一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物、制备方法及其应用 |
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| 申请号 | CN201510807932.1 | 申请日 | 2015-11-19 | 公开(公告)号 | CN105348337A | 公开(公告)日 | 2016-02-24 |
| 申请人 | 南京诺云生物科技有限公司; | 发明人 | 朱惠霖; 丁雪峰; 张永正; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种甜菊苷 生物 转化制备的 甜菊糖 衍生物、制备方法及其应用，属于食品化工领域。该方法以甜菊苷为底物，使所述底物在 葡萄糖 基供体存在下，利用UDP-葡萄糖基转移酶，在适当的 温度 、pH、盐浓度、底物浓度等条件下，通过酶催化得到了全新结构的甜菊糖衍生物NY101。本发明提供的甜菊苷生物转化制备甜菊糖衍生物NY101的方法，操作简便，成本低，转化效率高，可达>90％；提纯容易且纯度高，可达>95％，可用于食品与饮料业，具有巨大的潜在应用价值。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物，其特征在于:结构式如下： |
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| 说明书全文 | 一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物、制备方法及其应用 技术领域[0001] 本发明涉及一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物、制备方法及其应用，属于食品化工技术领域。 背景技术[0002] 甜菊糖是从菊科草本植物甜叶菊的叶、茎中提取出的一种新型天然甜味剂，是一种天然、绿色、保健的功能食品，它有着芬芳、清凉的味道，还具有甜度高、热能低的特点，其甜度是蔗糖的200-300倍，而热值仅为蔗糖额1/300，是一种可替代蔗糖非常理想的甜味剂。随着人类对健康、绿色的重视，甜菊糖被食品科学家称为是未来世界最具发展前景的甜味剂。 [0003] 甜菊糖被国际医学界认为是人类良好的营养补充剂和保健药品。经大量科学实验证明，甜菊糖有利于调节血糖和血压，经常食用可调节血糖水平，预防高血压，改善低血压症状；甜菊糖还具有抑制某些细菌生长和繁殖及阻止其感染的作用，能够治疗感冒和流感及预防龋齿等病症；甜菊糖能够降低人对糖和脂肪的需求，调节其日常饮食，降低人们对烟酒的需求，防止了糖尿病、肥胖症、心脏病等疾病的发生；同时，甜菊糖还具有对皮肤修复和改良作用，它能治疗皮肤疾病，消除皱纹，去除疤痕等。 [0004] 甜菊糖可广泛应用于食品、饮料、调味料、医药、日用化工、酿酒、化妆品等行业，较使用蔗糖可节省成本约60％，且营养价值高。甜菊糖的稳定性、代谢途径及其安全性已被深入研究，它已经我国卫生部、轻工业部批准使用，且亦被美国食品药品监督管理局认可为“GRAS(一般认为是安全的)”的级别。甜菊糖作为蔗糖的天然替代品，其应用前景广阔。 [0005] 甜菊糖虽有着众多优势，但是其严重的苦涩后味，却阻碍了其的广泛应用。目前，甜菊糖口感的改善可通过酶法生物转化来实现。已有报道，可以利用环糊精糖基转移酶改性甜菊糖，以改善其口感和味质，但是该酶转移糖基的位置不专一，产物不纯，且其甜度也严重降低。 [0006] 甜菊双苷向甜菊苷和莱鲍迪苷B的转化以及甜菊苷转化为莱鲍迪苷A和D的反应等。这些研究相对于甜菊糖的众多组分而言，仍微乎其微，而且其改性后的口感和味质也是一项庞大的研究。寻求高效的生物转化酶，转化工艺以及新型甜菊糖衍生物仍是甜菊糖未来的研究趋势。 发明内容[0007] 本发明解决的技术问题是：提出一种以甜菊苷为原料，通过酶法转化生产甜菊糖衍生物，从而改善其口感，可以较低的成本和较短的生产周期产出优质的甜菊苷生物转化制备的甜菊 糖衍生物、制备方法及其应用。 [0008] 为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物，结构式如下： [0009] [0010] 本发明提出的另一技术方案是：一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物的制备方法：以甜菊苷为底物，使所述底物在葡萄糖基供体存在下，在UDP-葡萄糖基转移酶(尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶)的催化作用下反应生成甜菊糖衍生物。 [0011] 优选的，所述的葡萄糖基供体为UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生循环体系。 [0013] 优选的，UDP-葡萄糖的用量为0.0135～5.41g/L；蔗糖的用量为34.23～68.46g/L；蔗糖合成酶的用量按湿菌体计为18.92～94.59g/L， [0015] 优选的，所述反应在MgCl2浓度为0～0.286g/L，温度为20～37℃，pH5.0～9.0的水相体系中进行，反应时间为0.5～72h。 [0016] 优选的，所述反应在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中进行。 [0017] 优选的，所述反应的糖基转移酶的添加量为18.92～227.03g/L，底物起始浓度为0.676～54.05g/L，辅酶的添加量为0.0135～5.41g/L。 [0019] 本发明的有益效果： [0020] (1)所述的葡萄糖基供体可以为UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生循环系统。其中，优选由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生循环系统，UDP-葡萄糖价格昂贵，采用UDP-葡萄糖再生循环系统可以大幅度的降低生产成本。 [0021] (2)将反应所用的全部原料加入到反应液中，混匀后，置于设定的参数下，摇床震荡反应，反应结束时其产物转化效率可达90％以上。通过对反应液分离提纯处理即可获取达到要求的甜菊糖衍生物NY101产品。一个具体的分离提纯方法是先经过树脂分离处理，再经乙醇反复结晶纯化，按照该提纯方法，可获得纯度高达95％的甜菊糖衍生物NY101产品。 [0022] (3)蔗糖作为原料之一，提供糖基，由于其物理化学性质与甜菊糖及其衍生物差异较大，故反应后可以采用树脂分离和结晶等方式去除未反应的蔗糖和反应副产物果糖。 [0023] (4)本发明以甜菊苷、蔗糖为原料，利用生物转化方法在所述参数下反应获取甜菊糖衍生物NY101产品，生产工艺绿色安全，且生产成本低、周期短，极大的提高产品的竞争力。由于本发明操作简便，转化效率高，提纯容易，所得产品纯度高，可用于食品与饮料业，具有重要的应用价值。附图说明 [0024] 下面结合附图对本发明的作进一步说明。 [0025] 图1 NY101的HPLC谱图及其MS谱图 [0026] 图2 NY101的核磁氢谱图 [0028] 图4 NY101的二维COSY谱图 [0029] 图5 NY101的二维HMQC谱图 [0030] 图6 NY101的二维HMBC谱图 具体实施方式[0031] 本发明主要提供两条制备甜菊糖衍生物NY101的路线： [0032] 路线一： [0033] [0034] [0035] 路线二： [0036] [0037] 实施例1： [0038] 重组大肠杆菌的构建及诱导表达 [0039] 利用分子生物学和基因工程技术等获得含有目的基因的重组大肠杆菌表达菌株，然后将重组大肠杆菌发酵培养，诱导表达制备含有目的蛋白的重组细胞。其具体步骤如下： [0040] 1)合成所需的引物片段，通过PCR扩增获得所需的UDP-葡萄糖基转移酶M301编码DNA片段，并通过同源重组技术，整合到pNYK表达载体的表达框中。 [0041] 2)将重组质粒转化到大肠杆菌中，获得含有目的基因的工程菌J301。 [0042] 3)将1ml工程菌J301置于TB培养基中，250rpm、37℃振荡培养至OD600＝1.0，加入终浓度为0.1mM IPTG于25℃振荡培养16h。诱导结束后以10000g，5min离心收集细胞，置于-80℃储存备用。得到了含有M301蛋白的菌体。 [0043] 同样的，制备出含有蔗糖合成酶M302蛋白的菌体。 [0044] 实施例2： [0045] 以甜菊苷(stevioside)为底物酶法直接制备NY101(路线一) [0046] 取实施例1中的菌体M301沉淀，湿菌体重为35mg，用无菌水重悬细胞，并于冰浴中超生波破碎细胞，即为反应所用的粗酶液。精密称取样品，配制成1.85mL体系，其中甜菊苷(stevioside)的终浓度2.70g/L、UDP-葡萄糖为2.70g/L，并加入0.286g/L的MgCl2；然后加入粗酶液，并加入Tris-HCl缓冲液(0.1M,pH8.0)至体系为1.85ml，起始反应。37℃恒温摇床 以150rpm振荡24h，100℃煮沸终止反应。13000g离心10min，取上清作为样品。使用LC-MS方法检测反应体系中NY101的含量。实验结果表明，NY101的转化率约为73％。 [0047] 实施例3： [0048] 最佳金属离子浓度的确定 [0049] 取实施例1中的菌体M301沉淀35mg，按照实施例2中的方法，转移至5ml离心管中，加入终浓度为2.70g/L的甜菊苷，UDP-葡萄糖为2.70g/L及MgCl2，并加入0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。按上述方法，取平行样，加入MgCl2的终浓度分别为0、0.286g/L，反应24h后，取样品煮沸终止后离心，将上清样品进行HPLC分析。其中MgCl2为0.1g/L时，NY101的产量最高。 [0050] 实施例4： [0051] 最佳反应温度的确定 [0052] 取实施例1中的M301菌体沉淀35mg，按照实施例2中的方法，转移至5ml离心管中，加入终浓度为0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，底物甜菊苷为2.70g/L，UDP-葡萄糖为2.70g/L。按上述方法取平行样，分别于20、25、30、37℃，150rpm进行催化反应，反应24h后，取样品煮沸终止后离心，将上清样品进行HPLC分析。其中温度为30℃时，NY101的产量最高。 [0053] 实施例5： [0054] 最佳反应pH的确定 [0055] 取实施例1中的M301菌体沉淀35mg，按照实施例2中的方法，转移至5ml离心管中，加入终浓度为0.1M的Tris-HCl缓冲液，底物甜菊苷为2.70g/L，UDP-葡萄糖为2.70g/L。按上述方法取平行样，其中pH分别调至5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0。于30℃，150rpm进行催化反应，反应24h后，取样品离心，将上清样品进行HPLC分析。其中pH为8.0时，NY101的产量最高。 [0056] 实施例6： [0057] 最佳缓冲液的确定 [0058] 取实施例1中的菌体M301沉淀35mg，按照实施例2中的方法，转移至5ml离心管中，加入终浓度为2.70g/L的底物甜菊苷，UDP-葡萄糖为2.70g/L。按上述方法，取平行样，并分别加入pH8.0的Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液。反应24h后，取样品煮沸终止后离心，将上清样品进行HPLC分析。其中在Tris-HCl缓冲液中反应时，NY101的产量最高。 [0059] 实施例7： [0060] 以甜菊苷(stevioside)为底物利用再生循环系统酶法制备NY101(路线二)[0061] 在本实施例中，使用蔗糖、蔗糖合成酶M302以及UDP-葡萄糖组成的UDP-葡萄糖再生循环体系作为葡萄糖基供体。 [0062] 取实施例1中的M301和M302菌体沉淀各35mg，按照实施例2中的方法，转移至5ml离心管中，加入终浓度为0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，底物甜菊苷为2.70g/L，UDP-葡萄糖为2.70g/L，蔗糖为34.23g/L。加入粗酶液后，起始反应。37℃恒温摇床以150rpm振荡24h，100℃煮沸终止反应。13000g离心10min，取上清作为样品。HPLC方法检测反应体系中NY101的含量。实验结果表明，NY101的产量最高。 [0063] 实施例8： [0064] M301酶添加量的选择 [0065] 取实施例1中的菌体M301沉淀和M302菌体沉淀35mg，按照实施例7中的方法，转移至5ml离心管中，加入终浓度为0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，底物甜菊苷为2.70g/L，UDP-葡萄糖为2.70g/L，蔗糖为34.23g/L。按上述方法，取平行样，并分别加入终浓度为18.92、37.84、113.51、170.27、227.03g/L M301的粗酶液。反应24h后，取样品煮沸终止后离心，将上清样品进行HPLC分析。其中添加227.03g/LM301粗酶液反应时，NY101的产量最高。 [0066] 实施例9： [0067] 最佳底物添加量 [0068] 取实施例1中的M301和M302菌体沉淀各35mg，按照实施例7中的方法，转移至5ml离心管中，加入终浓度为0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，蔗糖为34.23g/L，及UDP-葡萄糖为0.676g/L，及底物甜菊苷。按上述方法，取平行样，并分别加入终浓度为0.676、 0.901、1.35、2.70、5.41、13.51、27.03、54.05g/L的甜菊苷(stevioside)。反应24h后，取样品煮沸终止后离心，将上清样品进行HPLC分析。其中添加2.70g/L底物时，NY101的产量最高。 [0069] 实施例10： [0070] 最佳辅酶添加量 [0071] 取实施例1中的M301和M302菌体沉淀各35mg，按照实施例7中的方法，转移至5ml离心管中，加入终浓度为0.1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，底物甜菊苷为2.70g/L，蔗糖为34.23g/L，及UDP-葡萄糖。按上述方法，取平行样，并分别加入终浓度为5.41、2.70、 1.35、0.676、0.270、0.135、0.0541、0.0270、0.0135g/L的辅酶。反应24h后，取样品煮沸终止后离心，将上清样品进行HPLC分析。其中添加0.676g/L辅酶时，NY101的产量最高。 [0072] 实施例11： [0073] NY101结构分析 [0074] 取适量NY101，溶于氘代吡啶中，设置参数，进行氢、碳及二维核磁共振谱分析，根据 核磁谱图中碳氢相互关系解析NY101结构。 [0075] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及其特点，旨在让本领域的技术人员能够容易理解本发明的内容并据以实施，并不能以此来限制本发明的保护范围。但凡根据本发明精神实质所做的等效变化或者修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。 |
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