후 및 전에 약물 제품의 성능의 등가성을 평가하기 위해 사용된 SUPAC 접근(비교할 제품들의 용해 프로필들에서의 유사성 테스트 f2)은 현재 사용되는 검정(리파아제 검정) 및 다른 효소-특이 측정(프로테아제 검정)과 Zenpep® 제형의 용해 테스트에서 총 단백질들의 형광분석 결정을 위한 신규한 제안된 방법의 동등함을 보이기 위해 사용된다.

용해 프로필들에 유사성 테스트 f2를 적용하기 위해, FDA 가이드라인(Guidance for Industry "SUPAC MR: Modified release solid oral dosage forms. Scale-up and postapproval changes: chemistry, manufacturing, and controls, in vitro dissolution testing, and in vivo bioequivalence documentation" Center for Drug Evaluation and Research(CDER), September 1997; Guidance for Industry - dissolution testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms, Center for Drug Evaluation and Research(CDER), August 1997)은 실행되어야 될 일부 조건들을 나타낸다:

a. 각 시간 간격에서 곡선들 둘 다로부터 평균 용해값(n = 12) 사용,

b. 오직 하나의 측정만이 85% 용해점 이상으로 간주될 것이다,

c. 임의의 시료화 시점에서의 평균 차이는 용해 프로필들 사이에 15%보다 크지 않을 것이다.

d. 평균 데이터의 사용을 허용하기 위해, 더 이른 시점에서의 변이의 백분율 계수는 20%를 넘지 않을 것이며, 다른 시점들에서는 10%을 넘지 않을 것이다.

필요조건들 a, b 및 c는 본 발명의 용해 데이터에서 준수되는 것이다. 그러나, 허용된 값들보다 더 큰 CV 값들은 (d) 평가된 측정 방법들 모두에서 처음 세 시점들(10, 12, 15 분)에서 발견되었다. 이러한 시점들의 관찰된 높은 가변성은 첫 번째 시료화 시간(10 분)에서의 분석물의 매우 낮은 농도 및 12 및 15분의 추가 시점에서 경과 시간의 좁은 범위에서 제형의 고유한 가변성으로 설명될 수 있으며, 이는 용해 테스트 조건들에서 제형의 100% 방출이 매우 짧은 시간(30 분)에 이루어짐을 고려한 것이다.

상기 고려 사항에 근거하여, f2 테스트는 세 측정 방법들에서 관찰된 유사한 가변성이 수득된 평균 곡선들을 상당히 변경하지 않고 완전한 겹쳐짐을 보인다는 것을 고려하여 어떻게든 적용된다. 그런 다음, f2 테스트가 SUPAC 필요조건들을 완전히 준수하는 데이터로도 통과할 것인지를 확인하기 위해, 추가 평가가 마지막 세 시점들(15-18-30 분)을 고려하여 실시된다.

실시예 5.4.1. 비교: 형광분석 결정 함량 vs 리파아제 검정

형광분석 결정 vs 리파아제 검정(참조)의 용해 프로필들을 위한 f2 테스트는 모든 시점들이 고려될 때 두 곡선들 사이에서 87.4%의 유사성을 보였으며, 마지막 세 시점에서 계산을 실시했을 때 유사성은 83.3%였다.

실시예 5.4.2. 비교: 총 단백질들 함량의 형광분석 결정 vs 프로테아제 검정

형광분석 결정 vs 프로테아제 검정(참조)의 용해 프로필들을 위한 f2 테스트는 모든 시점들이 고려될 때 두 곡선들 사이에서 72.3%의 유사성을 보였으며, 마지막 세 시점에서 계산을 실시했을 때 유사성은 68.6%였다. 일반적으로, 50보다 더 큰 f2 값들(50~100)은 두 곡선들의 동일함 또는 등가성 및 이에 의한 테스트의 성능의 동일함 또는 등가성을 보장한다. 그러므로, f2 테스트에 의한 용해 프로필들의 비교에서 얻어진 결과들에 따르면 총 단백질들 함량의 형광분석 결정이, 모든 면에서, 판크레리파아제 제형들(Zenpep® 제형들)의 용해 테스트에서 API 방출의 측정시 효소-특이 방법들과 동등함을 명시하는 것이 가능하다.

실시예 6. 검증 데이터의 비교

신규한 형광분석 테스트 및 공지된 허용된 리파아제 활성 효소 검정(USP 방법) 사이의 비교를 완료하기 위해, 표 7이 포함된다.

[표 7]

검증 데이터의 비교

(a): 리파아제 검정에서의 표적 농도 = 12 리파아제 단위들/mL; (b): FL 검정에서의 표적 농도 = 0.3 리파아제 단위들/mL(3 μg DS/mL); (c): DP의 1 개 로트, 여섯 개의 독립적인 샘플들/실행(run); (d): DP의 의 6 개 로트, 각 로트에 대해 여섯 개의 독립적인 샘플들/실행

실시예 7. 판크레리파아제 비드들에서의 형광 분광법에 의한 용해 테스트.

상기 실시예들에 기재된 바와 같은 형광분석 방법들은 다른 투여량 강도를 갖는 Creon®의 이름으로 시장에서 존재하는 다른 판크레리파아제 제형들에 대해서도 실시된다. 결과들은 Zenpep®로서 판매되는 판크레리파아제 비드류에 대해 얻어진 결과들과 비교되고 도 5에 도시된다. 거동에서의 차이는 두 제형들(Zenpep®, Creon®)의 제형들의 다른 강도들 및 입자의 다른 표면적과 일치한다. 두 비드 크기가 다른 Zenpep® 강도들에 사용되며, 더 빠른 용해 프로필을 보이는 더 작은 것(약 1.8 mm 평균 직경)이 5,000 UI 캡슐들을 채우기 위해 사용되며, 더 큰 것(약 2.4 평균 직경) 20,000 UI 캡슐들을 채우기 위해 사용된다. Creon® 비드들은 약 1 mm 평균 직경이나, Zenpep® 비드들보다 상당히 더 불규칙적이므로, Zenpep®보다 더 빠른 용해 프로필을 제공하나, 배치마다 더 적게 재현된다(모든 Creon® 강도들은 동일 과립들을 사용한다).

실시예 8. 장-저항 테스트와 결합된 용해 테스트: GR- 테스트가 더해진 FL-테스트

FL-테스트 : 형광분석 측정을 수반한 용해 테스트

800 mL의 산 단계 배지를 바스켓 장비(USP Apparatus 1- 바스켓)가 장착된 용해 바스의 각 용기 내로 위치시킨다; 용해 배지(산 단계)는 37℃에서 평형화된다. 11,200 USP 리파아제 단위들(Zenpep® 미니탭들 또는 마이크로탭들의 10 개 캡슐들)에 상응하는 판크레리파아제 비드들의 양이 계량되고 Apparatus 1의 각 바스켓 내로 이동된다. 장비는 100 rpm에서 작동된다. 1 시간 후, 바스켓들은 배지로부터 제거되고, 수 밀리리터의 물로 세척되고 각 바스켓의 내용물은 패들 장비(USP Apparatus 2)가 부착된 37℃의 용해 바스에서 800 mL의 장 단계 배지를 함유하는 용해 용기 내로 옮겨진다. 장비는 100 rpm에서 작동된다. 30 분 후, 테스트 하에서 용액의 10-mL 부분이 제거되어 시험관으로 옮겨지고 실온에서 평형화된다. 장 단계 배지로의 추가 희석이 적정 농도(약 0.3 USP 단위들/mL)를 수득하기 위해 이루어진다. 용액들은 얼음/물 바스 내에서 저장되고 판독 전에 수동으로 진탕된다. 희석된 용액들은 하기 작동 파라미터들을 갖는 형광 스펙트로미터에서 판독된다: 1-cm 통로길이 석영 큐벳; 여기 파장:= 280 nm; 발광 파장(측정) = 346 nm; 여기 슬릿: = 6.0.

희석된 테스트 용액 내에서의 마커(API = 판크레리파아제; 100% 방출됨)의 표적 농도는 0.3 USP 리파아제 단위들/mL이다.

표준 용액은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되고 판독될 때까지 교반 하에서 얼음/물 바스 내에서 보관된다.

판크레리파아제 고형 조성물로부터의 약물의 방출량은 하기와 같이 계산된다.

계산들은 벌크 미니탭들/마이크로탭들에 대해 실시된다.

계산들은 캡슐들에 대해 실시된다.

위 식에서: LC는 샘플의 형광 판독(346 nm에서 발광)이다; LS는 표준의 형광 판독(346 nm에서 발광)이다; PS는 표준 중량(mg)이다; PC는 샘플 중량(mg)이다; US는 표준의 효능이다(리파아제 USP 단위들/mg, 배치 리파아제 검정); PM은 캡슐 내용물의 평균 중량(mg/캡슐)이다; UL은 개별적인 투여량 단위에서의 리파아제의 표지된 함량이다(USP 단위들/캡슐); VC는 샘플의 희석 부피(mL)이다; VS는 표준의 부피(mL)이다.

GR 테스트 : 위 저항 테스트(리파아제 검정 수반)

800 mL의 산 단계 배지가 바스켓 장비가 장착된 용해 바스의 각 용기(USP Apparatus 1-Basket) 내에 위치된 후 용해 배지는 37℃에서 평형이 유지된다. 11,200 USP 리파아제 단위들(Zenpep® 미니탭들 또는 마이크로탭들의 10 개 캡슐들)에 상응하는 판크레리파아제 비드들의 양이 계량되고 Apparatus 1의 각 바스켓 내로 옮겨진다. 장비는 100 rpm에서 작동된다. 1 시간 후, 바스켓들은 배지로부터 제거되고 바스켓들을 4℃에서 900 mL의 차가운 정제수를 함유하는 1,000 mL 비커에 잠깐(약 5 초 동안) 담궈 샘플들이 세척되고, 이 공정은 세척 배지의 교체 없이 3 회 반복된다. 각 바스켓 내의 내용물들은 세라믹 막자사발로 정량적으로 옮겨지고, 5~6 mL의 차가운 정제수를 첨가한다. 시료는 완전히 분산될 때까지 분쇄되고, 200 mL 메스 플라스크 내로 정량적으로 수집되고 막자사발 웰은 세척된다. 이러한 작업은 2~3 회 반복된다. 정제수는 최종 총 부피로 첨가된다. 적절한 농도(제품의 100% 위저항을 추정했을 때 가능한 이론적 최대 농도인 약 14 USP 단위들/mL)를 수득하기 위해 차가운 정제수로 추가 희석이 이루어진다. 샘플 용액은 적정 바로 전에 제조되며 얼음/물 바스 내에서 교반 하에 유지된다.

표준 용액은 하기와 같이 제조된다: 6,000 USP 단위들에 상응하는 USP 판크레아틴 리파아제 RS, 또는 판크레리파아제 작업 표준의 양이 정확하게 계량되고 세라믹 막자사발 내로 첨가되고, 약 5~6 mL의 정제수가 첨가된 후 분쇄된다. 막자사발로부터의 액체가 500-mL 메스 플라스크 내로 부어지고 막자사발 또한 세척된다. 이러한 작업은 2~3 회 반복된다. 정제수는 총 최종 부피로 첨가된다. 표준 용액은 적정 바로 전에 제조되며 얼음/물 바스 내에서 교반 하에 유지된다.

표준 용액의 최종 농도는 약 12.0 USP 단위들 리파아제/mL이다.

리파아제 검정에서: 30 mL의 기질 에멀젼(37℃ ± 0.1℃에서)은 적정기의 자켓형 용기 내로 부어지고, 온도를 37℃ ± 0.1℃로 유지하면서 자석 교반기에 의해 교반된다. 0.1N NaOH는 pH를 전위차적으로(potentiometrically) 9.20~9.23으로 조정하기 위해 첨가된다. 1.0 mL의 샘플 또는 표준 용액이 첨가된 후 pH를 9.0으로 유지하기 위해 5 분 동안 0.1N NaOH가 첨가된다.

계산은 하기 식에 따라 실시된다:

위 식에서 VMC은 샘플에 의한 분 당 소비된 0.1N NaOH의 부피이고(mL/min); AVMS는 표준에 의해 분 당 소비된 0.1 N NaOH의 부피이고(mL/min); PC는 샘플 중량이고(mg), PS는 표준의 중량이고(mg); DC는 샘플의 희석이고(mL); DS는 표준의 희석이고(mL); US는 표준의 효능이고(리파아제 USP 단위들/mg); UC는 배치 리파아제 검정이다(USP 리파아제 단위들/mg).

USP, <711> 용해 - 서방성 형태(산 단계)에 따른 허용 기준인, Acceptance Table 3은 하기와 같다:

수준 1 허용 기준: GR%는 각 개별 단위에 대해 90%보다 더 크거나 동일할 것이다;

수준 2 허용 기준: 12 개 단위들(수준 1에서의 6 개 단위들, 수준 2에서의6 개 단위들)의 GR의 평균값은 적어도 90%이며 75%보다 낮은 개별 단위는 없다;

수준 3 허용 기준: 24 개 단위들(수준 1에서의 6 개 단위들, 수준 2에서의6 개 단위들, 수준 3에서의 12 개 단위들)의 GR의 평균값은 적어도 90%이며 75%보다 낮은 개별 단위는 없다.

상기 보고된 데이터 및 고려사항들 모두에 근거하여, 판크레리파아제 비드들의 용해 테스트에서 방출된 소화 효소들의 마커로서 총 단백질 함량의 형광분석 측정은 신뢰성이 있으며 리파아제 활성의 검정에 기초한 현재 허용된 전서 측정 방법의 유리한 대안이다.