用于制备葡聚糖聚合物的葡糖基转移酶 |
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| 申请号 | CN201380049949.4 | 申请日 | 2013-09-25 | 公开(公告)号 | CN104838010A | 公开(公告)日 | 2015-08-12 |
| 申请人 | 纳幕尔杜邦公司; | 发明人 | M.S.帕伊内; Y.布伦; H.何; T.肖兹; | ||||
| 摘要 | 本文公开了包含 水 、 蔗糖 和合成聚α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶的反应溶液。所述葡糖基转移酶能够合成具有至少50％α-1，3糖苷键和至少100的数均聚合度的不溶解的葡聚糖 聚合物 。还公开了使用此类葡糖基转移酶以制备不溶解的聚α-1，3-葡聚糖的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种包含水、蔗糖和合成聚α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶的反应溶液，其中所述葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、或SEQ ID NO：34至少90％相同的氨基酸序列。 |
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| 说明书全文 | 用于制备葡聚糖聚合物的葡糖基转移酶[0001] 本申请要求美国临时申请61/705,177；61/705,178；61/705,179；61/705,180和61/705,181的权益，其中每项提交于2012年9月25日。所有这些先前的申请均全文以引用方式并入本文。 技术领域[0002] 本发明涉及酶催化领域。具体地，本发明涉及使用葡糖基转移酶制备高分子量、不溶解的聚α-1，3-葡聚糖。 背景技术[0003] 受到利用微生物或植物宿主的酶合成或基因工程以寻求找到新结构多糖的期望的驱动，研究人员已经发现了可生物降解且能够从可再生资源的原料经济地制备的多糖。一种此类多糖是聚α-1，3-葡聚糖(特征在于具有α-1，3-糖苷键的葡聚糖聚合物)。通过使蔗糖水性溶液与分离自唾液链球菌(Streptococcus salivarius)的葡糖基转移酶(gtf)接触已经分离到这种聚合物(Simpson等人，Microbiology 141：1451-1460，1995)。 由聚α-1，3-葡聚糖制备的膜耐受至多150℃的温度并相对于得自β-1，4-连接的多糖的聚合物具有优点(Ogawa等人，Fiber Differentiation Methods，47：353-362，1980)。 [0004] 美国专利7,000,000公开了利用唾液链球菌的gtfJ酶制备多糖纤维。在这种聚合物内至少50％的己糖单元是通过α-1，3-糖苷键连接的。唾液链球菌的gtfJ酶利用蔗糖作为聚合反应的底物，从而产生聚α-1，3-葡聚糖和果糖作为终产物(Simpson等人，1995)。在溶剂或包含溶剂的混合物中溶解超过临界浓度时，本发明所公开的聚合物形成液晶溶液。从这种溶液得到的连续、强力、棉花状纤维可纺丝并用于纺织应用。 [0005] 并非所有的葡糖基转移酶都能制备适用于纺丝纤维的分子量和α-1，3糖苷键百分比的葡聚糖。例如，大多数葡糖基转移酶不制备具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的数均聚合度的葡聚糖。因此，希望鉴定能够将蔗糖转化为具有高百分比的α-1，3糖苷键和高分子量的葡聚糖聚合物的葡糖基转移酶。 发明内容[0006] 在一个实施例中，本发明涉及包含水、蔗糖和合成聚α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶的反应溶液。所述葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、或SEQ ID NO：34的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。 [0007] 在第二个实施例中，反应溶液中的所述葡糖基转移酶合成具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的数均聚合度的聚α-1，3-葡聚糖。在第三个实施例中，所述葡糖基转移酶合成具有100％的α-1，3糖苷键和至少100的数均聚合度的聚α-1，3-葡聚糖。在第四个实施例中，所述葡糖基转移酶合成具有100％的α-1，3糖苷键和至少250的数均聚合度的聚α-1，3-葡聚糖。 [0009] 在第七个实施例中，本发明涉及制备聚α-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括使至少水、蔗糖和合成聚α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶接触的步骤。所述葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、或SEQ ID NO：34的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。可任选地分离在这种方法中制备的聚α-1，3-葡聚糖。 [0010] 在第八个实施例中，在这个方法中使用的所述葡糖基转移酶合成具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的数均聚合度的聚α-1，3-葡聚糖。在第九个实施例中，所述葡糖基转移酶合成具有100％的α-1，3糖苷键和至少100的数均聚合度的聚α-1，3-葡聚糖。在第十个实施例中，所述葡糖基转移酶合成具有100％的α-1，3糖苷键和至少250的数均聚合度的聚α-1，3-葡聚糖。 [0011] 在第十一个实施例中，所述方法的接触步骤还包括使引子与水、蔗糖和葡糖基转移酶接触。在第十二个实施例中，这种引子可为右旋糖酐或水解的葡聚糖。 [0012] 序列简述 [0013] 表1.核酸和蛋白质序列号汇总 [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] 具体实施方式[0019] 所有引用的专利和非专利文献的公开内容全文以引用方式并入本文中。 [0021] 本文可互换使用术语“聚α-1，3-葡聚糖”、“α-1，3-葡聚糖聚合物”和“葡聚糖聚合物”。聚α-1，3-葡聚糖是包含通过糖苷键连接在一起葡萄糖单体单元的聚合物，其中至少约50％的糖苷键是α-1，3-糖苷键。聚α-1，3-葡聚糖是多糖的一种类型。聚α-1，3-葡聚糖的结构可描述如下： [0022] [0023] 本文可互换使用术语“糖苷键”和“糖苷键合”，是指将碳水化合物分子(糖)连接至另一个基团(诸如另一个碳水化合物)的共价键合类型。如本文所用，术语“α-1，3-糖苷键”是指将α-D-葡萄糖分子通过相邻α-D-葡萄糖环上的碳1和碳3彼此连接的共价键合类型。这种键如上文提供的聚α-1，3-葡聚糖结构图所示。本文中，“α-D-葡萄糖”将被称为“葡萄糖”。 [0024] 本文术语“蔗糖”是指非还原二糖，其由通过α-1，2-糖苷键合连接的一个α-D-葡萄糖分子和一个β-D-葡萄糖分子组成。已知蔗糖常作为食糖。 [0025] 本文聚α-1，3-葡聚糖的“分子量”能够表示为数均分子量(Mn)或重均分子量(Mw)。另选地，分子量能够表示为道尔顿(Dalton)、克/摩尔、DPw(重均聚合度)、或DPn(数均聚合度)。本领域已知有各种方法用于计算这些分子量的测量结果，诸如采用高压液相色谱法(HPLC)、尺寸排阻色谱法(SEC)、或凝胶渗透色谱法(GPC)。 [0026] 本文可互换使用术语“葡糖基转移酶”、“gtf酶”、“gtf酶催化剂”、“gtf”和“葡聚糖蔗糖酶”。本文中gft酶的活性催化反应：底物蔗糖生成产物聚α-1，3-葡聚糖和果糖。gtf反应的其它产物(副产物)可包括葡萄糖(在从葡糖基-gtf酶中间体复合物水解出葡萄糖的情况下)、各种可溶性寡糖(DP2-DP7)、以及白菌二糖(在葡糖基-gtf酶中间体复合物的葡萄糖连接至果糖的情况下)。白菌二糖是由通过α-1，5键连接的葡萄糖和果糖组成的二糖。葡糖基转移酶的野生型形式大体包含(N末端至C末端方向)信号肽、可变域、催化域和葡聚糖结合域。根据CAZy(碳水化合物-活性酶)数据库(Cantarel等人，Nucleic AcidsRes.37：D233-238，2009)本文中gtf被归类为配糖水解酶家族70(GH70)。 [0027] 本文可互换使用术语“反应”和“酶促反应”，是指由葡糖基转移酶进行的反应。本文所用的“反应溶液”大体是指在包含蔗糖和水，以及任选地其它组分的溶液中，包含至少一种活性的溶液。使水、蔗糖和葡糖基转移酶接触的步骤是在反应溶液中进行的。如本文所用术语“在合适的反应条件下”是指支持通过葡糖基转移酶活性将蔗糖转化为聚α-1，3-葡聚糖的反应条件。本文中所述反应不是天然存在的。 [0028] 本文可互换使用术语“体积％”、“体积百分比”、“vol％”和“v/v％”。溶液中溶质的体积％可使用下式测定：[(溶质体积)/(溶液体积)]×100％。 [0029] 本文可互换使用术语“重量％”、“重量百分比(wt％)”和“重量-重量百分比(％w/w)”。重量％是指包含在组合物、混合物或溶液中的材料按重量计的百分比。 [0030] 本文可互换使用术语“增加的”、“增强的”和“改善的”。这些术语是指更大的数量或活性，诸如数量或活性比初始数量或活性稍大，或与初始数量或活性相比数量或活性大大超过，或包括在其中间的所有数量或活性。另选地，这些术语可指，例如，该数量或活性与和它相比较的数量或活性相比，高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。 [0031] 本文可互换使用术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”。这些术语涵盖核苷酸序列及类似的范围。多核苷酸可为DNA或RNA的聚合物，其为单链或双链的，任选的包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。 [0032] 在本文术语“基因”是指表达特定蛋白质的多核苷酸片段，并且其可以指单独的编码区或可以包含所述编码区上游和/或下游的调控序列(例如，所述编码区的转录起始位点上游的5′非翻译区)。“天然的”或“内源性的”基因是指天然存在的、带有其自身调控序列的基因；该基因位于生物体基因组中的天然初始位点。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。“外来的”或“异源性的”基因是指通过基因转移导入至宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因、或嵌合基因。在本文所公开的某些实施例中，所述多核苷酸序列是异源性的。“转基因”是已通过转化方法被导入基因组内的基因。“经密码子优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。 [0033] 天然的氨基酸序列或多核苷酸序列是天然存在的，而非天然的氨基酸序列或多核苷酸序列不是天然存在的。 [0034] 如本文所用，“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。如本文所用，“调控序列”是指位于所述编码序列的转录起始位点上游的核苷酸序列5′非翻译区以及3′非编码区，并且其可影响转录、RNA加工或稳定性、或者相关编码序列的翻译。调控序列可包括启动子、增强子、沉默子、5′非翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点、茎-环结构和基因表达调控涉及的其它元件。 [0035] 如本文所用，术语“重组”指两个原本分离的序列片段的人工组合，例如通过化学合成或通过以遗传工程技术操纵分离的核酸片段实现人工组合。本文互换使用术语“重组的”、“转基因的”、“转化的”、“工程化的”或“修饰用于外源性基因表达的”。 [0036] 在某些实施例中所用的术语“转化”是指将核酸分子转移进宿主生物体。核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可以整合进宿主生物的基因组中。含有转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化的”生物体或“转化体”。 [0037] 术语“重组的”或“异源性的”指两个原本分离的序列片段的人工组合，例如通过化学合成或通过以遗传工程技术操纵分离的核酸片段实现(人工组合)。 [0038] 如本文所用，相对于多核苷酸或多肽序列，术语“序列同一性”或“同一性”是指两序列中的核酸碱基或氨基酸残基当在指定比较窗口中比对最大匹配时是相同的。因此，“序列同一性百分比”或“百分比同一性”指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列而测得的值，其中在与参考序列(其不包含添加或缺失)进行比较时，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失(即空位)以实现两个序列的最佳比对。所述百分比的计算方法是，统计相同的核酸碱基或氨基酸残基在两段序列中同时出现的位置的数量以得到匹配位置数，将此匹配位置数除以比对窗口中的总位置数，再将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。 [0039] 在National Center for Biotechnology Information(NCBI)网站在线可用的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)算法可用于，例如计算本文所公开的两个或更多个多核苷酸序列(BLASTN算法)或多肽序列(BLASTP算法)之间的百分比同一性。另选地，序列间的百分比同一性可使用Clustal算法(例如CIustalW或ClustalV)进行计算。对于使用Clustal比对方法的多重比对，默认值可对应于GAP PENALTY＝10、以及GAP LENGTH PENALTY＝10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数可为KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数可为KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5，WINDOW＝4、以及DIAGONALS SAVED＝4。另外另选地，可使用EMBOSS算法(例如needle)进行序列之间百分比同一性计算，采用参数诸如GAP OPEN＝10、GAP EXTEND＝0.5、END GAP PENALTY＝false、END GAP OPEN＝10、END GAP EXTEND＝0.5、使用BLOSUM矩阵(例如，BLOSUM62)。 [0040] 本文公开了多种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列作为本公开发明的某些实施例的特征。可使用这些序列的变体，其与本文公开的序列有至少约70-85％、85-90％、或90％-95％相同。另选地，变体氨基酸序列或多核苷酸序列与本文公开的序列可具有至少 70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有与公开序列相同的功能/活性，或者具有公开序列至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、或99％的功能/活性。 [0041] 在某些实施例中所用的术语“分离的”是指从其天然来源完全或部分纯化的任何细胞组分(例如，分离的多核苷酸或多肽分子)。在一些情况下，分离的多核苷酸或多肽分子是较大组合物、缓冲体系或试剂混合物的一部分。例如，分离的多核苷酸或多肽分子可以异源方式包含在细胞或生物内。另一个例子是分离的葡糖基转移酶。 [0042] 在公开的发明的多个实施例中涉及反应溶液，其包含水、蔗糖和合成聚α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶。所述葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、或SEQ ID NO：34的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。显著地，这些葡糖基转移酶能够合成具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的数均聚合度的聚α-1，3-葡聚糖。此类葡聚糖适用于纺丝纤维和其它工业应用。 [0043] 通过入本文所述葡糖基转移酶制备的聚α-1，3-葡聚糖的分子量能够以DPn(数均聚合度)来测量。另选地，所述聚α-1，3葡聚糖的分子量能够以道尔顿(Daltons)、克/摩尔、或DPw(重均聚合度)来测量。在本发明的某些实施例中，所述聚α-1，3-葡聚糖具有分子量为至少约100的DPn或DPw。所述聚α-1，3-葡聚糖的分子量可或为至少约250DPn或DPw。还另选地，所述聚α-1，3-葡聚糖的DPn或DPw可为至少约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、或1000(或100和1000之间的任何整数)。 [0044] 可用本领域中已知的若干方法的任一个测量本文所述聚α-1，3-葡聚糖的分子量。例如，可使用高压液相色谱法(HPLC)、尺寸排阻色谱法(SEC)、或凝胶渗透色谱法(GPC)测量葡聚糖聚合物分子量。 [0045] 本文所述聚α-1，3-葡聚糖优选地为直链的/非支化的。在聚α-1，3-葡聚糖的葡萄糖单体单元之间的糖苷键(为α-1，3)的百分比为至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。在此类实施例中，因此，聚α-1，3-葡聚糖具有少于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、或0％的非α-1，3的糖苷键。 [0046] 应当理解，聚α-1，3-葡聚糖中存在的α-1，3-糖苷键的百分比越高，聚α-1，3-葡聚糖为直链的概率更高，因为在聚合物中形成分枝点的某些糖苷键的出现会更少。在某些实施例中，所述聚α-1，3-葡聚糖没有分枝点，或分枝点占所述聚合物中糖苷键百分比少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％。分枝点的例子包括α-1，6分枝点，诸如存在于变形聚合物中的那些。 [0047] 可使用本领域已知的任何方法测定聚α-1，3-葡聚糖的糖苷键特征图。例如，可13 1 采用使用核磁共振(NMR)光谱学的方法(例如，C NMR或 H NMR)测定键特征图。在Food Carbohydrates：Chemistry，Physical Properties，and Applications(S.W.Cui编辑，第三章，S.W.Cui，Structural Analysis of Polysaccharides，Taylor&Francis Group LLC，Boca Raton，FL，2005)中公开了可采用的这些和其它方法，其内容以应用方式并入本文。 [0048] 本文中所述聚α-1，3-葡聚糖可通过前述α-1，3键的百分比和分子量的任意组合来表征。例如，在本文反应溶液中制备的聚α-1，3-葡聚糖可具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的DPn或DPw。又如，所述聚α-1，3-葡聚糖可具有100％的α-1，3糖苷键和至少100的DPn或DPw。在另一个例子中，所述聚α-1，3-葡聚糖可具有100％的α-1，3糖苷键和至少250的DPn或DPw。 [0049] 在本发明的某些实施例中，所述葡糖基转移酶可来源于例如链球菌(Streptococcus)菌种、明串珠菌(Leuconostoc)菌种或乳杆菌(Lactobacillus)菌 种。链球菌(Streptococcus)菌种的例子(所述葡糖基转移酶来源于此)包括唾液链球菌(S.salivarius)、远缘链球菌(S.sobrinus)、蝙蝠齿链球菌(S.dentirousetti)、汗毛链球菌(S.downei)、变异链球菌(S.mutans)、口腔链球菌(S.oralis)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)和犬血链球菌(S.sanguinis)。明串珠菌(Leuconostoc)菌种(所述葡糖基转移酶来源于此)包括肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)、酵母促生明串珠菌(L.amelibiosum)、阿根廷明串珠菌(L.argentinum)、肉色明串珠菌(L.carnosum)、柠檬明串珠菌(L.citreum)、乳脂明串珠菌(L.crenoris)、葡萄聚明串珠菌(L dextranicum)和果糖明串珠菌(L.fructosum)。乳杆菌(Lactobacillus)菌种(所述葡糖基转移酶 来源于此)包括嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、唾液乳杆菌(Lsalivarius)、乳酪乳杆菌(L.casei)、曲乳杆菌(L curvatus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、清酒乳杆菌(L.sakei)、短乳杆菌(L.brevis)、布氏乳杆菌(L.buchneri)、发酵乳杆菌(L.fermentum)和罗伊氏乳杆菌(L reuteri)。 [0050] 本文中所述葡糖基转移酶可包含，或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、或SEQ ID NO：34中提供的氨基酸序列至少90％相同、其中所述葡糖基转移酶具有活性。另选地，所述葡糖基转移酶可包含，或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、或SEQ ID NO：34至少90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同、其中所述葡糖基转移酶具有活性。 [0051] 在所述葡糖基转移酶序列的每个氨基酸位置处例示了本文所公开的所有氨基酸残基。鉴于某些氨基酸彼此共享类似的结构和/或电荷特征(即保守的)，所述葡糖基转移酶序列中每个位置处的氨基酸可在所公开的序列中提供或用保守的氨基酸残基替换(“保守氨基酸替换”)如下： [0052] 1.下列小的脂族，非极性或微极性残基可以相互替换：Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Pro(P)、Gly(G)； [0053] 2.下列极性、带负电的残基和它们的酰胺可相互替换：Asp(D)、Asn(N)、Glu(E)、Gln(Q)； [0054] 3.下列极性的、带正电的残基可相互替换：His(H)、Arg(R)、Lys(K)； [0055] 4.下列脂族残基可相互替换：Ala(A)、Leu(L)、lie(I)、Val(V)、Cys(C)、Met(M)；以及 [0056] 5.下列大的芳族残基可相互替换：Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)。 [0057] 葡糖基转移酶的例子可为本文所公开氨基酸序列的任一个，还包括N-末端和/或C-末端的1-300(或之间的任何整数)个残基。此类另外的残基可来自对应的野生型序列(所述葡糖基转移酶来源于此)，或可为另一个序列诸如表位标签(位于N-末端或C-末端)或例如异源的信号肽(位于N末端)。因此，葡糖基转移酶的例子包括SEQ ID NO：61、62、63和64，其代表了野生型序列，SEQ ID NO：30、4、28和20分别来源于所述野生型序列。 [0058] 所述葡糖基转移酶能够由例如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、或SEQ ID NO：33中提供的多核苷酸序列编码。另选地，所述葡糖基转移酶能够由与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、或SEQ ID NO：33至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的多核苷酸序列编码。 [0059] 在某些实施例中，所述葡糖基转移酶合成聚α-1，3-葡聚糖，其中组分糖苷键的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％(或在50％和100％之间的任何整数)是α-1，3键。在此类实施例中，因此，所述葡糖基转移酶合成聚α-1，3-葡聚糖，其中少于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％的糖苷键为非α-1，3(键)。 [0060] 另一方面，所述葡糖基转移酶合成的聚α-1，3-葡聚糖没有分枝点，或分枝点占所述聚合物中糖苷键百分比少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％。分枝点的例子包括α-1，6分枝点，诸如存在于变形聚合物中的那些。 [0061] 所述葡糖基转移酶能够合成具有分子量为至少约100DPn或DPw的聚α-1，3-葡聚糖。另选地，所述葡糖基转移酶能够合成具有分子量为至少约400DPn或DPw的聚α-1，3-葡聚糖。另选地，所述葡糖基转移酶能够合成具有分子量为至少约100、150、200、250、 300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、或1000(或100和1000之间的任何整数)DPn或DPw的聚α-1，3-葡聚糖。 [0062] 在所公开的发明中可使用一种或多种不同的葡糖基转移酶。所述葡糖基转移酶优选地没有、或有非常微量(少于1％)的右旋糖酐蔗糖酶、罗伊糖蔗糖酶、或交替糖蔗糖酶活性。在某些实施例中所述葡糖基转移酶不包含SEQ ID NO：8的氨基酸残基2-1477或SEQ ID NO：8的氨基酸残基138-1477，其来源于在GENBANK中Gl号47527(SEQ ID NO：60)下所识别的葡糖基转移酶。 [0063] 本文所述葡糖基转移酶能够为引子非依赖性的或引子依赖性的。引子非依赖性的葡糖基转移酶不需要引子的存在以进行葡聚糖合成。在葡聚糖聚合物合成过程中，引子依赖性的葡糖基转移酶需要在反应溶液中存在启动分子充当酶的引子。如本文所用，术语“引子”是指任何能够充当葡糖基转移酶的引发剂的分子。例如本文中寡糖和多糖能够作为引子。例如能够在某些实施例中使用的引子包括右旋糖酐和其它基于碳水化合物的引子，诸如水解的葡聚糖。能够通过酸水解葡聚糖(诸如聚α-葡聚糖)制备水解的葡聚糖。国际专利申请公布WO2013/036918，其以引用方式并入本文，公开了使用聚α-1，3-葡聚糖作为起始材料来制备水解的葡聚糖。本文中用作引子的右旋糖酐能够为右旋糖酐T10(即，具有10kD分子量的右旋糖酐)。另选地，右旋糖酐能够具有例如约2、4、6、8、10、12、14、16、18、 20、或25kD的分子量。 [0064] 本文中使用的所述葡糖基转移酶可通过本领域已知的任何方法制备(例如，美国专利7000000，其内容以引用方式并入本文)。例如，可在任何细菌的(例如，大肠杆菌诸如TOP10、芽孢杆菌属(Bacillus sp.))或真核的(例如，酵母诸如毕赤酵母属(Pichia sp.)和酵母菌属(Saccharomyces sp.))异源性基因表达系统中重组制备所述葡糖基转移酶。例如，以上列出的任何核酸序列可用于这个目的。 [0065] 本文使用的所述葡糖基转移酶可在使用之前进行纯化和/或分离，或可例如以细胞裂解液形式使用。可从用于异源性表达所述酶的细菌(例如，大肠杆菌)制备细胞裂解液或提取物。例如，可使用弗氏细胞压碎器(French press)破坏所述细胞。在这些制备类型中所述葡糖基转移酶是可溶的。在反应溶液中可使用约0.15-0.3％(v/v)的所述溶胞产物或提取物以从蔗糖制备聚α-1，3-葡聚糖。在某些实施例中，首先通过诸如离心或过滤的方法清除细菌细胞裂解液的不溶解的物质。 [0066] 在某些实施例中，所述异源性基因表达系统可为设计用于蛋白质分泌的(系统)之一。在此类实施例中所述葡糖基转移酶包含信号肽(信号序列)。所述信号肽可为其天然的信号肽或异源的信号肽。 [0067] 可使用本领域已知的任何方法测定所述葡糖基转移酶的活性。例如，能够通过在包含蔗糖(50g/L)、右旋糖酐T10(1mg/mL)和磷酸钾缓冲液(pH 6.5，50mM)的反应溶液中测量还原性糖(果糖和葡萄糖)的生成来测定葡糖基转移酶活性，其中所述溶液在22-25℃保持24-30小时。通过将0.01mL的反应溶液添加至包含1 N NaOH和0.1％氯化三苯基四唑(triphenyltetrazolium chloride)的混合物、然后检测OD480nm处的吸收值增加(5分钟)来测量还原性糖。 [0068] 如果需要，能够控制本文中所述反应溶液的温度。在某些实施例中，所述溶液的温度在约5℃至约50℃之间。在某些实施例中，所述溶液的温度在约20℃至约40℃之间。另选地，所述溶液的温度可为约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40℃。 [0069] 可使用本领域已知的各种方法保持所述反应溶液的温度。例如，能够通过将包含反应溶液的容器放置于设定至所需温度的空气或水浴培养箱来保持反应溶液的温度。 [0070] 在所述溶液中蔗糖的初始浓度可为例如约20g/L至约400g/L。另选地，蔗糖的初始浓度可为例如约75g/L至约175g/L、或约50g/L至约150g/L。另选地，蔗糖的初始浓度可为例如约40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、或160g/L(或在40和160g/L之间的任何整数)。“蔗糖的初始浓度”是指刚把所有反应溶液组分(水、蔗糖、gtf酶)加入后溶液中的蔗糖浓度。 [0071] 在反应溶液中使用的蔗糖可为高纯的(≥99.5％)或任何其它纯度或等级的。例如，所述蔗糖可具有至少99.0％的纯度，或为试剂级的蔗糖。所述蔗糖可来源于任何可再生的糖源，诸如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱或玉米。所述蔗糖可以任何形式提供，诸如结晶型或非结晶型(例如，糖浆或甘蔗汁)。 [0072] 所述反应溶液的pH可在约4.0至约8.0之间。另选地，pH可为约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、或8.0。在某些实施例中，可在加入所述葡糖基转移酶之前设定包含水和蔗糖的溶液的pH。可通过加入或掺入合适的缓冲液来调整或控制所述反应溶液的pH，包括但不限于：磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸盐或它们的组合。所述缓冲液的浓度可为例如0mM至约100mM、或约10、20、或50mM。在反应溶液中可任选地加入合适量的DTT(二硫苏糖醇，例如，约1.0mM)。 [0073] 所公开的发明还涉及制备聚α-1，3-葡聚糖的方法，其包括使至少水、蔗糖和合成聚α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶接触的步骤。所述葡糖基转移酶可包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、或SEQ ID NO：34的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。可任选地分离在这个方法中制备的聚α-1，3-葡聚糖。 [0074] 如本文所述，使水、蔗糖和葡糖基转移酶在反应溶液中接触。因此，如本文所述，所述方法可包括提供包含水、蔗糖和葡糖基转移酶的反应溶液。应当理解，由于所述葡糖基转移酶合成聚α-1，3-葡聚糖，如反应的浑浊所指出的那样鉴于不溶解的聚α-1，3-葡聚糖掉出溶液，所述反应溶液变成反应混合物。所公开方法的接触步骤可以任意种方式进行。例如，可将所需量的蔗糖首先溶于水(任选地，在制备的这个阶段也可加入其它组分，诸如缓冲液组分)，之后进行所述葡糖基转移酶的添加。该溶液可以保持静止，或通过例如搅动或轨道振荡进行搅拌。所述溶液可为，并且通常为不含细胞的。 [0075] 所述葡糖基转移酶可任选地添加至水或水性溶液(例如，蔗糖水)，其在初始制备所述反应溶液时不含盐或缓冲液。然后此类制备过程的pH可根据需要修改，诸如至例如pH5-6。如果需要，所述反应可不用添加任何缓冲液而进行至完成。 [0076] 在某些实施例中，反应的完成可通过目视(沉淀的聚α-1，3-葡聚糖不再积累)和/或通过测量溶液中剩余的蔗糖量(残余的蔗糖)来确定，其中蔗糖消耗百分比超过约90％可指示反应完成。通常，根据某些参数诸如反应中所用的蔗糖和葡糖基转移酶的量，本发明所公开方法的反应完成会需要约12、24、36、48、60、72、84、或96小时。 [0077] 在本发明所公开方法的某些实施例中，蔗糖消耗的百分比为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。另选地，蔗糖消耗百分比可为＞ 90％或＞95％。 [0078] 在公开的发明中制备的聚α-1，3-葡聚糖的收率，基于反应溶液中所用的蔗糖重量可为至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％。 [0079] 任选地，在本发明所公开的方法中制备的聚α-1，3-葡聚糖可为分离的。例如，可通过离心或过滤分离不溶解的聚α-1，3-葡聚糖。为此，将聚α-1，3-葡聚糖与剩余的反应溶液分开，所述反应溶液可包含水、果糖和某些副产物(例如，白菌二糖，可溶的寡糖DP2-DP7)。该溶液也可包含残余的蔗糖和葡萄糖单体。 [0080] 聚α-1，3葡聚糖一种潜在的低成本聚合物，其能从包含蔗糖的可再生资源使用葡糖基转移酶而酶促产生。已经证明在所述聚合物在某些条件下溶解在溶剂中时，这种聚合物可形成有序的液晶溶液(美国专利7,000,000)。此类溶液可纺丝成连续的、高强度的、类似棉花的纤维。使用公开的发明所制备的聚α-1，3-葡聚糖具有能与之相比的实用性。 [0081] 实例 [0082] 所公开的发明在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例虽然说明了本发明的某些优选方面，但仅是以例证的方式给出的。从上述讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。 [0083] 缩写 [0084] 本文所用的一些缩写的含义如下：“g”是指克，“h”是指小时，“mL”是指毫升，“psi”是指磅每平方英寸，“wt％”是指重量百分比，“pm”是指微米，“℃”是指摄氏度，“mg”是指毫克，“mm”是指毫米，″μL”是指微升，“mmol”是指毫摩尔，“min”是指分钟，“mol％”是指摩尔百分比，“M”是指摩尔，“rpm”是指每分钟转数，“MPa”是指兆帕。 [0085] 一般方法 [0086] 葡糖基转移酶(gtf)粗提物的制备 [0087] 如下制备Gtf酶：用包含特定编码gtf的DNA序列的基于 的构建体转化大肠杆菌 细胞(Invitrogen，Carlsbad California)。每个序列经密码子 优化以在大肠杆菌中表达gtf酶。在37℃下，使表达特定gtf酶的单个大肠杆菌菌株摇动生长于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB(Luria broth)培养基(Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ)上至OD600＝0.4-0.5，每次加入IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷，货号16758，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)至终浓度为0.5mM。在IPTG诱导后将培养物在37℃下温育2-4小时。通过以5,000×g离心15分钟收获细胞，并重悬(20％w/v)于含二硫苏糖醇(DTT，1.0mM)的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中。将重悬的细胞通过弗氏细胞压碎器(SLM Instruments，Rochester，NY)两次以确保＞95％的细胞裂解。在4℃下，将裂解的细胞以12,000×g离心30分钟。通过BCA(二喹啉酸)蛋白质测定(Sigma-Aldrich)和SDS-PAGE对所得的上清液进行分析以确认gtf酶的表达，然后将上清液储存在-20℃。 [0088] Gtf酶活性的测定 [0089] 通过测量gtf反应溶液中还原糖(果糖和葡萄糖)的生成以确认Gtf酶活性。通过将gtf提取物(如上所述制备的)添加至包含蔗糖(50或150g/L)、磷酸钾缓冲液(pH6.5，50mM)、和任选地右旋糖酐(1mg/mL，右旋糖酐T10，货号D9260，Sigma-Aldrich)的混合物以制备反应溶液；加入gtf提取物至按体积计2.5％-5％。然后在22-25℃下将所述反应溶液温育24-30小时，随后离心。将上清液(0.01mL)加入至包含1N NaOH和0.1％氯化三苯基四唑(Sigma-Aldrich)的混合物。将混合物温育5分钟，之后使用ULTROSPEC分光光度计(Pharmacia LKB，New York，NY)测定其OD480nm从而测量还原糖果糖和葡萄糖的存在。 [0090] 糖苷键的测定13 [0091] 通过 C NMR(核磁共振)来测定由gtf酶合成的葡聚糖产物中的糖苷键。在50℃下，将干的葡聚糖聚合物(25-30mg)在搅拌下溶解于1mL包含3％按重量计的LiCl的氘代二甲亚砜(DMSO)。使用玻璃移液管将0.8mL所述溶液转移至5-mm NMR管。使用配备有CPDUL冷冻探针的Bruker Avance 500-MHz NMR光谱仪(Billerica，MA)，在125.76MHz的13 光谱频率处，使用26041.7Hz的光谱窗口获得了定量 C NMR光谱。采用了使用waltz解耦的反向封闭解耦脉冲序列，采集时间为0.629秒，脉冲间延迟为5秒，并且脉冲6000个。使用2.0Hzd指数级倍增以转化时间域数据。 [0092] 数均聚合度(DPn)的测定 [0093] 通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定由gtf酶合成的葡聚糖产物的DPn。在100℃，将干的葡聚糖聚合物以5mg/mL溶解于N，N-二甲基-乙酰胺(DMAc)和5％的LiCl中，摇TM动过夜。使用的SEC系统为来自Waters公司(Milford，MA)的Alliance 2695分离模块，带有三个联机检测器：来自Waters的微分折射仪2410、来自Wyatt Technologies(Santa TM Barbara，CA)的多角度光散射光度计Heleos 8+、和来自Wyatt的微分毛细管粘度计 TM ViscoStar 。用于SEC的柱子为四个来自Shodex(Japan)的苯乙烯-二乙烯基苯柱和两个线性KD-806M、KD-802和KD-801柱以改善在聚合物分布的低分子量区域的分辨率。流动相为含0.11％LiCI的DMAc。所用的色谱分离条件为柱和检测器50℃，样品和喷射器隔室 40℃，流速为0.5mL/分钟，并且注入体积为100μL。用于数据还原的软件包为来自Waters的EmpowerTM版本3(对广泛葡聚糖聚合物标准校正)和来自Wyatt的 版本6(带有 柱校正的三重检测方法)。 [0094] 实例1 [0095] Gtf酶0874(SEO ID NO：2)的制备 [0096] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的远缘链球菌(Streptococcussobrinus)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号450874(SEQ ID NO：2，由SEQ ID NO：1编码； 本文中称为“0874”)。 [0097] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 0874的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.，Menlo Park，CA)。将编码gtf 0874(SEQ ID NO：2)的核酸产物(SEQ ID NO：1)亚克隆至 (DNA2.0，Inc.)以生成质粒构建体标识为pMP57。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)以生成标识为TOP10/pMP57的菌株。 [0098] 通过细菌表达制备gtf 0874和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 0874的酶活性(参见下面的实例18)。 [0099] 实例2 [0100] Gtf酶6855(SEQ ID NO：4)的制备 [0101] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的唾液链球菌(Streptococcussalivarius)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号228476855(SEQ ID NO：4，由SEQ ID NO：3编码；本文中称为“6855”)。使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 6855的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf 6855(SEQ ID NO：4)的核酸产物(SEQ ID NO：3)亚克隆至 以生成标识为pMP53的质粒构建体。该质粒构建体被 用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP53的菌株。 [0102] 通过细菌表达制备gtf 6855和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 6855的酶活性(参见下面的实例18)。 [0103] 实例3 [0104] Gtf酶2379(SEQ ID NO：6)的制备 [0105] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的唾液链球菌(Streptococcussalivarius)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号662379(SEQ ID NO：6，由SEQ ID NO：5编码；本文中称为“2379”)。 [0106] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 2379的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf 2379(SEQ ID NO：6)的核酸产物(SEQ ID NO：5)亚克隆至 以生成标识为pMP66的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP66的菌株。 [0107] 通过细菌表达制备gtf 2379和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 2379的酶活性(参见下面的实例18)。 [0108] 实例4 [0109] Gtf酶7527(GtfJ，SEQ ID NO：8)的制备 [0110] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的唾液链球菌(Streptococcussalivarius)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号47527(SEQ ID NO：8，由SEQ ID NO：7编码； 本文中称为“7527”或“GtfJ”)。 [0111] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 7527的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf 7527(SEQ ID NO：8)的核酸产物(SEQ ID NO：7)亚克隆至 以生成标识为pMP65的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP65的菌株。 [0112] 通过细菌表达制备gtf 7527和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 7527的酶活性(参见下面的实例18)。 [0113] 实例5 [0114] Gtf酶1724(SEQ ID NO：10)的制备 [0115] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的汗毛链球菌(Streptococcus downei)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号121724(SEQ ID NO：10，由SEQ ID NO：9编码；本文中称为“1724”)。使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 1724的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf 1724(SEQ ID NO：10)的核酸产物(SEQ ID NO：9)亚克隆至 以生成标识为pMP52的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP52的菌株。 [0116] 通过细菌表达制备gtf 1724和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 1724的酶活性(参见下面的实例18)。 [0117] 实例6 [0118] Gtf酶0544(SEQ ID NO：12)的制备 [0119] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的变异链球菌(Streptococcus mutans)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号290580544(SEQ ID NO：12，由SEQ ID NO：11编码；本文中称为“0544”)。 [0120] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 0544的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf 0544(SEQ ID NO：12)的核酸产物(SEQ ID NO：11)亚克隆至 以生成标识为pMP55的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP55的菌株。 [0121] 通过细菌表达制备gtf 0544和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 0544的酶活性(参见下面的实例18)。 [0122] 实例7 [0123] Gtf酶5926(SEQ ID NO：14)的制备 [0124] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的蝙蝠齿链球菌(Streptococcusdentirousetti)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号167735926(SEQ ID NO：14，由SEQ ID NO：13编码；本文中称为“5926”)。使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 5926的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf 5926(SEQ ID NO：14)的核酸产物(SEQ ID NO：13)亚克隆至 以生成标识为pMP67的质粒构建体。该质 粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP67的菌株。 [0125] 通过细菌表达制备gtf 5926和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 5926的酶活性(参见下面的实例18)。 [0126] 实例8 [0127] Gtf酶4297(SEQ ID NO：16)的制备 [0128] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的口腔链球菌(Streptococcus oralis)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号7684297(SEQ ID NO：16，由SEQ ID NO：15编码；本文中称为“4297”)。 [0129] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 4297的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf4297(SEQ ID NO：16)的核酸产物(SEQ ID NO：15)亚克隆至 以生成标识为pMP62的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP62的菌株。 [0130] 通过细菌表达制备gtf 4297和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 4297的酶活性(参见下面的实例18)。 [0131] 实例9 [0132] Gtf酶5618(SEQ ID NO：18)的制备 [0133] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的犬血链球菌(Streptococcussanguinis)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号328945618(SEQ ID NO：18，由SEQ ID NO：17编码；本文中称为“5618”)。 [0134] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 5618的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf 5618(SEQ ID NO：18)的核酸产物(SEQ ID NO：17)亚克隆至 以生成标识为pMP56的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP56的菌株。 [0135] 通过细菌表达制备gtf 5618和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 5618的酶活性(参见下面的实例18)。 [0136] 实例10 [0137] Gtf酶2765(SEQID NO：20)的制备 [0138] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的链球菌属(Streptococcus sp.)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号322372765(SEQ ID NO：20，由SEQ ID NO：19编码；本文中称为“2765”)。 [0139] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 2765的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf2765(SEQ ID NO：20)的核酸产物(SEQ ID NO：19)亚克隆至 以生成标识为pMP73的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP73的菌株。 [0140] 通过细菌表达制备gtf 2765和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 2765的酶活性(参见下面的实例18)。 [0141] 实例11 [0142] Gtf酶4700(SEQ ID NO：22)的制备 [0143] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号21654700(SEQ ID NO：22，由SEQ ID NO： 21编码；本文中称为“4700”)。 [0144] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 2765的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf4700(SEQ ID NO：22)的核酸产物(SEQ ID NO：21)亚克隆至 以生成标识为pMP83的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP83的菌株。 [0145] 通过细菌表达制备gtf 4700和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 4700的酶活性(参见下面的实例18)。 [0146] 实例12 [0147] Gtf酶1366(SEQ ID NO：24)的制备 [0148] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的仓鼠链球菌(Streptococcus criceti)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号146741366(SEQ ID NO：24，由SEQ ID NO：23编码；本文中称为“1366”)。 [0149] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 1366的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf 1366(SEQ ID NO：24)的核酸产物(SEQ ID NO：23)亚克隆至 以生成标识为pMP86的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP86的菌株。 [0150] 通过细菌表达制备gtf 1366和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 1366的酶活性(参见下面的实例18)。 [0151] 实例13 [0152] Gtf酶0427(SEQ ID NO：26)的制备 [0153] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的远缘链球菌(Streptococcussobrinus)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号940427(SEQ ID NO：26，由SEQ ID NO：25编码；本文中称为“0427”)。 [0154] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 0427的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf0427(SEQ ID NO：26)的核酸产物(SEQ ID NO：25)亚克隆至 以生成标识为pMP87的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP87的菌株。 [0155] 通过细菌表达制备gtf 0427和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 0427的酶活性(参见下面的实例18)。 [0156] 实例14 [0157] Gtf酶2919(SEQ ID NO：28)的制备 [0158] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的唾液链球菌(Streptococcussalivarius)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号383282919(SEQ ID NO：28，由SEQ ID NO： 27编码；本文中称为“2919”)。 [0159] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 2919的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf2919(SEQ ID NO：28)的核酸产物(SEQ ID NO：27)亚克隆至 以生成标识为pMP88的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP88的菌株。 [0160] 通过细菌表达制备gtf 2919和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 2919的酶活性(参见下面的实例18)。 [0161] 实例15 [0162] Gtf酶2678(SEQ ID NO：30)的制备 [0163] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的唾液链球菌(Streptococcussalivarius)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号400182678(SEQ ID NO：30由SEQ ID NO：29编码；本文中称为“2678”)。 [0164] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 2678的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf2678(SEQ ID NO：30)的核酸产物(SEQ ID NO：29)亚克隆至 以生成标识为pMP89的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP89的菌株。 [0165] 通过细菌表达制备gtf 2678和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 2678的酶活性(参见下面的实例18)。 [0166] 实例16 [0167] Gtf酶2381(SEQ ID NO：32)的制备 [0168] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的唾液链球菌(Streptococcussalivarius)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号662381(SEQ ID NO：32由SEQ ID NO：31编码；本文中称为“2381”)。使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 2381的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf 2381(SEQ ID NO：32)的核酸产物(SEQ ID NO：31)亚克隆至 以生成标识为pMP96的质粒构建体。该质粒构建体被用 于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TOP10/pMP96的菌株。 [0169] 通过细菌表达制备gtf 2381和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 2381的酶活性(参见下面的实例18)。 [0170] 实例17 [0171] Gtf酶3929(SEQ ID NO：34)和另外的Gtf酶的制备 [0172] 该实例描述了制备一种N末端截短型式的唾液链球菌(Streptococcussalivarius)gtf酶，其标识为GENBANK下GI号387783929(SEQ ID NO：34由SEQ ID NO：33编码；本文中称为“3929”)。 [0173] 使用针对在大肠杆菌中蛋白质表达最优化的密码子合成编码gtf 3929的核苷酸序列(DNA2.0，Inc.)。将编码gtf 3929(SEQ ID NO：34)的核酸产物(SEQ ID NO：33)亚克隆至 以生成标识为pMP97的质粒构建体。该质粒构建体被用于转化大肠杆菌TOP10细胞以生成标识为TQP10/pMP97的菌株。 [0174] 通过细菌表达制备gtf 3929和其酶活性的测定按照在常规方法部分中所公开的步骤进行。在表2中显示了gtf 3929的酶活性(参见下面的实例18)。 [0175] 以类似的方式制备另外的gtf酶。简而言之，制备酶的N末端截短型式，其标识为GENBANK下GI号228476907(一种唾液链球菌(Streptococcus salivarius) gtf，SEQ ID NO：36，本文中称为“6907”)、228476661(一种唾液链球菌(Streptococcus Salivarius)gtf，SEQ ID NO：38，本文中称为“6661”)、334280339(一种解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)gtf，SEQ ID NO：40，本文中称为“0339”)、3130088(一种变异链球菌(Streptococcus mutans)gtf，SEQ ID NO：42，本文中称为“0088”)、24379358(一种变异链球菌(Streptococcus mutans)gtf，SEQ ID NO：44，本文中称为“9358”)、 325978242(一种解没食子酸链球菌(Streptococcus gallolyticus)gtf，SEQ ID NO：46，本文中称为“8242”)、324993442(一种犬血链球菌(Streptococcus sanguinis)gtf，SEQ ID NO：48，本文中称为“3442”)、47528(一种唾液链球菌(Streptococcus salivarius)gtf，SEQ ID NO：50，本文中称为“7528”)、322373279(一种链球菌属(Streptococcus sp.)gtf，SEQ ID NO：52，本文中称为“3279”)、170016491(一种柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)gtf，SEQ ID NO：54，本文中称为“6491”)、228476889(一种唾液 链球菌(Streptococcus salivarius)gtf，SEQ ID NO：56，本文中称为“6889”)、51574154(一种路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)gtf，SEQ ID NO：58，本文中称为“4154”)、和 322373298(一种链球菌属(Streptococcus sp.)gtf，SEQ ID NO：59，本文中称为“3298”)，并测试酶活性(表2，参见下面实例18)。 [0176] 实例18 [0177] 制备带有Gtf酶的不溶解的葡聚糖聚合物 [0178] 这个实例描述了使用在以上实例中制备的Gtf酶以合成葡聚糖聚合物。 [0179] 按照在常规方法部分中所公开的步骤，用上述gtf酶各自进行反应。简而言之，制备gtf反应溶液，其包含蔗糖(50g/L)，磷酸钾缓冲液(pH6.5，50mM)和Gtf酶(按体积计2.5％提取物)。在22-25℃下24-30小时后，通过离心收获不溶解的葡聚糖聚合物产物，用水洗三次，用乙醇洗一次，在50℃下干燥24-30小时。 [0180] 按照在常规方法部分中所公开的步骤，通过13C NMR来测定来自每个反应的不溶解的葡聚糖聚合物中的糖苷键，通过SEC测定每种产物的DPn。在表2中显示了这些分析的结果。 [0181] 表2 [0182] 由各种Gtf酶制备的葡聚糖的键和DPn [0183] [0184] [0185] 若干gtf酶制备了不溶解的葡聚糖产物(表2)。然而，仅Gtf酶6855(SEQ ID NO：4)、7527(gtfJ，SEQ ID NO：8)、1724(SEQ ID NO：10)、0544(SEQ ID NO：12)、5926(SEQ ID NO：14)、2765(SEQ ID NO：20)、0427(SEQ ID NO：26)、2919(SEQ ID NO：28)、2678(SEQ ID NO：30)、和3929(SEQ ID NO：34)制备了包含至少50％的α-1，3键和具有至少100的DPn的葡聚糖。因此这些酶适用于制备用于纤维应用的葡聚糖聚合物。 [0186] 仅gtf 6855(SEQ ID NO：4)、7527(gtfJ，SEQ ID NO：8)、1724(SEQ ID NO：10)、5926(SEQ ID NO：14)、2765(SEQ ID NO：20)、0427(SEQ ID NO：26)、2919(SEQ ID NO：28)、 2678(SEQ ID NO：30)、和3929(SEQ ID NO：34)制备了包含100％的α-1，3键和具有至少 100的DPn的葡聚糖。这些结果，其中在三十种gtf中仅有九种能够制备具有100％的α-1， 3键和至少100的DPn的葡聚糖，表明并非所有的Gtf酶能够制备具有高水平的α-1，3键的高分子量、不溶解的葡聚糖。更少的Gtf酶能制备包含100％的α-1，3键和具有至少250的DPn的葡聚糖聚合物。 [0187] 因此，鉴定了能够制备包含100％的α-1，3键和至少100的DPn的葡聚糖聚合物。这些酶能用于制备适用于制备纤维的葡聚糖。 |
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