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멜라노코르틴 수용체 ＭＣ4Ｒ 돌연변이체{Mutants of Melanocortin 4-receptor}
본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R의 아르기닌 220이 알라닌으로 치환되거나 트레오닌 232가 발린으로 치환된 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체에 관한 것이다. 멜라노코르틴(Melanocortin, 예를 들면, α-MSH, β-MSH, γ-MSH, ACTH 및 이들의 펩타이드 절편)은 동물 및 인간으로부터 유래하는 천연 호르몬으로 전구체인 프로-오피오멜라노코르틴(pro-opiomelanocortin: POMC) 펩타이드가 가수분해되어 생성되는 펩타이드 호르몬이다(Smith, AI et al., Endocr. Rev., 9, 159-179 (1988)). 멜라노코르틴은 색소형성의 조절(De Wied, D. et al., Physiol. Rev., 62, 976-1059 (1982)), 체온조절(Feng, JD et al., Brain Res. Bull., 18, 473-477 (1987)), 비만(Fan, W. et al., Nature, 385, 165-168, (1997)), 심장혈관계의 조절(Li, SJ et al., J.Neurosci, 16, 5182-5188 (1996)), 학습과 기억(De Wied, D. et al., Methods Achieve Exp. Pathol., 15, 167-199 (1991)) 및 면역조절 역할(Smith, EM et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 782-786 (1992))에 관여하는 것으로 알려져 있다. 멜라노코르틴은 멜라노코르틴 수용체와 결합함으로써 활성화되며, 이의 생리활성은 멜라노코르틴 수용체와 G-단백질의 커플링 반응으로 아데닐산고리화효소(adenylate cyclase)작용에 의해 조절된다(Mountjoy, KG et al., Science, 257, 1248-1251 (1992)). 현재까지, 멜라노코르틴 수용체는 뇌 및 신체의 말초(peripheral body)조직에서 각각 다른 형태로 발현되는 5개의 아형(subtype)이 클론되었고 그 특성이 규명되었다(Mountjoy, KG et al., Science, 257, 1248-1251 (1992); Chhajlani, V. et al., FEBS. Lett., 399, 417-420 (1992); Chhajlani, V. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 195, 866-973 (1993); Gantz, I. et al., J. Biol. Chem., 268, 8246-8250 (1993); Gantz, I. et al., J. Biol. Chem., 268, 15174-15179 (1993)). 이들은 각각 MC1R(melanocortin 1-receptor), MC2R(melanocortin 2-receptor). MC3R(melanocortin 3-receptor), MC4R(melanocortin 4-receptor) 및 MC5R (melanocrotin 5-receptor)로 명명되며, G-단백질 커플링 수용체족에 속한다. 이들 수용체 중, MC2R은 ACTH(부신피질 자극호르몬) 수용체인 반면, 다른 수용체들은 MSH(멜라닌 세포 자극호르몬) 수용체이다. 이들 수용체 중에서 MC3R과 MC4R이 식이(feeding) 조절과 관련이 있는 것으로 생각되는 뇌 영역인 시상하부(hypothalamus)에 국부적으로 위치한다는 것이 알려져 있다. 따라서 이 두 수용체의 생체 대사, 더욱 특정적으로는 식이조절 및 체중조절과 같은 대사과정에 대한 생리활성에 대한 연구가 진행되고 있다. MC3R 및 MC4R은 멜라노코르틴 수용체 아형으로서 밀접하게 연관되어 있고, 전체적 서열 일치는 60%를 차지한다(Adan, RA et al., Eur. J. Pharmacol., 405,13-14 (2000); Raffin-Sanson, ML et al., Eur. J. Endocrinol., 144, 207-208, (2001)). 그러나 MC3R 및 MC4R은 생물학적으로 몇 가지를 고려하여 구별할 수 있다. 예를 들면, 비록 두 가지 아형이 촉진제 자극으로 G-단백질에 결합하고 아데닐산고리화효소를 활성화시키지만, MC4R의 G-단백질 커플링 효율은 MC3R의 효율과는 다르다(Lee EJ et al., Eur. J. Biochem., 268, 582-591, (2001)). 더욱이, MC3R과 MC4R은 조직 분포 패턴에 대해 차이를 나타내고, 이는 두 수용체가 상이한 아형-특이 생리학적 역할을 지님을 제시한다. 이와 관련하여, MC4R 또는 MC3R 유전자를 파괴시킨 마우스 모델에서 MC3R 및 MC4R의 상이한 생리학적 과정이 밝혀졌으며(Huszar, D. et al., Cell, 88, 131-141 (1997); Butler, AA et al., Endocrinology, 141, 3518-3521 (2000); Chen, AS et al., Nat. Genet., 26, pp97-102, (2000)), 최근에 MC3R 유전자 적중 마우스를 이용한 실험에서 MC3R의 불활성화로 인해 마우스의 지방 무게가 증가되고 체중은 감소됨을 확인하였다. 문헌에 의하면 α-멜라닌세포 자극 호르몬에 의한 MC4R의 활성화가 에너지 소모를 증가시키고 음식 섭취를 감소시킨다고 보고된 바 있다. 또한, 비만 마우스에서 MC4R의 유전자 파괴가 관찰되었다. 상기 결과는 MC3R 및 MC4R이 에너지 항상성 조절작용을 수행함에 있어서 중복적인 역할을 하지 않음을 제시한다(Butler AA et al., Endocrinology, 141, 3518-3521, (2000); Chen, AS et al., Nat. Genet., 26, 97-102 (2000)). MC3R 또는 MC4R 유전자 적중 마우스 표현형의 비교를 통해 음식물을 섭취하는 행동에 있어서 두 수용체의 특이적 조절을 입증하였다. 예를 들면, 주로 식이조절에 있어 MC4R은 에너지 소모를 증가시키고 음식 섭취를 감소시킨다. 반면, MC3R은 약간의 특이적 대사 경로에 의해 지방 저장을 조절할 수 있다는 것이 밝혀졌다(Raffin-Sanson, ML et al., Eur. J. Endocrinol., 144, 207-208 (2001); Konda, Y. et al., J. Biol. Chem., 269, 13162-13166 (1994)). 상술한 바와 같은 멜라노코르틴 수용체 MC3R 및 MC4R의 특성이 밝혀지면서 이를 이용하여 생체 대사, 더욱 특정적으로는 식이조절 및 체중조절과 같은 대사과정을 조절할 수 있는 화합물을 스크리닝하고자 하는 시도가 이루어지고 있다. 미국특허 제5,908,609호에는 MC4R을 이용하여 체중조절에 유용한 화합물의 스크리닝방법이 개시된 바 있다. 미국특허 제5,994,087호에는 포유동물의 MC3R을 분리하고 특성을 규명한 후 이를 이용하여 MC3R 수용체에 대한 촉진제 및 길항제의 스크리닝 방법이 개시된 바 있다. 미국특허 제6,100,048호에는 포유동물의 멜라노코르틴 수용체를 암호화하는 핵산으로 구성된 재조합 발현 작제물을 제작하고 이에 대한 촉진제 및 길항제를 스크리닝하는 방법이 개시된 바 있다. 상기에서 개시된 스크리닝 방법은 검색하고자 하는 시료의 활성을 측정하기 위하여 시험관내(in vitro)에서 CRE(cAMP responsive element)-매개된 리포터 유전자 활성 분석법을 사용하고 있다.
본 발명자들은 멜라노코르틴 수용체 MC4R의 아르기닌 220이 알라닌으로 치환되거나 트레오닌 232가 발린으로 치환된 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체가 천연(native) 멜라노코르틴 수용체 MC4R 비해 CRE-루시퍼라제 리포터 유전자 활성이 현저히 높게 나타난다는 사실을 발견하였다. 이러한 발견을 기초로 하여 본 발명자들은 유전자 재조합 기술로 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체 유전자, 이를 포함하는 재조합 플라스미드 및 이 재조합 플라스미드로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 생성하고, 이들 형질전환체 또는 형질감염체로부터 본 발명의 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 생성하였으며, 이들 돌연변이체 및 이에 대한 길항제 또는 촉진제가 의학적으로 유용함을 확인하였다. 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R의 아미노산 서열 중 아르기닌 220을 알라닌으로 치환하거나 트레오닌 232를 발린으로 치환된 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 제공한다. 또한, 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화하는 유전자를 제공한다. 또한, 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다. 또한, 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 제공한다. 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화한 유전자를 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키며, 생성된 형질전환 또는 형질감염체를 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체 유전자가 발현되도록 적절한 배지 및 조건하에 배양하여 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 수득함을 특징으로 하는, 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체에 시험물질을 처리하고, CRE-매개된 리포터 유전자의 활성을 측정하여 활성이 증가한 경우, 그 시험물질을 멜라노코르틴 수용체 MC4R의 촉진제(agonist)로 판단함을 특징으로 하는, 비만증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체에 시험물질을 처리하고, CRE-매개된 리포터 유전자의 활성을 측정하여 활성이 감소한 경우, 그 시험물질을 멜라노코르틴 수용체 MC4R의 길항제(antagonist)로 판단함을 특징으로 하는, 체중감소증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
도 1은 MC3R/MC4R 키메라 수용체를 나타낸 것이다. 도 2는 HEK 293T 세포에서 멜라노코르틴 촉진제 α-MSH-ND에 의한 MC3R, MC4R 및 MC3R/MC4R 키메라 수용체(키메라 1 내지 4)의 CRE-매개된 루시퍼라제 유전자 전사활성을 비교하여 나타낸 그래프이다. a는 5번의 독립적인 실험 결과를 평균±표준편차로 나타낸 것이다. b는 MC3R, MC4R 및 MC3R/MC4R 키메라 수용체(키메라 1 내지 4)의 최대 CRE-매개된 루시퍼라제 활성을 나타낸 것으로 4회의 독립적인 실험결과를 평균±표준편차로 나타낸 것이다(* P<0.05, **P<0.01: MC3R 값에 대한 유의적 차이를 의미한다). 도 3은 MC3R 및 MC4R의 i3 루프 서열을 나타낸 것이다. 블랙박스는 서열 동질성을 나타내며, 회색박스는 보존적인 치환 서열을 나타낸 것이다(hMC4R: 사람유래 MC4R; mMC4R: 마우스유래 MC4R; sMC4R: 멧돼지유래 MC4R; bMC4R: 소유래 MC4R; rMC3R: 랫트유래 MC3R; hMC3R: 사람유래 MC3R). 도 4는 HEK 293T 세포에서 NDP-MSH에 의한 MC3R, MC4R 및 수 종류의 MC4R 돌연변이체의 cAMP-매개된 리포터 유전자 전사활성을 나타낸 그래프이다. a는 4회의 독립적인 실험결과를 평균±표준편차로 나타낸 것이다. b는 각 수용체의 최대CRE- 매개된 리포터 유전자 활성을 4회의 독립적인 실험결과를 평균±표준편차로 나타낸 것이다(**P<0.01, MC4R 값에 대한 유의적인 차이를 의미한다).
본 발명은 아미노산 서열 중 아르기닌 220을 알라닌으로 치환하거나 트레오닌 232를 발린으로 치환시켜 멜라노코르틴 수용체 MC4R 비해 활성이 증가된 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체(이하,“멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체”로 표기한다)를 제공한다. MC4R 및 MC3R의 상이한 생리학적 활성이 G-단백질 커플링에 의한 cAMP 경로와 연관이 있다는 것을 본 발명자들은 증명한 바 있다(Lee, EJ et al., Eur. J. Biochem., 268, 582-591 (2001)). 이와 관련하여, 시험관 내 CRE-매개된 리포터 유전자 활성 검정법을 이용하여 MC3R과 MC4R을 자극하는 몇 개의 α-MSH 유사체를분석였으며(Lee, EJ et al., Eur. J. Biochem., 268, 582-591 (2001)), 분석된 각각 다른 멜라노코르틴 유사체로 MC3R 및 MC4R을 자극하였을 때 사람 세포주 HEK293T에 발현된 MC3R 및 MC4R이 리포터 유전자의 전사를 자극할 수 있었다. 한편, 같은 멜라노코르틴 유사체로 MC3R 및 MC4R을 자극하였을 때 시험관 내 CRE-매개된 리포터 유전자 활성도를 조사하여 비교한 결과, MC4R의 리포터 유전자 활성은 MC3R의 리포터 유전자의 최대 활성에 비해 약 30 내지 50% 정도라는 것을 발견하였다(도 2b, 도 4b). 상기 결과에서 리포터 유전자 활성의 차이는 두 수용체의 G-단백질 커플링 효율이 다르다는 것을 나타내며, MC4R이 MC3R에 비해 G-단백질 커플링 효율이 낮음을 제시한다. 즉 G-단백질 커플링 효율이 상기 수용체를 통한 신호 전달 경로의 활성을 결정하는 중요한 요소이다. 관련된 관점으로서, 본 발명자들은 MC3R 및 MC4R의 G-단백질 커플링 특이성에 영향을 미치는 이 두 수용체의 특이적 영역에 대하여 연구하였다. G-단백질 커플링 특이성에 있어서, G-단백질 커플링 수용체족(예를 들면, 아드레날린(adrenergic), 세로토닌(serotonergic), 무스카린(muscarinic) 및 도파민(dopaminergic) 수용체를 포함하는 다수의 7 트렌스멤브레인 영역 수용체)의 3번째 세포내 루프영역(third intracellular(i3) loop domain, 이하 “i3 루프”라 한다)의 역할이 밝혀졌다(Cotecchia, S. et al., J. Biol. Chem., 267, 1633-1639 (1992); Lembo, PM et al., Mol. Pharmacol., 52, 164-171 (1997); Lee, NH et al., J. Bio. Chem., 268, 7949-7957 (1993); Picetti, R. et al., Crit. Rev. Neurobiol., 11, 121-142 (1997); Kunkel, T. et al., Methods Enzymol., 154,367-382 (1987)). 특히, G-단백질 커플링하는 서로 다른 두 수용체의 영역교환실험은 G-단백질 커플링에 있어서 i3 루프의 중요성을 입증하는 것이다(Liggett, SB et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 3665-3669 (1993); Kozell, LB, et al., J. Bio. Chem., 269, 30199-30306 (1994)). 이와 관련하여, 본 발명자들은 MC3R 및 MC4R에 있어서, MC3R에 대한 i3 루프 영역과 나머지 C-말단영역, i3 루프 영역, i3 루프 영역과 세포질 C-말단 루프 영역 그리고 세포질 C-말단 루프영역만을 각각 MC4R과 일치하는 영역으로 교환한 4가지 종류의 키메라 MC3R/MC4R 수용체를 제조하여(도 1) CRE-루시퍼라제 리포터 유전자 활성 검정법으로 수용체와 G-단백질 커플링의 유효성을 측정하였다(Chen, W., et al., Anal. Biochem., 226, 349-354 (1995); Baik, JH, et al., Academic press, 75-89 (1996)). 본 실험에서 특히, MC3R의 전체적인 i3 루프를 MC4R과 일치하는 i3 루프 영역과 교환한 키메라 수용체의 경우에 최대 리포터 유전자 활성이 약 60% 감소하는 결과를 보였는데(도 2b), 이는 MC4R에 의해 유도된 활성과 유사하다. 즉, MC3R i3 루프 영역을 MC4R i3 루프영역과 교환한 키메라 수용체가 천연 MC3R에 비해 리포터 유전자 활성이 약 60% 감소를 보인 결과는 i3 루프가 G-단백질 커플링 효율을 결정한다는 것을 제시한다. 또한, MC3R의 i3 루프와 세포질 C-말단 루프 영역을 MC4R의 일치하는 지역과 교환한 키메라 수용체도 최대 반응이 감소함을 보였다. 상기 결과에서 MC3R 수용체에 대한 i3 루프 영역이 G-단백질 커플링 효율의 주요한 부위라는 것을 제시한다. G-단백질 커플링에 있어서 중요한 부위로 밝혀진 i3 루프 영역에서 높게 전하를 띤 지역이 다수의 7 트렌스멤브레인 수용체에서 발견되었으며, 또한 i3 루프 영역의 아미노산 구조 분석을 통해 높은 전하를 띤 아미노산 잔기가 확인되었다. 이와 관련하여, 높은 전하를 띤 i3 루프 영역에 영향을 미치는 점 돌연변이 또는 결손은 G-단백질이 변형된 i3 루프에 결합하여 수용체의 시그날을 변화시킬 수 있으며(Cotecchia, S. et al., J. Biol. Chem., 267, 1633-1639 (1992); Lembo PM. et al., Mol. Pharmacol., 52, 164-171 (1997); Lee, NH et al., J. Biol. Chem., 268, 7949-7957 (1993)), 또한, 높은 전하를 띤 i3 루프 영역에서의 점 돌연변이와 결손은 소수성/친수성 아미노산의 교체 및 단백질의 2차구조와 양친매성-나선 구조에 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있다(Hunyady, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10040-10045 (1996); Greasley, PJ et al., J. Biol. Chem., 276, 46485-46494 (2001); Burstein, ES et al., Biochemistry, 37, 4052-4058, (1998)). 따라서, 본 발명자들은 활성이 낮은 MC4R에 있어서 i3 루프 영역의 극성 아미노산을 돌연변이 시켜 MC4R의 활성을 변화시킬 수 있다고 추측하였다. 이를 증명하기 위해, 본 발명자들은 MC4R에 대한 i3 루프 영역의 아미노산을 하기에 열거된 바와 같이 치환하여 돌연변이를 제조하였다. MC4R 돌연변이체 R220A는 아르기닌(Arg) 220을 알라닌(Ala)으로, MC4R 돌연변이체 K224A는 리신(Lys) 224를 알라닌(Ala)으로, MC4R 돌연변이체 R225A는 아르기닌(Arg) 225를 알라닌(Ala)으로, MC4R 돌연변이체 T232V는 트레오닌(Thr) 232를 발린(Val)으로,MC4R 돌연변이체 I235P는 이소루신(lle) 235를 프롤린으로, MC4R 돌연변이체 R236A는 아르기닌(Arg) 236을 알라닌(Ala)으로, MC4R 돌연변이체 R236Q는 아르기닌(Arg) 236을 글루타민으로 각각 치환한 것이다. 제조된 7종류의 MC4R 돌연변이체에 대한 CRE-루시퍼라제 리포터 유전자 활성 검정법을 통해 MC4R 돌연변이체와 G-단백질 커플링의 효율을 측정하였다. 본 실험에서 특히, MC4R 돌연변이 수용체 R220A 및 T232V 경우에 천연(native) MC4R에 비해 리포터 유전자 활성이 증가하여 천연 MC3R의 활성과 유사하게 나타났다(도 4b). 상기 결과에서, 멜라노코르틴 수용체 MC4R의 i3 루프 영역에 위치하는 아르기닌 220을 알라닌으로 치환하거나 트레오닌 232를 발린으로 치환한 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체에서 리포터 유전자의 활성이 증가한 것을 볼 때, 멜라노코르틴 MC4R의 G-단백질 커플링 효율에 있어서 아르기닌 220 및 트레오닌 232가 G-단백질 커플링을 방해하는 중요한 아미노산 잔기라는 것과 멜라노코르틴 수용체 MC4R의 특이적 G-단백질 커플링 특성과 관련이 있다는 것을 제시한다. 즉 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체는 G-단백질 커플링 효율이 증가됨에 따라 수용체를 통한 신호 전달 경로 활성이 높아짐을 알 수 있다. 본 발명에 따른 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체는 유전자 재조합 기술을 통해 제조할 수 있다. 유전자 재조합 방법은 단백질이나 그 단편 등을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포를 배양하여 단백질이나 그 단편을 제조하는 것이다. 유전자 재조합 기술은 본 발명에 따른 실질적으로 순수한 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 준비하는데 사용하면 특히 적합하다. 본 발명의 정의상 "실질적으로 순수한"이란 본 발명에 따른 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 코딩하는 DNA 서열이 형질감염된 세포주로부터 유래된 다른 수용체를 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화한 DNA 서열을 제공한다. 특정적으로, 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R의 유전자 서열 중 아르기닌 220을 암호화하는 DNA 서열을 알라닌을 암호화하는 DNA 서열로 치환시키거나 트레오닌 232을 암호화하는 DNA 서열을 발린을 암호화하는 DNA 서열로 치환시킨 서열을 포함하는 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체 DNA 서열을 제공한다. 본 발명의 특정 양태로서, 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화하는 유전자가 분리되고 클로닝되었다. 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체는 사람 MC4R(S77415) 유전자로부터 치환된 유전자이다. 사람 MC4R의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 미국특허 제6,100,048호 등에 기재되어 있다. 통상 유전자의 분리와 이의 클로닝에는 당업계에 공지된 일반적인 방법이 이용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체 유전자를 제조하기 위해 멜라노코르틴 수용체 MC4R 유전자를 주형으로 하여 돌연변이 프라이머로 PCR 증폭하여 cDNA를 작제하였다. 돌연변이 프라이머는 당업계의 공지된 일반적인 방법으로 제조될 수 있으며 본 발명의 실시예에서는 Quick Change TM 위치 지정 돌연변이 기구(Stratagene, USA)를 이용하여 디자인하였다. 멜라노코르틴 수용체 MC4R의아르기닌 220을 알라닌으로 치환한 서열로 암호화된 돌연변이체의 cDNA는 하기 실시예 표 4에 나타낸 바와 같이 프라이머 9와 프라이머10으로 PCR 증폭하여 작제하였고, 트레오닌 232를 발린으로 치환한 서열로 암호화된 돌연변이체의 cDNA는 프라이머 15와 프라이머 16으로 PCR 증폭하여 작제하였다. 본 발명의 특정 양태로서, 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다. 본 발명의 실시예에서, 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체 cDNA를 클로닝 벡터에 클로닝하였다. 클로닝 벡터로는 일반적으로 사용되는 다양한 종류의 벡터가 사용될 수 있으나 본 발명에서는 pSV(pSG(stratagene)의 다중 클론 부위(polycloning site)를 변환시킨 벡터)벡터를 사용하였다. 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체의 cDNA의 염기서열은 이중-가닥 시퀸싱 방법으로 분석하였으며, 아미노산 서열의 변화를 확인하였다. 본 발명의 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화하는 DNA 서열은 본 분야에 공지된 표준방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오서치, 어플라이드 바이오시스템TM 등으로 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 본 발명은 ⒜ 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화한 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, ⒝ 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는형질감염시키며, ⒞ 생성된 형질전환 또는 형질감염체를 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체의 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건하에 배양하여 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 수득할 수 있다. 연관된 관점으로서, 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제조할 수 있다. 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다. “발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다. 본 발명의 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다. 상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질감염”은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다. 발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화하는 cDNA를 클로닝할 때에는 동물세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 HEK293T 세포를 예시하였으나 물론 이에 제한되는 것은 아니다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다. 물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체에 시험물질을 처리하고, CRE-매개된 리포터 유전자의 활성을 측정하여 활성이 증가한 경우, 그 시험물질을 멜라노코르틴 수용체 MC4R의 촉진제(agonist)로 판단함을 특징으로 하는, 비만증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체에 시험물질을 처리하고, CRE-매개된 리포터 유전자의 활성을 측정하여 활성이 감소한 경우, 그 시험물질을 멜라노코르틴 수용체 MC4R의 길항제(antagonist)로 판단함을 특징으로 하는, 체중감소증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 당업계에 일반적으로 알려진 리포터 유전자의 활성을 이용한 방법을 사용하고 있다. 본 발명의 실시예에서는 멜라노코르틴 수용체 MC4R이 리간드(예를 들어, 천연 리간드인 α-MSH, β-MSH, γ-MSH 또는 이의 유사체)와 결합하는 경우 G-단백질 커플링으로 아데닐산고리화효소를 활성화시켜 cAMP수준을 증가시킨다는 점에 착안하여 CRE(cAMP responsive element)-매개된 리포터 유전자의 전사가 조절되도록 하는 스크리닝 방법을 이용하였다. 본 발명에 사용되는 리포터 유전자는 전사를 조절하는 프로모터 하에 작동가능하도록 연결된 것으로 그 전사활성을 용이하게 측정 할 수 있는 어떠한 리포터 유전자로도 제한 없이 사용할 수 있다. 리포터 유전자의 예로는 루시퍼라제, 알카라인 포스타아제, 클로람페니콜 아세틸전환효소, 글루쿠아노이드 합성효소, 성장 호르몬 또는 태반 알카라인 포스타아제 등을 암호화한 리포터 유전자가 있다. 본 발명의 형질전환 또는 형질전환된 세포는 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체에 대해 촉진작용(agonistic effect)을 하는 촉진제 또는 길항작용(antagonistic effect)을 갖는 길항제를 선별하는데 적용된다. 본원에 사용된 용어 “촉진제(agonist)”란 MC4R과 결합하여 천연 리간드의 효과를 모사하는 화합물을 의미하며, 용어 “길항제(antagonist)”란 천연 리간드의 효과를 억제하는 화합물을 의미한다. 본 발명의 실시예에서는 HEK293T세포에 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 암호화하는 유전자를 포함한 재조합 플라스미드, 리포터 유전자인 루시퍼라제를 탑제한 pCRE-luc(Stratagene) 및 β-갈락토시다제 리포터 유전자를 첨가하여 형질감염시킨 후 멜라노코르틴 수용체 MC4R에 작용하는 촉진제인 α-MSH 유사체인 NDP-MSH를 처리하여 루시퍼라제 활성을 측정하는 방법을 예시하고 있다. 루시퍼라제 활성은 β-갈락토시다제 발현을 기준으로 결정되고 규정화된다. 본 발명에 따른 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체에 대한 촉진제를 스크리닝 하는 방법은 시험 물질을 본 발명의 형질전환체 또는 형질감염체에 처리하여 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체가 활성화됨에 따라 CRE-매개된 리포터 유전자 활성이 증가하는 것을 분석하여 확인할 수 있으며, 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체에 대한 길항제를 스크리닝 하는 방법은 시험 물질이 처리된 본 발명의 형질전환체 또는 형질감염된 세포에 멜라노코르틴 펩타이드를 처리하여 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체의 활성을 유도하는 멜라노코르틴 펩타이드를 방해하는지의 여부를 CRE-매개된 리포터 유전자 활성이 감소하는 것을 분석하여 확인 할 수 있다. 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. <실시예> 실시예 1 MC3R/MC4R 키메라 수용체 발현 벡터의 작제 MC3R과 MC4R은 전체 아미노산 서열의 60%가 동일하며 76%의 유사성을 가지고 있다. 상기 수용체의 트랜스멤브레인 영역은 높은 상동성을 지니고 있으며 세포 내 및 세포 외 루프는 상동성이 낮은 특성이 있다. 본 발명자들은 G 단백질 커플링에 있어서, MC3R과 MC4R의 각각의 영역들이 어떤 역할을 하는지를 조사하기 위하여 4종류의 키메라 수용체를 제조하였다. 키메라 수용체는 G 단백질 커플링에 서 i3 영역의 역할을 규명하기 위하여 디자인하였다. 4종류의 키메라 수용체 키메라 1, 키메라 2, 키메라 3 및 키메라 4를 제조하기 위해 각각의 발현 벡터를 제작하였다. 각각의 키메라 수용체의 cDNA는 로저 D. 콘(Roger D. Cone)박사로부터 제공받은 쥐 MC3R(X70667)과 사람 MC4R(S77415) 유전자의 i3 루프 영역 및 C-말단 영역의 서열을 상호 치환하여 다음과 같은 배열을 갖도록 제조하였다. 이때, MC3R과 MC4R의 서열은 NCBI 데이터베이스로부터 획득하였으며, 이를 ClustalW 및 GENE DOC 프로그램을 사용하여 정렬하였다. 키메라 1은 MC3R의 i3 루프 영역(아미노산 서열 249-279)과 나머지 C-말단 영역(아미노산 서열 280-359)을 MC4R의 대응하는 영역으로 교환하였으며(키메라1: MC3R 1-248 -MC4R 218-332 ), 키메라 2는 i3 루프 영역만을 MC4R의 i3 루프 영역으로 교환하였다(키메라 2: MC3R 1-248 -MC4R 218-246 -MC3R 280-337 ). 키메라 3은 MC3R의 i3 루프와 세포질 C-말단 루프아미노산 서열 338-359)를 MC4R의 대응하는 영역으로 교환하였으며(키메라3: MC3R 1-248 -MC4R 218-332 -MC3R 280-337 -MC4R 305-332 ), 키메라 4는 세포질 C-말단 루프만을 MC4R의 대응하는 영역으로 교환하였다(키메라4: MC3R 1~337 -MC4R 305-332 )(도 1). 키메라 수용체의 cDNA는 각각의 수용체로부터 기원하는 단편들을 벡터 프라이머(프라이머 1 및 프라이머 2)와 MC3R 및 MC4R간의 접합부위에 대한 중복 프라이머를 사용하여 1차적으로 PCR 증폭한 다음 증폭된 단편들을 아가로스 겔로부터 분리 정제하고 2개의 외부 벡터 프라이머를 이용하여 2차적으로 PCR 증폭함으로써 제조하였다. MC3R의 아미노말단부터 트렌스멤브레인 V영역의 카르복시 말단까지의 서열(아미노산1-248)을 주형으로 하여 벡터 프라이머(프라이머 1)와 중복 36-머 프라이머(프라이머 4)를 이용하여 PCR 증폭하였다. 상기 중복 프라이머는 주형서열인 MC3R로부터 24개의 염기와 MC4R의 12개의 염기를 포함하는 것이다. 동일한 방법으로 MC4R을 주형(아미노산 218 번부터 332번)으로 하고 2개의 프라이머(프라이머 3, 프라이머 2)를 이용하여 PCR를 수행하였다. 상기 PCR 산물들을 정제한 다음 키메라 1의 경우에는 프라이머 3 과 프라이머 4를 사용하여 PCR 증폭하였으며, 키메라 2의 경우에는 프라이머 5 과 프라이머 6을 사용하여 PCR 증폭하였다. 키메라 3의 경우에는 프라이머 7 과 프라이머 8을 사용하여 PCR 증폭하였으며, 키메라 4는 프라이머 7 과 프라이머 8을 사용하여 PCR 증폭하였다. 이때, PCR 반응은 최종부피 50 ㎕가 되도록 1.5 mM MgCl 2 , 20 pmol 프라이머, 10 mM의 dNTP 혼합물, 50ng의 시료 DNA, 10 X PCR 완충용액, 1.25 unit의 Taq DNA 폴리머라제(Life technologies, Inc., Grand Island, NY)를 혼합한 다음 상기 혼합액을 94℃에서 1분간 변성, 94℃에서 10초간 변성, 55℃에서 30초간 재결합, 72℃에서 1분간 신장과정을 34회 반복하였다. 72℃에서 10분간 확장한 다음 반응을 종료하였다. PCR 증폭에 사용한 프라이머는 표 1에 나타낸 바와 같다. 프라이머 3 내지 프라이머 8에서 밑줄은 MC4R로부터 유래한 서열이며, 그외의 부분은 MC3R로부터 유래한 서열을 나타낸다.
키메라 수용체 작제에 사용한 프라이머 서열
| 프라이머 | 서열 | 서열번호 | | 1 | MC3R-F(벡터 프라이머) | 5' CGA GCT CGG ATC CCC GGG CTG CAG GAA TTC 3' | 1 | | 2 | MC4R-R(벡터 프라이머) | 5' ATG CAT GCT CGA GGT CGA CGG TAT CGA TAA 3' | 2 | | 3 | MC4R-F | 5' CACATGTTCCTC ATGGCCAGGCTTCACATTAAGAGG3'734 745 652 675 | 3 | | 4 | MC3R-R | 5' AAGCCTGGCCAT GAGGAACATGTGGATATATAGGGT 3'663 652 745 722 | 4 | | 5 | Chm2-3R-F | 5' GGAGCGATTACC ATCACTATCCTGCTGGGTGTTTTC 3'727 738 839 862 | 5 | | 6 | Chm2-4R-R | 5' CAGGATAGTGAT GGTAATCGCTCCCTTCATATTGGC 3'850 839 738 715 | 6 | | 7 | Chm3-4R-F | 5' ATCTACGCCTTC CGGAGTCAAGAACTGAGGAAAACC 3'1001 1012 913 936 | 7 | | 8 | Chm3-3R-R | 5' TTCTTGACTCCG GAAGGCGTAGATGAGGGGGTCGAT 3'924 913 1012 989 | 8 |
상기와 같이 작제된 키메라 수용체의 최종 PCR 산물을 아가로스 겔로부터 분리하고 정제한 다음 이를 제한효소 BamHI 및 XhoI 으로 절단하고 과발현 벡터인 pSV(Lee, EJ et al., Eur J Biochem, 268, 582-591 (2001); Baik, JH et al., Methods in Neuroscience, 29, 75-89 (1996))의 BamHI 및 XhoI 효소 제한 부위에 순차적으로 삽입하여, 각각의 발현벡터 pSV-Chimera 1, pSV-Chimera 2, pSV-Chimera 3, pSV-Chimera 4를 작제하였다. 상기 모든 키메라 삽입체들은 디디옥시 터미네티터 사이클 시퀀싱 킷트(Parmacia)을 이용하여 자동 서열분석기 ALFexpress(Pharmacia)로 서열을 분석하였다. 그 결과, 모든 영역에서 점돌연변이나 치환은 관찰되지 않았다. 실시예 2 MC3R/MC4R 키메라 수용체의 형질감염 및 발현 상기 실시예 1에서 작제한 발현벡터를 이.콜라이(E.Coli) 숙주세포 DH5α에 형질감염시킨 다음 형질감염된 세포를 LB(Luria-Bertani)-한천(Agar)( AMP + 50㎎/㎖) 배지에 접종하고 37℃ 배양기에서 16시간 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 세포를 수거한 다음, 세포 부유 용액을 첨가하여 세포를 부유시키고, 세포용해 용액으로 상기 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 중성용액으로 중성화시킨 후 원심분리하여 맑은 상층용액을 미리 평형(equilibrium) 시킨 컬럼(+ 전하)에 넣었다. 맑은 상층용액이 컬럼에서 다 내려간 후 세척 용액으로 2번 흘려주었다. 그런 다음, 정제 용액으로 컬럼에 붙어 있는 플라스미드 DNA를 회수하여 플라스미드 침전 과정을 거친 후 순수한 플라스미드 DNA(발현된 키메라 수용체들)를 얻었다. 숙주세포인 HEK 239T를 10% 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM)배지에서 배양한 시킨 후, FuGENE 6 형질감염 시약(Roche Molecular Biochemicals)을 이용하여 제조사에서 지시한 절차에 따라 상기에서 분리한 발현벡터로 각각 형질감염시켰다. 실시예 3 MC3R/MC4R 키메라 수용체의 리간드 결합력 측정 HEK 293T 세포를 MC3R/MC4R 키메라 수용체 플라스미드로 형질감염시킨 다음 리간드 결합력을 측정하였다. HEK 293T 세포를 상기 실시예 2의 방법에 따라 야생형 MC3R, MC4R 및 MC3R/MC4R 키메라 수용체 플라스미드로 형질감염시킨 다음 24시간 후에 배지를 제거하고 세척 완충액(트리스 50mM, 염화나트륨 100mM, 염화칼륨 5mM, 염화칼슘 2mM, pH 7.2)으로 2회 세척하였다. 즉시 세포에 10 -10 M 농도의 [ 125 I] NDP-MSH 및 10 -6 M 농도의 경쟁적 표지되지 않은 리간드가 함유된 결합 완충액(트리스 50mM, 염화나트륨 100mM, 염화칼륨 5mM, 염화칼슘 2mM, 5% HBSSC(Hanks′Balanced Salt Solution) 및 0.5% 소 혈청 알부민, pH 7.2) 0.25㎖을 첨가하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 배양 마지막 단계에서 플레이트를 얼음에서 15분간 방치한 다음 세포를 차가운 결합 완충액 0.5㎖로 2회 세척하였다. 플레이트에 0.5N NaOH 0.5㎖를 2회 처리하여 세포를 분리하였다. 이를 워크만 자동 감마 카운터기를 이용하여 방사능을 측정하고 Kd 및 Bmax 값은 그라프페드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prime software)를 이용하여 95%의 신뢰구간에서 계산하였다. 한편, 상기 요오드화 NDP-MSH 및 125 I(Iodotyrosyl2)-[NIe 4 , D-Phe 7 ]-MSH는 다음과 같은 클로라민-T 방법에 따라 제조하였다. NDP-MSH 5㎍이 첨가된 Na125I(NEN) 1mCi(10μL)를 200mM 인산나트륨 완충액(pH7.2) 100㎕에 첨가하고 클로라민 T 용액2.8㎎/㎖가 포함된 200mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.2)을 15초 동안 첨가한 후 3.6㎎/㎖농도의 소디움 메타바이설페이트 50㎖를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 상기 반응 혼합물을 트리플루오로아세트산 0.1%를 함유한 0.1% BSA 용액1ml로 희석하고 C18 Sep-Par 카트리지(Waters)가 장착된 세파덱스 G25 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 분획을 회수하고 방사성 분획에 BSA 0.1%를 첨가하였다. [ 125 I] NDP-MSH의 특이 활성을 측정한 결과, 약 0.59pmol/100,000cpm으로 나타났다. 실험결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 야생형 MC3R, MC4R 및 키메라 수용체는 [ 125 I] NDP-MSH에 모두 높은 친화력으로 결합하였다. [ 125 I] NDP-MSH에 대한 MC3R 및 MC4R의 친화력은 각각 3.775±0.4906nM, 4.269±1.0090nM로 나타났으며, 상기 두 수용체의 Bmax값은 매우 유사하였다. 또한, 각각의 키메라 수용체는 모 수용체와 유사한 친화력을 나타내었다. 이러한 결과는 리간드 결합 영역이 주로 트랜스멤브레인 영역에 위치해 있기 때문에 수용체간의 i3 루프 치환이 리간드 결합 영역에 있어서 중요한 구조적 영향을 주지 않는다는 것을 의미한다.
MC3R, MC4R 및 키메라 수용체의 리간드 결합력
| Bmax(f㏖/㎎ protein) | Kd(nM) | | MC3R | 361.7±20.47 | 3.775±0.4906 | | MC4R | 375.9±40.07 | 4.269±1.0090 | | 키메라 1 | 329.2±21.56 | 3.310±0.5175 | | 키메라 1 | 329.2±21.56 | 3.558±0.4753 | | 키메라 3 | 298.7±23.34 | 3.164±0.5977 | | 키메라 4 | 381.2±53.52 | 4.298±1.3350 |
1 . 3회의 독립적인 실험결과를 평균±표준오차로 나타낸 값임. 실시예 4 MC3R/MC4R 키메라 수용체의 CRE-루시퍼라제 리포터 유전자 활성 조사 상기 실시예 2에서 제작한 키메라 수용체의 루시퍼라제 리포터 유전자 활성을 조사하였다. HEK 293T세포 5×10 5 cells를 6-웰 배양접시에 도말한 다음 pCRE-luc(Stratagene) 1㎍, β-갈락토시다제 유전자를 운반하는 플라스미드 pCH11O 0.5㎍ 및 각각의 키메라 수용체 플라스미드 DNA 1㎍ 또는 야생형의 MC3R, MC4R을 첨가하여 형질감염시켰다. 형질감염 후 6시간이 경과된 다음 새로운 배지(0.5% 소 혈청 알부민을 포함하는 DMEM배지)로 교체하였다. 형질감염 후 24시간 이 경과된 다음 10 -5 M 농도의 α-MSH-ND(alpha-melanocyte-stimulating hormone (MSH)-ND)를 3시간 동안 처리한 다음 세포를 용해시키고 루시퍼라제 검정 시스템(Promega)을 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 발광정도는 96-웰 발광측정기(Microlumat; EG & G Berthold, Bad Wilbad, Germany)를 이용하여 측정하였으며 리포터 유전자의 발현은 β-갈락토시다제 활성을 이용하여 정상화하였다(Herbomel, P. et al., Cell, 39, 653-662 (1984); (Bardford, MM, Anal Biochem., 72, 248-254 (1976)). 대조군으로는 pCRE-luc 1㎍, β-갈락토시다제 유전자를 운반하는 플라스미드 pCH110 0.5㎍ 및 각각의 키메라 수용체 1㎍을 첨가하여 상기와 같은 방법으로 형질전환하였으며, 이때 멜라노코르틴 펩타이드(α-MSH-ND)는 처리하지 않았다. 실험 결과는 대조군의 루시퍼라제 활성에 대한 형질감염된 세포의 루시퍼라제 활성의 비율로 나타내었다. 또한, 획득한 데이터의 평균값을 그라프페드 프라임 소프트웨어(GraphPad Prime software)의 비선형 제곱 회귀분석을 이용하여 기울기 변수를 갖는 S자 곡선으로 나타내었다. EC 50 값(nM)은 평균±표준오차(SE)로 나타내었다. 실험결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 α-MSH 유사체 농도가 증가할수록 루시퍼라제 활성은 전형적으로 용량 의존적으로 증가하였다. 한편, 세포를 리포터 플라스미드만으로 형질 감염시켰을 때에는 α-MSH 유사체에 의한 유의적인 변화가 나타나지 않았다. 이는 형질감염에 사용한 세포주에 자체적으로 존재할 수 있는 멜라노코르틴 수용체에 의해 루시퍼라제 활성에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 또한, CRE 서열이 없는 루시퍼라제 리포터 벡터를 사용하여 형질감염시킨 다른 대조군의 루시퍼라제 활성은 리포터 플라스미드에 CRE 서열이 존재하는 루시퍼라제 리포터 벡터를 사용한 경우와 동일하게 나타났다. 따라서, 본 실시예에서 측정된 CRE-루시퍼라제 활성은 수용체에 의한 cAMP-매개된 유전자 발현의 변화에 따른 세포 내 cAMP 변화를 반영하는 것이며, 이는 수용체-G단백질-작동인자의 상호작용을 증명하는 것으로 판단할 수 있다. MC4R에 의해 유도된 루시퍼라제 활성은 MC3R에 의해 유도된 루시퍼라제 활성의 약 30 내지 50%로 나타났다. MC3R의 i3 루프 및 C-말단 영역을 MC4R의 대응하는 영역으로 교환한 키메라 1은 최대 리포터 유전자 활성이 천연 MC3R과 유사하게 나타났다. 키메라 4의 경우에는 최대 리포터 유전자 활성이 약간 증가하는 경향을 보였다. 반면, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이 키메라 2 및 키메라 3은 최대루시퍼라제 유전자 활성이 각각 60% 및 45%씩 감소하였다. 용량-반응곡선으로부터 계산된 EC 50 은 일반적으로 높게 나타났으며, 그 결과를 표 3에 요약하였다. α-MSH-ND 자극을 받은 키메라 2 수용체의 루시퍼라제 리포터 유전자 활성은 MC3R(EC 50 =1.3nM)에 비해 8.7배(EC 50 =11.37nM)나 높게 나타났으나 다른 키메라 수용체의 EC 50 값은 큰 변화가 없었다. 이는 G 단백질 커플링이 MC3R 및 MC4R의 세포질내 3번째 루프와 관련이 있다는 것을 의미한다.
MC3R, MC4R 및 키메라 수용체에 대한 멜라노코르틴 촉진제 α-MSH-ND의 처리에 따른 EC50 값
| EC 50 (nM) | | MC3R | 1.309±0.367 | | MC4R | 1.007±0.564 | | 키메라 1 | 3.303±0.782 | | 키메라 2 | 11.372±6.128** | | 키메라 3 | 3.163±1.475 | | 키메라 4 | 2.988±0.725 |
1 . 3회의 독립적인 실험결과를 평균±표준편차로 나타낸 값임. ** P<0.01 MC3R의 EC 50 값과 유의적 차이가 있음 실시예 5 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체 및 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터의 작제 본 발명자들은 MC4R의 i3 루프 영역의 아미노산을 돌연변이시켜 7종류의 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 작제하였다. 돌연변이 수용체 R220A는 아르기닌(Arg) 220을 알라닌(Ala)으로 치환하여 제조하였으며, 돌연변이 수용체 K224A는 리신(Lys) 224를 알라닌(Ala)으로, R225A는 아르기닌(Arg) 225를 알라닌(Ala)으로, T232V는 트레오닌(Thr) 232를 발린(Val)으로, I235P는 이소루신(lle) 235를 프롤린으로, R236A는 아르기닌(Arg) 236을 알라닌(Ala)으로, R236Q는 아르기닌(Arg) 236을 글루타민으로 각각 치환한 것이다. MC4R을 주형으로 하여 각각의 정방향 및 역방향 프라이머로 PCR 증폭하여 cDNA를 작제하였다. PCR시 pfu DNA 중합효소(Pfu Torbo DNA 폴리머라제, Stratagene, USA)를 사용하였으며 95℃에서 30초, 55℃에서 1분, 68℃에서 12분의 주기를 16번 반복하였다. PCR 증폭에 사용한 프라이머는 표 4에 나타낸 바와 같으며 R220A는 프라이머 9과 프라이머 10, K224A는 프라이머 11과 프라이머 12, R225A는 프라이머 13과 프라이머 14, T232V는 프라이머 15과 프라이머 16, I235P는 프라이머 17과 프라이머 18, R236A는 프라이머 19과 프라이머 20, R236Q는 프라이머 21과 프라이머 22를 사용하였다. 돌연변이 프라이머는 Quick Change TM 위치 지정 돌연변이 기구(Stratagene, USA)를 이용하여 MC4R의 i3 영역의 서열로부터 디자인하였다. 밑줄은 돌연변이 아미노산 잔기를 나타내는 것이다.
MC4R 돌연변이 수용체 제조에 사용된 프라이머.
| 프라이머 | 서열 | 서열번호 | | 9 | R220A(F) | 5'gttcctgatggcc gcg cttcacattaagag 3' | 9 | | 10 | R220A(R) | 5' ctcttaatgtgaag cgc ggccatcaggaac 3' | 10 | | 11 | K224A(F) | 5' gccaggcttcacatt gcg aggattgctgtc 3' | 11 | | 12 | K224A(R) | 5' gacagcaatcct cgc aatgtgaagcctggc 3' | 12 | | 13 | R225A(F) | 5' cttcacattaaggcgattgctgtcctcccc 3' | 13 | | 14 | R225A(R) | 5' ggggaggacagcaat cgc cttaatgtgaag 3' | 14 | | 15 | T232V(F) | 5' gtcctccccggc gta ggtgccatccgc 3' | 15 | | 16 | T232V(R) | 5' gcggatggcacc tac gccggggaggac 3' | 16 | | 17 | I235P(F) | 5' ggcactggtgcc cca cgccaaggtgcc 3' | 17 | | 18 | I235P(R) | 5' ggcaccttggcg tgg ggcaccagtgcc 3' | 18 | | 19 | R236Q(F) | 5' cactggtgccatc cag caaggtgccaatatg 3' | 19 | | 20 | R236Q(R) | 5' catattggcacctt gct ggatggcaccagtg 3' | 20 | | 21 | R236A(F) | 5' cactggtgccatc gcg caaggtgccaatatg 3' | 21 | | 22 | R236A(R) | 5' catattggcaccttg cgc gatggcaccagtg 3' | 22 |
메틸화된(methylated) cDNA를 Dnp Ⅰ효소로 37℃에서 1시간 동안 반응시킴으로써 절단하였다. 이를 제한효소 BamHI 및 XhoI 으로 절단하고 과발현 벡터인 pSV(Lee, EJ et al., Eur J Biochem, 268, 582-591 (2001); Baik, JH et al., Methods in Neuroscience, 29, 75-89 (1996))의 BamHI 및 XhoI 효소 제한 부위에 순차적으로 삽입하여, 각각의 발현벡터 pSV-R220A, pSV-K224A, pSV-R225A, pSV-T232V, pSV-I235P, pSV-R236A, pSV-R236Q 를 작제하였다. 모든 DNA 플라스미드 삽입체들은 전체 이중-가닥 시퀀싱에 의해 서열을 분석하였으며 아미노산의 변화를 확인하였다. 실시예 6 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체의 형질감염 및 발현 상기 실시예 5에서 작제한 발현벡터를 이. 콜라이(E.Coli) 숙주세포 DH5α에 형질감염시킨 다음 형질감염된 세포를 LB(Luria-Bertani)-한천(Agar)( AMP + 50㎎/㎖) 배지에 접종하고 37℃ 배양기에서 16시간 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 세포를 수거한 다음, 세포 부유 용액을 첨가하여 세포를 부유시키고, 세포용해 용액으로 상기 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 중성용액으로 중성화시킨 후 원심분리하여 맑은 상층용액을 미리 평형(equilibrium) 시킨 컬럼(+ 전하)에 넣었다. 맑은 상층용액이 컬럼에서 다 내려간 후 세척 용액으로 2번 흘려주었다. 그런 다음, 정제 용액으로 컬럼에 붙어 있는 플라스미드 DNA를 회수하여 플라스미드 침전 과정을 거친 후 순수한 플라스미드 DNA(발현된 돌연변이 수용체들)를 얻었다. 숙주세포인 HEK 239T를 10% 소 태아 혈청이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM)배지에서 배양한 시킨 후, FuGENE 6 형질감염 시약(Roche Molecular Biochemicals)을 이용하여 제조사에서 지시한 절차에 따라 상기에서 분리한 발현벡터로 각각 형질감염시켰다. 실시예 7 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체의 리간드 결합력 측정 상기 실시예 6의 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체 플라스미드를 HEK 239T 세포에 형질감염시켜 리간드 결합력을 조사하였다. HEK 293T 세포를 상기 실시예 2의 방법에 따라 야생형 MC3R, MC4R 및 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체플라스미드로 형질감염키고 상기 실시예 3의 방법에 따라 리간드 결합력을 측정하였다. 실험 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체 모두가 [ 125 I] NDP-MSH에 결합하였다. 이는 돌연변이 수용체가 원형질막에서 모두 발현되었음을 의미하는 것이다. 또한, 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체의 [ 125 I] NDP-MSH에 대한 결합력에 있어서 수용체간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
MC3R, MC4R 및 MCR4 돌연변이 수용체의 리간드 결합력
| 수용체종류 | Bmax (f㏖/㎎ protein) | Kd (nM) | | MC3R | 361.7±20.47 | 3.775±0.4906 | | MC4R | 375.9±40.07 | 4.269±1.0090 | | R220A | 325.9±25.23 | 3.893±0.6862 | | K224A | 297.9±18.47 | 4.967±0.6529 | | R225A | 323.8±26.67 | 4.006±0.7527 | | T232V | 304.8±34.29 | 3.514±0.9270 | | I235P | 309.6±15.92 | 3.621±0.4330 | | R236A | 296.3±38.75 | 4.081±1.1980 | | R236Q | 282.0±41.17 | 4.529±1.4400 |
1 . 3회의 독립적인 실험결과를 평균±표준오차로 나타낸 값임. 실시예 8 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체의 CRE-루시퍼라제 리포터 유전자 활성 조사 형질감염된 HEK 293T 세포에 α-MSH-ND 대신NDP-MSH([Nle(4),D-Phe(7) ]alpha-melanocyte-stimulating hormone)를 처리하여 실시예 4와 동일한 CRE-매개된 리포터 유전자 활성측정 방법을 실시하였다. 실험결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체 R220A와 T232V의 경우 야생형의 MC4R에 비해 리포터 유전자 활성이 증가되어 MC3R의 활성과 유사하게 나타났다. 반면에 다른 돌연변이 수용체의 CRE-루시퍼라제 리포터 유전자 활성은 야생형 MC4R의 활성과 유사하게 나타났다. 또한, 표 6에 나타낸 바와 같이, R220A의 EC 50 값은 야생형 MC4R에 비해 13.9배 낮았으며 T232V의 EC 50 값은 야생형 MC4R에 비해 7.6배 낮게 나타났다. 그 외의 돌연변이 수용체 K224A(2.4배), R225A(4.1배), R236A(4.5배) 및 R236Q(4.5배)는 EC 50 값이 야생형에 비해 약간 증가하는 경향을 보였으나, 최대 CRE-루시퍼라제 리포터 유전자 활성은 변하지 않았으며, 돌연변이 수용체 I235P의 경우에는 EC 50 값과 최대 리포터 유전자 활성 모두가 변화를 나타내지 않았다.
MC3R, MC4R 및 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체의 루시퍼라제 유전자 활성
| 돌연변이수용체 | EC 50 (nM) 1 | | MC4R | 5.63±1.876 | | MC3R | 1.84±0.3012 | | R220A | 0.405±0.0939* | | K224A | 2.36±1.760 | | R225A | 1.39±0.7258 | | T232V | 0.744±0.4138* | | I235P | 3.61±1.851 | | R236A | 1.24±0.5365 | | R236Q | 1.26±0.9031 |
1 . 4회의 독립적인 실험결과를 평균±표준오차로 나타내 값임. * P<0.05 MC4R의 EC 50 값과 유의적 차이가 있음
본 발명에 따른 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체는 멜라노코르틴 수용체 MC4R의 아르기닌 220을 알라닌으로 치환하거나 트레오닌 232를 발린으로 치환시켜 멜라노코르틴 수용체 MC4R 비해 활성이 증가한 수용체로서, 이 돌연변이 수용체, 이를 암호화한 유전자, 이 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드, 이 재조합 플라스미드로 형질전환 내지 형질감염된 세포를 생성하고, 이들 형질전환체 또는 형질감염체로부터 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 제조할 수 있다. 또한 멜라노코르틴 수용체 MC4R 돌연변이체를 이용한 비만증 치료제 또는 체중 감소증 치료제의 스크리닝 방법으로 유용하다. |
