用于使用纤维素进行同时糖化和发酵的表达纤维素酶的酵母 |
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| 申请号 | CN200980153709.2 | 申请日 | 2009-11-23 | 公开(公告)号 | CN102272303A | 公开(公告)日 | 2011-12-07 |
| 申请人 | 马斯科马公司; 斯泰伦博斯大学; | 发明人 | J·麦克布赖德; E·布列夫诺瓦; C·甘地; M·梅隆; A·弗罗利赫; K·德洛尔特; V·拉吉加里亚; J·弗莱特; E·范齐尔; R·登哈恩; D·拉格兰格; S·罗斯; M·彭蒂莱; M·伊尔曼; M·西尔卡-阿霍; J·乌西塔洛; H·H·豪; C·赖斯; J·维拉里; E·A·斯通豪斯; A·吉尔伯特; J·D·基廷; H·徐; D·威尔斯; I·谢克哈尔; N·索恩格伦; A·K·沃纳; D·墨菲; | ||||
| 摘要 | 包括表达异源 纤维 素酶的克鲁维 酵母 的宿主细胞从 纤维素 产生 乙醇 。另外，可以一起共同培养表达不同的异源纤维素酶的多种宿主细胞并用于从纤维素产生乙醇。重组酵母菌株和酵母菌株的共培养物可用于独自地产生乙醇，或者也可以与外部添加的纤维素酶一起使用以增加 糖化 和 发酵 过程的效率。 | ||||||
| 权利要求 | 1.转化的耐热的酵母宿主细胞，其包含至少一个含有编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中，当使用纤维素作为碳源生长时，所述酵母宿主细胞能够产生乙醇。 |
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| 说明书全文 | 用于使用纤维素进行同时糖化和发酵的表达纤维素酶的酵母 背景技术[0001] 木质纤维素生物质被广泛认为是用于生产可再生燃料和化学品的有前景的原材料来源。阻碍从生物质原料更广泛地产能的主要障碍是普遍缺乏用于克服这些材料抗拒被转化为有用的燃料的低成本技术。木质纤维素生物质含有可以被转化为乙醇的碳水化合物级份(例如，纤维素和半纤维素)。为了转化这些级份，纤维素和半纤维素必须最终被转化或水解为单糖；长期以来恰恰是该水解被证明存在问题。 [0002] 生物介导的过程对于能量转化、尤其是将木质纤维素生物质转化为燃料是有前景的。涉及酶促或微生物水解的生物质加工方案通常包括四个生物介导的转化：(1)分解糖的酶类(纤维素酶和半纤维素酶)的产生；(2)存在于预处理的生物质中的碳水化合物成分水解为糖；(3)己糖(例如葡萄糖、甘露糖和半乳糖)的发酵；和(4)戊糖(例如木糖和阿拉伯糖)的发酵。这四个转化发生于被称作联合生物加工(CBP)的工艺配置中的单一步骤中，联合生物加工与其它的整合度较低的配制的区别在于：其不涉及用于生产纤维素和/或半纤维素的专门的工艺步骤。 [0003] CBP提供了比特征在于专门的纤维素酶生产的方法成本更低且效率更高的潜在可能。有益之处部分来源于避免了与生产纤维素酶相关的资金成本、底物和其它原材料和工具。此外，使用CBP，数个因素支持实现较高速率的水解，因此减小了反应器的体积和资金投入，包括酶-微生物协同作用，以及使用噬热生物体和/或复合的纤维素酶系统。此外，纤维素粘附性的分解纤维素的微生物可能相对于非粘附性的微生物(例如污染物)成功地竞争纤维素水解的产物，这会增加基于微生物纤维素利用的工业方法的稳定性。通过以下两个策略在开发能够进行CBP的微生物方面取得了进展：对天然存在的分解纤维素的微生物进行工程化以改善与产物相关的特征，例如产率和效价；以及对表现出高产物产率和效价的不分解纤维素的生物进行工程化以表达异源纤维素酶和半纤维素酶系统以实现纤维素和半纤维素的利用。 [0004] 天然纤维素降解需要三种主要类型的酶活性：第1种类型是内切葡聚糖酶(1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶；EC 3.2.1.4)。内切葡聚糖酶在无定形纤维素的纤维素多糖链中随机切割，产生不同长度的寡糖，从而产生新的链末端。第2种类型是外切葡聚糖酶，包括纤维糊精酶(1，4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶；EC 3.2.1.74)和纤维二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶；EC 3.2.1.91)。外切葡聚糖酶以渐进的方式作用于纤维素多糖链的还原末端或非还原末端，释放葡萄糖(葡聚糖水解酶)或纤维二糖(纤维二糖水解酶)作为主要产物。外切葡聚糖酶还可以作用于微晶纤维素，推测为使纤维素链从微晶结构上脱落下来。第3种类型是β-葡萄糖苷酶(β-葡萄糖苷葡萄糖水解酶； EC3.2.1.21)。β-葡萄糖苷酶将可溶性纤维糊精和纤维二糖水解为葡萄糖单元。 [0005] 面包酵母(酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)仍然是生产乙醇的优选微生物 B等人，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.73，53-84(2001))。该微生物的有益特性包括：(i)接近于理论产率的高生产力(所使用的每克葡萄糖产生0.51克乙醇)，(ii)高耐渗性和耐酒精性质，(iii)工业过程中的天然鲁棒性(robustness)，和(iv)由于其长期与制酒和制面包以及酿啤酒接触，所以一般被认为是安全的(GRAS)。此外，酿酒酵母显示出对于由于生物质预处理而产生的通常存在于水解物中的抑制剂的耐受性。 [0006] 酿酒酵母的一个主要缺点在于其不能利用复合的多糖，例如纤维素，或其分解产物，例如纤维二糖和纤维糊精。在尝试解决这个问题时，已经将来自细菌和真菌来源的数种异源纤维素酶转移进入酿酒酵母，使其能够降解纤维质的衍生物(Van Rensburg，P.，等人，Yeast 14，67-76(1998))，或使其能够在纤维二糖上生长(Van Rooyen，R.，等人，J.Biotech.120，284-295(2005))；McBride，J.E.，等人，Enzyme Microb.Techol.37，93-101(2005))。然而，目前在酵母中异源表达的纤维素酶的表达水平和比活性的水平仍然不足以使酵母能够在不外部添加酶的情况下有效地在纤维质底物上生长并产生乙醇。仍然显著需要改善纤维素酶活性的量以实现能够有效且成本划算地将纤维质底物转化为乙醇的联合生物加工(CBP)系统的目标。 [0007] 使用酿酒酵母的另一个主要缺点在于：外部添加的纤维素酶的最适作用温度高于酿酒酵母的最适作用温度。因此，情况是：要么在两个不同的温度通过两个步骤的过程进行该过程，要么选定一个温度，在该温度时，两个过程都在一定程度上发挥作用，但是至少其中一个过程不是在最佳效率进行。 [0008] 为了解决这些局限性，本发明提供了野生型和密码子优化的异源纤维素酶的组合在酵母中的异源表达，其允许有效地从纤维素来源产生乙醇。本发明还提供了此类异源纤维素酶在耐热的酵母中的表达以及使用此类转化的酵母来生产乙醇的方法。 [0009] 发明概述 [0010] 本发明涉及分解纤维素的宿主细胞。本发明的宿主细胞表达异源纤维素酶并且能够从纤维素生产乙醇。 [0011] 具体地，在一些实施方式中，本发明提供了包含含有编码纤维素酶的核酸的至少一个异源多核苷酸的耐热的酵母宿主细胞，其中，当使用纤维素作为碳源生长时，所述酵母宿主细胞能够产生乙醇。 [0012] 在另一个实施方式中，本发明提供了转化的耐热的酵母宿主细胞，其包含：(a)至少一个包含编码内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸；(b)至少一个包含编码β-葡萄糖苷酶的核酸的异源多核苷酸；(c)至少一个包含编码第一纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸；和(d)至少一个包含编码第二纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸。 [0013] 在另一个实施方式中，本发明提供了转化的酵母宿主细胞，其包含：(a)至少一个包含编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是内切葡聚糖酶；(b)至少一个包含编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是β-葡萄糖苷酶；(c)至少一个包含编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是第一纤维二糖水解酶；和(d)至少一个包含编码纤维素酶的核酸的异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是第二纤维二糖水解酶，其中所述纤维素酶中的至少两种被细胞分泌。 [0014] 在另一个实施方式中，本发明提供了包含至少六种异源多核苷酸的转化的酵母宿主细胞，其中每种异源多核苷酸包含编码纤维素酶的核酸。 [0015] 在另一个实施方式中，本发明提供了包含至少四种异源多核苷酸的转化的酵母宿主细胞，其中每种异源多核苷酸包含编码内切葡聚糖酶的核酸。 [0016] 在另一个实施方式中，本发明提供了包含至少两种酵母宿主细胞的共培养物，其中：(a)所述宿主细胞中的至少一种包含含有编码纤维素酶的核酸的第一异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是内切葡聚糖酶；(b)所述宿主细胞中的至少一种包含含有编码纤维素酶的核酸的第二异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是β-葡萄糖苷酶；(c)所述宿主细胞中的至少一种包含含有编码纤维素酶的核酸的第三异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是第一纤维二糖水解酶；(d)所述宿主细胞中的至少一种包含含有编码纤维素酶的核酸的第四异源多核苷酸，其中所述纤维素酶是第二纤维二糖水解酶；其中所述第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸和第四多核苷酸不在同一宿主细胞中；并且其中所述共培养物能够从纤维素产生乙醇。 [0017] 在本发明的一些具体实施方式中，所述纤维素碳源是不可溶的纤维素，晶体纤维素，衍生自木质纤维素、硬木、磷酸膨胀纤维素或微晶纤维素的纤维素。 [0018] 在一些实施方式中，本发明的宿主细胞包含含有编码第一纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸，包含编码内切葡聚糖酶的核酸的多核苷酸，包含编码β-葡萄糖苷酶的核酸的多核苷酸，和/或包含编码第二纤维二糖水解酶的核酸的多核苷酸。 [0019] 在一些实施方式中，纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶是灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M. darwinensis)、N. walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfidafusca)、热纤梭菌(Clostridum thermocellum)、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、Saccharophagusdegradans、Piromyces equii、Neocallimastix patricarum、 白曲 霉(Aspergillus kawachii)、甜 菜 胞 囊 线 虫(Heterodera schachtii)、红 褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊 耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝 顶孢(Acremonium thermophilum)、费希新萨托菌(Neosartoryafischeri)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、土曲霉(Aspergillusterreus)、粗糙脉孢菌(Neurospora Crassa)或拟南芥(Arabidopsisthaliana)的纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶。 [0020] 在一些具体的实施方式中，纤维二糖水解酶是灰腐质霉(H.grisea)CBH1、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)CBH1、埃默森篮状菌(T.emersonii)CBH1、里氏木霉(T.reesei)CBH1、埃默森篮状菌(T.emersonii)CBH2、C.lucknowense CBH2或里氏木霉(T.reesei)CBH2。在一些实施方式中，包含编码纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸编码包含纤维二糖水解酶和纤维素结合模块(CBM)的融合蛋白。在一些具体实施方式中，所述CBM是里氏木霉(T.reesei)CBH2的CBM、里氏木霉(T.reesei)CBH1的CBM或C.lucknowense CBH2b的CBM。在一些具体实施方式中，所述CBM通过连接子序列与所述纤维二糖水解酶融合。在一些具体实施方式中，宿主细胞表达第一和第二纤维二糖水解酶，其中所述第一纤维二糖水解酶是埃默森篮状菌CBH1和CBD融合物，并且所述第二纤维二糖水解酶是C.lucknowense CBH2b。 [0021] 在其它具体的实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶是扣囊复膜酵母菌β-葡萄糖苷酶。在另一具体的实施方式中，所述内切葡聚糖酶是台湾家白蚁(C.formosanus)内切葡聚糖酶。在另一具体的实施方式中，所述内切葡聚糖酶是里氏木霉(T.reesei)内切葡聚糖酶，例如里氏木霉EG2。 [0022] 在本发明的一些实施方式中，纤维素酶中的至少一种或至少两种是附着的。在本发明的其他实施方式中，纤维素酶中的至少一种是分泌的。在另一个实施方式中，纤维素酶中的至少一种是附着的，并且纤维素酶中的至少一种是分泌的。在另一个实施方式中，所有的纤维素酶都是分泌的。 [0023] 在本发明的一些实施方式中，编码纤维素酶的核酸是密码子优化的。 [0024] 在一些实施方式中，宿主细胞可以是耐热的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、密西西比毕赤酵 母(Pichia mississippiensis)、墨西哥毕赤酵母(Pichiamexicana)、粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)、仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)、葡萄牙棒孢酵 母(Clavispora lusitaniae)、墨西哥假丝酵母(Candida mexicana)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)或克鲁维酵母属(Kluveryomyces)宿主细胞。例如，在一些实施方式中，宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(K.lactis)或马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)的宿主细胞。在一些实施方式中，耐热的宿主细胞是酿酒酵母宿主细胞，并且其中酿酒酵母被选择为耐热的。 [0025] 在一些实施方式中，宿主细胞可以是油质的酵母细胞。在一些具体的实施方式中，油质的酵母细胞是布拉氏霉菌属(Blakeslea)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、白霉属(Mucor)、须霉属(Phycomces)、腐霉属(Pythium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、丝孢酵母属(Trichosporon)或耶罗威亚酵母属(Yarrowia)的细胞。 [0026] 在一些实施方式中，宿主细胞是酿酒酵母细胞。 [0027] 在一些具体的实施方式中，宿主细胞能够在大约30℃、35℃、37℃、42℃、45℃或50℃以上的温度从纤维素产生乙醇。 [0028] 在另一个具体的实施方式中，宿主细胞能够以至少大约10mg/小、时/升、至少大约30mg/小、时/升、至少大约40mg/小时/升、至少大约50mg/小时/升、至少大约60mg/小时/升、至少大约70mg/小时/升、至少大约80mg/小时/升、至少大约90mg/小时/升、至少大约100mg/小时/升、至少大约200mg/小时/升、至少大约300mg/小时/升、至少大约400mg/小时/升、至少大约500mg/小时/升、至少大约600mg/小时/升、至少大约700mg/小时/升、至少大约800mg/小时/升、至少大约900mg/小时/升或至少大约1g/小时/升的速度产生乙醇。 [0029] 本发明还提供了使用本发明的宿主细胞和共培养物的方法。例如，本发明还涉及水解纤维质底物的方法，包括将所述纤维质底物与本发明的宿主细胞或共培养物接触。本发明还涉及发酵纤维素的方法，包括在含有不可溶的纤维素的培养基中，在合适的条件下将本发明的宿主细胞或共培养物培养足以允许纤维素糖化和发酵的时间。在一些具体的实施方式中，该方法还包括将纤维质底物与外部产生的纤维素酶接触。 [0030] 在本发明的一些具体方法中，纤维质底物是选自下列的木质纤维素生物质：草、柳枝稷、大米草(cord grass)、黑麦草、草芦(reedcanary grass)、芒草(miscanthus)、糖加工残渣、甘蔗渣、农业废弃物、稻草、稻壳、大麦秸秆、玉米棒、谷物秸秆、小麦秸秆、芸苔秸秆、燕麦秸秆、燕麦壳、玉米纤维、秣草、大豆秸秆、玉米秸秆、林业废弃物、再生木浆纤维、造纸淤泥、锯屑、硬木、软木、Agave、及其组合。 [0031] 在本发明的一些具体方法中，宿主细胞或共培养物产生乙醇。乙醇可以以下列速度产生：至少大约10mg/小、时/升、至少大约30mg/小时/升、至少大约40mg/小时/升、至少大约50mg/小时/升、至少大约60mg/小时/升、至少大约70mg/小时/升、至少大约80mg/小时/升、至少大约90mg/小时/升、至少大约100mg/小时/升、至少大约200mg/小时/升、至少大约300mg/小时/升、至少大约400mg/小时/升、至少大约500mg/小时/升、至少大约600mg/小时/升、至少大约700mg/小时/升、至少大约800mg/小时/升、至少大约900mg/小时/升或至少大约1g/小时/升。 [0033] 图1显示了用于检测经异源纤维素酶转化的乳酸克鲁维酵母(菌落编号1-8)和马克斯克鲁维酵母(菌落编号9-16)中的内切葡聚糖酶I活性的CMC平板检验的图。菌株8和16是未经转化的阴性对照。左侧的平板显示菌落生长，右侧的平板显示由清除区(clearance zone)的存在指示的CMC酶活性。清除区在图中显示为白色斑点。 [0034] 图2显示了用于检测经异源纤维素酶转化的马克斯克鲁维酵母株中的CBH1活性的MU-lac检验的结果。 [0035] 图3显示了由数种表达异源纤维素酶的马克斯克鲁维酵母株转化的Avicel的百分率。 [0036] 图4显示了由数种表达异源纤维素酶的马克斯克鲁维酵母株从Avicel产生/消耗的乙醇。 [0037] 图5显示了表达异源纤维素酶的酿酒酵母在细菌微晶纤维素(BMCC)上的生长。 [0038] 图6显示了由表达异源纤维素酶的酿酒酵母菌株从Avicel产生的乙醇。 [0039] 图7显示了由表达异源纤维素酶的酿酒酵母菌株从经过预处理的硬木(5％基于干重百分率)产生的乙醇。 [0040] 图8显示了在存在多个浓度的外部添加的纤维素酶的情况下，由表达异源纤维素酶的酿酒酵母从经过预处理的硬木(5％基于干重百分率)产生的乙醇。 [0041] 图9显示了在YP培养基和YNB培养基中，由MO288(圆圈)和对照菌株(三角形)从Avicel产生的乙醇。 [0042] 图10显示了使用补充了外部纤维素酶的酿酒酵母，通过小规模的同时糖化和发酵(SSF)过程从Avicel(15％基于干重百分率)产生的乙醇产率。将来自表达异源纤维素酶的酵母菌株(MO288)的产率与来自对照菌株(MO249)的产率在多个外部纤维素浓度下在150小时的时间内进行比较(100％纤维素酶载量表示25mg/g总固体；最初的固体浓度是 15％)。 [0043] 图11显示了使用补充了外部纤维素酶的酿酒酵母，通过同时糖化和发酵(SSF)过程产生了理论乙醇产率。将来自表达异源纤维素酶的酵母菌株(MO288)的产率与来自对照菌株(MO249)的产率进行比较。 [0044] 图12显示了基于168小时的同时糖化和发酵(SSF)过程的乙醇产率的预测的纤维素酶节省。 [0045] 图13显示了如实施例9描述的Avicel转化测定中人工纤维素酶的活性。以CBH1共有序列″CBH1cons″转化MO429菌株；以空载体pMU451转化MO419菌株，作为阴性对照。其它菌株的描述见实施例9的表8。 [0046] 图14显示了实施例10中描述的表达CBH1和CBH2酶的多种组合的酵母对于Avicel的活性。 [0047] 图15显示了实施例10中描述的表达多种纤维素酶的酵母对于Avicel的活性。 [0048] 图16显示了由表达异源纤维素酶的五种酿酒酵母菌株的共培养物从Avicel产生的乙醇。 [0049] 图17显示了由表达异源纤维素酶的四种酿酒酵母菌株的共培养物从Avicel产生的乙醇，以及由菌株MO288(其表达四种纤维素酶)产生的乙醇。 [0050] 图18显示了由表达异源纤维素酶的四种酿酒酵母菌株的共培养物联合外部添加的纤维素酶从Avicel产生的乙醇。 [0051] 图19显示了使用表达异源纤维素酶的四种酿酒酵母菌株的共培养物或MO288的计算的酶的节省(相对于未经转化的酿酒酵母)。 [0052] 图20显示了M0509冷冻贮液、YPX分离体和YPD分离体的木糖利用和乙醇产生。 [0053] 图21显示了在存在相同的培养基和8g/L乙酸盐的情况下在40℃时M1105(标记为″菌落C2″)和MO1046的生长。 [0054] 图22显示了由M1105(三角形)和M1088(方块)在18％TS MS419上产生的乙醇。以M1105进行的实验具有低10％的酶的剂量，接种的细胞密度为1/2，然而产生了较高的乙醇效价。以MO1105进行的实验在40℃进行，以M1088进行的实验在35℃进行。 [0055] 图23显示了由M1105产生的乙醇，其中仅接种0.15g/L DCW进行发酵，产生了一些糖的积累和29g/L的乙醇。 [0056] 图24显示了由M1254在标准的IFM(圆圈)和低铵的IFM(方块)的条件下产生的乙醇。 [0057] 图25显示了：在40℃在补充了合成的抑制剂混合物(其包括8g/L乙酸盐)的复合木糖培养基中，单一菌落与M1254和M1339的比生长速率的比较。按照与发生进化的相同的条件筛选单一菌落。菌落C1被重命名为M1360。 [0058] 图26显示了：在40℃在补充了葡萄糖的工业相关的发酵培养基上，M1360的发酵性能。接种60mg/L干细胞重的M1360来进行发酵。 [0059] 图27显示了在35℃和40℃，在PHW(18％固体，未洗涤的MS149)上进行的SSF中由数种菌株产生的乙醇。所有的反应都载入4mg/g“zoomerase”(Novozyme 22c)。 [0060] 图28显示了在含有0.2％的CMC或地衣淀粉或大麦-β-葡聚糖的SC-URA平板上点染的培养物。每个平板的最上面的两行是基于Y294的培养物，最下面两行含有基于MO749的菌株。数字标示出了每个菌株包含的质粒。pMU471包含C.f.EG，作为阳性对照。将平板在30℃温育24小时(左侧的照片)，然后洗掉菌落，并以0.1％刚果红将平板染色，以1％NaCl脱色(右侧的照片)。 [0061] 图29显示了产生Cel5纤维素酶的菌株的上清液的SDS-PAGE分析。包含不具有外来基因的质粒的菌株用作参考菌株(REF)。也包括了含有表达C.f.EG(其是之前发现的最成功的EG)的质粒pMU471的菌株。 [0062] 图30显示了表达EG的菌株在(A)PASC(2小时)和(B)avicel(24小时)上的活性。包含不具有外来基因的质粒的菌株用作参考菌株(REF)，也包括了表达C.f.EG(pMU471)的菌株作为阳性对照。 [0063] 图31显示了以TrEG2和另外的TeCBH1w/TrCBD转化的酵母的上清液转化avicel的能力的分布。M1088转化显示为黑色的垂直线。侧接该线的虚线代表测量值的标准偏差。 [0064] 图32显示了：在HTP avicel测验(48小时的时间点)中，由表达纤维素酶的酵母菌株的上清液转化的Avicel。M0509是不表达纤维素酶的阴性对照。菌株1088是仅表达CBH1、CBH2和BGL的亲代菌株，而1179、1180和1181是1088的转化子，它们还表达TrEG2。 [0065] 图33显示了，分解纤维素的菌株M1403和不分解纤维素的背景菌株M1254与多种数量的商售酶补充物在造纸淤泥CBP/SSF中产生的乙醇。实验条件为：30％固体进料批，10g/l细胞接种，pH 5.5，温度为40℃，Zoom＝Novozymes 22C纤维素酶制剂，BGL＝AB酶EL2008044L BGL制剂，Xyl＝AB酶EL2007020L木聚糖酶制剂。 [0066] 图34显示了由CBP酵母(M1179)和不表达纤维素酶的对照菌株M0509进行的两种类型的造纸淤泥的发酵。实验条件为：18％固体，细胞载量为10g/l或1g/L，pH 5.5，温度为35℃，载入1mg/g BGL和1mg/g Xyl。BGL＝AB酶EL2008044L BGL制剂，Xyl＝AB酶EL2007020L木聚糖酶制剂。 [0067] 图35显示了：在多种外部纤维素酶浓度下，分解纤维素的酵母菌株M0963和不分解纤维素的对照菌株M0509在经预处理的硬木(PHW)(MS149)的22％的未洗涤的固体上的性能。实验条件：22％固体进料批，pH 5.4，温度35℃，所有的酶蛋白(EP)都是“zoomerase”(Novozymes 22C)。 [0068] 图36显示了：在多种最初细胞载量下，分解纤维素的酵母菌株M1284在经洗涤的预处理的硬木的30％固体上的性能。实验条件：30％固体进料批，pH 5.0，温度35℃，4mg EP＝0.25mg BGL+0.25mg木聚糖酶+0.25mg果胶酶+3.25mg Zoomerase，20mg EP＝1mg BGL+1mg木聚糖酶+1mg果胶酶+16.7mg Zoomerase。Zoomerase＝Novozymes 22C纤维素酶制剂，BGL＝AB酶EL2008044L BGL制剂，Xyl＝AB酶EL2007020L木聚糖酶制剂，果胶酶＝Genencor Multifect果胶酶FE。 [0069] 图37显示了，分解纤维素的菌株M1284和不分解纤维素的背景菌株M0509与多种数量的商售酶补充物在洗涤的玉米秸秆CBP/SSF中产生的乙醇。实验条件为：18％固体进料批，10g/l细胞接种，pH 5.0，温度为35℃，每种情况下载入1mg/g BGL和1mg/g木聚糖酶。BGL＝AB酶EL2008044L BGL制剂，Xyl＝AB酶EL2007020L木聚糖酶制剂。 [0070] 图38显示了表达不同的CBH1基因的酵母培养物上清液在Avicel(A，B)或MULac(C，D)上的活性，以及基于MULac估计的CBH1的浓度(mg/L，E，F)。宿主菌株是Y294或M0749。CBH1基因是：Te，埃默森篮状菌；Ct，嗜热毛壳菌；At，嗜热枝顶孢；Tr，里氏木霉； Hg，灰腐质霉；Ta，嗜热子囊菌。标明了质粒的名称。酵母在YPD中一式三份培养3天。数据为平均值±标准偏差。 [0071] 图39显示了酵母菌株M0509中修饰的基因。 [0072] 图40显示了用于构建M0509的酵母菌株和相关的遗传修饰。 [0073] 图41显示了酵母菌株M1105的系谱。 [0074] 图42显示了酵母菌株M1254的系谱。 [0075] 发明详述 [0076] 公开的方法和材料一般用于工程化的酵母的领域。 [0077] 定义 [0078] “载体”例如“质粒”或“YAC”(酵母人工染色体)是指通常携带一个或多个基因的染色体外元件，其不是细胞的中心代谢的一部分，并且通常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是自我复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，来自任何来源的单链或双链DNA或RNA，可以是线性、环状或超螺旋的，其中一些核苷酸序列连接或重组进入独特的构建体，所述构建体能够将启动子片段和所选基因产物的DNA序列以及合适的3’非翻译序列导入细胞中。优选地，本发明的质粒或载体是稳定的并且是自我复制的。 [0079] “表达载体”是能够指导与其可操作地连接的基因的表达的载体。 [0080] 本文使用的术语“异源的”是指源自内生来源之外的来源的载体、质粒或宿主细胞。因此，例如，异源序列可以是源自相同宿主的不同基因或质粒的序列，来自宿主细胞的不同菌株的序列，或来自不同分类组(例如不同的界、门、纲、目、科、属或种，或这些分类门类之一内的任意亚组)的生物的序列。术语“异源”在本文中与术语“外源”作为同义词使用。 [0081] 本文使用的术语“结构域”是指具有共同的物理或化学特征例如疏水性、极性、球状、螺旋状结构域或特征的分子或结构的一部分，例如DNA结合结构域或ATP结合结构域。结构域可以通过其与保守性结构或功能基序的同源性来鉴别。纤维二糖水解酶(CBH)结构域的实例包括催化结构域(CD)和纤维素结合结构域(CBD)。 [0082] “核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”是由共价连接的被称作核苷酸的亚基组成的聚合化合物。核酸包括多聚核糖核酸(RNA)和多聚脱氧核糖核酸(DNA)，二者都可以是单链或双链的。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成的DNA和半合成的DNA。 [0083] “分离的核酸分子”或“分离的核酸片段”是指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合物形式，或其任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯，可以是单链形式或双链螺旋。可以是双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。术语核酸分子，尤其是DNA或RNA分子仅仅是指分子的一级和二级结构，不将其限定为任何特定三级结构形式。因此，该术语尤其包括存在于线性或环状DNA分子(例如限制性片段)、质粒和染色体中的双链DNA。在讨论具体的双链DNA分子的结构时，在本文中可以根据通常的规则来描述序列：仅给出5’至3’方向的DNA的非转录链的序列(即与mRNA具有序列同源性的链)。 [0084] “基因”是指编码多肽的核苷酸的装配，并且包括cDNA和基因组DNA核酸。“基因”还指表达特定蛋白的核酸片段，包括单个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)，以及编码序列之前的调节序列(5’-非编码序列)和之后的调节序列(3’-非编码序列)。“天然基因”是指存在于自然界中的具有其本身的调节序列的基因。 [0085] 当单链形式的核酸分子可以在合适的温度和溶液离子强度条件下与其它核酸分子退火时，该核酸分子是与其它核酸分子例如cDNA、基因组DNA或RNA“可杂交的”。杂交和洗涤条件是熟知的并且在例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(1989)尤其是其中的第11章和表11.1(下称″Maniatis″，通过引用全文并入本文)中有举例说明。温度和离子强度的条件决定杂交的“严格性”。可以调节严格条件以筛选中等相似的片段，例如来自关系远的生物的同源序列；以及高度相似的片段，例如来自紧密相关的生物的复制功能酶的基因。杂交后的洗涤决定严格条件。一组条件使用如下洗涤步骤：在室温以6X SSC，0.5％SDS洗涤15分钟；然后在45℃以2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟；然后在50℃以0.2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟，重复两次。更严格的条件是：在较高的温度进行洗涤，其中洗涤与上述条件相同，只不过最后两次以0.2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟的温度升高至60℃。另一组高度严格性的条件是：最后在65℃以0.1XSSC，0.1％SDS洗涤两次。另一组高度严格性的条件是：在65℃在0.1X SSC，0.1％SDS杂交，以2X SSC，0.1％SDS洗涤，然后以0.1XSSC，0.1％SDS洗涤。 [0086] 杂交需要两个核酸包含互补序列，虽然可能会发生碱基之间的错配(取决于杂交的严格性)。核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有这些序列的核酸的杂交体的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按以下顺序递减：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。对于长度在100个核苷酸以上的杂交体，已经得出了用于计算Tm的公式(参见，例如Maniatis，9.50-9.51)。对于较短的核酸即寡核苷酸的杂交，错配的位置变得更加重要，并且寡核苷酸的长度决定其特异性(参见，例如Maniatis，11.7-11.8)。在一个实施方式中，可杂交的核酸的长度是至少大约10个核苷酸。优选地，可杂交的核酸的最小长度是至少大约15个核苷酸；更优选为至少大约20个核苷酸；最优选的长度是至少30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可以根据诸如探针长度等因素根据需要来调整温度和洗涤溶液的盐浓度。 [0087] 如本领域所知的术语“百分率同一性”是两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，其是通过比较这些序列来确定的。在本领域，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性的程度，视情况而定，根据此类序列串之间的匹配来确定。 [0088] 如本领域所知，两个多肽之间的“相似性”通过将多肽的氨基酸序列及其保守性氨基酸替换与第二多肽的序列进行比较来确定。 [0089] 可以通过已知的方法容易地计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于下列文献中描述的方法：Computational MolecularBiology(Lesk，A.M.，ed.)Oxford University Press，NY(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W. 编 )Academic Press，NY(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编)Humana Press，NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编)AcademicPress(1987)；and Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编)Stockton Press，NY(1991)。用于测定同一性的优选方法被设计为产生所测序列之间的最佳匹配。用于测定同一性和相似性的方法编撰于公众可获得的计算机程序中。可以使用LASERGENE生物信息学计算包(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)的Megalign程序来进行序列比对和同一性百分率的计算。本文公开的多个序列比对是使用Clustal的比对方法(Higgins and Sharp(1989)CABIOS.5：151-153)，使用缺省参数(空隙罚分＝10，空隙长度罚分＝10)进行的。使用Clustal方法的配对比对的缺省参数是KTUPLE 1，空隙罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALS SAVED＝5。 [0090] 合适的核酸序列或其片段(本发明的分离的多核苷酸)编码与本文报道的氨基酸序列至少大约70％至75％同一的多肽，与本文报道的氨基酸序列至少大约80％、85％或90％同一的多肽，或与本文报道的氨基酸序列至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽。合适的核酸片段是与本文报道的核酸序列至少大约70％、75％或80％同一的，与本文报道的核酸序列至少大约80％、85％或90％同一的，或与本文报道的核酸序列至少大约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的。合适的核酸片段不仅具有以上同一性/相似性，还通常编码具有至少50个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，或至少250个氨基酸的多肽。 [0091] DNA或RNA“编码区”是指：当被置于合适的调节序列控制之下时，在体外或在体内在细胞中被转录和/或翻译成多肽的DNA或RNA分子。“合适的调节区”是指位于编码区的上游(5’-非编码序列)、之内、或下游(3’-非编码序列)，并且影响相关的编码区的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核酸区域。调节区可以包括启动子、翻译引导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。编码区的边界是通过5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子来确定的。编码区可以包括但不限于，原核区域、来自mRNA的cDNA、基因组DNA分子、合成的DNA分子，或RNA分子。如果编码区要在真核细胞中表达，则编码区的3’端通常会具有多聚腺苷化信号和转录终止序列。 [0092] “同种型”是指与另一蛋白具有相同功能但是由不同的基因编码并且在序列上可以具有小的差异的蛋白。 [0093] “旁系同源物”是由于基因组内复制而相关的基因所编码的蛋白。 [0094] “直系同源物”是来自于从共同的祖先基因通过物种形成(speciation)而进化出的不同物种的基因。正常而言，直系同源物在进化过程中保留与祖先基因相同的功能。 [0095] “开放阅读框”缩写为ORF，其意思是包含翻译起始信号或起始密码子(例如ATG或AUG)和终止密码子并且可以潜在地被翻译成多肽序列的一定长度的核酸，其可以是DNA、cDNA或RNA。 [0096] “启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA片段。一般而言，编码区位于启动子的3’位置。启动子可以完整地来源于天然基因，或者可以由源自天然存在的不同启动子的不同元件组成，甚至可以包含合成的DNA区段。本领域技术人员理解：不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中的表达，或者在不同发育阶段的表达，或者响应于不同的环境或生理状况的表达。使基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。还认识到，由于在多数情况下尚未完全确定调节序列的准确边界，所以不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。启动子通常在其3’末端与转录起始位点分界，并且向上游(5’方向)延伸至包括启动高于背景的可检测水平的转录所需的最小数目的碱基或元件。在启动子之内可以存在转录起始位点(例如通过与核酸酶S1绘图而方便地确定)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合结构域(共有序列)。 [0097] 当RNA聚合酶将编码区转录成mRNA时，编码区处于细胞中的转录和翻译控制元件“控制之下”，然后mRNA进行反式RNA剪接(如果编码区含有内含子)并被翻译成编码区所编码的蛋白。 [0098] “转录和翻译控制区”是DNA调节区，例如启动子、增强子、终止子等，其提供编码区在宿主细胞中的表达。在真核细胞中，多聚腺苷化信号是控制区。 [0099] 术语“可操作地结合”是指核酸序列在单一核酸片段上的结合，从而一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码区的表达时(即编码区处于启动子的转录控制之下)，该启动子与该编码区为可操作地结合。编码区可以按照正义或反义反向与调节区可操作地结合。 [0100] 本文使用的术语“表达”是指源自本发明的核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可以指mRNA翻译成多肽。 [0101] 表达异源纤维素酶的宿主细胞 [0102] 为了解决以前的系统的局限性问题，本发明提供了表达异源纤维素酶的宿主细胞，它们可有效且有效率地从纤维素产生乙醇。在一些实施方式中，宿主细胞可以是酵母。根据本发明，酵母宿主细胞可以是，例如，来自下列属：酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)和耶罗威亚酵母属(Yarrowia)。作为宿主细胞的酵母的种可以包括，例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、S.bulderi、S.barnetti、少孢酵母(S.exiguus)、葡萄汁酵母(S.uvarum)、糖化酵母(S.diastaticus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)或脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)。在一些实施方式中，酵母选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizzosaccharomycespombe)、白假丝酵母菌(Candida albicans)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、Arxulaadeninivorans、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、多形德巴利酵母(Debaryomyces polymorphus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)。在一个具体的实施方式中，酵母是酿酒酵母。在另一个实施方式中，酵母是耐热的酿酒酵母。合适的宿主的选择被认为是本领域技术人员根据本文的教导的能力范围内。 [0103] 在本发明的一些实施方式中，宿主细胞是油质的细胞。根据本发明，油质的宿主细胞可以是油质的酵母细胞。例如，油质的酵母宿主细胞可以来自下列属：布拉氏霉菌属(Blakeslea)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamelia)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、白霉属(Mucor)、须霉属(Phycomyces)、腐霉属(Pythium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidum)、红酵母属(Rhodotorula)、丝孢酵母属(Trichosporon)或耶罗威亚酵母属(Yarrowia)。根据本发明，油质宿主细胞可以是油质微藻类宿主细胞。例如，油质微藻类宿主细胞可以来自破囊壶菌属(Thraustochytrium)或裂殖壶菌属(Schizochytrium)。然后，可以使用常规的脂质酯基转移方法通过油质生物从甘油三酸酯产生生物柴油。在一些具体实施方式中，可以诱导油质宿主细胞以分泌合成的脂质。使用油质宿主细胞的实施方式是有利的，因为它们可以从木质纤维素原料产生生物柴油(木质纤维素原料相对于含油种子底物而言较为便宜)，可以更密集地生长，显示出较低的生命循环二氧化碳排放，并且可以在贫瘠的土地上培养。 [0104] 在本发明的一些实施方式中，宿主细胞是耐热的宿主细胞。耐热的宿主细胞在同时糖化和发酵过程中是特别有用的：其允许外部产生的纤维素酶和产生乙醇的宿主细胞在相似的温度范围内实现最佳的性能。 [0105] 本发明的耐热的宿主细胞可以包括，例如，东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、密西西比毕赤酵母(Pichiamississippiensis)、墨西哥毕赤酵母(Pichia mexicana)、粉状毕赤酵母(Pichia farinosa)、仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)、葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)、墨西哥假丝酵母(Candidamexicana)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的宿主细胞。在一些实施方式中，耐热的细胞是酿酒酵母菌株，或其它酵母菌株，它们已经经过改造以在高温下生长，例如，通过在细胞恒稳器中在高温下选择它们的生长。 [0106] 在本发明的一些具体的实施方式中，宿主细胞是克鲁维酵母属的宿主细胞。例如，克鲁维酵母属的宿主细胞可以是乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、K.blattae、K.phaffii、亚罗克鲁维酵母(K.yarrowii)、K.aestuarii、K.dobzhanskii、K.wickerhamii、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)或K.waltii的宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母宿主细胞。在另一个实施方式中，宿主细胞是马克斯克鲁维酵母宿主细胞。 [0107] 在本发明的一些实施方式中，耐热的宿主细胞可以在高于大约30℃、大约31℃、大约32℃、大约33℃、大约34℃、大约35℃、大约36℃、大约37℃、大约38℃、大约39℃、大约40℃、大约41℃或大约42℃的温度生长。在本发明的一些实施方式中，耐热的宿主细胞可以在高于大约30℃、大约31℃、大约32℃、大约33℃、大约34℃、大约35℃、大约36℃、大约37℃、大约38℃、大约39℃、大约40℃、大约41℃、大约42℃或大约43℃或大约44℃或大约45℃或大约50℃的温度从纤维素产生乙醇。 [0108] 在本发明的一些实施方式中，耐热的宿主细胞可以在大约30℃至60℃，大约30℃至55℃，大约30℃至50℃，大约40℃至60℃，大约40℃至55℃，或大约40℃至50℃的温度生长。在本发明的一些实施方式中，耐热的宿主细胞可以在大约30℃至60℃，大约30℃至55℃，大约30℃至50℃，大约40℃至60℃，大约40℃至55℃，或大约40℃至50℃的温度从纤维素产生乙醇。 [0109] 在本发明的一些实施方式中，宿主细胞具有代谢木糖的能力。关于开发利用木糖的技术的详细信息，可以见下列公开物：Kuyper M等人FEMS Yeast Res.4：655-64(2004)，Kuyper M等人FEMS YeastRes.5：399-409(2005)，和Kuyper M等人FEMS Yeast Res.5：925-34(2005)，通过引用方式全文并入本文。例如，可以通过异源表达木糖异构酶基因XylA(例如，来自厌氧真菌Piromyces属E2)、过表达五种参与木酮糖转化为分解糖的中间体的酿酒酵母酶类(木酮糖激酶、核糖5-磷酸异构酶、核糖5-磷酸差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶)和删除编码醛糖还原酶的GRE3基因以使木糖醇的产生最小化，从而在酿酒酵母中实现木糖的利用。 [0110] 根据本文描述的方法，宿主细胞可以包含抗生素标志物或可以不包含抗生素标志物。 [0111] 使用本发明的编码纤维素酶的多核苷酸对宿主细胞进行遗传工程化(转导或转化或转染)，更详细的描述见下文。可以在本发明的载体中将编码纤维素酶的多核苷酸导入宿主细胞，所述载体可以是例如包含编码异源纤维素酶的序列的克隆载体或表达载体。宿主细胞可以包含作为整合拷贝或质粒拷贝的本发明的多核苷酸。 [0112] 在一些方面，本发明涉及包含如下文描述的多核苷酸构建体的宿主细胞。本发明的宿主细胞可以表达一种或多种异源纤维素酶多肽。在一些实施方式中，宿主细胞包含编码异源纤维素酶或其片段、变体或衍生物的多核苷酸的组合。宿主细胞可以包含例如多个拷贝的相同的核酸序列，例如，为了增强表达水平，或者，宿主细胞可以包含独特的多核苷酸的组合。在其它实施方式中，宿主细胞包含编码异源纤维素酶或其片段、变体或衍生物的单一的多核苷酸。特别地，此类表达单一的异源纤维素酶的宿主细胞可用于与本发明的包含编码至少一种其它异源纤维素酶或其片段、变体或衍生物的多核苷酸的其它宿主细胞共培养。 [0113] 可以通过本领域已知的方法将编码异源纤维素酶的多核苷酸导入宿主细胞中。可以通过醋酸锂转化、原生质球转化或通过电穿孔转化将编码异源纤维素酶的多核苷酸导入例如酵母宿主细胞中，转化方法如Current Protocols in Molecular Biology， 13.7.1-13.7.10所描述。可以通过磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染或电穿孔将构建体导入其它宿主细胞中(Davis，L.等人，Basic Methods in MolecularBiology，(1986))。 [0114] 可以检查如上所述的经转化的宿主细胞或细胞培养物的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和/或β-葡萄糖苷酶蛋白含量。对于使用分泌的异源纤维素酶，可以通过分析宿主(例如酵母)细胞上清液来测定蛋白含量。在一些实施方式中，可以通过丙酮沉淀法或通过使用即抛型去离子药筒缓冲样品而从酵母细胞上清液中回收高分子量的物质。也可以通过方法从重组酵母细胞培养物中回收并纯化蛋白，包括附着的异源纤维素酶，所述方法包括例如原生质球制备和裂解、使用玻璃珠破碎细胞，和使用液氮破碎细胞。另外的蛋白纯化方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱、凝胶过滤和血凝素色谱。在完成成熟蛋白的构型时，如果需要，可以使用蛋白重折叠步骤。最后，可以使用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。 [0115] 蛋白分析方法包括例如传统的Lowry法或根据BioRad生产商的说明书进行的蛋白测定法。使用这些方法，可以估计糖分解性酶的蛋白含量。另外，为了精确测定蛋白浓度，可以使异源纤维素酶与标签一起表达，例如His-标签或HA-标签，并通过标准方法纯化，使用例如针对标签的抗体、标准镍树脂纯化技术或类似方法。 [0116] 可以就纤维素的水解(例如通过糖测定法)、就特定类型的纤维素酶活性(例如通过测定单独的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡萄糖苷酶活性)，或者就总的纤维素酶活性，进一步分析如上文所述的转化的宿主细胞或细胞培养物。可以通过例如测定内切葡聚糖酶特异性CMC底物的还原末端的增加来测定内切葡聚糖酶活性。可以通过例如使用不溶性纤维素底物(例如，无定形底物磷酸膨胀纤维素(PASC)或微晶纤维素(Avicel))并测定底物水解的程度来测定纤维二糖水解酶的活性。可以通过多种测定法例如使用纤维二糖来测定β-葡萄糖苷酶活性。 [0117] 总纤维素酶活性，包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶的活性，可以协同水解晶体纤维素。因此，可以使用不溶性底物测定总纤维素酶活性，所述底物包括纯的纤维质底物，例如Whatman 1号滤纸、棉绒、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类的纤维素和含有纤维素的底物例如染色的纤维素、α纤维素或预处理的木质纤维素。还可以通过本领域普通技术人员已知的方法检测纤维素酶的比活性，例如，通过Avicel测定法(如上文描述)，其中将就针对样品所测的蛋白(纤维素酶)浓度进行校正。 [0118] 因此，本发明的一个方面涉及有效率地生产纤维素酶，以辅助纤维素的消化和乙醇的产生。纤维素酶可以是任何参与纤维素消化、代谢和/或水解的酶，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶 [0119] 在另外的实施方式中，测定转化的宿主细胞或细胞培养物的乙醇产生情况。可以通过本领域普通技术人员已知的技术测定乙醇的产生，例如通过标准的HPLC折射率法。 [0120] 异源纤维素酶 [0121] 根据本发明，异源纤维素酶在宿主细胞中的表达可有利地用于从纤维质来源产生乙醇。可以异源地表达来自多种来源的纤维素酶以成功地增加乙醇生产效率。例如，纤维素酶可以来自真菌、细菌、植物、原生动物或白蚁来源。在一些实施方式中，纤维素酶是灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木 霉(T.reesei)、澳 洲乳白 蚁(C.lacteus)、台 湾家白 蚁(C.formosanus)、高山象 白蚁(N.takasagoensis)、澳大利 亚矛颚 家白蚁(C.acinaciformis)、达尔 文 澳 白 蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣 囊 复 膜 酵 母 菌 (S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfida fusca)、热纤梭 菌(Clostridumthermocellum)、解 纤 维 梭菌 (Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、Saccharophagus degradans、Piromycesequii、Neocallimastix patricarum、白曲霉(Aspergillus kawachii)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremoniumthermophilum)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙脉孢菌(Neurospora Crassa)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)的纤维素酶。 [0122] 在本发明的一些实施方式中，在同一种宿主细胞中共表达来自单一生物的多种纤维素酶。在本发明的一些实施方式中，在同一宿主细胞中共表达来自不同生物的多种纤维素酶。特别地，可以在同一宿主细胞中共表达来自2、3、4、5、6、7、8、9或更多种生物的纤维素酶。类似地，本发明可以包括酵母菌株的共培养物，其中所述酵母菌株表达不同的纤维素酶。共培养物可以包括表达来自同一生物或来自不同生物的异源纤维素酶的酵母菌株。共培养物可以包括表达来自2、3、4、5、6、7、8、9或更多种生物的纤维素酶的酵母菌株。 [0123] 本发明的纤维素酶包括内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶。纤维素酶可以是例如内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶。 [0124] 在本发明的一些实施方式中，内切葡聚糖酶可以是内切葡聚糖酶I或内切葡聚糖酶II同种型、旁系同源物或直系同源物。在一些实施方式中，由本发明的宿主细胞表达的内切葡聚糖酶可以是重组的内-1，4-β-葡聚糖酶。在具体的实施方式中，内切葡聚糖酶是里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、黄胸散白蚁(R.speratus)、白曲霉(Aspergillus kawachii)、甜菜 胞囊线虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座 菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、C.lucknowense、球毛壳菌(C.globosum)、土 曲 霉 (Aspergillus terreus)、烟 曲 霉 (Aspergillusfumigatus)、粗 糙 脉 孢 菌(Neurospora crassa)或嗜热枝顶孢(Acremonium thermophilum)内切葡聚糖酶。在一个具体的实施方式中，内切葡聚糖酶包含选自SEQ ID NO：30-39或52-56的氨基酸序列，如下面的表1所示。在一些其它的实施方式中，内切葡聚糖酶包含与选自SEQ ID NO：30-39或52-56的氨基酸序列至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的氨基酸序列。 [0125] 在实际中，可以使用已知的计算机程序常规地确定任意多肽是否与本发明的多肽至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。用于测定同一性百分率的方法(如下文就多核苷酸同一性更详细地讨论)也与评价多肽序列同一性相关。 [0126] 在一个具体的实施方式中，内切葡聚糖酶是来自里氏木霉的内切葡聚糖酶I(″eg1″)。在一些实施方式中，内切葡聚糖酶包含与SEQ IDNO：39至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的氨基酸序列。 [0127] 在另一个具体实施方式中，内切葡聚糖酶是来自台湾家白蚁的内切葡聚糖酶。在一些实施方式中，内切葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：31至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的氨基酸序列。 [0128] 在另一个具体实施方式中，内切葡聚糖酶是来自红褐肉座菌的内切葡聚糖酶。在一些实施方式中，内切葡聚糖酶包含与SEQ ID NO：54至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的氨基酸序列。 [0129] 在一些实施方式中，β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶I或β-葡萄糖苷酶II同种型、旁系同源物或直系同源物。在本发明的一些实施方式中，β-葡萄糖苷酶源自扣囊复膜酵母菌。在具体的实施方式中，β-葡萄糖苷酶包含与SEQ ID NO：40至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的氨基酸序列。 [0130] 在本发明的一些实施方式中，纤维二糖水解酶可以是纤维二糖水解酶I和/或纤维二糖水解酶II同种型、旁系同源物或直系同源物。在一个具体实施方式中，纤维二糖水解酶包含选自SEQ ID NO：21-29或46的氨基酸序列，如下面的表1所示。在本发明的具体实施方式中，纤维二糖水解酶是来自里氏木霉的纤维二糖水解酶I或II。在另一个实施方式中，纤维二糖水解酶包含与SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的序列。 [0131] 在本发明的其它具体实施方式中，纤维二糖水解酶是来自埃默森篮状菌的纤维二糖水解酶I或II。在另一个实施方式中，纤维二糖水解酶包含与SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的序列。 [0132] 在另一个实施方式中，本发明的纤维二糖水解酶是C.lucknowense纤维二糖水解酶。在具体的实施方式中，纤维二糖水解酶是C.lucknowense纤维二糖水解酶Cbh2b。在一个实施方式中，纤维二糖水解酶包含与SEQ ID NO：25至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的序列。 [0133] 在本发明的一些实施方式中，纤维素酶包含选自下面的表1中的序列的序列。本发明的纤维素酶还包括包含与表1的序列至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的序列的纤维素酶。 [0134] 本发明的一些实施方式包括包含SEQ ID NO：21-40、46或52-56任意项的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500或更多个连续氨基酸的多肽或其结构域、片段、变体或衍生物。 [0135] [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] [0141] [0142] [0143] [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] [0150] [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] [0162] [0163] [0164] [0165] [0166] [0167] [0168] [0169] [0170] [0171] [0172] [0173] [0174] [0175] [0176] 在本发明的一些方面，以分离的形式提供本发明的多肽和多核苷酸，例如纯化至匀质。 [0177] 本发明还包括包含或由氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：21-40、46或52-56任意项的多肽、并且与此类多肽的部分(所述多肽的此类部分一般含有至少30个氨基酸，更优选至少50个氨基酸)具有至少大约80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％的相似性。 [0178] 如本领域所知晓，两个多肽之间的“相似性”是通过将多肽的氨基酸序列及其保守性氨基酸替换与第二多肽的序列进行比较来确定的。 [0179] 本发明还涉及SEQ ID NO：21-40、46或52-56的任意项的多肽的结构域、片段、变体、衍生物或类似物。 [0180] 本发明的多肽的片段或部分可以用于通过肽合成产生相应的全长多肽，因此，所述片段可以用作产生所述全长多肽的中间体。 [0181] 纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶多肽的片段包括保留纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶的任意特异性生物活性的结构域、蛋白水解片段、删除片段，尤其是灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家 白蚁(C.acinaciformis)、达尔文 澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复 膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfids fusca)、热纤梭菌(Clostridumthermocellum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridumjosui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、Saccharophagus degradans、Piromycesequii、Neocallimastix patricarum、白 曲 霉(Aspergillus kawachii)、甜 菜 胞 囊 线 虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremoniumthermophilum)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、烟曲 霉(Aspergillus fumigatus)、土 曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙 脉孢 菌(Neurospora Crassa)、北美散白蚁(R.flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)的纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶多肽的片段。多肽片段还包括保留纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶蛋白的催化活性的多肽的任意部分。 [0182] SEQ ID NO：21-40、46或52-56的任意项的多肽的变体、衍生物或类似物可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被替换为保守性或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)并且此类替换的氨基酸残基可以是或者可以不是由遗传密码编码的，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基，或(iii)其中成熟多肽与另一个化合物例如增加多肽的半衰期的的化合物(例如，聚乙二醇)融合，或(iv)其中另外的氨基酸与成熟多肽融合，以纯化多肽，或(v)其中多肽的片段是可溶性的，即不与膜结合，但仍和针对与膜结合的受体的配体结合。此类变体、衍生物和类似物被认为落在本领域技术人员从本文教导后的范围内。 [0183] 本发明的多肽还包括多肽的变体。多肽的“变体”可以是保守性变体，或等位基因变体。本文使用的保守性变体是指不会对蛋白的生物学功能造成不利影响的氨基酸序列的改变。当改变的序列阻止或破坏与蛋白相关的生物学功能时，替换、插入或删除被称为对该蛋白造成不利影响。例如，可以改变蛋白的总体电荷性、结构或疏水-亲水性质但不对生物学活性造成不利影响。因此，可以改变氨基酸序列，以便例如赋予肽更大的疏水或亲水性，但不对蛋白的生物学活性造成不利影响。 [0184] “等位基因变体”是指占据生物的染色体的给定基因座的基因的可替代形式。Genes II，Lewin，B.，ed.，John Wiley&Sons，New York(1985)。 可 以 使 用 本领域已知的诱变技术产生非天然存在的变体。虽然等位基因变体具有与上述提及的那些稍微不同的氨基酸序列，但是仍然具有与灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfidafusca)、热纤梭菌(Clostridum thermocellum)、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonsa fimi)、Saccharophagusdegradans、Piromyces equii、Neocallimastix patricarum、白 曲 霉 (Aspergillus kawachii)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白 囊 耙齿 菌(Irpex lacteus)、嗜 热 枝顶 孢(Acremonium thermophilum)、费希 新 萨 托 菌(Neosartoryafischeri)、球 毛 壳 菌 (Chaetomium globosum)、嗜 热毛 壳 菌(Chaetomiumthermophilum)、烟 曲 霉(Aspergillus fumigatus)、土 曲 霉(Aspergillusterreus)、粗糙脉孢菌(Neurospora Crassa)、北美散白蚁(R.flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶蛋白相关的相同或相似的生物学功能。 [0185] 内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡萄糖苷酶蛋白家族的等位基因变体、保守性替换变体以及成员可以具有这样的氨基酸序列：所述氨基酸序列与SEQ ID NO：21-40、46或52-56任一项所示的灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸 散白蚁(R.speratus)、白 曲霉(Aspergillus kawachii)、甜菜 胞囊线虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座 菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremoniumthermophilum)、北美散白蚁(R.flavipes)或费希新萨托菌(Neosartoryafischeri)的纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少90％、至少 95％的氨基酸序列同一性。此类序列的同一性或同源性在本文中定义为：经过比对序列和引入空隙(如果必要)以达到最大同源性百分率之后，并且不把任何保守性替换考虑为序列同一性的一部分，候选序列中与已知肽相同的氨基酸残基的百分率。肽序列的N末端、C末端或内部延伸、删除或插入不应被理解为影响同源性。 [0186] 因此，本发明的蛋白和肽包括这样的分子，所述分子包含SEQ IDNO：21-40、46和52-56的氨基酸序列或其片段，所述片段具有灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、白曲霉(Aspergillus kawachii)、甜菜胞 囊线虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座 菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremoniumthermophilum)、北美散白蚁(R.flavipes)或费希新萨托菌(Neosartoryafischeri)的纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶多肽序列的至少大约3、4、5、6、10、15、20、25、30、35或更多个氨基酸残基的连续序列；此类序列的氨基酸序列变体，其中至少一个氨基酸残基被插入至所公开序列的N-或C-末端或之内；经过另一种残基替换的所公开序列的氨基酸序列变体，或其如上文定义的片段。考虑到的变体还包括含有预先确定的突变(通过例如同源重组、定点或PCR诱变产生的)的那些，以及其它动物物种(包括但不限于，细菌、真菌、昆虫、兔子、大鼠、猪、牛、绵羊、马和非人灵长类物种)的对应蛋白，蛋白家族的等位基因或其它天然存在的变体，以及衍生物，在所述衍生物中蛋白经过共价修饰：通过取代、化学、酶学、或其它合适的方法以除了天然存在的氨基酸以外的部分(例如，可检测部分，例如酶或放射性同位素)进行修饰。 [0187] 使用已知的蛋白工程方法和重组DNA技术，可以产生变体以改善或改变纤维素酶多肽的性质。例如，可以从分泌的蛋白的N-末端或C-末端删除一个或多个氨基酸但基本上不丧失生物学功能。 [0188] 因此，本发明进一步包括灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家 白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳 白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridum thermocellum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪 碱 纤 维 单 胞 菌 (Cellulomonasfimi)、Sacch aroph agus degradans、Piromyces equii、Neocallimastixpatricarum、白 曲霉(Aspergillus kawachii)、甜菜 胞囊 线虫(Heteroderaschachtii)、红 褐 肉 座 菌 (H.jecorina)、Orpinomyces属、白 囊 耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremonium thermophilum)、费希新萨托菌 (Neosartoryafischeri)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙脉孢菌(NeurosporaCrassa)、北美散白蚁(R.flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶多肽变体，其显示出实质上的生物学活性。此类变体包括删除、插入、倒位、重复和替换，其根据本领域已知的一般规则进行选择，对活性几乎没有影响。 [0189] 技术人员完全知晓不会显著影响蛋白功能或者影响可能性较低的氨基酸替换(例如将一个脂肪族氨基酸替换为另一个脂肪族氨基酸)，如下文进一步描述。 [0190] 例如，在Bowie等人，″Deciphering the Message in ProteinSequences：Tolerance to Amino Acid Substitutions，″Science247：1306-1310(1990)中提供了关于如何制备表型沉默的氨基酸替换的指导，其中作者指出：主要有两种研究氨基酸序列对变化的耐受的策略。 [0191] 第一种策略通过进化过程中的自然选择来开发氨基酸替换的耐受性。通过比较不同物种中的氨基酸序列，可以鉴定保守性氨基酸。这些保守性氨基酸可能对于蛋白功能具有重要意义。相反，其中替换已经被自然选择容忍的氨基酸位置表明这些位置对于蛋白功能不是至关紧要的。因此，可以修饰容忍氨基酸替换的位置但仍然保持蛋白的生物学活性。 [0192] 第二个策略使用遗传工程以将氨基酸变化导入克隆的基因的特定位置以鉴定对于蛋白功能具有关键意义的区域。例如，可以使用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(在分子的每个残基导入单一的丙氨酸突变)(Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989))。然后可以测定得到的突变体分子的生物学活性。 [0193] 如作者所指出的，这两种策略揭示出：蛋白质经常令人惊奇地耐受氨基酸替换。作者还指出了蛋白中的某些氨基酸位置可能允许哪些氨基酸改变。例如，埋藏最深的(在蛋白的三级结构内)氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链的少数特征通常是保守的。此外，耐受的保守性氨基酸替换涉及脂肪族或疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替换；羟基残基Ser和Thr的替换；酸性残基Asp和Glu的替换；酰胺残基Asn和Gln的替换；碱性残基Lys、Arg、和His的替换；芳香族残基Phe、Tyr、和Trp的替换；以及小的氨基酸Ala、Ser、Thr、Met、和Gly的替换。 [0194] 术语“衍生物”和“类似物”是指与灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosantts)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridumthermocellum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、Saccharophagus degradans、Piromycesequii、Neocallimastix patricarum、白 曲 霉(Aspergillus kawachii)、甜 菜 胞 囊 线 虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremoniumthermophilum)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、烟曲 霉(Aspergillus fumigatus)、土 曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙 脉孢 菌(Neurospora Crassa)、北美散白蚁(R.flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶多肽不同、但是保持其必要性质的多肽。 一般地，衍生物和类似物是总体上密切相似的，并且，在很多区域与灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridumthermocellum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪碱 纤维单胞 菌(Cellulomonas fimi)、Sacch aroph agus degradans、Piromycesequii、Neocallimastix patricarum、白 曲 霉(Aspergillus kawachii)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremoniumthermophilum)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙脉孢菌(Neurospora Crassa)、北美散白蚁(R.flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶多肽多肽相同。当用于指灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridum thermocellum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonasfimi)、Saccharophagus degradans、Piromyces equii、Neocallimastixpatricarum、 白 曲霉(Aspergillus kawachii)、甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremonium thermophilum)、费希 新 萨托 菌(Neosartorya fischeri)、球 毛 壳菌 (Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、土曲 霉(Aspergillus terreus)、粗糙 脉孢 菌(NeurosporaCrassa)、北美 散白 蚁(R.flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶多肽时，术语“衍生物”和“类似物”包括保持相应的天然多肽的至少一些活性(例如外切葡聚糖酶活性或者催化结构域的活性)的任何多肽。 [0195] 灰 腐 质 霉(H.grisea)、嗜 热 子 囊 菌 (T.aurantiacus)、埃 默 森 篮 状菌(T.emersonii)、里 氏 木 霉(T.reesei)、澳 洲 乳 白 蚁(C.lacteus)、台 湾 家白 蚁 (C.formosanus)、高 山 象 白 蚁(N.takasagoensis)、澳 大 利 亚 矛 颚 家 白蚁(C.acinaciformis)、达 尔 文 澳 白 蚁 (M.darwinensis)、N.walkeri、扣 囊 复 膜酵 母 菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄 胸 散 白 蚁 (R.speratus)、嗜 热 放 线菌(Thermobfidafusca)、热 纤 梭 菌(Clostridum thermocellum)、解 纤 维 梭 菌(Clostridiumcellulolyticum)、约 氏 梭 菌 (Clostridum josui)、短 小 芽 孢 杆 菌(Bacilluspumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、Saccharophagusdegradans、Piromyces equii、Neocallimastix patricarum、白 曲 霉 (Aspergillus kawachii)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白 囊 耙齿 菌(Irpex lacteus)、嗜 热 枝顶 孢(Acremonium thermophilum)、费希 新 萨 托 菌(Neosartoryafischeri)、球 毛 壳 菌 (Chaetomium globosum)、嗜 热毛 壳 菌(Chaetomiumthermophilum)、烟 曲 霉(Aspergillus fumigatus)、土 曲 霉(Aspergillusterreus)、粗糙脉孢菌(Neurospora Crassa)、北美散白蚁(R.flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶多肽的衍生物是这样的多肽，其经过改变以显示天然多肽中不存在的另外特征。衍生物可以经过共价修饰：通过取代、化学、酶学、或其它合适的方法以除了天然存在的氨基酸以外的部分(例如，可检测部分，例如酶或放射性同位素)进行修饰。衍生物的实例包括融合蛋白。 [0196] 类似物是本发明的灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家 白蚁(C.acinaciformis)、达尔文 澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复 膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridum thermocellum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪 碱 纤 维 单 胞 菌 (Cellulomonasfimi)、Saccharophagus degradans、Piromyces equii、Neocallimastixpatricarum、白 曲霉(Aspergillus kawachii)、甜菜 胞囊 线虫(Heteroderaschachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremonium thermophilum)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、烟 曲 霉(Aspergillusfumigatus)、土 曲 霉(Aspergillus terreus)、粗 糙 脉 孢 菌(NeurosporaCrassa)、北美散白蚁(R.flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶多肽的另一种形式。“类似物”也保持与目标多肽基本上相同的生物学功能或活性，例如，作为纤维二糖水解酶的功能。类似物包括前蛋白，其通过前蛋白部分的切割被激活以产生有活性的成熟多肽。 [0197] 本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成的多肽。在一些具体实施方式中，多肽是重组多肽。 [0198] 本发明还提供了等位基因变体、直系同源物和/或物种同源物。可以使用本领域已知的程序，使用本文公开的序列或保藏于ATCC的克隆的信息，获得对应于SEQ ID NO：1-40的任意项的基因的全长基因、等位基因变体、剪接变体、全长编码部分、直系同源物、和/或物种同源物。例如，可以通过从本文提供的序列制备合适的探针或引物并就等位基因变体和/或想要的同源物筛选合适的核酸来源来分离和鉴定等位基因变体和/或物种同源物。 [0199] 共有序列纤维素酶 [0200] 在本发明的一些实施方式中，宿主细胞表达至少一种不是源自任何一种特定生物，而是具有是共有纤维素酶序列的人工氨基酸序列的异源纤维素酶。所述共有纤维素酶序列可以是内切葡聚糖酶共有序列、β-葡萄糖苷酶共有序列或纤维二糖水解酶共有序列。 [0201] 在一个具体实施方式中，异源纤维素酶是CBH1共有序列。因此，在一个实施方式中，本发明涉及包含与SEQ ID NO：43的共有CBH1序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一的序列的多肽序列。在一些实施方式中，本发明涉及包含SEQ ID NO：43的序列的多肽。 [0202] 本发明还涉及包含含有与SEQ ID NO：43的共有CBH1序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一的序列的多肽序列的宿主细胞。本发明还涉及包含编码含有与SEQ ID NO：43的共有CBH1序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一的序列的多肽序列的多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞包含编码含有与SEQ ID NO：43的共有CBH1序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一的序列的多肽序列的至少一个多核苷酸和至少一个编码异源纤维素酶的第二多核苷酸。所述第二多核苷酸可以编码内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶共有序列、β-葡萄糖苷酶共有序列或纤维二糖水解酶共有序列。在一些实施方式中，当使用纤维素作为碳源生长时，所述的包含编码含有与SEQ ID NO：43的共有CBH1序列至少80％、85％、 90％、95％、98％、99％或100％同一的序列的多肽序列的多核苷酸的宿主细胞能够产生乙醇。 [0203] 纤维素酶的组合 [0204] 在本发明的一些实施方式中，宿主细胞表达异源纤维素酶的组合。例如，宿主细胞可以包含至少2种异源纤维素酶、至少3种异源纤维素酶、至少4种异源纤维素酶、至少5种异源纤维素酶、至少6种异源纤维素酶、至少7种异源纤维素酶、至少8种异源纤维素酶、至少9种异源纤维素酶、至少10种异源纤维素酶、至少11种异源纤维素酶、至少12种异源纤维素酶、至少13种异源纤维素酶、至少14种异源纤维素酶或至少15种异源纤维素酶。宿主细胞中的异源纤维素酶可以来自相同的或不同的物种。 [0205] 在本发明的一些实施方式中，宿主细胞表达异源纤维素酶的组合，其包括至少一种内切葡聚糖酶、至少一种β-葡萄糖苷酶和至少一种纤维二糖水解酶。在本发明的另一个实施方式中，宿主细胞表达异源纤维素酶的组合，其包括至少一种内切葡聚糖酶、至少一种β-葡萄糖苷酶和至少两种纤维二糖水解酶。所述至少两种纤维二糖水解酶可以都是纤维二糖水解酶I，可以都是纤维二糖水解酶II，或者一种是纤维二糖水解酶I、一种是纤维二糖水解酶II。 [0206] 在本发明的一个具体实施方式中，宿主细胞表达纤维素酶的组合，其包括台湾家白蚁内切葡聚糖酶I和扣囊复膜酵母菌β-葡萄糖苷酶I。在本发明的另一个实施方式中，宿主细胞表达纤维素酶的组合，其包括埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I和里氏木霉纤维二糖水解酶II。 [0207] 在另一个实施方式中，宿主细胞表达纤维素酶的组合，其包括台湾家白蚁内切葡聚糖酶I、扣囊复膜酵母菌β-葡萄糖苷酶I、埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I和C.lucknowense纤维二糖水解酶IIb。在另一个实施方式中，宿主细胞表达纤维素酶的组合，其包括台湾家白蚁内切葡聚糖酶I、扣囊复膜酵母菌β-葡萄糖苷酶I、埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I和里氏木霉纤维二糖水解酶II。在另一个实施方式中，宿主细胞表达纤维素酶的组合，其包括红褐肉座菌内切葡聚糖酶2、扣囊复膜酵母菌β-葡萄糖苷酶I、埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I和里氏木霉纤维二糖水解酶II。在另一个实施方式中，宿主细胞表达纤维素酶的组合，其包括红褐肉座菌内切葡聚糖酶2、扣囊复膜酵母菌β-葡萄糖苷酶I、埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I和C.lucknowense纤维二糖水解酶II。 [0208] 附着的和分泌的纤维素酶 [0209] 根据本发明，纤维素酶可以是附着的或分泌的。如本文所使用，如果蛋白的至少一个末端结合(例如，共价和/或静电地结合)至细胞膜或细胞壁，则该蛋白是“附着”至生物的细胞表面。将认识到，附着蛋白可以包括一个或多个酶的区域，所述区域可以在核酸和/或蛋白水平上连接至一个或多个其它类型的区域(例如启动子、终止子、锚定结构域、连接子、信号区域等)。虽然一个或多个酶的区域可以不直接与细胞膜或细胞壁结合(例如当通过锚定结构域结合时)，但是该蛋白仍然被认为是根据本说明书所述的“附着的酶”。 [0210] 可以通过例如将锚定结构域引入由细胞异源表达的重组蛋白中来实现附着，或者通过异戊二烯化(prenylation)、脂肪酰基键、糖基磷脂酰肌醇锚定物或其它合适的分子锚定物(其可以将附着蛋白锚定至宿主细胞的细胞膜或细胞壁)来实现。附着蛋白可以在其氨基末端或任选在其羧基末端进行附着。 [0211] 本文使用的“分泌的”意思是释放至细胞外环境中，例如释放至培养基中。虽然附着蛋白可以含有分泌信号(作为其非成熟氨基酸序列的一部分)，但是它们保持与细胞表面附着，并且不落在本文使用的分泌蛋白的范围内。 [0212] 如本文使用的“灵活的连接子序列”是指连接两个氨基酸序列的氨基酸序列，例如，锚定于细胞壁的氨基酸序列，其具有包含想要的酶活性的氨基酸序列。灵活的连接子序列允许必要的自由度，以使包含想要的酶活性的氨基酸序列具有减小的空间位阻(就细胞附近而言)，并且也可以促进包含想要的酶活性的氨基酸序列的正确折叠。 [0213] 在本发明的一些实施方式中，附着的纤维素酶通过连接于锚定结构域的灵活的连接子序列而附着。在一些实施方式中，锚定结构域是来自酿酒酵母的CWP2(用于羧基末端锚定)或FLO1(用于氨基末端锚定)。 [0214] 在一些实施方式中，可以向本发明的表达载体添加异源分泌信号以促进纤维素酶蛋白的细胞外表达。在一些实施方式中，异源分泌信号是来自里氏木霉的分泌信号Xyn2。 [0215] 包含纤维素酶的融合蛋白 [0216] 本发明还包括融合蛋白。例如，所述融合蛋白可以是异源纤维素酶与第二种肽的融合物。异源纤维素酶与第二种肽可以直接融合或通过例如连接子序列间接融合。融合蛋白可以包含例如在异源纤维素酶的N-末端的第二种肽和/或在异源纤维素酶的C-末端的第二种肽。因此，在一些实施方式中，本发明的多肽包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包含异源纤维素酶。 [0217] 根据本发明，融合蛋白可以包含第一和第二多肽，其中所述第一多肽包含异源纤维素酶，并且所述第二多肽包含信号序列。根据另一个实施方式，融合蛋白可以包含第一和第二多肽，其中所述第一多肽包含异源纤维素酶，并且所述第二多肽包含用于促进纯化或鉴别的多肽或报告子多肽。用于促进纯化或鉴别的多肽或报告子肽可以是，例如，HIS-标签、GST-标签、HA-标签、FLAG-标签、MYC-标签或荧光蛋白。 [0218] 根据另一个实施方式，融合蛋白可以包含第一和第二多肽，其中所述第一多肽包含异源纤维素酶，并且所述第二多肽包含锚定肽。在一些实施方式中，锚定结构域是来自酿酒酵母的CWP2(用于羧基末端锚定)或FLO1(用于氨基末端锚定)。 [0219] 根据另一个实施方式，融合蛋白可以包含第一和第二多肽，其中所述第一多肽包含异源纤维素酶，并且所述第二多肽包含纤维素结合模块(CBM)。在一些实施方式中，CBM来自例如，里氏木霉(T.reesei)Cbh1或Cbh2，来自灰腐质霉(H.grisea)Cbh1，或来自C.lucknowenseCbh2b。在一些具体实施方式中，CBM与纤维二糖水解酶融合。在一个具体实施方式中，融合蛋白包含第一和第二多肽，其中所述第一多肽包含异源纤维二糖水解酶，并且所述第二多肽包含CBM。在另一个具体实施方式中，纤维二糖水解酶是埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I，并且CBM是里氏木霉纤维二糖水解酶CBM。在另一个具体实施方式中，纤维二糖水解酶是埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I，并且CBM是灰腐质霉纤维二糖水解酶CBM。在一些实施方式中，灰腐质霉的CBM包含SEQ ID NO：21的氨基酸492-525。 [0220] 在一些实施方式中，本发明的多肽包括包含第一多肽和第二多肽的融合蛋白，其中所述第一多肽是纤维二糖水解酶，并且所述第二多肽是纤维二糖水解酶的结构域或片段。在一些实施方式中，本发明的多肽包括包含第一多肽和第二多肽的融合蛋白，其中所述第一多肽是埃默森篮状菌Cbh1、灰腐质霉Cbh1、嗜热子囊菌Cbh1、埃默森篮状菌Cbh2、里氏木霉Cbh1、里氏木霉Cbh2、C.lucknowense Cbh2b，或其结构域、片段、变体或衍生物，其中所述第二多肽是埃默森篮状菌Cbh1、灰腐质霉Cbh1、嗜热子囊菌Cbh1、埃默森篮状菌Cbh2、里氏木霉Cbh1、里氏木霉Cbh2、C.lucknowense Cbh2b，或其结构域、片段、变体或衍生物。在具体的实施方式中，所述第一多肽是埃默森篮状菌Cbh1，并且所述第二多肽是来自里氏木霉Cbh1或Cbh2或来自C.lucknowense Cbh2b的CBM。在另外的实施方式中，第一多肽在第二多肽的N-末端或C-末端。在一些其它实施方式中，第一多肽和/或第二多肽由密码子优化的多核苷酸编码，例如，针对酿酒酵母或克鲁维酵母进行密码子优化的多核苷酸。在具体的实施方式中，第一多核苷酸是密码子优化的埃默森篮状菌cbh1，并且第二多核苷酸编码来自里氏木霉Cbh1或Cbh2的密码子优化的CBM。在另一个具体实施方式中，第一多核苷酸是密码子优化的埃默森篮状菌cbh1，并且第二多核苷酸编码来自C.lucknowense Cbh2b的密码子优化的CBM。 [0221] 在一些其它实施方式中，第一多肽和第二多肽通过连接子序列融合。在一些实施方式中，所述连接子序列可以由密码子优化的多核苷酸编码。(密码子优化的多核苷酸在下文中有更详细的描述。)对应于根据本发明的密码子优化的连接子1的氨基酸序列是：灵活的连接子-strep标签-TEV位点-FLAG-灵活的连接子融合物，并且对应于GGGGSGGGGS AWHPQFGG ENLYFQG DYKDDDKGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：57)。 [0222] DNA序列如下： [0223] GGAGGAGGTGGTTCAGGAGGTGGTGGGTCTGCTTGGCATCCACAATTTGGAGGAGGCGGTGGTGAAAATCTGTATTTCCAGGGAGGCGGAGGTGATTACAAGGATGACGACAAAGGAGGTGGTGGATCAGGAGGTGGTGGCTCC(SEQ ID NO：41) [0224] 对应于优化的连接子2的氨基酸序列是：灵活的连接子-strep标签-连接子-TEV位点-灵活的连接子，并且对应于GGGGSGGGGSWSHPQFEKGG ENLYFQG GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：58)。DNA序列如下： [0225] ggtggcggtggatctggaggaggcggttcttggtctcacccacaatttgaaaagggtggagaaaacttgtactttcaaggcggtggtggaggttctggcggaggtggctccggctca (SEQ IDNO：42)。 [0226] 共培养物 [0227] 本发明还涉及包含至少两种酵母宿主细胞的共培养物，其中所述至少两种酵母宿主细胞中的每一种包含编码异源纤维素酶的分离的多核苷酸。如本文使用的“共培养物”是指在同一个容器中在一起生长的宿主细胞的两种不同的菌株或种类。在本发明的一些实施方式中，共培养物的至少一种宿主细胞包含含有编码内切葡聚糖酶的核酸的异源多核苷酸，共培养物的至少一种宿主细胞包含含有编码β-葡萄糖苷酶的核酸的异源多核苷酸，并且至少一种宿主细胞包含含有编码纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸。在进一步的实施方式中，共培养物还包含这样的宿主细胞：其含有包含编码第二纤维二糖水解酶的核酸的异源多核苷酸。 [0228] 共培养物可以包含酵母宿主细胞的两种或更多种菌株，并且可以在宿主细胞的两种或更多种菌株的任意组合中表达异源纤维素酶。例如，根据本发明，共培养物可以包含两种菌株：表达内切葡聚糖酶的宿主细胞的一种菌株，和表达β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶和第二纤维二糖水解酶的宿主细胞的第二种菌株。根据本发明，共培养物还也可以包含四种菌株：表达内切葡聚糖酶的宿主细胞的一种菌株，表达β-葡萄糖苷酶的宿主细胞的一种菌株，表达第一纤维二糖水解酶的宿主细胞的一种菌株，和表达第二纤维二糖水解酶的宿主细胞的一种菌株。类似地，共培养物可以包含表达两种纤维素酶(例如内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶)的宿主细胞的一种菌株，和表达一种或多种纤维素酶(例如一种或多种纤维二糖水解酶)的宿主细胞的第二种菌株。除了包含异源纤维素酶的至少两种宿主细胞之外，共培养物还可以包括不包含异源纤维素酶的其它宿主细胞。 [0229] 共培养物中的多种宿主细胞菌株可以以相等的数目存在，或者，宿主细胞的一种菌株或种类的数目可以显著超过宿主细胞的另一种菌株或种类。例如，在包含宿主细胞的两种菌株或种类的共培养物中，一种宿主细胞与另一种的比例可以是大约1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶10，1∶100，1∶500或1∶1000。类似地，在包含宿主细胞的三种或更多种菌株或种类的共培养物中，宿主细胞的菌株或种类可以以相等或不等的数目存在。 [0230] 本发明的共培养物可以包含附着的纤维素酶、分泌的纤维素酶或附着的与分泌的纤维素酶二者。例如，在本发明的一些实施方式中，共培养物包含含有编码分泌的异源纤维素酶的多核苷酸的至少一种酵母宿主细胞。在另一个实施方式中，共培养物包含含有编码附着的异源纤维素酶的多核苷酸的至少一种酵母宿主细胞。在一个实施方式中，共培养物中所有的异源纤维素酶都是分泌的。在另一个实施方式中，共培养物中所有的异源纤维素酶都是附着的。此外，其它纤维素酶，例如外部添加的纤维素酶，也可以存在于共培养物中。 [0231] 编码异源纤维素酶的多核苷酸 [0232] 本发明还包括编码本发明的纤维素酶的分离的多核苷酸。因此，本发明的多核苷酸可以编码内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶。多核苷酸可以包含内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶或纤维二糖水解酶。 [0233] 在本发明的一些具体实施方式中，多核苷酸编码内切葡聚糖酶，其是内-1，4-β-葡聚糖酶。在具体的实施方式中，多核苷酸编码来自里氏木霉的内切葡聚糖酶I。在一些其它实施方式中，内切葡聚糖酶由包含与SEQ ID NO：19至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的序列的多核苷酸编码。在具体的实施方式中，多核苷酸编码来自台湾家白蚁的内切葡聚糖酶1。在一些其它实施方式中，内切葡聚糖酶由包含与SEQ ID NO：11至少大约70％、大约80％、大约 90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的序列的多核苷酸编码。在具体的实施方式中，多核苷酸编码来自里氏木霉的内切葡聚糖酶I。在一些其它实施方式中，内切葡聚糖酶由包含与SEQ ID NO：19至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的序列的多核苷酸编码。 在具体的实施方式中，多核苷酸编码来自红褐肉座菌的内切葡聚糖酶2。在一些其它实施方式中，内切葡聚糖酶由包含与SEQ ID NO：54至少大约70％、大约80％、大约90％、大约 95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的序列的多核苷酸编码。 [0234] 在一些实施方式中，多核苷酸编码β-葡萄糖苷酶I或β-葡萄糖苷酶II同种型、旁系同源物或直系同源物。在本发明的一些实施方式中，多核苷酸编码源自扣囊复膜酵母菌的β-葡萄糖苷酶。在具体的实施方式中，β-葡萄糖苷酶由包含与SEQ ID NO：20至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的序列的多核苷酸编码。 [0235] 在本发明的一些实施方式中，多核苷酸编码纤维二糖水解酶I和/或纤维二糖水解酶II同种型、旁系同源物或直系同源物。在本发明的具体实施方式中，多核苷酸编码来自里氏木霉的纤维二糖水解酶I或II。在本发明的具体实施方式中，多核苷酸编码来自埃默森篮状菌的纤维二糖水解酶I或II。在另一个实施方式中，纤维二糖水解酶由包含与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的序列的多核苷酸编码。在本发明的具体实施方式中，多核苷酸编码来自C.lucknowense的纤维二糖水解酶。在另一个实施方式中，纤维二糖水解酶由包含与SEQ ID NO：5至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的序列的多核苷酸编码。 [0236] 在其它实施方式中，多核苷酸是包含与表1所列的核苷酸序列至少大约70％、大约80％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％同一的序列的多核苷酸。在一些方面，多核苷酸可以编码源自例如真菌、细菌、原生动物或白蚁来源的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡萄糖苷酶。 [0237] 在一些方面，本发明涉及包含编码埃默森篮状菌、灰腐质霉、嗜热子囊菌、C.lucknowense或里氏木霉Cbh1或Cbh2的功能性或结构性结构域的核酸的多核苷酸。例如，里氏木霉Cbh1的结构域包括但不限于：(1)信号序列，其是SEQ ID NO：27的氨基酸1至33；(2)催化结构域(CD)，其是SEQ ID NO：27的大约氨基酸41至大约氨基酸465；和(3)纤维素酶结合模块(CBM)，其是SEQ ID NO：27的大约氨基酸503至大约氨基酸535。里氏木霉Cbh2的结构域包括但不限于：(1)信号序列，其是SEQ ID NO：27的氨基酸1至33；(2)催化结构域(CD)，其是SEQ ID NO：27的大约氨基酸145至大约氨基酸458；和(3)纤维素酶结合模块(CBM)，其是SEQ IDNO：27的大约氨基酸52至大约氨基酸83。 [0238] 本发明还包括包含与如上所述的编码埃默森篮状菌、灰腐质霉、嗜热子囊菌、C.lucknowense或里氏木霉Cbh1或Cbh2结构域的核酸至少大约70％、75％或80％同一、至少大约90％至大约95％同一，或至少大约96％、97％、98％、99％或100％同一的核酸的分离的多核苷酸。 [0239] 本发明还包括如上所述的纤维素酶基因的变体。变体可以在编码区、非编码区或二者中包含变异。实例有：包含改变的多核苷酸变体，其产生沉默替换、添加或删除，但是不改变所编码的多肽的性质或活性。在一些实施方式中，通过由于遗传密码的简并性造成的沉默替换来产生核苷酸变体。在进一步的实施方式中，可以为了多种原因产生灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfidafusca)、热纤梭菌(Clostridum thermocellum)、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、Saccharophagusdegradans、Piromyces equii、Neocallimastix patricarum、 白 曲霉(Aspergillus kawachii)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremonium thermophilum)、费 希 新 萨 托 菌 (Neosartoryafischeri)、球 毛 壳 菌 (Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、土曲 霉(Aspergillusterreus)、粗糙 脉孢 菌(Neurospora Crassa)、北美 散白 蚁(R.flavipes)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的纤维素酶多核苷酸变体，例如，为了针对特定宿主优化密码子表达。本发明的密码子优化的多核苷酸在下文中有进一步的讨论。 [0240] 本发明还包括编码融合蛋白的分离的多核苷酸。在一些实施方式中，编码融合蛋白的核酸包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸编码埃默森篮状菌cbh1、灰腐质霉cbh1、嗜热子囊菌cbh1或埃默森篮状菌cbh1，其中所述第二多核苷酸编码里氏木霉cbh1或里氏木霉cbh2或C.lucknowense cbh2b的CBM。在编码融合蛋白的核酸的具体实施方式中，第一多核苷酸编码埃默森篮状菌cbh1，第二多核苷酸编码来自里氏木霉Cbh1或Cbh2的CBM。 [0241] 在进一步的实施方式中，第一和第二多核苷酸是相同的方向，或者第二多核苷酸与第一多核苷酸的方向相反。在另外的实施方式中，第一多核苷酸编码的多肽在第二多核苷酸编码的多肽的N-末端或C-末端。在一些其它实施方式中，第一多核苷酸和/或第二多核苷酸由密码子优化的多核苷酸编码，例如，针对酿酒酵母、克鲁维酵母或针对酿酒酵母与克鲁维酵母二者进行密码子优化的多核苷酸。在编码融合蛋白的核酸的具体实施方式中，第一多核苷酸是密码子优化的埃默森篮状菌cbh1，第二多核苷酸编码来自里氏木霉Cbh1或Cbh2的密码子优化的CBM。 [0242] 本发明还提供了等位基因变体、直系同源物和/或物种同源物。可以使用本领域已知的程序，使用来自本文公开的序列或保藏于ATCC的克隆的信息，获得对应于SEQ ID NO：1-20的任意项的基因的全长基因、等位基因变体、剪接变体、全长编码部分、直系同源物、和/或物种同源物。例如，可以通过从本文提供的序列制备合适的探针或引物并就等位基因变体和/或想要的同源物筛选合适的核酸来源来分离和鉴定等位基因变体和/或物种同源物。 [0243] “含有与本发明的参考核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的核酸”是指，该核酸的核苷酸序列与该参考序列是相同的，只不过对于编码特定多肽的参考核苷酸序列的每100个核苷酸而言，该核苷酸序列可以包括多达5个点突变。换言之，为了获得含有与参考核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的核酸，可以将参考序列中多达5％的核苷酸删除或替换为其它核苷酸，或者，可以将多达参考序列的总核苷酸的5％的多个核苷酸插入到该参考序列中。查询序列可以是SEQ ID NO：1-20任意项所示的完整序列，或本文描述的任何指定片段或结构域。 [0244] 在实际中，可以使用已知的计算机程序常规地确定任意特定核酸分子或多肽是否与本发明的核苷酸序列或多肽是至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的。可以使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.(1990)6：237-245)的算法的FASTDB计算机程序来测定查询序列(本发明的序列)与主题序列之间的最佳总体匹配，也称为全局序列比对。在序列比对中，查询和主题序列都是DNA序列。可以通过将U转化为T来比较RNA序列。所述全局序列比对的结果以同一性百分率表示。DNA序列的FASTDB比对中使用的用于计算百分率同一性的优选参数是：矩阵＝一元的，k-tuple＝4，错配罚分＝1，连接罚分＝30，随机化组长度＝0，截止得分＝1，空隙罚分＝5，空隙大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或主题核苷酸序列的长度，以较短者为准。 [0245] 如果由于5’或3’删除而不是由于内部删除而导致主题序列比查询序列短，则必须对结果进行人工校正。这是由于：当计算百分率同一性时，FASTDB程序不考虑主题序列的5’和3’截短。对于在5’或3’末端相对于查询序列被截短的主题序列，通过计算未匹配的/比对的查询序列的碱基数目(其是主题序列的5’和3’)占查询序列的总碱基数的百分率来校正百分率同一性。核苷酸是否匹配/比对是通过FASTDB序列比对的结果来确定的。然后从使用指定参数通过以上FASTDB程序计算而来的百分率同一性中减掉该百分率，以获得最终的百分率同一性得分。该校正后的得分用于本发明的目的。为了人工调整百分率同一性得分，只计算那些在主题序列的5’和3’碱基之外的碱基，如FASTDB比对所显示，它们不与查询序列匹配/比对。 [0246] 例如，90个碱基的主题序列与100个碱基的查询序列进行比对以确定百分率同一性。删除发生在主题序列的5’末端，因此，FASTDB比对不显示5’末端的前10个碱基的匹配/比对。10个未配对的碱基代表10％的序列(不匹配的5’和3’末端的碱基数目/查询序列的碱基总数目)，所以，从通过FASTDB程序计算而来的百分率同一性得分中减掉10％。如果剩余的90个碱基完全匹配，则最终的百分率同一性将是90％。在另一个实例中，90个碱基的主题序列与100个碱基的查询序列进行比较。这次的删除是内部删除，所以不存在不与查询序列匹配/比对的位于主题序列的5’或3’的碱基。在这种情况下，通过FASTDB程序计算的百分率同一性不进行人工校正。再次说明：只有那些不与查询序列匹配/比对的位于主题序列的5’和3’的碱基进行人工校正。为了本发明的目的不进行其它人工校正。 [0247] 本发明的一些实施方式包括：包含SEQ ID NO：1-20任意项的至少10、20、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700或800个连续核苷酸或更多个核苷酸的核酸分子，或其结构域、片段、变体、或衍生物。 [0248] 本发明的多核苷酸可以是RNA的形式或DNA的形式，所述DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。所述DNA可以是双链或单链的，并且如果是单链，可以是编码链或非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与编码SEQ ID NO：21-40、46或52-56的编码序列相同，或者可以是不同的编码序列，所述编码序列由于遗传密码的冗余或简并性的缘故而编码与SEQ ID NO：21-40、46或52-56任一项的DNA相同的成熟多肽。 [0249] 在一些实施方式中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO：21-40、46或52-56的至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少95个或至少100个或更多个连续氨基酸的核酸片段。 [0250] 编码SEQ ID NO：21-40、46或52-56的成熟多肽的多核苷酸可以包括，仅成熟多肽的编码序列；成熟多肽的任意结构域的编码序列；成熟多肽的编码序列(或结构域编码序列)以及非编码序列，例如内含子或成熟多肽的编码序列的5’和/或3’的非编码序列。 [0251] 因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括：仅包括编码多肽的序列的多核苷酸；以及，包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。 [0252] 在本发明的其它方面，含有与本文公开的核酸序列至少大约90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列的核酸分子编码具有纤维二糖水解酶(″Cbh″)、内切葡聚糖酶(″Eg″)或β-葡萄糖苷酶(″Bgl″)功能活性的多肽。“具有Cbh、Eg或Bgl功能活性的多肽”是指显示出类似于但不一定等同于本发明的Cbh、Eg或Bgl多肽的功能活性的活性的多肽，所述活性通过例如特定的生物学测定法所测。例如，可以通过测定Cbh、Eg或Bgl多肽水解纤维素的能力或通过测定Cbh、Eg或Bgl活性水平来常规测定Cbh、Eg或Bgl的功能活性。 [0253] 当然，由于遗传密码的简并性，本领域普通技术人员将会完全认识到：大部分的“含有与SEQ ID NO：1-20任意项的核酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列的核酸分子或其片段”将编码具有Cbh、Eg或Bgl功能活性的多肽。事实上，由于这些多核苷酸序列的任意项的简并变体都编码相同的多肽，所以，在很多情况下，本领域技术人员即使不进行上述的比较测定也将会完全了解这一点。在本领域中还将认识到，对于那些不是简并变体的核酸分子，也会有合理的数量编码具有Cbh、Eg或Bgl功能活性的多肽。 [0254] 本发明的多核苷酸还包括编码灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridumthermocellum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、Saccharophagus degradans、Piromycesequii、Neocallimastix patricarum、白 曲 霉(Aspergillus kawachii)、甜 菜 胞 囊 线 虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremoniumthermophilum)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、烟曲 霉(Aspergillus fumigatus)、土 曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙 脉孢 菌(Neurospora Crassa)、北美散白蚁(R.flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)的纤维素酶或其结构域、片段、变体或衍生物的核酸，所述核酸与编码允许检测本发明的多核苷酸的标志物序列的多核苷酸融合。在本发明的一个实施方式中，标志物的表达不依赖于纤维素酶的表达。所述标志物序列可以是选自URA3，HIS3，LEU2，TRP1，LYS2或ADE2的酵母可选择标志物。Casey，G.P.等人，″Aconvenient dominant selection marker for gene transfer in industrialstrains of Saccharomyces yeast：SMR1 encoded resistance to theherbicide sulfometuron methyl，″J.Inst.Brew.94：93-97(1988)。 [0255] 密码子优化的多核苷酸 [0256] 根据本发明的一个实施方式，编码异源纤维素酶的多核苷酸可以是密码子优化的。本文使用的术语“密码子优化的编码区”意思是：通过将至少一个或一个以上或很多个密码子替换为生物体的基因中更经常使用的一个或多个密码子，而使核酸编码区适应在该给定生物的细胞中的表达。 [0257] 一般而言，生物中高度表达的基因偏向于被该生物中最丰富的tRNA种类所识别的密码子。这种偏向的一种度量是“密码子适应指数”或称“CAI”，其测定在何种程度上，用于编码特定基因中的每个氨基酸的密码子是在来自该生物的高度表达的基因的参照组中最经常存在的启动子。 [0258] 本发明的密码子优化的序列的CAI对应于大约0.8至1.0，大约0.8至0.9，或大约1.0。密码子优化的序列可以进一步被修饰以在特定生物中表达，这取决于该生物的生物学限制性。例如，可以从序列中除掉大量的″A″或″T″的串(例如超过4、4、5、6、7、8、9或 10个连续碱基的串)，如果已知这些序列对转录产生不利影响。此外，可以为了分子克隆的目的除去特定的限制性酶位点。此类限制性酶位点的实例包括PacI、AscI、BamHI、BglII、EcoRI和XhoI。另外，可以检查DNA序列中的长度为10个碱基或更长的正向重复序列、反向重复序列和镜像重复序列，可以通过将密码子替换为“第二最佳”密码子，即在特定生物(针对该生物进行序列的优化)中发生的频率第二高的密码子，从而对它们进行人工修饰。 [0259] 包含编码任意多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的变异允许编码基因的序列的差异。由于每个密码子由3个核苷酸组成，并且构成DNA的核苷酸限定在4种特定的碱基，所以有64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸(其余3种密码子编码终止翻译的信号)。本文表2中提供了“遗传密码”，其显示了哪种密码子编码哪种氨基酸。结果是，很多氨基酸被不止一种密码子代表。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸被4种三元组所编码，丝氨酸和精氨酸被6种三元组编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由1种三元组编码。这种简并性允许DNA碱基组成在很大范围内变化，但不改变DNA所编码的蛋白质的氨基酸序列。 [0260] 表2：标准遗传密码 [0261] [0262] 很多生物显示出对编码插入到生长中的肽链中的特定氨基酸的特定密码子的使用偏向。不同生物之间的密码子优选性或密码子偏向、密码子使用的差异受到遗传密码的简并性的影响，并且在很多生物中有完善的研究。密码子偏向通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，信使RNA的翻译效率又被认为尤其依赖于被翻译的密码子的特性以及特定的转运RNA(tRNA)分子的可利用性。细胞中所选的tRNA的主导性一般是肽合成中最常使用的密码子的反映。因此，可以基于密码子优化调整基因以便在给定生物中进行优化的基因表达。 [0263] 鉴于对于多种动物、植物和微生物物种而言大量的基因序列是可以获得的，所以可以计算出密码子使用的相对频率。密码子使用表是可以容易地获得的，例如http://phenotype.biosci.umbc.edu/codon/sgd/index.php(2008年5月7日访问)或http://www.kazusa.or.jp/codon/(2008年3月20日访问)，并且这些表格可以按多种方式进行改编。参见Nakamura，Y等人″Codon usage tabulated from the international DNA sequencedatabases：status for the year 2000″Nucl.Acids Res.28：292(2000)。下文表3提供了酵母的密码子使用表格，其是从GenBank Release128.0[2002年2月15日]计算而来的。该表格使用的是mRNA命名法，所以表格使用的是存在于RNA中的尿嘧啶(U)而非存在于DNA中的胸腺嘧啶(T)。该表格进行了改编所以频率的计算是针对每种氨基酸，而非针对所有64种密码子。 [0264] 表3：酿酒酵母基因的密码子使用表 [0265] [0266] [0267] [0268] [0269] [0270] 通过使用该表格或类似表格，本领域普通技术人员可以将频率应用于任何给定的多肽序列，并产生密码子优化的编码区的核酸片段，其编码多肽，但是其使用针对给定物种的优化的密码子。可以通过多种不同的方法设计密码子优化的编码区。 [0271] 在一种方法中，密码子使用表用于发现用于任何给定氨基酸的单一的使用频率最高的密码子，并且在该特定氨基酸出现在多肽序列中时，每次都使用该密码子。例如，参见上文表3，对于亮氨酸而言，频率最高的密码子是UUG，其使用频率是27.2％。因此，给定氨基酸序列中所有的亮氨酸残基都被分配UUG密码子。 [0272] 在另一种方法中，密码子的实际频率在编码序列中随机分布。因此，使用该方法进行优化时，如果假定的多肽序列具有100个亮氨酸残基，则，参照表3中酿酒酵母中的使用频率，大约5个或5％的亮氨酸密码子将是CUC，大约11个或11％的亮氨酸密码子将是CUG，大约12个或12％的亮氨酸密码子将是CUU，大约13个或13％的亮氨酸密码子将是CUA，大约26个或26％的亮氨酸密码子将是UUA，大约27个或27％的亮氨酸密码子将是UUG。 [0273] 这些频率将随机遍布于编码假定的多肽的编码区中的亮氨酸密码子中。如本领域普通技术人员将理解：使用该方法时序列中密码子的分布可以有很大变化。但是，序列总是编码相同的多肽。 [0274] 当使用上述方法时，术语“大约”用于精确说明给定氨基酸的密码子频率的百分数。本文使用的“大约”定义为比给定数值多1个氨基酸或少1个氨基酸。如果使用频率分数大于或等于0.50，则将氨基酸的整数数值“五入”；如果使用频率分数小于或等于0.49，则将其“四舍”。再次以人基因中亮氨酸的使用频率为例，假设一个多肽具有62个亮氨酸残基，则密码子使用的频率分数这样计算：62乘以每种密码子的频率。因此，62的7.28％等于4.51个UUA密码子，或″大约5”即4、5或6个UUA密码子；62的12.66％等于7.85个UUG密码子或″大约8″即7、8或9个UUG密码子；62的12.87％等于7.98个CUU密码子或″大约8”即7、8或9个CUU密码子；62的19.56％等于12.13个CUC密码子或″大约12”即11、12或13个CUC密码子；62的7.00％等于4.34个CUA密码子或″大约4”即3、 4或5个CUA密码子；62的40.62％等于25.19个CUG密码子或″大约25”即24、25或26个CUG密码子。 [0275] 可以通过计算每种氨基酸的密码子频率，然后为多肽序列随机分配密码子，人工地以优化的频率随机分配密码子以编码给定的多肽序列。另外，本领域普通技术人员可以容易地获得多种算法和计算机软件程序。例如，Lasergene Package中的″EditSeq″函数，其可以从DNAstar，Inc.，Madison，WI获得；VectorNTI Suite中的backtranslation函数，其可以从InforMax，Inc.，Bethesda，MD获得；以及GCG--Wisconsin Package中的″backtranslate″函数，其可以从Accelrys，Inc.，San Diego，CA获得。另外，公众可以获得多种资源以进行编码区序列的密码子优化，例如http://www.entelechon.com/bioinformatics/backtranslation.php？ lang＝ eng(2008年 4月 15日 访 问)的″backtranslation″函数和可以从http://bioinfo.pbi.nrc.ca：8090/EMBOSS/index.html(2002年7月9日访问)获得的″backtranseq″函数。本领域普通技术人员还可以通过基本的数学函数轻易地实现构建初步算法以基于给定的频率分配密码子。 [0276] 使用本领域普通技术人员熟知的标准的和常规的分子生物学操作，可以获得多种选择以合成通过上文描述的任意方法设计的密码子优化的编码区。在一种方法中，通过标准方法合成一系列互补的寡核苷酸对(oligonucleotide pair)，每个长度是80-90个核苷酸并且跨越想要的序列的长度。合成这些寡核苷酸对，从而实现在退火之后，它们形成80-90个碱基对的双链片段，其包含粘末端，例如，将所述对中的每个寡核苷酸合成为延伸超出与对中的另一寡核苷酸互补的区域3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基。每对寡核苷酸的单链末端设计为与另一对寡核苷酸的单链末端退火。使寡核苷酸对退火，然后使大约5至6个这些双链片段通过粘性单链末端退火在一起，然后将它们连接在一起并克隆进入标准的细菌克隆载体，例如可以从Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA获得的 载体。然后通过标准方法将构建体测序。几个这样的构建体(由5至6个80-90个碱基对片段的片段组成)连接在一起，即制备大约500个碱基对的片段，从而在一系列质粒构建体中代表完整的想要的序列。然后使用合适的限制性酶切割这些质粒的插入子，并连接在一起以形成最终的构建体。然后将最终的构建体克隆进入标准的细菌克隆载体并测序。另外的方法对于技术人员是完全显而易见的。此外，基因合成可以容易地从商业途径获得。 [0277] 在一些实施方式中，通过本文描述的任意方法进行完整多肽序列或其片段、变体或衍生物的密码子优化。设计多种想要的片段、变体或衍生物，然后每个单独进行密码子优化。此外，可以设计并构建本发明的部分密码子优化的编码区。例如，本发明包括编码多肽的密码子优化的编码区的核酸片段，其中至少大约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 95％、或100％的密码子位置已经针对给定物种进行了密码子优化。也就是说，它们包含在想要的物种(例如酵母物种，例如酿酒酵母或克鲁维酵母)的基因中优选使用的密码子，替换了在天然核酸序列中通常使用的密码子。 [0278] 在另外的实施方式中，将全长的多肽序列针对给定物种进行密码子优化，产生编码整个多肽的密码子优化的编码区，然后，从原始的密码子优化的编码区制备密码子优化的编码区的核酸片段，其编码多肽的片段、变体和衍生物。本领域普通技术人员熟知的是，如果基于密码子在给定物种中的使用频率为全长编码区随机分配密码子，则编码片段、变体和衍生物的核酸片段将不一定是针对给定物种完全密码子优化的。但是，与天然密码子使用相比，此类序列与想要的物种的密码子使用之接近程度仍然要高得多。该方法的优点在于，合成编码给定多肽的每个片段、变体和衍生物的密码子优化的核酸片段虽然是常规操作，但是是耗时的，并且花费巨大。 [0279] 密码子优化的编码区可以是例如编码来自灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridumthermocellum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、Sacch aroph agus degradans、Piromycesequii、Neocallimastix patricarum、白 曲 霉(Aspergillus kawachii)、甜 菜 胞 囊 线 虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremoniumthermophilum)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、烟曲 霉(Aspergillus fumigatus)、土 曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙 脉孢 菌(Neurospora Crassa)、北美散白蚁(R.flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)的纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡萄糖苷酶或其结构域、片段、变体或衍生物的形式。 [0280] 通过本文描述的方法针对特定物种进行密码子优化，例如，在一些实施方式中，编码灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosatus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridum thermocellum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonasfimi)、Saccharophagus degradans、Piromyces equii、Neocallimastixpatricarum、 白 曲霉(Aspergillus kawachii)、甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremonium thermophilum)、费希 新 萨托 菌(Neosartorya fischeri)、球 毛壳 菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、土 曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙 脉孢 菌(NeurosporaCrassa)、北美 散白 蚁(R.flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)的纤维素酶的多肽或其结构域、片段、变体或衍生物的密码子优化的编码区是根据酵母(例如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母和/或马克斯克鲁维酵母)的密码子使用进行优化的。还提供了包含编码灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蚁(C.lacteus)、台湾家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜酵母菌(S.fibuligera)、C.lucknowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfida fusca)、热纤梭菌(Clostridumthermocellum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridumjosui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、Saccharophagus degradans、Piromycesequii、Neocallimastix patricarum、白 曲 霉(Aspergillus kawachii)、甜 菜 胞 囊 线 虫(Heterodera schachtii)、红褐肉座菌(H.jecorina)、Orpinomyces属、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、嗜热枝顶孢(Acremoniumthermophilum)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)、烟曲 霉(Aspergillus fumigatus)、土 曲霉(Aspergillus terreus)、粗糙 脉孢 菌(Neurospora Crassa)、北美散白蚁(R.flavipes)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)纤维素酶的多肽或其结构域、片段、变体或衍生物的密码子优化的编码区的多核苷酸、载体和其它表达构建体，以及使用此类多核苷酸、载体和其它表达构建体的多种方法。 [0281] 在本文描述的一些实施方式中，根据酵母(酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或马克斯克鲁维酵母)中的密码子使用优化编码SEQ ID NO：21-40、46或52-56的任意项或其结构域、片段、变体或衍生物的密码子优化的编码区。在一些实施方式中，序列是特别针对在酿酒酵母中的表达进行密码子优化的。在一些实施方式中，序列是针对在克鲁维酵母中的表达进行密码子优化的。在一些实施方式中，序列是针对在酿酒酵母和克鲁维酵母二者中的最佳表达同时进行密码子优化的。或者，可以根据任意植物、动物或微生物物种中的密码子使用来优化编码SEQ ID NO：21-40、46或52-56的任意项的密码子优化的编码区。 [0282] 载体和在宿主细胞中使用载体的方法 [0283] 本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体，经过本发明的载体遗传工程化的宿主细胞，和通过重组技术产生本发明的多肽。 [0284] 宿主细胞经过本发明的载体遗传工程化(转导、转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。所述载体可以是例如下列形式：质粒、病毒颗粒、噬菌体等。可以在视需要进行改良的常规营养培养基中培养工程化的宿主细胞，以激活启动子、选择转化子或扩增本发明的基因。培养条件例如温度、pH等是以前用于宿主细胞的选择用来表达的条件，并且对本领域普通技术人员是显而易见的。 [0285] 本发明的多核苷酸可用于通过重组技术产生多肽。因此，例如，可以在多种表达载体中的任一种中包括多核苷酸以表达多肽。此类载体包括染色体、非染色体和合成的DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；和酵母质粒。然而，可以使用任何其它载体，只要其在宿主中是可复制的和存活的。 [0286] 可以通过多种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般地，通过本领域已知的方法将DNA序列插入到合适的限制性核酸内切酶位点。此类方法和其它方法被认为是在本领域技术人员能力范围内。 [0287] 表达载体中的DNA序列与用于指导mRNA合成的合适的表达控制序列(启动子)可操作地结合。此类启动子的代表性实例如下： [0288]基因 生物 系统名 使用原因/益处 PGK1 酿酒酵母 YCR012W 强组成型启动子 ENO1 酿酒酵母 YGR254W 强组成型启动子 TDH3 酿酒酵母 YGR192C 强组成型启动子 TDH2 酿酒酵母 YJR009C 强组成型启动子 TDH1 酿酒酵母 YJL052W 强组成型启动子 ENO2 酿酒酵母 YHR174W 强组成型启动子 GPM1 酿酒酵母 YKL152C 强组成型启动子 TPI1 酿酒酵母 YDR050C 强组成型启动子 [0289] 另外，来自压力和饥饿响应基因的启动子序列可用于本发明。在一些实施方式中，可以使用来自酿酒酵母基因GAC1、GET3、GLC7、GSH1、GSH2、HSF1、HSP12、LCB5、LRE1、LSP1、NBP2、PIL1、PIM1、SGT2、SLG1、WHI2、WSC2、WSC3、WSC4、YAPI、YDC1、HSP104、HSP26、ENA1、MSN2、MSN4、SIP2、SIP4、SIP5、DPL1、IRS4、KOG1、PEP4、HAP4、PRB1、TAX4、ZPR1、ATG1、ATG2、ATG10、ATG11、ATG12、ATG13、ATG14、ATG15、ATG16、ATG17、ATG18、和ATG19的启动子区域。可以使用驱动在本发明的宿主细胞中的基因表达的任意合适的启动子。另外，可以使用大肠杆菌lac或trp以及其它已知的控制原核或低等真核细胞中的基因表达的启动子。 [0290] 此外，表达载体可以包含一个或多个选择性标志物基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型特性，例如用于真核细胞培养物的URA3、HIS3、LEU2、TRP1、LYS2、ADE2、二氢叶酸还原酶、新霉素(G418)抗性或zeocin抗性，或大肠杆菌中的四环素或氨比西林抗性。 [0291] 表达载体还可以包含用于翻译起始的核糖体结合位点和/或转录终止子。载体还可以包括用于扩增表达的合适序列，或可以包括另外的调节区域。 [0292] 包含合适的如本文所述的DNA序列以及合适的启动子或控制序列的载体可用于转化合适的宿主以允许该宿主表达蛋白质。 [0293] 因此，在一些方面，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是本申请其它地方描述的宿主细胞。所述宿主细胞可以是，例如，低等真核细胞，例如酵母细胞，例如酿酒酵母或克鲁维酵母，或者所述宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。 [0294] 作为合适的宿主的代表性实例，可以提及：细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)；嗜热或嗜温细菌；真菌细胞，例如酵母；和植物细胞等。合适的宿主的选择被认为是在本领域技术人员根据本文教导的能力范围内。 [0295] 合适的真菌宿主包括酵母。在本发明的一些方面，酵母选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母(Schizzosacch aromyces pombe)、白假丝酵母菌(Candida albicans)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、Arxula adeninivorans、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、多形德巴利酵母(Debaryomycespolymorphus)、西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、马克斯克鲁维酵母、布拉氏霉菌属(Blakeslea)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、白霉属(Mucor)、须霉属(Phycomces)、腐霉属(Pythium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、丝孢酵母属(Trichosporon)和耶罗威亚酵母属(Yarrowia)。 [0296] 使用宿主细胞产生生产乙醇的方法 [0297] 本发明还涉及使用宿主细胞和共培养物从纤维质底物生产乙醇。可以通过例如将纤维质底物与本发明的宿主细胞或共培养物接触来完成此类方法。 [0298] 有多种纤维质底物可用于本发明。用于纤维素活性测定的底物可以基于它们在水中的溶解性分为两类：可溶的和不可溶的。可溶的底物包括纤维糊精或衍生物、羧甲基纤维素(CMC)或羟乙基纤维素(HEC)。不可溶的底物包括晶体纤维素、微晶纤维素(Avicel)、无定形纤维素，例如磷酸膨胀的纤维素(PASC)、染色的或荧光纤维素，和经过预处理的木质纤维素生物质。这些底物一般是高度有序的纤维质物质，因此仅少量可溶。 [0299] 将认识到，合适的木质纤维素物质可以是任何含有可溶性和/或不溶性纤维素的原料，其中所述不溶性纤维素可以是晶体或非晶体形式。在多个实施方式中，木质纤维素生物质包括，例如，木材、玉米、玉米秸秆、木屑、树皮、树叶、农业和林业的残留物、草例如柳枝稷、反刍动物消化产物、城市垃圾、造纸厂污水、报纸、纸板或其组合。 [0300] 在一些实施方式中，本发明涉及，通过将纤维质底物(例如如上文描述的纤维质底物)与本发明的宿主细胞接触来水解所述纤维质底物的方法。在一些实施方式中，本发明涉及，通过将纤维质底物(例如如上文描述的纤维质底物)与包含表达异源纤维素酶的酵母细胞的共培养物接触来水解所述纤维质底物的方法。 [0301] 在一些实施方式中，本发明涉及发酵纤维素的方法。此类方法可以这样完成：例如，在含有不可溶的纤维素的培养基中培养宿主细胞或共培养物，以允许进行纤维素的糖化和发酵。 [0302] 根据本发明，乙醇的产生可以在下列温度进行：至少大约30℃、大约31℃、大约32℃、大约33℃、大约34℃、大约35℃、大约36℃、大约37℃、大约38℃、大约39℃、大约 40℃、大约41℃、大约42℃、大约43℃、大约44℃、大约45℃、大约46℃、大约47℃、大约 48℃、大约49℃或大约50℃。在本发明的一些实施方式中，耐热的宿主细胞可以在高于大约30℃、大约31℃、大约32℃、大约33℃、大约34℃、大约35℃、大约36℃、大约37℃、大约 38℃、大约39℃、大约40℃、大约41℃、大约42℃或大约43℃或大约44℃或大约45℃或大约50℃的温度从纤维素产生乙醇。在本发明的一些实施方式中，耐热的宿主细胞可以在大约30℃至60℃，大约30℃至55℃，大约30℃至50℃，大约40℃至60℃，大约40℃至55℃，或大约40℃至50℃的温度从纤维素产生乙醇。 [0303] 在一些实施方式中，产生乙醇的方法可以包括：将纤维质底物与本发明的宿主细胞或共培养物接触，另外，将纤维质底物与外部产生的纤维素酶接触。示例性的外部产生的纤维素酶是商业上可获得的，并且是本领域技术人员已知的。 [0304] 因此，本发明还涉及减少从纤维素产生给定数量的乙醇所需的外部产生的纤维素酶的量的方法，包括：将纤维素与外部产生的纤维素酶并与本发明的宿主细胞或共培养物接触。在一些实施方式中，使用低至少大约5％，10％，15％，20％，25％，30％或50％的外部产生的纤维素酶，可以实现相同数量的乙醇产量。在一些实施方式中，不添加外部纤维素酶，或者少于大约5％的纤维素酶是外部添加的纤维素酶，或者少于大约10％的纤维素酶是外部添加的纤维素酶，或者少于大约15％的纤维素酶是外部添加的纤维素酶。 [0305] 在一些实施方式中，方法包括在特定速率产生乙醇。例如，在一些实施方式中，以下列速率产生乙醇：至少大约0.1mg/小时/升，至少大约0.25mg/小时/升，至少大约0.5mg/小时/升，至少大约0.75mg/小时/升，至少大约1.0mg/小时/升，至少大约2.0mg/小时/升，至少大约5.0mg/小时/升，至少大约10mg/小时/升，至少大约15mg/小时/升，至少大约20.0mg/小时/升，至少大约25mg/小时/升，至少大约30mg/小时/升，至少大约 50mg/小时/升，至少大约100mg/小时/升，至少大约200mg/小时/升，至少大约300mg/小时/升，至少大约400mg/小时/升，或至少大约500mg/小时/升。 [0306] 在一些实施方式中，本发明的宿主细胞可以以比在相同条件下生长的对照菌株(不含异源纤维素酶)高至少大约0.1mg/小时/升，至少大约0.25mg/小时/升，至少大约0.5mg/小时/升，至少大约0.75mg/小时/升，至少大约1.0mg/小时/升，至少大约2.0mg/小时/升，至少大约5.0mg/小时/升，至少大约10mg/小时/升，至少大约15mg/小时/升，至少大约20.0mg/小时/升，至少大约25mg/小时/升，至少大约30mg/小时/升，至少大约 50mg/小时/升，至少大约100mg/小时/升，至少大约200mg/小时/升，至少大约300mg/小时/升，至少大约400mg/小时/升，或至少大约500mg/小时/升的速率产生乙醇。在一些实施方式中，可以在不存在任何外部添加的纤维素酶的情况下产生乙醇。 [0307] 可以使用本领域已知的任意方法测定乙醇产量。例如，可以使用HPLC分析法测定发酵样品中的乙醇的量。有很多乙醇测定试剂盒是商业上可获得的，其使用例如基于醇氧化酶测定。测定乙醇产量的方法是根据本文教导后本领域技术人员能力范围内的事。 [0308] 下面将通过这些非限制性实施例更详细地描述本发明的下列实施方式。实施例 [0309] 本发明呈现了用于产生能够进行联合生物加工的酵母的多个重要步骤。本发明描述了通过表达异源纤维素酶的组合而产生的改善的分解纤维素的酵母。本发明首次证明了经转化的克鲁维酵母从纤维素产生乙醇的能力，仅表达分泌的异源纤维素酶的酵母菌株从纤维素产生乙醇的能力，以及表达不同的纤维素酶的多个酵母菌株的共培养物从纤维素产生乙醇的能力。此外，此类酵母菌株和酵母菌株的共培养物能够增强同时糖化和发酵(SSF)过程的效率。 [0310] 一般性程序 [0311] 一般性的菌株培养和培养基 [0312] 大肠杆菌菌株DH5α(Invitrogen)或NEB 5α(New EnglandBiolabs)用于质粒转化和繁殖。细胞生长于LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨)，其中补充了氨比西林(100mg/L)，卡那霉素(50mg/L)或zeocin(20mg/L)。当需要使用zeocin进行选择时，将LB调整为pH 7.0。另外，如果需要固体培养基，则添加15g/L的琼脂。 [0313] 酵母菌株常规生长于YPD(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)，YPC(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L纤维二糖)，或YNB+葡萄糖(6.7g/L无氨基酸的酵母氮源，并补充对于菌株适当的氨基酸，20g/L葡萄糖)培养基，其中含有G418(250mg/L，除非另有指明)或zeocin(20mg/L，除非另有指明)以用于选择。对于固体培养基，则添加15g/L琼脂。 [0314] 分子学方法 [0315] 按照标准程序进行DNA操作(Sambrook等人1989)。使用Phusion聚合酶(New England Biolabs)进行PCR，以进行克隆；使用Taq聚合酶(New England Biolabs)进行PCR，以筛选转化子；在一些情况下使用Advantage Polymerase(Clontech)进行基因的PCR以矫正营养缺陷型。遵循生产商提供的说明书。限制性酶购自NewEngland Biolabs，根据提供的说明书进行消化。使用生产商指定的Quick ligation试剂盒(New England Biolabs)进行连接。使用Qiagen或Zymo科研试剂盒进行凝胶纯化，使用Zymo科研试剂盒进行PCR产物和消化物的纯化，使用Qiagen中量和微量制备试剂盒进行质粒DNA的纯化。在Dartmouth College的Molecular Biology Core Facility进行测序。酵母介导的连接(YML)用于产生一些构建体(Ma等人Gene58：201-216(1987))。其是这样进行的：产生待克隆的DNA片段，其与待组合的其它片段和/或骨架载体具有20-40bp的同源性。然后，通过标准方法将能够在酵母中复制的骨架载体(pRS426)(具有用于选择的Ura3基因)与用于克隆的靶序列转化进入酵母中。经转化的酵母将这些片段重新组合以形成完整构建体，得到的质粒允许在不含尿嘧啶的培养基上进行选择。 [0316] 载体 [0317] 用于下文详述的实验中的质粒构建体载体总结于表4，用于载体构建的引物总结于表5。 [0318] 表4.所用的质粒 [0319] [0320] [0321] [0322] [0323] [0324] 缩写：ENO1P/T＝烯醇酶1基因启动子/终止子；PGK1P/T＝磷酸甘油酸激酶1基因启动子/终止子；T.r.＝里氏木霉(Trichoderma reesei)；H.g.＝灰腐质霉 (Humicola grisea)；T.a.＝嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)；T.e.＝埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii，S.f.＝扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)； C.l.(a)＝澳洲乳白蚁(Coptotermes lacteus)；C.f.＝台湾家白蚁(Coptotermes formosanus)；N.t.＝高 山象白蚁(Nasutitermes takasagoensis)；C.a.＝澳大 利亚矛颚家白蚁(Coptotermes acinaciformis)；M.d.＝达尔文澳白蚁(Mastotermes darwin ensis)；N.w.＝Nasutitermes walkeri；R.s.＝黄胸散白蚁(Reticulitermes speratus)；C.l.(b)＝Chrysosporiumlucknowense；N.f.＝费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)；R.f.＝北美散白蚁(Reticulitermes flavipes)；C.t.＝嗜热毛壳菌 (Chaetomiumthermophilum) [0325] 表5：使用的引物 [0326] [0327] 产生了酵母表达载体YEpENO-BBH以促进在酿酒酵母烯醇酶1(ENO1)基因启动子和终止子控制下的异源表达。该载体的有用之处还在于：可以通过使用BamHI、BglII消化简便地切割来自该载体的表达盒。YEpENO1(Den Haan等人，Metabolic Engineering.9：87-942007)含有YEp352骨架，其中ENO1基因的启动子和终止子序列被克隆进入BamHI和HindIII位点。BamHI消化该质粒，以Klenow聚合酶和dNTP填充悬突以除掉BamHI位点。 将该质粒重连接以产生YEpENO-B。然后使用相同的方法，将BglII破坏掉，随后将HindIII位点破坏掉，以产生YEpENO-BBHtemplate。YEpENO-BBHtemplate用作PCR反应的模板，其中使用下列引物： [0328] ENOBB-left [0329] (5’-GATCGGATCCCAATTAATGTGAGTTACCTCA-3’)和 [0330] ENOBB-right [0331] (5’-GTACAAGCTTAGATCTCCTATGCGGTGTGAAATA-3’)，其中ENO1盒与150bp的上游侧接区域和220bp的下游侧接区域一起被扩增。BamHI和HindIII消化该产物，通过Klenow聚合酶和dNTP处理填充悬突，并克隆于yENO1上的两个PvuII位点之间，从而有效替换原始的ENO1盒，并产生YEpENO-BBH。 [0332] 设计密码子优化形式的灰腐质霉cbh1(Hgcbh1)、嗜热子囊菌cbh1(Tacbh1)和埃默森篮状菌cbh1和cbh2(Tecbh1和Tecbh2)，并从GenScript Corporation(Piscataway，NJ，USA)订购合成的基因。将购自GenScript Corporation的这4种合成的cbh编码基因克隆进入质粒pUC57。以EcoRI和XhoI消化得到的载体，以切除cbh基因，然后将其克隆进入经EcoRI和XhoI消化的YEpENO-BBH。从而产生质粒pRDH103(含有Hgcbh1)、pRDH104(含有Tacbh1)、pRDH105(含有Tecbh1)和pRDH106(含有Tecbh2)，其中cbh编码基因处于ENO1启动子和终止子的转录控制下。另外，产生了pRDH101，以表达来自pBZD_10631_20641的里氏木霉CBH1。按照说明书使用TakaraExTaq酶，使用引物sCBH1/2L和sCBH1R从pBZD_10631_20641扩增sTrcbh1。然后分离片段并以EcoRI和XhoI消化。还以EcoRI和XhoI消化YEpENO-BBH，并分离和连接相关的带。使用引物sCBH1/2-L和sCBH2R(5’-CAGTCTCGAGTTACAAGAAAGATGGGTTAGC-3’)，从质粒pBZD_10631_20641扩增编码里氏木霉cbh2基因的1494bp的片段，以EcoRI和XhoI消化，并克隆进入pJC1(Crouse等人，Curr.Gen.28：467-473(1995))的EcoRI和XhoI位点之间，将其置于酿酒酵母磷酸甘油酸激酶1(PGK1)基因启动子和终止子的转录控制下。该质粒被称作pRDH107。然后，通过以BamHI和BglII进行消化而切下来自pRDH103、pRDH104和pRDH105的表达盒并分别克隆进入pRDH107的BamHI位点以产生pRDH118、pRDH120、pRDH108和pRDH109。pRDH109含有与pRDH108相同的表达盒，但是，在pRDH108中，基因表达盒彼此的方向是相反的。这些质粒及其基本基因型总结于表4。 [0333] 还产生了另外2个2-μ载体，以表达Chrysosporium lucknowenseCBH2b和埃默森篮状菌CBH1，其具有里氏木霉CBH1的CBM的c-末端融合物。埃默森篮状菌cbh1与里氏木霉cbh1的CBM之间的融合是通过连接三个片段产生的。表5列出了用于这些构建体的寡核苷酸。使用pRDH105作为模板，以寡核苷酸395 Te cbh1 Synt1 PacI-ATG和398 Te cbh1 synt core SmaI扩增了PCR产物，以PmlI和SmaI消化，分离800bp的片段。使用pRDH101作为模板，以寡核苷酸399Trcbh1 synt CBM5MlyIHincII和400Trcbh1synt CBM AscIXhoI扩增了第二个PCR产物，以MlyI和XhoI消化，分离180bp的片段。将这两个PCR片段与pRDH105的6.9kb PmlI-XhoI片段连接，产生pMU624。 [0334] 使用 NetAspGene1.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetAspGene/)，就推定的内含子分析Chrysosporium lucknowense cbh2b基因(描述于已经公开的美国专利申请2007/0238155)的基因组的3900bp DNA序列。从基因组序列中除掉预测的内含子，从而产生482个氨基酸的开放阅读框，在CodonDevices合成它，就在酿酒酵母中的表达进行密码子优化，并克隆进入pUC57载体。修饰质粒pAJ401(Saloheimo等人Mol.Microbiol.13：219-228，1994)(其包含PGK1启动子和终止子)以在PacI和AscI限制性位点之间表达里氏木霉cbh2。以pAJ410作为模板，以引物379ScPGK1prom-786SacI+ApaI和380ScPGK1prom EcoRI-PacI扩增PGK1启动子，并以PacI和EcoRI消化。以寡核苷酸381CBH2WTEcoRI-PacI-ATG和 386CBH2WT TAA-AscI-EcoRI从pTTc01(Teeri 等 人，Gene 51：43-52，1987)扩增里氏木霉cbh2ORF，以PacI和EcoRI消化，并与经SacI-EcoRI消化的pAJ401连接，从而产生pMI508。将pMI508中的PacI-AscI片段替换为合成的1.4kb的里氏木霉egl1基因，从而产生pMI522。以PmlI和XhoI消化pMI522的1.9kb的片段，并与pRDH1076.4kb PmlI-XhoI片段连接，从而产生pMI568。以PacI和AscI消化pMI568，将 7kb的片段与pMI558的1.5kb的片段连接，从而产生pMU784，以用于表达C.lucknowense cbh2b。 [0335] 还构建了用于在酿酒酵母中表达内切葡聚糖酶的一组2-μ载体，以及作为对照的相关质粒。产生了pMU451作为对照载体，并用于克隆处于ENO1启动子和终止子控制下的纤维素酶。这是通过将PacI/AscI连接子添加至pMU451的EcoRI/XhoI位点实现的。从CodonDevices订购合成的基因，将收到的在pUC57中的基因克隆进入该载体作为PacI/AscI片段。按照这种方式产生并列举于表4中的载体是：pMU458、pMU463、pMU465、pMU469、pMU471、pMU472、pMU473、pMU475、pMU499、pMU500和pMU503。 [0336] 从pBKD_1和pBKD_2构建体产生载体，以用于将分泌形式的纤维素酶整合于酿酒酵母中的δ整合位点，或用于整合进入马克斯克鲁维酵母的基因组。通过PCR从ySFI(van Rooyen等人，J.Biotechnol.120：284-95(2005))克隆扣囊复膜酵母菌BGL1(SfBGLI)。所用的内切葡聚糖酶(TrEGI)是表1中给出的序列。通过PCR(使用PacI和AscI位点)将纤维素酶编码基因克隆进入pBKD_1和pBKD_2-以产生pBKD1-BGL1和pBKD2-sEG1。然后将来自pBKD2-sEG1的ENO1P-sEG1-ENO1T盒作为SpeI，NotI片段亚克隆进入pBKD1-BGL1，以产生pBKD1-BGL1-sEG1。 [0337] 通过以Not1切割pMU185(pUG66)并分离1190bp的含有lox PZeoR的插入子来产生pMU562，其用于将纤维素酶整合进入马克斯克鲁维酵母。将该插入子连接进入Not1消化的4.5Kb δ-整合载体以产生pMU562。通过以Asc1/Pac1切割含有里氏木霉CBH2的质粒pMU291、分离1491bp CBH2基因并将其连接进入经Asc1/Pac1切割的δ-整合载体pMU562，产生pMU576。通过以Asc1/Pac1切割来自pMU398的埃默森篮状菌CBH1、分离1380bp的CBH1基因并连接进入经Asc1/Pac1切割的δ-整合载体pMU562，产生pMU577。类似地，将一组重组纤维素酶构建体(pMU661至pMU668和pMU750、pMU755、pMU809-见表4)，包括多种内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶，引入pMU562以进行共转化。这些纤维素酶基因的合成的序列最初获自Codon Devices，然后克隆进入2μ表达载体以用于酿酒酵母。然后将它们从这些载体转移至如表X详述(包括使用的消化物)的整合载体。这些构建体一起形成了可以单独或联合被转化、然后通过活性测定法进行筛选的文库。使用在δ序列内部或外部非常靠近的地方切割的酶消化这些构建体，以进行整合。还构建了用于使用潮霉素标志物整合纤维素酶的类似的构建体(pMU721、pMU760和pMU761)。 [0338] 酵母的转化 [0339] 对于酿酒酵母中全部质粒的常规转化，使用标准的化学转化方法(Sambrook等人Molecular cloning：Alaboratory manual.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。对于一些转化，使用修改自Hill等人(Nucleic Acids Res.19：5791(1991))描述的程序的方法。 [0340] 基于Cho等人(1999)和Ausubel等人(1994)，开发了用于酵母的电转化的程序。通过以AccI消化pBD1-BGL1-sEG1来产生线性DNA片段。AccI在δ序列中具有独特位点。 通过以3M NaAc和冰冷的乙醇沉淀来纯化片段，然后以70％的乙醇洗涤，在70℃真空烤箱中干燥之后，重悬于USB dH2O(不含DNA酶和RNA酶，无菌水)。 [0341] 通过在5mL YPD培养基中生长至饱和来制备用于转化的酿酒酵母。取出4mL培养物的样品，以冷的蒸馏水洗涤2次，并重悬于640μL冷的蒸馏水中。加入80μL 100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH7.5(10X TE缓冲液-经过滤除菌的)和80μL 1M醋酸锂，pH7.5(10XLiAc-经过滤除菌的)，将细胞悬浮液在30℃温育45分钟，并轻微摇动。加入20μL 1M DTT，继续温育15分钟。然后将细胞离心，以冷的蒸馏水洗涤一次，以电穿孔缓冲液(1M山梨醇，20mM HEPES)洗涤一次，最后重悬于267μL电穿孔缓冲液中。使用相同的程序转化乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母，区别在于以0.5mL的过夜培养物接种50mL YPD，并在37℃生长4个小时，然后按照如上所述进行离心和制备。另外，在37℃进行温育和回收步骤。 [0342] 对于电穿孔，将10μg线性化的DNA(通过在凝胶上的估计进行测定)与50μL细胞悬浮液在1.5mL的无菌微量离心管中混合。然后将混合物转移至0.2cm电穿孔杯，使用Biorad Gene Pulser装置向样品施以1.4kV(200μ，25μF)的脉冲。将含有1M山梨醇的1mL YPD(调节至pH 7.0)(YPDS)置于所述电穿孔杯中，使细胞恢复～3小时。将100-200μL细胞悬浮液涂敷在含有合适的抗生素的YPDS琼脂平板上，将所述平板在30℃温育3-4天，直至出现菌落。 [0343] 酵母菌株 [0344] 使用所描述的载体和转化程序产生表6所列的酵母菌株。 [0345] 表6：酵母菌株 [0346] [0347] [0348] [0349] [0350] 以AccI消化质粒pBKD1-BGL1-sEG1(pMU276)并通过电转化方法转化进入酿酒酵母Y294，以产生具有δ整合的拷贝的SfBGLI和TrEGI的菌株，其被称作M0243。然后将游离质粒转化进入酿酒酵母Y294和/或M0243。 [0351] 为了产生自动选择性的酿酒酵母菌株，即，可以在无需选择性压力的培养基中生长以保持游离质粒的菌株，以NsiI和NcoI消化的pDF1转化菌株，并在SC-ura-leu平板上选择。这导致酿酒酵母中的FUR1基因被破坏。使用引物FUR1-left(5′-ATTTCTTCTTGAACCATGAAC-3′)和FUR1-right(5′-CTTAATCAAGACTTCTGTAGCC-3′)，通过PCR来确认FUR1的破坏，其中2568bp表示被破坏。 [0352] 按照如上所述的方法，通过以AccI消化的pBKD1-BGLI-sEGI转化M0282来产生M0282，区别之处在于将转化混合物涂覆在含有10g/L BMCC、10g/L酵母提取物和20g/L蛋白胨的平板上。 [0353] 通过菌落PCR验证克鲁维酵母株中整合基因的存在。通过以用于补偿它们的营养缺陷型的基因的PCR产物进行转化使选择的酵母菌株成为原养型的。 [0354] 用于酶测定的纤维质底物 [0355] 细菌微晶纤维素(BMCC)由CP Kelco公司惠赠。收到的BMCC是在4℃水中的搅拌的O/N。将底物重新水化之后，将其在水中洗涤6次，并重悬于水中。通过在105℃干燥样品直至获得恒定重量来测定底物的干重。 [0356] 按照生产商的提供使用Avicel PH105(FMC Biopolymers)。 [0357] 通过在160PSI使底物自动水解10分钟来产生经预处理的混合的硬木。将预处理的材料洗涤5次，以除掉抑制剂和可溶性糖，并重悬于蒸馏水中。将样品在105℃干燥过夜，以测定干重。通过定量糖化分析糖含量显示含有50％的葡聚糖。 [0358] 按照Zhang and Lynd(2006)中的描述，稍作修改，制备磷酸膨胀纤维素(PASC)。以100mL蒸馏水将Avicel PH105(10g)在4L的烧瓶中润湿。向烧瓶中缓慢加入800mL 86.2％的磷酸，先300mL，然后混合，随后加入50mL的等份。将透明溶液在4℃放置1小时以允许纤维素完全溶解，直至在反应混合物中不再有结块。接下来，以500mL的等份，加入总共2L的冰冷的蒸馏水，在每次添加之间混匀。将300mL的混合物等份在5,000rpm、2℃离心20分钟，弃上清。加入300mL冷的蒸馏水，随后，重复离心4次。向纤维素中加入4.2mL 2M碳酸钠和300mL水，然后以蒸馏水洗涤2或3次，直至最终的pH是～6。在105℃烤箱中将样品干燥至恒重，以测定干重。 [0359] 酶测定 [0360] 按照与McBride，J.E.等人(Enzyme Microb.Techol.37：93-101(2005))相似的方式测定β-葡萄糖苷酶活性，区别在于减少测定的体积并在微量滴定板中进行反应。简而言之，使酵母菌株在YPD或YPC培养基(含有或不含合适的抗生素)中生长至饱和，测定600nm处的光密度(OD(600))，取出0.5mL的培养物样品。将该样品离心，分离上清液并保存，以pH 5.0的50mM柠檬酸盐缓冲液将细胞沉淀物洗涤2次。用于上清液的反应物由下列组成：50μL样品，50μL柠檬酸盐缓冲液和50μL 20mM对-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(PNPG)底物。以经洗涤的细胞进行的反应由下列组成：25μL细胞，75μL柠檬酸盐缓冲液和50μL PNPG底物。如果活性对于标准曲线的范围而言过高，则使用较低的细胞浓度并重新进行测定。标准曲线由2倍连续稀释的硝基苯酚(PNP)标准物组成，起始于500nM，终止于7.8nM，并且包括缓冲液空白。制备上清液或细胞的合适的稀释物之后，将微量滴定板与反应底物在37℃温育10分钟。通过加入底物进行反应，温育30分钟，通过加入150μL 2M Na2CO3停止反应。然后将平板在2500rpm离心5分钟，将150μL上清液转移至另一平板。在405nm读取每个孔的吸光率。 [0361] 通过观察合成的完全培养基(如上所述，但包含20g/L葡萄糖)平板(含有0.1％羧甲基纤维素(CMC))(以刚果红(Beguin，Anal.Biochem.131：333-6(1983))染色)上的清除区来定性检测内切葡聚糖酶活性。细胞在平板上生长2-3天，以pH7.5的1M Tris-HCL缓冲液从平板上洗掉。然后将平板以0.1％刚果红溶液染色10分钟，然后以1M NaCl洗掉多余的染料。 [0362] 使用底物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷(MULac)检测CBH1活性。通过混合50μL酵母上清液与50μL 4mM MUlac底物溶液(在pH 5.5的50mM柠檬酸盐缓冲液中制备)来进行测定。使反应进行30分钟，然后以1M Na2CO3停止反应。在微量滴定板读数器中读取每个孔中的荧光(激发：355nm；发射：460nm)。 [0363] 酶活性的定量 [0364] 使用Den Haan等人，Enzyme and Microbial Technology 40：1291-1299(2007)中描述的程序测定在PASC和Avicel上的酶活性。简而言之，将酵母上清液与纤维素在4℃温育以结合纤维素酶。然后，将纤维素从酵母上清液中过滤出来，重悬于柠檬酸盐缓冲液和叠氮钠中，并在37℃温育。通过取样和进行苯酚-硫酸测定法来测定反应中糖的积累(见实施例10和表9)。 [0365] 还使用96孔板方法测定了Avicel活性水平(见实施例2)。待测菌株在35℃在96孔的深孔板中的YPD中生长，并以900RPM摇动。生长之后，将平板在4000rpm离心10分钟。向新的96孔深孔板中加入300μL底物(2％avicel，50mM醋酸钠缓冲液，0.02％叠氮钠，β-葡萄糖苷酶-1μL/mL)，不要使avicel沉降。向该底物中加入300μL酵母上清液，取出100μL作为最初的样品。将测定板在35℃温育，以800rpm摇动，在第24和48小时取样。将样品置于96孔PCR平板中，并在2000rpm旋转2分钟。然后将50μL上清液加入到之前置于单独的96孔PCR平板中的100μL DNS试剂中，混合，并在PCR仪中加热至99℃，持续5分钟，然后冷却至4℃。将50μL转移至微量滴定板中，在565nm测定吸光率。按照下式计算avicel的转化： [0366] [0367] Y-在24或48小时的时候，Avicel的转化百分率 [0368] S-DNS/葡萄糖校正斜率，对于565nm时的DNS，其等于0.1 [0369] A-T＝0时的Avicel浓度，对于1％Avicel而言，其等于10g/L [0370] 实施例1：表达异源β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶的克鲁维酵母的产生 [0371] 为了测试克鲁维酵母表达功能性异源纤维素酶的能力，以编码异源纤维素酶的载体转化了两种克鲁维酵母株：马克斯克鲁维酵母(ATCC菌株号#10606；MO157)和乳酸克鲁维酵母(ATCC菌株号#34440)。 [0372] 根据上文描述的酵母转化程序，将含有酵母δ整合序列、KanMX标志物和编码S.f.BGLI及T.r.EGI的序列的载体(pBKD-BFLI-sEG1)转化进入克鲁维酵母，并在G418上进行选择。通过PCR验证转化子，然后通过CMC测定法进行测试。结果显示于图1。异源纤维素酶活性的存在由CMC平板上的清除区指示。如图1所示，未经转化的乳酸克鲁维酵母株(菌落8)或未经转化的马克斯克鲁维酵母株(菌落16)都未显示出内切葡聚糖酶活性。然而，7个经转化的乳酸克鲁维酵母落中有6个显示出CMC酶活性，并且所有的7个经转化的马克斯克鲁维酵母落都显示出CMC酶活性。MO413和MO414被鉴定为两个显示出CMC酶活性的马克斯克鲁维酵母落。 [0373] 实施例2：表达CBH1和CBH2的克鲁维酵母的产生 [0374] 还检测了克鲁维酵母表达功能性异源纤维二糖水解酶的能力。在这些实验中，以含有里氏木霉CBH2、埃默森篮状菌CBH1或二者的构建体转化马克斯克鲁维酵母(MO157)。类似地，以含有里氏木霉CBH2、埃默森篮状菌CBH1或二者的构建体转化MO414(以S.f.BGLI和T.r.EGI转化的马克斯克鲁维酵母)。 [0375] 按照上文描述进行转化。然后按照上文描述使用底物4-甲基伞形基-β-D-乳糖苷(MU-Lac)检测CBH1活性。在每种转化子的8个菌落上进行测定，对三个显示出最高活性的菌落取平均值。结果显示于图2，其显示了以埃默森篮状菌CBH1转化的菌株具有高MU-lac活性。 [0376] 还测定了表达异源纤维二糖水解酶的克鲁维酵母株对于Avicel的活性。在一个实验中，以包含里氏木霉CBH2和埃默森篮状菌CBH1编码序列及zeocin标志物的载体转化MO413。通过这种转化产生了新的菌株MO491，并且显示出MU-乳糖苷活性。在第二个实验中，以包含里氏木霉CBH2和埃默森篮状菌CBH1编码序列及潮霉素标志物的载体转化MO413，从该转化分离出菌株MO599和MO600。按照上文描述在48小时的时候测定对于Avicel的活性，结果显示于图3，其显示：表达异源纤维素酶的克鲁维酵母在35℃具有Avicelase活性，在45℃也显示出Avicelase活性(数据未显示)。 [0377] 实施例3：表达纤维素酶文库的克鲁维酵母的产生 [0378] 还通过以纤维素酶的文库(按照上文描述产生文库)转化酵母而产生了克鲁维酵母株。例如，以含有zeocin标志物的纤维素酶的文库转化MO413，以产生新的菌株MO601-MO604和MO611-MO617。此外，以相同的文库转化MO157(马克斯克鲁维酵母)，鉴定出了新的菌株MO618-MO625。按照上文描述在48小时的时候测定对于Avicel的活性，结果如图3所示，其显示：以异源纤维素酶的文库转化的克鲁维酵母在35℃也具有Avicelase活性。以文库转化MO157显示出最高的活性。还证明了在45℃时的Avicelase活性(数据未显示)。 [0379] 实施例4：通过转化的克鲁维酵母产生乙醇 [0380] 为了测定表达异源纤维素酶的克鲁维酵母是否能从Avicel产生乙醇，在35℃在YPD(如上所述的YPD，含有20g/L葡萄糖；25mL，在250mL的摇瓶中)中以300rpm摇动培养预培养物24小时。24和48小时后，加入40g/L另外的葡萄糖。在72小时的时候，使用柠檬酸盐缓冲液将培养物的pH调节至～5.0(缓冲液的最初pH是5.5，最终浓度是50mM)，将培养物加入到含有5.5g Avicel(最终浓度10％w/v)的封闭的塑料摇瓶中。按照生产商的提供使用Avicel PH105(FMC Biopolymers)。将培养物在35℃以150rpm摇动温育。 [0381] 通过HPLC分析进行发酵样品中乙醇的定量，从所有的后续数据点中减掉瓶中最初的乙醇浓度(来自预培养物)(最初的乙醇浓度介于0至大约6g/L)。除了MO603之外，所有菌株的最初的葡萄糖浓度都是0.000g/L。对于该菌株，最初的葡萄糖浓度是0.069g/L，这将导致从最初的糖产生最大0.035g/L的乙醇。 [0382] 如图4所示的结果证明：工程化的马克斯克鲁维酵母株也能够从Avicel直接产生乙醇。未经转化的对照菌株MO157随着实验的进行显示出稳定下降的乙醇浓度。这是由于乙醇被该菌株消耗，因为在瓶中存在少量的氧。 [0383] 在以里氏木霉CBH2和埃默森篮状菌CBH1及潮霉素标志物转化的两种菌株(MO599和M600)中，有一种(MO599)显示出乙醇的产生。此外，在以里氏木霉CBH2和埃默森篮状菌CBH1及zeocin标志物转化的五种菌株中，有四种(MO601、MO602、MO604和MO491)显示出乙醇的产生。这证明工程化的耐热的马克斯克鲁维酵母能够从顽固的晶体纤维素Avicel中直接产生乙醇。 [0384] 实施例5：表达异源纤维素酶的酿酒酵母的产生 [0385] 还产生了表达异源纤维素酶的酿酒酵母并测试了它们在含有细菌微晶纤维素(BMCC)的培养基上的生长能力。在这些实验中，通过使菌株在含有空气的密封的亨氏管中的BMCC中生长来维持微有氧条件。 [0386] 以允许表达里氏木霉EGI和扣囊复膜酵母菌BGLI的构建体(pKD-BGLI-sEGI)转化表达埃默森篮状菌CBH1和里氏木霉CBH2的菌株(MO248)。将转化子铺板于BMCC固体琼脂平板，7天之后，在平板上出现了5个菌落(数据未显示)。来自这5个菌落中最大的那一个菌落的酵母被分离为菌株MO282(上文更详细地描述了MO282)。测试的3种对照菌株在相同的平板上的生长情况。一种菌株表达埃默森篮状菌CBHI和里氏木霉CBH2，两种菌株表达里氏木霉EG1和扣囊复膜酵母菌BGLI。对照酵母菌株的平板上未出现菌落(数据未显示)。 [0387] 还使用液体培养基测试了MO282在BMCC中的生长能力。图5显示：表达所有4种分泌的纤维素酶的MO282在BMCC中的生长程度远大于仅含质粒的对照(MO249)、仅表达埃默森篮状菌CBH1和里氏木霉CBH2的菌株(MO249)和表达4种附着的纤维素酶的菌株(MO144)。 [0388] 这些结果证明：异源表达分泌的埃默森篮状菌CBHI、里氏木霉CBH2、里氏木霉EGI和扣囊复膜酵母菌BGLI的酵母能够在细菌微晶纤维素中生长。 [0389] 实施例6：表达异源纤维素酶的酿酒酵母能够从Avicel和经过预处理的硬木产生乙醇。 [0390] 为了测定经转化的酿酒酵母是否能够在不外部添加纤维素酶的情况下从纤维素直接产生乙醇，使经转化的菌株以Avicel作为唯一碳源生长。按照生产商的提供使用Avicel PH105(FMC Biopolymers)。 [0391] 以用于酵母的合成的完全培养基的非葡萄糖成分制备Avicel培养基，其包括：不含氨基酸的酵母氮源-6.7g/L并补充完全的氨基酸混合物(完全补充物混合物)。在一些情况下，在生长实验中使用酵母提取物(10g/L)和蛋白胨(20g/L)(YP)作为补充物。培养条件为无氧条件，通过加入碳源后、高压灭菌之前以氮气吹扫封闭的玻璃瓶来保持无氧。通过在高压灭菌之后进行无菌过滤而加入非碳培养基成分(作为10X的溶液)。以20％的体积接种至Avicel培养物。通过HPLC分析进行发酵样品中乙醇的定量，从所有的后续数据点减掉瓶中的最初的乙醇浓度(来自预培养物)。 [0392] 如图6所示：当使用YNB培养基成分时，相对于对照菌株(M0249)，菌株M0288(表达扣囊复膜酵母菌BGLI、里氏木霉EGI、里氏木霉CBH2和埃默森篮状菌CBH1)能够从avicel PH105直接产生乙醇。 [0393] 还使用经过预处理的硬木证明了MO288从纤维素产生乙醇的能力。通过使底物在160PSI中自动水解10分钟来产生经预处理的混合硬木。将经预处理的材料洗涤5次以除掉抑制剂和可溶性糖，并重悬于蒸馏水中。将样品在105℃过夜干燥以测定干重。通过定量糖化分析糖含量显示含有50％的葡聚糖。培养基和培养条件与上文就Avicel实验所描述的相同，区别在于以10％的体积接种培养物。 [0394] 图7中显示的数据证明MO288也能够在不添加酶的情况下从经预处理的硬木产生乙醇。当使用YP作为培养基时，菌株产生的乙醇比对照多～0.5g/L，当使用YNB时，比对照多～0.2g/L。 [0395] 这些数据证明：异源表达分泌的埃默森篮状菌CBH1、里氏木霉CBH2、里氏木霉EGI和扣囊复膜酵母菌BGLI的酵母能够在不添加任何外源纤维素酶的情况下从纤维素产生乙醇。 [0396] 实施例7：经转化的酵母菌株和外部添加的纤维素酶协同作用以从经预处理的混合的硬木产生乙醇 [0397] 目前从生物质生产乙醇是通过使用SSF类型的方法来实现的，其中，向含有经预处理的纤维质生物质、酵母生长培养基和酵母的反应物中外部添加纤维素酶。为了测定表达重组纤维素酶的酵母是否能够改善这一方法，在存在多种浓度的外部添加的纤维素酶的情况下培养表达分泌的纤维素酶的重组酵母。生长和培养条件如上文的实施例中所描述。 [0398] 在这些实验中，在相同的条件下将表达四种分泌的纤维素酶的重组酵母菌株(MO288)直接与对照菌株(MO249)进行比较。以下列浓度添加外部纤维素酶：25mg纤维素酶/克纤维素(100％)、22.5mg纤维素酶/克纤维素(90％)、18.75mg纤维素酶/克纤维素(75％)或6.25mg纤维素酶/克纤维素(25％)。还在不添加任何外部纤维素酶的情况下(0％)进行了实验。使用最初固体浓度为5％的经预处理的混合硬木(按照上文实施例中的描述制备)作为纤维素源。数据显示于图8。从该数据可以清楚地看出：对于所测的每个纤维素酶载入浓度，产生纤维素酶的菌株相对于对照菌株都产生了额外的乙醇。 [0399] 为了更详细地检测该效应，使用经预处理的混合硬木在两种不同类型的培养基中评价了不同浓度的外部纤维素酶的情况下的乙醇产量。结果如图9所示。在YP培养基中，在较高的纤维素酶载量时，MO288多产生了6-9％的乙醇，在25％载量时仅多产生了1％的乙醇，在无外部纤维素酶时，产生了多100％的乙醇。在YNB培养基中，在低的纤维素酶载量时，MO288产生了多20-40％的乙醇，在较高的纤维素酶载量时产生了多～10％的乙醇。这些结果可用于确定在达到相同的总的乙醇产率的情况下，可以从该过程中减掉的纤维素酶的量。对于YP培养基而言，相对于对照，可以减少～15％的纤维素酶载量；对于YNB培养基而言，可以减少～5％的纤维素酶载量。在非零的纤维素酶载量的情况下，在YP培养基中，相对于对照而言，表达纤维素酶的菌株的乙醇生产力增加5％-20％。对于在YNB培养基中培养的菌株而言，其相对于对照增加10％-20％。 [0400] 这些数据证明：如果联合使用表达分泌的纤维素酶的菌株和外部添加的纤维素酶，可以在下列方面改善之前的SSF方法：从生物质中生产乙醇的产率和乙醇的生产力。类似地，当加入表达重组纤维素酶的菌株时，可以减少达到特定百分率的理论乙醇产率所需的纤维素酶载量。 [0401] 实施例8：经转化的酵母菌株也增加外部添加的纤维素酶从Avicel产生乙醇的效率 [0402] 为了测试在高浓度底物时是否会保持这种相同的趋势，使用15％的Avicel PH105作为底物替代5％的经预处理的混合硬木重复了这些实验。结果显示于图10和11。在相同的条件下，相对于对照酵母菌株(MO249)，产生纤维素酶的菌株(MO288)常规地从Avicel产生更多的乙醇，即使是在升高的乙醇浓度时(图10)。例如，当在SSF反应中载入25mg纤维素酶/克纤维素时，测试菌株(M0288)产生54g/L乙醇，而对照菌株(M0249)产生50g/L。 [0403] 为了检测纤维素酶置换，测定了不同的纤维素酶载量时达到的理论乙醇产率的百分数。显示于图12中的结果是以M0288和M0249一式三份进行的，从而允许计算增加的乙醇产率的标准偏差。可用于计算纤维素酶置换的数据显示于图12。图12显示了在SSF实验中，在168小时的时候，基于理论乙醇产率的纤维素酶的节省量。在压力瓶中在30ml的氮气净化的YP+15％Avicel中进行SSF。使用以5Spyzme：1 Novozyme-188比例混合的外部纤维素酶。实验持续168小时，每天取样，通过HPLC评估乙醇产量。图中的箭头指示达到与对照相同的从纤维素产生的乙醇产量所需的纤维素酶载量。对于对照而言，该载量持续较低(即，乙醇产率持续较高)。对于168小时的时候的数据，平均纤维素酶置换(需要载入的量的减少)是13.3％±4.9％。 [0404] 实施例9：使用人工Cbh1产生乙醇 [0405] 为了设计具有有效的纤维素酶活性的CBH1蛋白，比对了来自NCBI数据库的17种CBH1蛋白序列(表7)。 [0406] 表7：用于比对的真菌CBH1基因 [0407]生物 Genbank# 费希新萨托菌 XM_001258277 玉米赤霉(Gibberella zeae) AY196784 微紫青霉菌(Penicillium janthinellum) X59054 血红丛赤壳(Nectria haematococca) AY502070 梨孢镰刀菌(Fusarium poae) AY706934 嗜热毛壳菌 AY861347 土曲霉 XM_001214180 产黄青霉(Penicillium chrysogenum) AY790330 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa) X77778 色木霉(Trichoderma viride) AY368686 灰腐质霉 X17258 嗜热子囊菌 AF421954 埃默森篮状菌 AAL89553 里氏木霉 P62694 白腐菌(Phanerochaete chrysosporium) Z29653 黑曲霉 XM_001391971 黑曲霉 XM_001389539 [0408] [0409] 将人工蛋白序列设计为这些蛋白的共有(最常见)序列。将预测的信号序列替换为酿酒酵母α交配因子前信号序列，以下显示了CBH1蛋白的共有序列。大写字母表示酿酒酵母α交配因子前信号序列。 [0410] MRFPSIFTAVLFAASSALAqqagtltaethpsltwqkctsggscttvngsvvidanwrwvhatsgstncytgntwdttlcpddvtcaqncaldgadysstygvttsgnslrlnfvtqgsqknvgsrlylmeddttyqmfkllgqeftfdvdvsnlpcglngalyfvamdadggmskypgnkagakygtgycdsqcprdlkfingqanvegwepssndanagignhgsccaemdiweansistaftphpcdtigqtmcegdscggtyssdryggtcdpdgcdfnpyrmgnktfygpgktvdttkkvtvvtqfitgssgtlseikrfyvqngkvipnsestisgvsgnsittdfctaqktafgdtddfakkgglegmgkalaqgmvlvmslwddhaanmlwldstyptdatsstpgaargscdtssgvpadveanspnsyvtfsnikfgpigstftg(SE Q ID NO：43)。 [0411] 产生了用于表达CBH1共有序列的酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的密码子优化序列(SEQ ID NO：44)，如下所示。 [0412] atgagatttccttcaatcttcactgctgttttgttcgcagcctcaagtgctttagcacaacaggccggaacattgacagcagaaactcatccttccttaacctggcaaaagtgcacttctggaggttcatgcactacagtgaatggatctgtcgtgatcgatgcaaactggagatgggttcacgcaacttcaggttctaccaactgttataccggaaacacttgggacaccacattgtgcccagatgacgtcacgtgcgctcagaactgtgctttggatggagctgattacagttcaacctatggtgtaactacatccggaaactctttgagattaaacttcgttactcaaggaagtcaaaagaacgttggttctagattgtacttaatggaggacgatacaacctatcaaatgttcaaattgttaggtcaggagttcacctttgacgtagatgtcagtaacttgccatgtgggttaaacggagctttatactttgtggcaatggatgctgacggtggaatgtccaagtatccaggaaacaaagccggtgcaaagtacggtacaggatattgtgattcacagtgccctagagatttgaagttcattaacggtcaagcaaatgtggagggttgggaaccatctagtaacgatgccaatgcgggtattggtaatcatgggtcctgttgcgctgagatggatatctgggaggccaactcaatatctactgcctttacccctcacccatgcgatacaattggtcaaactatgtgcgagggtgattcatgtggtggaacctactcctctgatagatacggaggtacatgcgatccagatggttgcgactttaatccatacagaatgggaaacaaaaccttttacggtcctggaaagacagttgatactaccaagaaagtaacagtcgtgacccagtttatcaccggtagttctggaaccttatccgaaatcaaaagattctacgttcagaacggtaaagtaattccaaacagtgaatctacaatttcaggagtgagtggtaattctattactaccgacttttgtacagctcagaaaacagcatttggtgacaccgatgactttgctaagaagggtggattagaaggtatgggtaaagctttggcccagggaatggtgttagttatgtctttatgggatgatcacgccgcaaatatgttatggttggattcaacatatccaactgatgccacaagtagtacacctggagctgccagaggttcttgtgatacatcttccggtgttccagccgatgtagaagcaaattctcctaactcctatgttaccttctccaatataaagtttggtccaatcggttcaacattcactggttaa(SE Q ID NO：44) [0413] 将密码子优化的序列插入至游离的酵母表达载体(pMU451)，处于ENO1启动子和终止子控制下，插入至PacI/AscI位点。将得到的表达构建体(pMU505)转化进入MO375宿主菌株，该宿主菌株衍生自Y294(MO013)，其中通过以酿酒酵母His3和Trp1PCR产物进行转化而挽救His3和Trp1营养缺陷型。得到的表达CBH1共有序列的菌株被称作MO429。 [0414] 为了测定MO429是否具有纤维素酶活性，按照上文描述进行了Avicel转化测验，在24小时的时候进行测定。如图14所示：相对于以空载体转化的阴性对照(MO419)，表达共有的Cbh1序列的酿酒酵母(MO429)显示出纤维素酶活性。另外，将MO429的纤维素酶活性与表达其它异源纤维素酶的酵母菌株进行比较。所测的菌株总结于下表8中。 [0415] 表8：Avicel转化测验中使用的分解纤维素的菌株 [0416] [0417] 表8中的所有菌株都衍生自相同的亲代MO375菌株，并以游离的酵母载体转化。使用含有表中所列的异源纤维素酶基因(针对在酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母中的表达进行了密码子优化)的游离的酵母载体产生了MO420、MO429、MO445、MO456、MO457和MO458。 MO429、MO445、MO456、MO457和MO458中的纤维素酶的表达处于酿酒酵母ENO1启动子和终止子控制下。埃默森篮状菌CBH1与其自身的天然信号序列一起表达。如图14所示，共有的CBH1对于Avicel的分泌的活性与在相同载体和相同宿主菌株中表达的其它的真菌CBH1的活性是相当的。 [0418] 实施例10：酿酒酵母中的纤维素酶的活性比较 [0419] 以编码多种不同的异源纤维二糖水解酶的多核苷酸转化酿酒酵母，并按照上文描述测定它们在PASC和Avicel上的活性。结果显示于下表： [0420] 表9：酿酒酵母中的纤维二糖水解酶活性 [0421] [0422] 另外，使用96孔板测验法测定了在Avicel上的活性，结果显示于图14。在图中，对于每种菌株，第一个条柱代表在24小时的时候释放的糖，第二个条柱代表在48小时的时候释放的糖。单独或与里氏木霉CBH2一起表达的CBH1显示出一些avicel活性-在48小时的时候达到了10％的avicel转化。CBH1与来自C.lucknowense的CBH2的组合并联合埃默森篮状菌CBH1(其中附着CBD)在48小时的时候达到了高得多的avicel转化：大约22％的转化。 [0423] 在酿酒酵母中测定的内切葡聚糖酶的avicel活性数据显示于图15。数据证明：当在酿酒酵母中表达时，在所测的EG中，台湾家白蚁EG显示出最高的avicel活性。 [0424] 实施例11：表达不同的异源纤维素酶的酵母菌株的共培养物从Avicel产生乙醇[0425] 在YNB培养基中，多种产生纤维素酶的酵母菌株的共培养物也显示出从Avicel PH105产生乙醇的能力(图16)。在该实验中，将下列五种菌株以等体积的比例混合：单独产生埃默森篮状菌CBH1(M0247)、嗜热子囊菌CBH1(M0266)、灰腐质霉CBH1(M0265)、埃默森篮状菌CBH1和里氏木霉CBH2的组合(M0248)、里氏木霉EGI和扣囊复膜酵母菌BGLI的组合(M0244)；然后以20％的体积接种。这些菌株中的每一种菌株中的每种异源表达的纤维素酶都被分泌。培养基和培养条件如上文对于Avicel实验所描述。图16中的证据证明：异源纤维素酶无需在单一的酵母菌株中被表达以从纤维素产生乙醇。相反，可以一起培养表达不同的分泌的异源纤维素酶的酵母菌株以从纤维素产生乙醇，而无需添加任何外源纤维素酶。 [0426] 还评估了使用不同组合的纤维素酶的共培养物。在该共培养物实验中，一起培养了下列四种酵母菌株：M0566(删除了FUR的M0424)：分泌的SfBGLI；M0592(删除了FUR的M0449)：分泌的CfEGI；M0563(与Y294/pMI574fur1Δ相同)：分泌的Cl CBH2b；和M0567(与Y294/pMI529fur1Δ相同)：分泌的TeCBH1+CBD。这些菌株在液体YPD中生长3天，直至培养物对于预培养物而言达到饱和。此时，将它们用于接种实验，其中avicel(10％)用作底物，在接种前将4种菌株以等体积混合。 [0427] 图17证明：共培养的菌株能够在不存在任何添加的纤维素酶的情况下直接从avicel产生乙醇。在168小时后，相对于对照菌株，共培养物产生大约多4倍的乙醇，相对于M0288大约多3倍。 [0428] 还将该共培养物用于SSF实验中，其中以5种不同的载量(10mg蛋白/g avicel、7.5mg/g、5mg/g、2.5mg/g和0mg/g)使用Zoomerase纤维素酶混合物，以10％的体积接种菌株。 [0429] 图18显示了在不同的纤维素酶载量时，由共培养物、M0288和M0249产生的乙醇产量的原始数据。图18A显示：在所测的所有的纤维素酶载量时，共培养的菌株产生的乙醇显著多于不产生纤维素酶的对照。图18B显示：在所测的所有的纤维素酶载量，共培养物产生的乙醇多于之前测试的菌株M0288。图19显示了，使用多种纤维素酶载量，在168小时的SSF后，使用这些培养物中的每一种能够达到的理论乙醇产率的百分数。数据证明：相对于对照菌株，共培养的菌株的纤维素酶能够达到减少至大约1/2，相对于M0288，能够减少大约35％。 [0430] 这些数据证明：这种共培养物中的纤维素酶的组合高效地产生乙醇。 [0431] 实施例12：健壮的利用木糖的菌株的构建 [0432] M0509(ATCC保藏号________，保藏日2009年11月23日)是酿酒酵母菌株，其组合了代谢木糖的能力和在存在经预处理的硬木的抑制剂的情况下发酵糖类所需的鲁棒性(robustness)。M0509是通过三步过程构建的。第一，对酿酒酵母的工业菌株进行基准检查以鉴定具有足以进行经预处理的混合的硬木底物的同时糖化和发酵(SSF)的鲁棒性/顽强性水平的的菌株。菌株M0086满足了第一个要求，其是酿酒酵母菌株的二倍体菌株。第二，就利用木糖的能力对M0086进行遗传工程化，从而产生菌株M0407。第三，使M0407在含有木糖培养基(含有预处理抑制剂)的恒化器中适应数周，从而产生菌株M0509。 [0433] 从菌株M0086经过遗传工程化而产生利用木糖的菌株M0407。这种工程化需要7个遗传修饰。主要的修饰是异源木糖异构酶基因XylA的功能性表达，该基因分离自厌氧真菌Piromyces属E2。还过表达了编码参与木酮糖向糖分解性中间体的转化的所有五种酶的酿酒酵母结构基因：木酮糖激酶、核糖5-磷酸异构酶、核糖5-磷酸差向异构酶、转酮醇酶和转醛醇酶。此外，删除了编码醛糖还原酶的GRE3基因，以使木糖醇的产生最小化。所修饰的7个基因列举于图39中。将GRE3，RKI1，RPE1，TAL1和TKL1基因座的遗传修饰设计为留下最简载体DNA并且无抗生素标志物。对每个基因座的DNA进行测序以确认所预期的结果。将7个遗传修饰中的每一个依次导入菌株M0086。图40显示了从头到底的修饰的进程，以及该过程中每个步骤的菌株的名称，起始于M0086，终止于M0407。 [0434] GRE3的删除和RKI1，RPE1，TAL1及TKL1的增加的表达涉及内源性酿酒酵母基因座的修饰。在GRE3的情况下，两个等位基因都被删除。对于其它4个基因座，仅修饰单独一个等位基因。内源性基因座的所有修饰都需要使用可选择的抗生素标志物，包括来自大肠杆菌转位子Tn903的kanr(赋予对G418的抗性)、来自诺尔斯氏链霉菌(Streptomyces noursei)的nat1(赋予对clonNAT/诺尔斯菌素的抗性)和来自大肠杆菌的dsdA(赋予对D-丝氨酸的抗性)。就需要的基因组修饰进行选择之后，使用loxP/cre重组酶系统从基因组中切除抗生素标志物。质粒pMU210携带cre重组酶，该质粒中包含zeocin抗性标志物。在合适的选择性培养基上测定pMU210的丧失以及所有的抗生素标志物。随后的PCR基因分型和DNA测序确认了从经修饰的基因组基因座除掉了抗生素标志物。 [0435] RKI1，RPE1，TAL1和TKL1的过表达是这样实现的：将酿酒酵母丙糖磷酸异构酶启动子TPI置于紧接这4个ORF中的每一个的5’。对于TAL1和RKI1，删除它们的内源性启动子的一小部分。为了避免破坏邻近的ORF和可能的转录调节元件，将TPI启动子导入RPE1和TKL1基因座，使得RPE1和TKL1基因座均为两个拷贝，二个基因座的两个拷贝都被TPI启动子调节。 [0436] 为了增强M0407的木糖利用并增加其对预处理抑制剂的耐受，将该菌株在表10所述的有序条件下在恒化器中保持4周。 [0437] 表10：用于改良M0407的条件 [0438] [0439] 将经适应的恒化器培养物的等份铺板于YPXi50％，在YPDXi培养基(100g/L葡萄糖，50g/L木糖，25％MS149pressate)上筛选出9个M0407的“适应的”菌落。M0407和M0228(在Mascoma上产生的利用木糖的菌株，在质粒上含有XlyA和XKS1)作为对照。24小时的时候，葡萄糖已经被所有的菌株完全消耗掉。M0407和M0228分别利用了30和25g/L的木糖。所有的9个M0407“适应的”菌落都利用了44g/L以上的木糖。木糖消耗的最大量是48g/L。该菌株被称作M0509。 [0440] 使用18S rDNA测序来确认菌株M0509是酿酒酵母(KurtzmanCP和Robnett，CJ；FEMS Yeast Research 3(2003)417-432)。从M0509基因组DNA扩增跨越18S rDNA的1774bp的片段，并送去测序。1753bp的M050918S rDNA序列显示与NCBI中的酿酒酵母18S序列(核苷酸登记号Z75578)100％的匹配。 [0441] 由于M0509是通过在恒化器中培养M0407菌株4周而获得的，所以，区分这两种菌株的培养时长提供了测定工程化的遗传修饰的稳定性的方法。比较了M0407和M0509在GRE3，RKI1，RPE1，TAL1和TKL1基因座的DNA序列进行比较，没有显示出变化。这说明在这些基因座上的遗传修饰在遗传上是稳定的，至少在所用的生长条件下是稳定的。 [0442] 使用实时PCR分析来估计XylA/XKS1载体的整合的拷贝数。M0407具有大约10个拷贝的载体，而M0509具有大约20个拷贝。这说明可以通过延长在木糖培养基上的培养时间来增加XylA/XKS1载体的拷贝数。 [0443] 为了进一步测定XylA/XKS1整合的稳定性，将M0509在以葡萄糖或木糖作为唯一碳源的液体培养基中培养～50代。50代之后，从每个培养物分离单个的菌落，定量测定XylA/XKS1整合的数目并与原始的M0509冷冻贮液比较。分离自木糖-培养物的菌落具有～20个拷贝的XylA/XKS1，与冷冻贮液相同。葡萄糖-培养的菌落显示出稍微减少的拷贝数，其是～16个。 [0444] 葡萄糖-菌落的XylA/XKS1拷贝数的稍微减少提出了关于菌株的性能的问题。为了部分地解决这个问题，比较了木糖-分离体、葡萄糖-分离体和冷冻贮液的木糖消耗。冷冻贮液和木糖-繁殖的分离体在24小时内利用了所有的木糖，并产生了相同数量的乙醇，但是葡萄糖-繁殖的菌株仅消耗了一半的木糖。见图20。 [0445] 实施例13：耐热的、健壮的利用木糖的菌株的选择 [0446] M1105能够在存在8g/L乙酸盐的情况下在40℃以上的温度进行发酵。以M0509为背景构建了M1105，因此，其是能够将葡萄糖和木糖转化为乙醇的工业上的健壮菌株。 [0447] 按照图41和下文描述在细胞恒稳器中经过4轮选择/适应而分离了M1105。在实验过程中，温度从38℃升高至41℃。M1017(ATCC保藏号_______，保藏日2009年11月23日)分离自第一个细胞恒稳器运行，随后通过GRE3基因座的PCR而确认是M0509的后代。M1017用于在41℃接种第二个细胞恒稳器运行，使用的是YMX培养基(酵母氮源，2g/L木糖)。M1046分离自所述第二个细胞恒稳器运行。在42℃，在YPX50上，M1046生长缓慢，但其加倍时间仍比M1017短36％。M1080分离自在40℃以M1046和YMX培养基接种的-1 细胞恒稳器。M1080在40℃在YMX上的比生长速率是0.22h 。M1105分离自M1080：基于在细胞恒稳器中的选择，使用的是YPD2X10+乙酸盐培养基(2g/L葡萄糖，10g/L木糖，8g/L乙酸盐，pH 5.4)，温度为39℃。 [0448] 在35℃，在富集培养基中，M1105的生长比M0509快10％-20％。此外，M1105具有增加的乙酸盐耐受，因为该菌株在存在乙酸盐的情况下的生长比其祖先菌株快得多。见图21。虽然在高温时，亲代菌株需要葡萄糖以耐受乙酸盐，但是M1105不需要葡萄糖或复合培养基成分以在存在7g/L乙酸盐的情况下在pH 5.4时生长。 [0449] 为了测试发酵性能，在40℃，使用3.8mg Zoomerase/克原料，以大约0.7g/L DCW将M1105接种于18％MS419。在168小时的时候，M1105产生3.55％(w/v)的乙醇。图22显示了时间进程以及以M1088(见下文描述)进行的类似的运行，以作为比较。以仅使用0.15g/L DCW的接种进行的类似运行产生了2.9％(w/v)的乙醇，并且在实验过程中产生了一些糖的积累。见图23。 [0450] 实施例14：耐热的、健壮的利用木糖的菌株的适应 [0451] M1254能够在存在12g/L乙酸盐的情况下在40℃以上的温度进行发酵，显示出比耐热菌株M1105增加的鲁棒性。 [0452] 按照表11和图42以及如下所述在细胞恒稳器中经过三轮的选择/适应而分离了M1254。第一个细胞恒稳器运行是以M1105进行接种。使用YMX培养基(不含氨基酸的酵母氮源，20g/L木糖)加8g/L乙酸盐，pH为5.5，温度为40℃。从所述第一个细胞恒稳器运行中分离M1155，并用于接种第二个细胞恒稳器，其含有YPD培养基(酵母提取物，蛋白胨，20g/L葡萄糖)加12g/L乙酸盐，pH为5.4，温度为41℃。从所述第二个细胞恒稳器运行中分离M1202。M1254分离自第三个细胞恒稳器运行，第三个细胞恒稳器运行是：以M1155和M1202在不含氨基酸的酵母氮源+5％固体当量的MS419水解物培养基中接种，pH为4.8，温度为39℃。 [0453] 表11：用于从M1105产生M1254的进化条件 [0454] [0455] 在5％固体当量的MS419水解物(其是选择菌株M1254所用的条件)中，M1254的生长比M1202快7.3±0.9％，比M1155快17±2.0％。然而，标准的发酵培养基限制了发酵性能。因此，该菌株应该与较低的铵浓度一起使用，例如1.1g/L磷酸二铵(DAP)或低于3g/L的DAP。图24显示了使用较低的DAP浓度时的较高的发酵速率。使用18％MS149，4mg外部纤维素酶/克TS，40℃，0.5g/L接种DCW M1254和pH 5.4进行发酵。使用5M的氢氧化钾控制pH，在每次固体进料时添加1g/L碳酸镁。所有的酶都是先加入，在5个时间点(0、3、6、24和48小时)加入固体，并等量进料3.6％TS。 [0456] 使用下表12描述的进化条件从M1254产生MO1360。 [0457] 表12：从M1254产生M1360的条件 [0458] [0459] 虽然M1360仍然实质上被合成的抑制剂混合物抑制，但是在40℃以大约5小时的加倍时间生长。见图25。在工业相关的培养基中，在40℃，从仅60mg/L干细胞重起始，在48小时内，M1360能够从葡萄糖产生超过60g/L的乙醇，以及5g/L干细胞重。见图26。 [0460] 已知的是：随着温度的升高，酶的活性增加，因此，需要耐热的酿酒酵母菌株。图27显示了3个等同的SSF，其中载入了18％PHW固体。当在相同的外部酶载量(4mg/g)进行两个反应时，相对于在35℃进行的对照反应，在40℃进行的反应产生的乙醇大约多17％。 这种增强的性能表示该过程中成本的实质性节省。 [0461] 实施例15：纤维素酶在健壮的利用木糖的菌株中的表达 [0462] M1088能够分泌三种不同的分解纤维素的酶：来自扣囊复膜酵母菌的β-葡萄糖苷酶(SfBGL)，来自C.lucknowense的纤维二糖水解酶2b(ClCBH2b)，和与里氏木霉纤维二糖水解酶I纤维素结合结构域融合的来自埃默森篮状菌的纤维二糖水解酶I(TeCBH1+CBDTrCBH1)。M1088基因组还含有编码能够提供对下列抗生素抗性的多肽的基因：卡那霉素、诺尔斯菌素和潮霉素B。质粒pMU624也存在于M1088中，该质粒含有编码能够提供对氨比西林抗性的多肽的基因。用于从M0509产生M1088和M0963的步骤总结于下表13中。 [0463] 表13：用于产生菌株M1088和M0963的菌株 [0464] [0465] [0466] [0467] 实施例16：选择在健壮的利用木糖的菌株中表达的内切葡聚糖酶 [0468] 内切葡聚糖酶加强纤维二糖水解酶的活性，因此，研究了家族5的内切葡聚糖酶补充之前鉴定的CBH1和CBH2的能力。选择了5种家族5的内切葡聚糖酶，并使用表14所示的pRDH122表达质粒进行克隆，使其处于ENO1启动子/终止子控制下。 [0469] 表14：酿酒酵母中表达的家族5的内切葡聚糖酶 [0470] [0471] 将所有的表达5种新的EG2型纤维素酶的质粒转化进入Y294(实验室菌株)和M0749(如上所述的健壮的利用木糖的菌株)，通过PCR确认转化子。图28显示：将数个-URAM0749菌株点染于含有0.2％的CMC或地衣淀粉或大麦-β-葡聚糖的SC 平板上。从图 28可以看出，M0749参考菌株在含有CMC的平板上产生了小的区域。基于pMU471(台湾家白蚁EG)和pRDH147的菌株在所测的所有底物上都产生了非常好的清除区。 [0472] 与参考菌株和表达台湾家白蚁EG(pMU471)的菌株一起，测试了5种表达eg2的菌株水解avicel和PASC的能力，测试了表达cbh2的菌株对于avicel的活性。菌株生长于-URA双倍强度的SC 培养基中(3.4g/L YNB；3g/L氨基酸dropout库，不含尿嘧啶；10g/L硫酸铵；20g/L葡萄糖)，缓冲至pH 6(20g/L琥珀酸；12g/L NaOH，以NaOH将pH设定为6)。 10mL培养物在125mL的Erlenmeyer瓶中在30℃生长三天。每种菌株接种三个瓶。接种之后，取出样品进行凝胶分析和活性测定。样品离心之后，每种取出12μl，加入到5μl的蛋白装载缓冲液中，并煮沸5分钟。然后将样品载入10％的SDS-PAGE中并分离，然后进行银染。结果显示于图29。不是所有的菌株都产生了预期大小的可见的带。C.f.EG呈现为大约 55kDa的带(如以前所见到的)，但是由M0749产生的带似乎比Y294产生的带稍大。对于甜菜胞囊线虫eng1、Orpinomyces属celB或白囊耙齿菌en1产物，没有可见的带。由Y294和M0749产生的红褐肉座菌EG2呈现为～57kDa的可见的带。与预测的44kDa的大小相比，分子量的增加可能表示高度糖基化。由Y294产生的白曲霉EGA呈现为～42kDa的可见的带。然而，由M0749产生的白曲霉EGA清楚地显示为～120kDa的可见的带。额外的分子量可能表示高度糖基化。 [0473] 使用所描述的高通量avicel转化方法测试了所有的菌株的活性。还测试了表达内切葡聚糖酶的菌株对于PASC的活性。用于测定程序的DNS含有苯酚，根据文献，这会赋予更高的灵敏性。活性数据可以见图30。 [0474] 表达H.j.eg2(pRDH147)的M0749菌株产生了最高水平的分泌的活性，如通过测定EG2在PASC或avicel上的活性所测得。该酶在PASC和avicel上的活性比C.f.EG(pMU471)高。合成的A.k.EGA(pRDH145)也产生了对这两种底物的可见活性。该产物在M0749中的产量似乎比在Y294中要高，并且，当在该菌株中产生时，其在avicel和PASC上的活性比C.f.EG要高。 [0475] 实施例17：内切葡聚糖酶在健壮的利用木糖的菌株中的表达 [0476] 产生了数种菌株以测试在健壮的利用木糖的菌株背景中共表达TrEG2和CBH的影响。以构建体转化M1088以将TrEG2整合于rDNA基因座，其中使用Sh-ble基因作为标志物(pMU1409)。进行了类似的转化，区别在于整合TeCBH1w/TrCBD，以增加该基因的拷贝数。来自这两个转化的43个转化子以及一式两份M1088培养物生长于含有20ug/mL zeocin的YPD中，进行avicel测定。图31显示了这些测定的结果。数据显示：有相当大比例的以TrEG2构建体转化的菌株具有显著增加的avicel转化能力，而具有额外的TeCBH1w/TrCBD拷贝的转化子仅具有少量的avicel水解的改善。 [0477] 在所测定的菌株中，选择了最好的9个候选物，并重新划线培养以产生单一菌落。然后使这些单一的菌落生长于YPD中，转移2次，总共产生18代。将最后的转移(传代数据见图32)与第一个YPD培养物(最初的数据见图32)进行比较。数据证实：当过表达TrEG2时，酵母上清液转化avicel的能力升高了～50％。 [0478] 此外，在M1254背景下产生了菌株M1403，其含有编码扣囊复膜酵母菌(SfBGL)、来自C.lucknowense的纤维二糖水解酶2b(ClCBH2b)、与里氏木霉纤维二糖水解酶I纤维素结合结构域融合的来自埃默森篮状菌纤维二糖水解酶I(TeCBH1+CBDTrCBH1)和甜菜胞囊线虫eng1的异源基因。在M0509的背景下产生了菌株M1284，其含有编码这四种纤维素酶的异源基因。在表15中更详细地描述了菌株M1284和M1403。 [0479] 表15：表达内切葡聚糖酶的酵母菌株 [0480] [0481] [0482] [0483] 实施例18：通过CBP酵母菌株转化木质纤维素底物 [0484] 纤维素酶在酵母中的表达，尤其是CBH1(附着里氏木霉CBD的埃默森篮状菌CBH1)，CBH2(C.lucknowense CBH2b)，EG2(里氏木霉EG2)和BGL(扣囊复膜酵母菌BGL)显著减少在将木质纤维素酶促地转化为乙醇过程中所需要的外部添加的酶。为了测试过表达这些酶的效应，构建了数种菌株并在多种底物上进行了测试。 [0485] 图33显示了通过工程化的耐热的酿酒酵母宿主菌株(亲代菌株M1254，分解纤维素的衍生物M1403)进行的造纸淤泥的CBP发酵的数据。单独M1254的数据证明：从造纸淤泥产生乙醇需要添加纤维素酶(即zoomerase)。M1430的数据(其中未添加外部的纤维素酶)(实心的橙色方框)证明：该菌株能够通过其表达的纤维素酶转化“可转化的”的底物中的实质部分(～80％)。通过向M1403菌株中添加另外的外部纤维素酶进行的发酵证明了从造纸淤泥底物进行酶促转化的最终潜在可能。目测证实非-CBP菌株不能使底物液化，而CBP菌株可以。 [0486] 此外，表达CBH1、CBH2、EG2和BGL的CBP菌株M1179能够在很大程度上转化造纸淤泥，而无需添加纤维素酶。见图34。该反应中的对照菌株M0509在该反应中仅产生了少量的乙醇。数据还显示：与其它反应中使用的较高的细胞密度(10g/L)相反，当以较低的细胞密度(1g/L)载入时，M1179能够转化该物质。这暗示了该菌株能够通过发酵实验生长并产生纤维素酶。 [0487] 经预处理的硬木(PHW)也可以被CBP菌株转化。图35显示了在PHW的发酵过程中，相对于不表达纤维素酶的对照菌株(M0509)，使用表达纤维素酶的菌株(M0963)的效应。该比较证明：当仅载入2mg/g的外部酶时，CBP菌株可以从PHW产生与在该过程中载入4mg/gM0509时相等的乙醇的量。所需的外部酶减少了50％，这表示在该过程中巨大的潜在的成本降低。 [0488] CBP菌株还能够从PHW产生高乙醇效价。图36显示：以最小的外部酶载量4mg/g和相对低的细胞接种(2g/L)，30％经洗涤的固体发酵能够产生多达大约70g/L的乙醇效价。低细胞密度培养最终赶上并超过高细胞密度培养物的能力表明在整个发酵过程中该菌株生长并持续产生酶。 [0489] 除了PHW之外，玉米秸秆也被认为是通过酶促糖化被转化为乙醇的良好底物。图37证明：经预处理的玉米秸秆也能够被CBP酵母菌株良好地转化。在该实验中，CBP菌株能够转化大约82％的高载量酶(15FPU或大约20mg/g)能够实现的转化量。非-CBP菌株产生的乙醇是CBP菌株能够产生的乙醇的大约60％。 [0490] 实施例19：CBH1纤维素酶的比较 [0491] 为了提供关于不同的CBH1酶的表达水平的另外的数据，使选择的菌株生长于YPD培养基中，并测定在MULac和Avicel上的活性。研究了Y294和M0749转化子，结果显示于图38。 [0492] ＊ ＊ ＊ [0493] 这些实施例诠释了本发明的可能的实施方式。虽然已经特别显示了本发明并通过参考它的一些实施方式而描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，这仅是通过举例的方式来呈现，而非限制，可以不脱离本发明的精神和范围对其进行多种形式和细节上的改变。因此，本发明的宽度和范围不应被任何上述的示例性实施方式所限制，而应该仅由随附的权利要求及其等同物来确定。 [0494] 本文引用的所有文献，包括杂志的论文或摘要，公开的或相应的美国或外国专利申请，授权的或外国专利，或任何其它文献，每篇皆通过引用方式全文并入本文，包括所引用的文献中记载的所有数据、表格、图和文字。 |
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