一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法专利检索- .目的是以下述为特征的通过分析基因表达或基因组对比进行序列鉴定专利检索查询-专利查询网

一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法
申请号	CN201410679529.0	申请日	2014-11-24	公开(公告)号	CN104450958A	公开(公告)日	2015-03-25
申请人	贵州师范大学;			发明人	乙引; 洪鲲; 万晴姣; 张宇斌;
摘要	一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法，通过ELISA方法从蝴蝶兰检测到齿兰环斑病毒ORSV-GZ，利用其枯斑寄主苋色黎进行纯化，RT-PCR扩增该病毒外壳蛋白CP基因并将其克隆至pMD18-T载体后测序并进行核苷酸序列分析。本发明从分子水平对ORSV蝴蝶兰分离物进行鉴定，完成了该病毒分离物的分子鉴定，为兰花病毒的检测、防控及兰花种质资源的保护提供理论基础。
权利要求	1.一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤： 1)采集表现出病毒病症状的蝴蝶兰样品，经过ELISA检测为ORSV阳性后摩擦接种于苋色藜，单斑分离后保存于苋色藜，并将该病毒分离物命名为ORSV-GZ； 2)称取感染ORSV-GZ的新鲜苋色黎叶片，提取其总RNA，于-80℃保存备用； 3)根据GenBank已报道的ORSV 外壳蛋白基因设计引物，上游引物：ORSV-CP-F为：5′-CCGGATCCTATGTCTTACACTATTACAGACCC-3′，下游引物ORSV-CP-R为：5′-CTCAAGCTTAGGAAGAGGTCCAAGTAAGT-3′；以1μL提取的总RNA为模板，进行一步RT-PCR扩增ORSV的CP基因，PCR反应条件：50℃30min；94℃2min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，反应30个循环； 72℃延伸10min；取1μL RT-PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，应在约477bp左右观察到DNA条带； 4)将上步获得的RT-PCR产物进行纯化，RT-PCR产物纯化后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析并使用微量核酸蛋白分析仪测定其浓度，将RT-PCR产物即ORSV CP基因克隆至pMD18-T载体中； 5)随机挑取平板上的大肠杆菌单菌落若干分别转入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中进行振荡培养，在37℃、200rpm调价下持续16h后，采用菌液PCR的方法对各培养物进行阳性重组子的筛选； 6)采用DNAMAN7.0 软件对ORSV-GZ和其他11种ORSV分离物的CP基因进行同源性分析，利用MEGA5.0软件构建基于其CP基因的系统进化树，采用Neighbor-Joining聚类分析方法。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)病毒接种分离过程为：用500目的金刚砂喷洒苋色藜接种叶片，将感染ORSV蝴蝶兰叶片于1％磷酸氢二钾溶液中研磨提取不超过2min，并将提取液摩擦接种于苋色藜叶片，随后立即用清水冲洗叶片，洗去金刚砂和多余的溶液；5-10天后接种叶片应出现较明显的坏死小斑，剪取单个坏死斑点，采用上述接种方法重新接种至健康的苋色藜叶片，3次单斑分离后获得单一病毒或病毒株系。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：感染ORSV蝴蝶兰叶片与1％磷酸氢二钾溶液的质量体积比为1:10。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中PCR过程为取各培养物菌液 100μL，12000rpm，离心1min，弃上清，用400μL无菌水重悬沉淀，沸水浴10min，12000rpm离心5min，上清即为模板；正向通用引物：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG；反向通用引物：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，退火温度55℃：循环次数：25；取各PCR产物1μL进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，若在约600bp处出现条带，则提取其剩余菌液中的质粒进行测序。
说明书全文	一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法技术领域 [0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法。背景技术 [0002] 齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)，隶属烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，基因组为(+)ssRNA。其外壳蛋白(Coat protein，CP)基因的ORF长度为477bp，编码158个氨基酸残基，蛋白分子量约为18.0kDa，病毒颗粒呈杆状，无包被，长约 300nm，宽约18nm，螺旋对称，螺纹明显，颗粒中轴有沟状构造，病毒颗粒分散在细胞质内呈晶格排列。ORSV在世界各地商业生产的兰花中分布非常广泛，至少可以感染包括文心兰属(Oncidium)在内的35种兰属，其所导致的病变症状主要是花叶、环斑、碎色等。除此之外，齿兰环斑病毒还常与建兰花叶病毒(CymMV)复合侵染兰花，使其叶片形成不规则的褪绿、条纹、圆斑甚至坏死等症状，进而导致植株生长不良、花小而少，花期缩短等，使兰花的商业价值大打折扣。 [0003] 近年来，随着兰花市场和种植规模的不断发展，兰花病虫害的发生也日趋严重，其中以病毒病的危害最重，这些都对兰花产业的健康发展构成极大的威胁。本发明采用血清学和分子生物学技术(如ELISA、RT-PCR等)从蝴蝶兰分离获得ORSV，克隆其CP基因并对其序列进行分析，完成了该病毒分离物的分子鉴定，为兰花病毒的检测、防控及兰花种质资源的保护提供理论基础。发明内容 [0004] 本发明旨在提供一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法。 [0005] 本发明主要通过ELISA方法从蝴蝶兰检测到齿兰环斑病毒ORSV-GZ，利用其枯斑寄主苋色黎进行纯化，RT-PCR扩增该病毒外壳蛋白(CP)基因并将其克隆至pMD18-T载体后测序并进行核苷酸序列分析。具体通过以下技术方案实现： [0006] 一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法，包括以下步骤： [0007] 1)采集表现出花叶、褪绿、环斑、碎色的毒病症状的蝴蝶兰样品，经过ELISA检测为ORSV阳性后摩擦接种于苋色藜，三次单斑分离后保存于苋色藜，并将该病毒分离物命名为ORSV-GZ； [0008] 2)称取感染ORSV-GZ的新鲜苋色黎叶片，用RNAiso Plus 试剂提取其总RNA，于-80℃保存备用； [0009] 3)根据GenBank已报道的ORSV外壳蛋白基因设计引物，上游引物：ORSV-CP-F为：5′-CCGGATCCTATGTCTTACACTATTACAGACCC-3′，下游引物ORSV-CP-R为：5′-CTCAAGCTTAGGAAGAGGTCCAAGTAAGT-3′，以1μL提取的总RNA为模板，进行一步RT-PCR扩增ORSV的CP基因，PCR反应条件：50℃30min；94℃2min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，反应30个循环； 72℃延伸10min，取1μL RT-PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，应在约477bp左右观察到DNA条带； [0010] 4)将上步获得的RT-PCR产物进行纯化，RT-PCR产物纯化后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析并使用微量核酸蛋白分析仪测定其浓度，将RT-PCR产物即ORSV CP基因与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α并做过夜培养； [0011] 5)随机挑取平板上的大肠杆菌单菌落若干分别转入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中进行振荡培养16h(37℃，200rpm)，采用菌液PCR的方法对各培养物进行阳性重组子的筛选，提取重组质粒DNA并送上海生工进行基因测序； [0012] 6)采用DNAMAN7.0 软件对ORSV-GZ和其他11种ORSV分离物的CP基因进行同源性分析，利用MEGA5.0软件构建基于其CP基因的系统进化树，采用Neighbor-Joining聚类分析方法。 [0013] 所述的病毒接种分离过程为：用500目的金刚砂喷洒苋色藜待接种叶片，将感染ORSV蝴蝶兰叶片于1％磷酸氢二钾溶液(1:10，m/V)中研磨提取(不超过2min)，并将提取液摩擦接种于苋色藜叶片，随后立即用清水冲洗叶片，洗去金刚砂和多余的溶液，5-10天后接种叶片应出现较明显的坏死小斑，剪取单个坏死斑点，采用上述接种方法重新接种至健康的苋色藜叶片，3次单斑分离后可获得单一病毒或病毒株系。 [0014] 本发明步骤(5)中PCR过程为：PCR模板制备：取各培养物(菌液)100μL，12000rpm，离心1min，弃上清，用400μL无菌水重悬沉淀，沸水浴10min，12000rpm离心 5min，上清即为模板；正向通用引物：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG；反向通用引物： 5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，退火温度55℃：循环次数：25；取各PCR产物1μL进行 1％的琼脂糖凝胶电泳分析，若在约600bp处出现条带，则提取其剩余菌液中的质粒，质粒送上海生工生物工程有限公司进行测序； [0015] 本发明的有益效果为通过齿兰环斑病毒分离物的分子鉴定，为兰花病毒的检测、防控及兰花种质资源的保护提供理论基础。附图说明 [0016] 图1ORSV CP基因RT-PCR产物； [0017] 图2是pMD18T-ORSV CP重组质粒的菌液PCR筛选结果； [0018] 图3是基于ORSV CP基因构建的系统进化树。具体实施方式 [0019] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。 [0020] 实施例1 [0021] 一种齿兰环斑病毒分离物分子鉴定的方法，包括以下步骤： [0022] 1)采集表现出花叶、褪绿、环斑、碎色等疑似病毒病症状的蝴蝶兰样品，通过ELISA方法检测其病毒(ELISA试剂为美国Agdia公司产品，货号：SRA 54301，按其说明书进行操作)。将ELISA检测为ORSV阳性的叶片研磨后摩擦接种于苋色藜，三次单斑分离后保存于苋色藜，并将该病毒分离物命名为ORSV-GZ； [0023] 2)称取0.1g感染ORSV-GZ的新鲜苋色黎叶片，用RNAiso Plus试剂提取其总RNA，于-80℃保存备用； [0024] 3)根据GenBank已报道的ORSV外壳蛋白基因设计引物。上游引物：ORSV-CP-F为：5′-CCGGATCCTATGTCTTACACTATTACAGACCC-3′，下游引物ORSV-CP-R为：5′-CTCAAGCTTAGGAAGAGGTCCAAGTAAGT-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。以1μL提取的总RNA为TM 模板，进行一步RT-PCR扩增ORSV的CP基因(使用商品化试剂盒“PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2”，宝生物大连公司，货号：RR055A，或其它公司同类产品，操作按试剂盒说明书进行)，具体PCR反应条件：50℃30min；94℃2min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，反应30个循环；72℃延伸10min。取1μL RT-PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，应在约477bp左右观察到DNA条带(常规分子生物学实验方法)； [0025] 4)采用“普通产物纯化试剂盒”(北京天根生化科技有限公司，货号：DP204，或其它公司同类产品)将上步获得的RT-PCR产物进行纯化，操作按说明书进行。RT-PCR产物纯化后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析并使用微量核酸蛋白分析仪测定其浓度。将RT-PCR产物(ORSV CP基因)克隆至pMD18-T载体中(宝生物大连公司，货号：6011，按载体说明书进行克隆和大肠杆菌的转化操作)； [0026] 5)随机挑取平板上的大肠杆菌单菌落若干分别转入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中进行振荡培养16h(37℃，200rpm)。采用菌液PCR的方法对各培养物进行阳性重组子的筛选，PCR条件： [0027] ①PCR模板制备：取各培养物(菌液)100μL，12000rpm，离心1min，弃上清，用400μL无菌水重悬沉淀，沸水浴10min，12000rpm离心5min，上清即为模板； [0028] ② 正向通用引物：5 ′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG；反向通用引物：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，退火温度55℃：循环次数：25)(常规分子生物学操作)。 [0029] ③取各PCR产物1μL进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，若在约600bp处出现条带，则提取其剩余菌液中的质粒(采用质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司，产品号：DP103，操作按试剂盒说明书进行)。质粒送上海生工生物工程有限公司进行测序； [0030] 6)采用DNAMAN7.0软件对ORSV-GZ和其他11种ORSV分离物的CP基因进行同源性分析，利用MEGA5.0软件构建基于其CP基因的系统进化树，采用Neighbor-Joining聚类分析方法。 [0031] 实施例2毒原分离 [0032] 用500目的金刚砂喷洒ORSV的枯斑寄主苋色藜叶片，将ELISA方法检测为ORSV阳性的蝴蝶兰叶片于1％磷酸氢二钾溶液(1:10，m/V)中研磨提取(不超过2min)，并将研磨液摩擦接种于苋色藜叶片，随后立即用清水冲洗，洗去金刚砂和多余的溶液。苋色藜置于防虫温室培养，每天观察。大约5-10天后接种叶片出现较明显的坏死小斑。剪取单个坏死斑点，采用上述接种方法重新接种至健康的苋色藜叶片。经过3次单斑分离后可获得单一病毒或病毒株系。活毒采取活体保存和真空冷冻干燥后低温保存备用。 [0033] 实施例3 ORSV CP基因的克隆及测序 [0034] 以感染ORSV-GZ病叶的总RNA为模板(总RNA的提取按“发明内容”第2)项进TM行)，采用商品化试剂盒(“PrimeScript One St ep RT-PCR Kit Ver.2”，宝生物大连公司，货号：RR055A，操作按试剂盒说明书进行)，利用特异性引物5′-CCGGATCCTATGTCTTACACTATTACAGACCC-3′和5′-CTCAAGCTTAGGAAGAGGTCCAAGTAAGT-3′进行一步RT-PCR扩增ORSV CP基因。RT-PCR反应体系如表1： [0035] 表1 RT-PCR反应体系 [0036] [0037] 按以下条件进行RT-PCR反应： [0038] [0039] 取1μL RT-PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，可观察到一条明亮的约477bp的ORSV CP基因目的片段，如图1所示。 [0040] RT-PCR产物经“普通产物纯化试剂盒”(北京天根生化科技有限公司，货号：DP204，按说明书操作)纯化回收后与pMD18-T载体进行连接(宝生物大连公司，货号： 6011，按载体说明书进行克隆和大肠杆菌的转化操作)。采用菌液PCR筛选阳性克隆，PCR条件： [0041] ①PCR模板制备：取各培养物(菌液)100μL，12000rpm，离心1min，弃上清，用400μL无菌水重悬沉淀，沸水浴10min，12000rpm离心5min，上清即为模板； [0042] ② 正向通用引物：5 ′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG；反向通用引物：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，退火温度55℃：循环次数：25)(常规分子生物学操作)。 [0043] ③取各PCR产物1μL进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，若在约600bp处出现条带，则提取其剩余菌液中的质粒(采用质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司，产品号：DP103，操作按试剂盒说明书进行)。质粒送上海生工生物工程有限公司进行测序，结果如图2所示。 [0044] 从阳性菌液中提取重组质粒(“质粒小提试剂盒”，天根生化科技(北京)有限公司，产品号：DP103)并将质粒送上海生工生物工程有限公司测序(ORSV-GZ CP序列已公布，GenBank Accession No.KF225471)。测序结果，该基因全长477bp，编码158个氨基酸残基。 [0045] 实施例4 ORSV-GZ分离物CP序列同源性分析 [0046] 同源性分析采用DNAMAN7.0软件，将ORSV-GZ分离物与已报道的11种ORSV分离物，以及同属其他3种病毒进行CP基因序列比对。结果显示，ORSV-GZ分离物与同种其他病毒序列同源性为96％-99％，其中，与NHRIK1(韩国)、Taiwan(台湾)、South Korea(韩国)、gd(广东)分离物核苷酸相似性高达99.79％，与Cipanas Cianjur(印尼)、Gunung Sindur(印尼)分离物相似性为99.58％，与KO3(韩国)分离物的相似性为99.37％，与Singapore(新加坡)相似性为分离物99.16％，与ONK1(韩国)、CYK1(韩国)分离物相似性为98.95％，与Kebun Raya Bogor(印尼)分离物相似性为96.86％。同时，ORSV-GZ分离物与同属其他三种病毒的同源性非常低，其中，TMV为69.21％，RMV为53.55％、PMMoV为64.12％。据此确定该病毒蝴蝶兰分离物为ORSV。 [0047] 实施例5基于CP基因的系统进化树分析 [0048] 采用MEGA5.0软件以Neighbor-Joining聚类分析方法构建基于ORSV CP基因的系统进化树。如图3所示，从贵州蝴蝶兰分离的ORSV-GZ与其它11种ORSV分离物亲缘关系极为接近，而与同属其他三种病毒亲缘关系较远。由此可知，ORSV CP基因在进化过程中极为保守。

意见反馈