新型糖基转移酶基因及其使用 |
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| 申请号 | CN201380005375.0 | 申请日 | 2013-01-16 | 公开(公告)号 | CN104066840A | 公开(公告)日 | 2014-09-24 |
| 申请人 | 三得利控股株式会社; | 发明人 | 田中良和; 兴津奈央子; 松井啓祐; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供编码具有在黄 酮 4’位羟基上转移糖的活性的 蛋白质 的多核苷酸。一种多核苷酸，其选自(a)多核苷酸，其由序列号1的 碱 基序列组成；(b)多核苷酸，其为与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交的多核苷酸，且编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质；(c)多核苷酸，其编码由序列号2的 氨 基酸序列组成的蛋白质；(d)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质等。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种多核苷酸，其特征在于，选自以下(a)～(e)： |
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| 说明书全文 | 新型糖基转移酶基因及其使用技术领域背景技术[0002] 花卉产业中，具有新性状的花总是备受珍重。特别是改变了作为花中最重要的性状即“花色”的植物的开发在产业很受重视，至今为止，利用古老方法通过杂交进行品种改良已开发出各种各样颜色的花。杂交虽然是有效的品种改良方法，但因植物中的固有的遗传限制，所以存在只能利用可杂交的近缘种所具有的基因资源的缺点。例如，尽管进行了长年的杂交育种，但至今为止在月季、康乃馨、菊花、百合中还未育出紫色～蓝色，龙胆、鸢尾中还未育出鲜艳的红色，老鹳草、牵牛花中还未育出黄色的品种。 [0003] 花的颜色由类黄酮、类胡萝卜素、叶绿素、甜菜素的4种色素生成。其中，类黄酮呈现黄、红、紫、蓝等多种颜色。呈现红、紫、蓝色的1组总称为花色素苷，花色素苷结构的丰富多彩是花色丰富多彩的原因之一。考虑到花色素苷的生物合成途径时，其依赖于苷元的结构，大致可分为3个组。如康乃馨、老鹳草的鲜艳的红色花中富含花葵素型花色素苷，蓝色、紫色花中富含花翠素型花色素苷。月季、康乃馨、菊花、百合中不存在蓝、紫色的品种，是因为这些植物不具有合成花翠素型花色素苷的能力。 [0004] 为了使花色变蓝，不仅要积累花翠素，认为还需要(i)花色素苷被1个或多个芳香族酰基修饰，(ii)花色素苷与黄酮、黄酮醇等的辅色素共存，(iii)铁离子、铝离子与花色素苷共存，(iv)花色素苷所定位的液胞的pH从中性上升到弱碱性，或(v)花色素苷、辅色素、金属离子形成复合物(这样的花色素苷称为金属花色素苷(metalloanthocyanin))中的任一条件(以下的非专利文献1)。 [0005] 类黄酮、花色素苷的生物合成已被充分研究，并鉴定了相关的生物合成酶、编码该酶的基因(参照以下非专利文献2、图1)。例如，已从大量植物中获得了花翠素生物合成所必需的羟化类黄酮B环的类黄酮3’，5’-羟化酶(F3’5’H)的基因。此外，通过将这些F3’5’H基因转入康乃馨(参照以下专利文献1)、月季(参照以下非专利文献3、专利文献2、3)、菊花(参照以下专利文献4)，可育出在花瓣内积累花翠素，使花色变蓝的基因重组植物(参照以下非专利文献4)。此种康乃馨和月季已有市售。 [0006] 黄酮(flavone)为有机化合物的一种，黄烷衍生物的环状酮，狭义上指化学式C15H10O2、分子量222.24的化合物、2，3-二脱氢黄烷-4-酮(2,3-didehydroflavan-4-one)。广义上将属于黄酮类的衍生物称为“黄酮”。广义的黄酮(黄酮类)是类黄酮的生 物类别之一，类黄酮中以黄酮结构为基本骨架，而且3位上不具有羟基的类黄酮分类为“黄酮”。作为代表性的“黄酮”，可列举为芹菜素(apigenin；4',5,7-三羟基黄酮(4',5,7-trihydroxyflavon e))、木犀草素(luteolin；3',4',5,7-四羟基黄酮(3',4',5, 7-tetrahydroxyflavone))。本申请说明书中，用语“黄酮”是指广义的黄酮、即属于黄酮类的衍生物。 [0007] 还可从大量的植物中获得黄酮生物合成中所必需的黄酮合成酶(FNS)基因。已知黄酮与花色素苷共存时，具有使花色素苷的颜色变蓝变深的效果，这些FNS基因在花色改变中引人注目。通过将FNS基因与F3’5’H一起转入不具有合成黄酮能力的月季中，可在花瓣中积累花翠素的同时也积累黄酮，从而使花色变得更蓝(参照以下专利文献5)。而且，因黄酮除了使花色变蓝以外，还吸收紫外线，所以，可保护植物不受紫外线伤害，或在虫媒花中作为发送给昆虫视觉的信号而发挥功能。此外，黄酮还与植物和土壤微生物之间的相互作用有关。而且，黄酮作为对健康有益的成分还用作食品、化妆品的材料。例如，黄酮被认为具有抗癌作用，已证实通过摄取大量含有黄酮的食物材料，可治疗和预防癌症。 [0008] 此外，还从大量植物中得到修饰花色素苷、黄酮的基因。虽具有糖基转移酶、酰基转移酶、甲基转移酶等，但在此记载的是有关催化糖苷化反应的糖基转移酶(GT)。例如，编码具有在花色素苷3位羟基上转移葡萄糖的活性的蛋白质的基因已从龙胆、紫苏、矮牵牛、月季、金鱼草等中分离(参照以下非专利文献4～6、专利文献6)。编码具有在花色素苷5位羟基上转移葡萄糖的活性的蛋白质的基因已从紫苏、矮牵牛、龙胆、马鞭草、蓝猪耳等中分离(参照以下非专利文献5～7、专利文献7)。编码具有在黄酮7位羟基上转移葡萄糖的活性的蛋白质的基因已从拟南芥中分离(参照以下非专利文献8)。还报道了编码具有在黄芩苷7位羟基上转移葡萄糖的活性的蛋白质的基因已从黄芩中分离，该基因在大肠杆菌中表达的蛋白质催化显示在类黄酮7位羟基上转移葡萄糖的活性的反应(参照以下非专利文献9)。编码具有在花色素苷3’位羟基上转移葡萄糖的活性的蛋白质的基因已从龙胆、蝶豆、瓜叶菊中分离(参照以下专利文献8)。而且，编码具有在花色素苷A环和C环2处不同羟基上依次转移葡萄糖的活性的蛋白质的基因已从月季中分离(参照以下专利文献9)。 编码具有在花色素苷B环不同的2处羟基上依次转移葡萄糖的活性的蛋白质的基因已从蝶豆中分离(参照以下专利文献10)。 [0009] 所述糖基转移酶以UDP-葡萄糖为糖供体，但最近，以酰基葡萄糖为糖供体的糖基转移酶也已被鉴定。编码具有在花色素苷-3葡萄糖苷5位羟基上转移葡萄糖的活性的蛋白质的基因已从康乃馨中分离，编码具有在7位羟基上转移葡萄糖的活性的蛋白质的基因已从飞燕草中分离(参照以下非专利文献10)。 [0010] 如此，作为糖基转移酶，存在大量各种各样的具有在羟基上转移葡萄糖的活性的蛋白质。 [0011] 但是，认为还留有很多其功能还未得到鉴定的糖基转移酶。例如，还未鉴定出编码具有在类黄酮4’位上转移糖的活性的蛋白质的基因、编码具有在类黄酮A环和B环2处羟基上依次转移糖的活性的蛋白质的基因。虽已报道了使来自彩虹菊的糖基转移酶基因在大肠杆菌中表达的蛋白质在体外试验(in vitro)中，显示出在类黄酮4’位或7位的任一个羟基上转移葡萄糖的活性，但该糖基转移酶在植物体中原本的活性为在苄胍5位羟基上转移葡萄糖(参照以下非专利文献11)。 [0012] 可是，以鸭跖草、矢车菊、串红、喜林草的色素为代表的金属花色素苷(metalloanthocyanin)由6分子花色素苷、6分子黄酮及2原子金属离子组成，各成分集合在一起而形成稳定的蓝色色素(参照图2、非专利文献1)。例如，喜林草的金属花色素苷(metalloanthocyanin)由Nemophilin(参照图3)、丙二酰芹菜素4’，7-二葡萄糖苷(参照 2+ 3+ 图4)、Mg 及Fe 形成。串红的金属花色素苷(metalloanthocyanin)由cyanosalvianin(参 2+ 照图5)、芹菜素4’，7-二葡萄糖苷(参照图6)及Mg 形成。根据至今为止的研究，可知形成金属花色素苷(metalloanthocyanin)的蓝色花均生物合成了在4’位和7位这两个羟基上附加糖的黄酮，其黄酮上附加的糖在金属花色素苷(metalloanthocyanin)形成中，在分子识别上担负着重要的作用。表明在黄酮的4’位上配位的糖在形成时的分子识别中很重要，7位的糖有助于其稳定性(参照以下非专利文献1)。上述的2个糖附加在黄酮上才形成金属花色素苷(metalloanthocyanin)，而显现美丽的蓝色。此外，蓝色的荷兰鸢尾花瓣中含有4’位上附加糖的黄酮。而且，由于黄酮上附加2个糖而使溶解度升高、物性改变，所以，期待能扩大作为健康食品、医药品、化妆品材料的用途。 [0013] 现有技术文献 [0014] 专利文献 [0015] 专利文献1国际公开第WO2006/105598号公报 [0016] 专利文献2国际公开第WO2010/122849号公报 [0017] 专利文献3国际公开第WO2005/017147号公报 [0018] 专利文献4国际公开第WO2009/062253号公报 [0019] 专利文献5国际公开第WO2008/156211号公报 [0020] 专利文献6国际公开第WO2007/094521号公报 [0021] 专利文献7国际公开第WO99/05287号公报 [0022] 专利文献8国际公开第WO01/092509号公报 [0023] 专利文献9日本特开2006-149293号公报 [0024] 专利文献10日本特开2005-95005号公报 [0025] 非专利文献 [0026] 非专利文献1Natural Product Reports(2009),26,884-915 [0027] 非专利文献2Biosci.Biotechnol.Biochem(2010),74(9),1760-1769 [0028] 非专利文献3Plant Cell Physiol(2007),48(11),1589-1600 [0029] 非专利文献4Plant Cell Physiol(1996),37(5),711-716 [0030] 非专利文献5J.Biol.Chem(1999),274(11),7405-7411 [0031] 非专利文献6Plant Molecular Biology(2002),48,401-411 [0032] 非专利文献7Journal of Experimental Botany(2008),59(6),1241-1252[0033] 非专利文献8Biosci.Biotechnol.Biochem(2006),70(6),1471-1477 [0034] 非专利文献9Planta(2000),210,1006-1013 [0035] 非专利文献10Plant Cell(2010),22(10),3374-89 [0036] 非专利文献11The Plant Journal(1999),19(5),509-519 发明内容[0037] 改变黄酮的物性对改变花色、对食品、医药品、化妆品材料的开发非常需要。例如，虽然积累了花翠素的康乃馨、月季、菊花的颜色为蓝紫色，但还在进行使该颜色变得更蓝的研究。 [0038] 在这种状况下，本发明要解决的课题在于，提供编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的多核苷酸及其使用。 [0039] 为解决上述课题，本发明申请人深入研究，不断实验的结果，确认出可分离编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的多核苷酸，并使用该多核苷酸，从而完成了本发明。 [0040] 即本发明如下。 [0041] [1]一种多核苷酸，其特征在于，选自以下(a)～(e)： [0042] (a)多核苷酸，其由序列号1的碱基序列组成； [0043] (b)多核苷酸，其为与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸，且编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质； [0044] (c)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质； [0045] (d)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质；及 [0046] (e)多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质。 [0047] [2]根据所述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，为(a)由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸。 [0048] [3]根据所述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，为(c)编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。 [0049] [4]根据所述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，为(f)编码具有与序列号2的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，且具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的多核苷酸。 [0050] [5]根据所述[4]中所述的多核苷酸，其特征在于，为(g)编码具有与序列号2的氨基酸序列有97％以上同一性的氨基酸序列，且具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的多核苷酸。 [0051] [6]根据所述[5]中所述的多核苷酸，其特征在于，为(h)编码具有与序列号2的氨基酸序列有98％以上同一性的氨基酸序列，且具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的多核苷酸。 [0052] [7]根据所述[1]～[6]中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，为DNA。 [0053] [8]一种蛋白质，其特征在于，由所述[1]～[7]中任一项所述的多核苷酸编码。 [0054] [9]一种载体，其特征在于，含有所述[1]～[7]中任一项所述的多核苷酸。 [0055] [10]一种非人宿主，其特征在于，转入所述[9]中所述的载体。 [0056] [11]一种方法，其特征在于，使用所述[1]～[7]中任一项所述的多核苷酸在黄酮4’位羟基上附加糖。 [0057] [12]一种植物或者其后代或它们的部分或者组织，其特征在于，转入所述[1]～[7]中任一项所述的多核苷酸且含有该多核苷酸。 [0058] [13]根据所述[12]中所述的植物的部分，其特征在于，为切花。 [0059] [14]一种切花加工品，其特征在于，使用所述[13]中所述的切花。 [0060] [15]一种具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的制造方法，其特征在于，包含以下工序： [0061] 培养所述[10]中所述的非人宿主或使其生长发育，且 [0062] 从该非人宿主中提取具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质。 [0063] [16]一种在4’位羟基上附加糖的黄酮的制造方法，其特征在于，包含以下工序： [0064] 培养所述[10]中所述的非人宿主或使其生长发育，且 [0065] 从该非人宿主中提取在4’位羟基上附加糖的黄酮。 [0066] [17]一种食品，其特征在于，含有通过所述[16]中所述的制造方法制造的在4’位羟基上附加糖的黄酮。 [0067] [18]一种医药品，其特征在于，含有通过所述[16]中所述的制造方法制造的在4’位羟基上附加糖的黄酮。 [0068] [19]一种化妆品，其特征在于，含有通过所述[16]中所述的制造方法制造的在4’位羟基上附加糖的黄酮。 [0069] 通过使本发明的多核苷酸在适当的宿主细胞内表达，可制造具有在黄酮4’位羟基上特异性转移糖的活性的蛋白质。根据本发明，通过使具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质在植物内组成型或组织特异性表达，从而可用于改变花色。 [0070] 通过将具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质例如转入如月季的原本即具有在黄酮7位羟基上转移糖的活性的植物中，生成在4’位和7位这两个羟基上附加糖的黄酮。或通过使具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质与具有在黄酮7位羟基上转移糖的活性的蛋白质一起在植物体内表达，而生成在4’位和7位这两个羟基上附加糖的黄酮。 [0072] 图1为说明花色素苷的生物合成途径的图。 [0073] 图2为金属花色素苷(metalloanthocyanin)结构的概要图。 [0074] 图3为来自喜林草的花色素苷(Nemophilin)的结构式。 [0075] 图4为来自喜林草的黄酮(丙二酰芹菜素4’，7-二葡萄糖苷)的结构式。 [0076] 图5为来自串红的花色素苷(cyanosalvianin)的结构式。 [0077] 图6为来自串红的黄酮(芹菜素4’，7-二葡萄糖苷)的结构式。 [0078] 图7为使花瓣提取液与芹菜素进行酶反应的液体的高效液相色谱。 [0079] 图8为说明芹菜素4’，7-二葡萄糖苷的生物合成途径的图。 [0080] 图9为使NmGT8蛋白质溶液与芹菜素进行酶反应的液体的高效液相色谱。 [0081] 图10为使NmGT8蛋白质溶液与芹菜素7-葡萄糖苷进行酶反应的液体的高效液相色谱。 [0082] 图11为归纳NmGT8蛋白质与在黄芩素5位上附加糖的酶对各种类黄酮底物的反应性的图。 [0083] 图12-1为将NmGT8和NmGT3的氨基酸序列进行比对的比对图。 [0084] 图12-2为将NmGT8和NmGT4的氨基酸序列进行比对的比对图。 [0085] 图12-3为将NmGT8和NmGT3及NmGT4的氨基酸序列进行比对的比对图。 [0086] 图13为将NmGT8与在金鱼草的查耳酮4’位上附加糖的酶的氨基酸序列进行比对的比对图。 [0087] 图14为将NmGT8与在月季的花色素3位和5位上附加糖的酶的氨基酸序列进行比对的比对图。 [0088] 图15为以本发明的NmGT8与所述诸酶的关系为指标的系统树。 [0089] 图16为含有转入蓝猪耳的NmGT8的构建物(pSPB4583)。 [0090] 图17为含有转入矮牵牛的NmGT8的构建物(pSPB5424、5428)。 [0091] 图18为转入NmGT8的重组矮牵牛的花瓣提取液的高效液相色谱。 [0092] 图19为转入了NmGT8的重组矮牵牛的花瓣提取液(250-1250m/z)的提取正离子色谱图。 [0093] 图20为含有转入康乃馨的NmGT8的构建物(pSPB5433)。 [0094] 图21为含有转入月季的NmGT8的构建物(pSPB4577、4578、5437、5440)。 [0095] 图22为转入NmGT8的重组月季的花瓣提取液的高效液相色谱。 [0096] 图23为转入NmGT8的重组月季的花瓣提取液(250-1250m/z)的提取正离子色谱图。 具体实施方式[0097] 本发明涉及一种多核苷酸，其选自以下(a)～(e)： [0098] (a)多核苷酸，其由序列号1的碱基序列组成； [0099] (b)多核苷酸，其为与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸，且编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质； [0100] (c)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质； [0101] (d)多核苷酸，其编码由序列号2的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成，且具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质；及 [0102] (e)多核苷酸，其编码具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质。 [0103] 本说明书中，用语“多核苷酸”是指DNA或RNA。 [0104] 本说明书中，用语“严谨条件”是指使多核苷酸或寡核苷酸与基因组DNA的选择性且可检测的特异性结合可进行的条件。严谨条件由盐浓度、有机溶剂(例如，甲酰胺)、温度及其他公知条件的适当组合来定义。即通过减少盐浓度、增加有机溶剂浓度或使杂交温度上升来增加严谨性(stringency)。而且，杂交后的洗涤条件也影响严谨性。该洗涤条件还由盐浓度和温度定义，根据盐浓度的减少和温度的上升来增加洗涤的严谨性。因此，用语“严谨条件”是指仅在各碱基序列间的“同一性”或“同源性”的程度例如整体平均为约80％以上，优选为约90％以上，更优选为约95％以上，进一步优选为97％以上，最优选为98％以上的具有高同源性的碱基序列间之间进行特异性杂交的条件。作为“严谨条件”，例如可列举温度为60℃～68℃中，钠浓度为150～900mM，优选为600～900mM，pH6～8的条件，作为具体例，可列举在5xSSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠)、1％SDS、5xDenhardt溶液50％甲醛及42℃的条件下进行杂交，在0.1x SSC(15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠)、0.1％SDS及55℃的条件下进行洗涤。 [0105] 杂交例如可根据Current protocols in molecular biology(edited by Frederick M.Ausubel et al.,1987)中所记载的方法等、本领域技术人员公知的方法或依照这些的方法来进行。此外，使用市售的文库时，可根据附带的使用说明书中记载的方法进行。作为此种通过杂交而选择的基因，可来自天然，例如来自植物，也可以来自植物以外。且通过杂交而选择的基因可以是cDNA，也可以是基因组DNA，还可以是化学合成的DNA。 [0106] 上述“1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列”是指例如1～20个，优选为1～5个，更优选为1～3个任意数量的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列。作为基因工程的方法之一的定点诱变法因为是可在特定位置转入特定突变的方法，所以有用，可根据Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989等中记载的方法进行。 通过将该突变DNA使用适当的表达体系表达，可得到由1或多个的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列组成的蛋白质。 [0107] 而且，本发明所涉及的DNA可根据本领域技术人员公知的方法，例如亚磷酰胺法等化学合成的方法，以植物的核酸试样为模板，使用基于目的基因的核苷酸序列设计的引物的核酸扩增法等得到。 [0108] 本说明书中，用语“同一性”及“同源性”是指在多肽序列(或氨基酸序列)或多核苷酸序列(或碱基序列)中的2条链之间，在构成该链的各氨基酸残基之间或各碱基之间的适合关系中，可确定为同一的量(数)，指2个多肽序列或2个多核苷酸序列之间的序列相关性的程度，“同一性”及“同源性”可容易地计算出。已知很多测定2个多核苷酸序列或2个多肽序列间的同源性的方法，用语“同一性”及“同源性”为本领域技术人员所周知(例如，参照Lesk,A.M.(Ed.),Computational Molecular Biology,Oxford University Press,New York,(1988)；Smith,D.W.(Ed.),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Academic Press,New York,(1993)；Grifin,A.M.&Grifin,H.G.(Ed.),Computer Analysis of Sequence Data:Part I,Human Press,New Jersey,(1994)；von Heinje,G.,Sequence Analysis in Molecular Biology,Academic Press,New York,(1987)；Gribskov,M.&Devereux,J.(Ed.),Sequence Analysis Primer,M-Stockton Press,New York,(1991)等)。 [0109] 此外，本说明书中所述的“同一性”及“同源性”的数值除了特殊说明的情况以外，可为使用本领域技术人员公知的同源性搜索程序计算出的数值，优选为使用Mac Vector应用程序(Version9.5、Oxford Molecular Ltd.，Oxford，England)的ClustalW程序计算出的数值。 [0110] 本发明的多核苷酸(核酸、基因)为“编码”所着眼的蛋白质的多核苷酸(核酸、基因)。在此，“编码”是指使所着眼的蛋白质在具备其活性的状态下表达。此外，“编码”包含将所着眼的蛋白质用连接的结构序列(外显子)编码，或介由介导序列(内含子)编码的两者的含义。 [0111] 具有与生俱来的碱基序列的基因如以下实施例中记载，例如，通过DNA测序仪的分析而得到。而且，编码具有经修饰的氨基酸序列的酶的DNA以具有与生俱来的碱基序列的DNA为基础，可使用常用的定点诱变、PCR法合成。例如，将希望修饰的DNA片段通过与生俱来的cDNA或基因组DNA的限制性内切酶处理而得到，并以此为模板，使用转入所需突变的引物实施定点诱变、PCR法，得到所需的修饰的DNA片段。其后，将转入该突变的DNA片段与编码目的酶的其他部分的DNA片段连接即可。 [0112] 或者，为了得到编码由缩短了的氨基酸序列组成的酶的DNA，例如，将编码比目的氨基酸序列长的氨基酸序列，例如编码全长氨基酸序列的DNA用所需限制性内切酶切割，其结果，所得到的DNA片段不编码目的氨基酸序列的整体的情况下，合成由不足部分的序列组成的DNA片段,并连接即可。 [0113] 此外，通过使所得到的多核苷酸在使用大肠杆菌及酵母中的基因表达体系表达，并测定酶活性，可确认所得到的多核苷酸编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质。而且，通过使该多核苷酸表达，可得到作为多核苷酸产物的具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质。或者即使使用由序列号2记载的氨基酸序列组成的多肽的抗体，也可获得具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质，还可使用所涉及的抗体，将编码来自其他生物的具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的多核苷酸进行克隆。 [0114] 本发明涉及包含所述多核苷酸的(重组)载体、特别是表达载体,进而涉及由该载体转化的宿主。 [0115] 作为宿主，可使用原核生物或真核生物。作为原核生物，可使用细菌，例如可使用属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)，芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等常用的宿主。作为真核生物，可使用低等真核生物，例如真核微生物，例如作为真菌的酵母或丝状菌。 [0116] 作为酵母，例如可列举酵母属(Saccharomyces)微生物，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等，此外，作为丝状菌，可列举曲霉属(Aspergillus)微生物，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)，青霉属(Penicillium)微生物。作为宿主，可进一步使用动物细胞或植物细胞，作为动物细胞，可使用小鼠、仓鼠、猴子、人等的细胞系，而且昆虫细胞，例如蚕细胞、蚕的成虫其自身也作为宿主使用。 [0117] 本发明的表达载体依赖于转入它们的宿主的种类，含有表达调控区，例如启动子、终止子及/或复制起点等。作为细菌用表达载体的启动子，使用常用的启动子，例如trc启动子、tac启动子、lac启动子等，作为酵母用启动子，例如可使用3－磷酸甘油醛脱氢酶启动子、PH05启动子等，且作为丝状菌用启动子，例如可使用淀粉酶启动子、trpC启动子等。此外，作为动物细胞宿主用启动子，可使用病毒性启动子，例如SV40早期启动子、SV40晚期启动子等。 [0118] 作为在植物细胞内使多核苷酸组成型表达的启动子的例子，可列举花椰菜花叶病毒的35SRNA启动子、rd29A基因启动子、rbcS启动子、mac-1启动子等。此外，为了进行组织特异性的基因表达，可使用在其组织中特异性表达的基因的启动子。 [0119] 表达载体的制备可使用限制性内切酶、连接酶等根据通常方法进行。此外，通过表达载体的宿主的转化也可根据通常方法进行。 [0120] 将通过所述表达载体转化的宿主进行培养、栽培或使其生长发育，从培养物或培养基中，根据通常方法，例如通过过滤、离心分离、细胞破碎、凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法等回收·纯化，可得到目的蛋白质。 [0121] 本说明书中，对于来自喜林草的编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的基因已有记述，但本发明所涉及的多核苷酸不限于来自喜林草的基因，作为编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的基因的起源，可为植物、动物，也可为微生物，只要具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性，无论起源如何，均可用于植物中花色的改变。 [0122] 本发明也涉及通过将编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的外源性多核苷酸转入植物，并使其在该植物内含有而得到的植物或其后代或这些的部分或组织。作为该部分或组织的形态，可以是切花。使用本发明所涉及的编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的多核苷酸，可将黄酮4’位糖苷化，或抑制黄酮4’位的糖苷化，其结果可改变植物中的花色。 [0123] 在目前的技术水平下，可利用在植物中转入多核苷酸，并使该多核苷酸组成型或组织特异性表达的技术。向植物中转入DNA，可通过本领域技术人员公知的方法，例如农杆菌法、双元载体法、电穿孔法、PEG法、基因枪法等进行。 [0124] 作为可转化的植物的例子，可列举月季、康乃馨、菊花、金鱼草、仙客来、兰花、洋桔梗、小苍兰、非洲菊、唐菖蒲、霞草、长寿花、百合、天竺葵、老鹳草、矮牵牛、蓝猪耳、郁金香、红掌、蝴蝶兰、稻子、大麦、小麦、菜籽、马铃薯、番茄、毛白杨、香蕉、蓝桉、番薯、大豆、苜蓿、羽扇豆、玉米、花椰菜、大丽花等，但不限于这些。 [0125] 本发明涉及使用上述切花的加工品(切花加工品)。在此，作为切花加工品，包含使用该切花的干花瓣、保鲜花、干花、树脂密封品等，但不限于此。 [0126] 此外，根据本发明的制造方法制造的在4’位羟基上附加糖的黄酮可用于食品、医药品、化妆品的制造方法等用途。 [0127] 本发明中，根据反义法、共抑制法、RNAi法等，可抑制植物内目的基因的表达。抑制目的基因的表达的方法可根据本领域技术人员公知的方法进行，例如可列举 反 义 RNA/DNA 技 术 [Bioscience&industry,50,322(1992)、化 学 ,46,681(1991)、Biotechnology,9,358(1992)、Trends in Biotechnology,10,87(1992)、Trends in Biotechnology,10,152(1992)、细胞工程,16,1463(1997)]、三螺旋(triple helix)技术[Trends in Biotechnology,10,132(1992)]等。例如，基因表达的抑制可使用包含与本发明的基因的反义链同一的核苷酸序列的全部或一部分的单链核酸分子进行。此种方法作为反义法而已知。反义法中，通过使具有与希望抑制表达的基因互补的序列的RNA高水平表达，可抑制靶基因的表达。该方法中，可使用包含与本发明所涉及的多核苷酸(基因)的反义链同一的核苷酸序列的全部的单链RNA。此外，上述方法中，还可使用包含与本发明的基因的反义链同一的核苷酸序列的一部分的单链RNA。此种一部分的单链RNA只要是可抑制本发明的基因的表达即可，只要是本领域技术人员即可适当设计，但优选为与本发明的基因特异性的物质，其链长优选为5～100核苷酸，更优选为5～50核苷酸，进一步优选为10～20核苷酸。 [0128] 基因表达的抑制可使用与本发明所涉及的基因的正义链同一的核苷酸序列的全部或一部分的单链核酸分子进行。即该正义单链核酸与上述反义单链核酸同样，可用于本发明的基因表达的抑制。该方法中，可使用与本发明的基因的正义链同一的核苷酸序列的全部的单链RNA进行。此外，上述方法中，还可使用包含与基因的正义链同一的核苷酸序列的一部分的单链RNA。只要此一部分的单链RNA可抑制本发明的基因的表达即可，只要是本领域技术人员即可适当设计，但优选为与本发明的基因特异性的物质，其链长优选为5～100核苷酸，更优选为5～50核苷酸，进一步优选为10～20核苷酸。 [0129] 而且，基因表达的抑制使用包含与本发明的基因同一的核苷酸序列的全部或一部分的双链核酸分子进行。例如，通过使用该双链核酸分子，可使被子植物中本发明的基因的反义或正义单链核酸表达。本发明的双链核酸分子优选为DNA，其链长及具体的核苷酸序列为与目的单链核酸分子的链长及核苷酸序列对应的序列。例如，使上述反义单链核酸表达时，本发明的双链核酸分子为含有作为编码链的本发明的基因的反义链的物质。此外，使上述正义单链核酸表达时，本发明的双链核酸分子为含有作为编码链的本发明的基因的正义链的物质。 [0130] 双链核酸分子可使用本领域技术人员公知的方法在植物中表达。例如，通过将包含启动子、本发明的双链核酸分子及转录终止子等的表达载体转入目的植物中，并栽培所得到的植物体，可使双链核酸分子表达。向植物中转入表达载体可根据本领域技术人员公知的方法，例如农杆菌法、双元载体法、电穿孔法、PEG法、基因枪法等进行。 [0131] 作为使用本发明的核酸分子的基因表达的抑制法的其他例子，可列举共抑制法。该方法中，具有本发明的基因的全核苷酸序列的正义双链DNA被转入目的植物中。由此，本发明的正义单链RNA表达，并通过该RNA极端抑制该基因的表达(Plant Cell9:1357-1368,1997)。 [0132] 实施例 [0133] 以下根据实施例具体地说明本发明。 [0134] [实施例1：喜林草花瓣中的在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的检测] [0136] 阶段1：未着色、紧实闭合的花蕾(约2-5mm)； [0137] 阶段2：着色、紧实闭合的花蕾(约2-5mm)； [0138] 阶段3：着色、闭合的花蕾、萼片正要张开的花蕾(约5-10mm)； [0139] 阶段4：花瓣正要张开的花蕾(约10-15mm) [0140] 阶段5：完全开放的花 [0141] ＜喜林草花瓣提取液的制备＞ [0142] 期待在生物合成花色素苷前的花瓣的阶段1和2中检测出黄酮糖基转移酶的活性。因此，使用阶段1和2的花瓣，制备花瓣提取液。将500mg花瓣样品(-80℃下保存的阶段1和2的样品各250mg)在液氮中冷却，同时用研钵磨碎，溶解在1.5mL的提取缓冲液(组成；磷酸钾缓冲液(pH7.5)：100mM、二硫苏糖醇(DTT)：1mM、聚乙烯吡咯烷酮40：50mg/mL、蔗糖：100mg/mL)中。将所得到的蛋白质溶液进行离心分离(10000rpm、4℃、10分钟)，在回收的上清中加入硫酸铵至30％的饱和浓度。4℃下搅拌1小时后，离心分离(10000rpm、4℃、10分钟)回收上清。在所得到的上清中添加硫酸铵至饱和浓度70％，4℃下搅拌1小时后，离心分离(10000rpm、4℃、10分钟)，得到沉淀。将该沉淀溶解在500μl的洗脱缓冲液(组成；TrisHCl(pH7.5)：2.5mM、DTT：1mM、脒苯基甲磺酰氟盐酸(APMSF)：10μM)中，使用NAP-5Colums SepHadex G-25DNA Grade(GE Healthcare公司)进行色谱柱纯化，以除去硫酸铵。将该液作为“花瓣提取液”。离心分离中，使用Avanti HP-26XP(转子：JA-2)(BECKMAN COULTER公司)。 [0143] ＜酶活性测定＞ [0144] 混 合 40μl 的 花 瓣 提 取 液、20μl 的 5mM UDP- 葡 萄 糖、20μl 的 1M TrisHCl(pH7.5)、1μl的500ng/μl芹菜素，将在冰上用水调整至200μl的反应液在30℃下保持1小时。其后，加入200μl的停止缓冲液(含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液)使反应停止，将反应液用高效液相色谱法(Prominence(岛津制作所)进行分析。检测器使用岛津PDA SPD-M10AVP在330nm处检测黄酮。色谱柱使用Shim-Pack ODS150mm*4.6mm(岛津制作所)。洗脱使用A液(0.1％TFA水溶液)和B液(含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液)。进行由两者的8：2的混合液到3：7的混合液的10分钟直线浓度梯度洗脱和在此之后5分钟的由3：7的混合液的洗脱。流速为0.6mL/分钟。作为对照，使用在相同条件下使用将花瓣提取液在100℃下热处理20分钟的花瓣提取液进行酶反应的反应液。 [0145] 其结果，不仅生物合成了与芹菜素4’，7-二葡萄糖苷纯品、芹菜素7-葡萄糖苷标准品表示相同的保留时间·最大吸收的黄酮，还生物合成了与芹菜素7-葡萄糖苷表示相近的保留时间的黄酮(参照图7)。不添加UDP-葡萄糖而进行酶反应时，未生物合成任何产物。 [0146] [实施例2：芹菜素4’-葡萄糖苷的保留时间·最大吸收的确定] [0147] 考虑到喜林草花瓣中的芹菜素4’，7-二葡萄糖苷的生物合成途径时，在生物合成芹菜素4’，7-二葡萄糖苷的过程中，芹菜素4’-葡萄糖苷和芹菜素7-葡萄糖苷应作为中间产物生物合成(参照图8)。由此，实施例1中检测出的与芹菜素7-葡萄糖苷表示相近的保留时间的黄酮可判断为芹菜素4’-葡萄糖苷(参照图7)。可确定芹菜素4’-葡萄糖苷的保留时间·最大吸收。 [0148] 由上述结果表明，喜林草花瓣中存在具有在依赖UDP-葡萄糖的黄酮4’位和7位羟基上转移糖的活性的蛋白质。有关4’位和7位羟基的糖苷化，认为有1个酶进行两者的糖苷化的可能性，和由各自不同的酶进行4’位和7位羟基的糖苷化的可能性。 [0149] [实施例3：编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的基因的候选基因的获得] [0150] ＜总RNA的分离＞ [0151] 使用Plant RNAeasy Kit(QIAGEN公司)，根据制造者推荐的方法，从喜林草的阶段1和2的花瓣中分离总RNA。 [0152] ＜来自喜林草的花瓣的cDNA的表达分析＞ [0153] 进行来自30μg喜林草的花瓣的总RNA的逆转录反应后，制备均一化cDNA文库。将所制备的文库通过乳液PCR，进行每个克隆的扩增后，通过基因组测序仪FLX(Roche Diagnostics Japan株式会社)进行碱基序列的确定。此外，将所得到碱基序列数据翻译成氨基酸序列，提取与龙胆的花色素苷3’-糖基转移酶的氨基酸序列显示同源性的序列。装配这些序列，得到编码糖基转移酶的候选基因。 [0154] [实施例4：编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的基因的候选基因的全长cDNA序列的获得] [0155] 实施例3中得到25种糖基转移酶基因的序列。对于其中10个基因(NmGT0～9)，进行了用于获得全长cDNA序列的实验。 [0156] 全长cDNA序列的获得使用GeneRacer Kit(invitrogen公司)，根据制造者推荐的方法进行。从实施例3中得到的cDNA部分序列中选择其克隆的特异性区域，以该区域的序列为基础设计RACE用引物，通过RACE PCR得到5’，3’末端序列。以该序列为基础，设计用于扩增全长cDNA序列的引物，以喜林草cDNA为模板，使用KOD-plus polymerase(TOYOBO公司)，根据制造者推荐的方法，以50μl进行PCR反应(94℃保持2分钟，进行30个94℃15秒、55℃30秒、68℃2分钟的循环后，4℃下保持)。喜林草的cDNA使用SuperScriptII Reverse Transcriptase(invitrogen公司)，以实施例2中分离的总RNA为模板，根据制造者推荐的方法合成。引物设计成可在大肠杆菌表达载体pET15b(Novagen公司)上插入NmGT0～9基因，可在全长cDNA的两端包含限制性内切酶位点。使用该PCR生成物，使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit for sequencing(invitrogen)，根据制造者推荐的方法，获得包含NmGT基因全长的质粒(pTOPO-NmGT0～9)。分析插入质粒的碱基序列，从编码具有在黄酮4’位转移糖的活性的蛋白质的基因的候选基因(NmGT0～9)中获得全长cDNA序列(NmGT8：序列号1)。 [0157] [实施例5：具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质候选的酶活性测定实验(使用粗酶的情况)] [0158] ＜大肠杆菌表达构建物的制备＞ [0159] 分别用3μg相当于pTOPO-NmGT0～9的限制性内切酶处理，回收所得到的约1.5kb的DNA片段。2μg的载体pET15b也用限制性内切酶处理，与所得到的DNA片段连接，制备大肠杆菌表达构建物(pET-NmGT0～9)。 [0160] ＜糖基转移酶在大肠杆菌中的表达＞ [0161] 将pET-NmGT0～9使用One Shot BL21(DE3)(invitorgen)，根据制造者推荐的方法，转入大肠杆菌株BL2，获得转化大肠杆菌。将该大肠杆菌使用Overnight Express Autoinduction System1(Novagen公司)，根据制造者推荐的方法培养。在所制备的2mL培养液中，将转化大肠杆菌在37℃下培养至OD600值为0.5(约4小时)。将该大肠杆菌液作为预培养液，加入到50mL的培养液中，27℃下主培养过夜。 [0162] 将主培养过夜的大肠杆菌液进行离心分离(3000rpm、4℃、15分钟)，将集菌后的菌体悬浮于5mL Sonic缓冲液(组成；TrisHCl(pH7.0)：2.5mM、二硫苏糖醇(DTT)：1mM、脒苯基甲磺酰氟盐酸(APMSF)：10μM)中，通过超声波处理粉碎大肠杆菌后，进行离心分离(15000rpm、4℃、10分钟)，回收上清。将其上清作为粗酶液。离心分离使用Avanti HP-26XP(转子：JA-2)(BECKMAN COULTER公司)。 [0163] ＜酶活性测定＞ [0164] 混合80μl的粗酶液、20μl的5mM UDP-葡萄糖、20μl的1M TrisHCl(pH7.5)、1μl的500ng/μl的芹菜素，将在冰上用水调整至200μl的反应液在30℃下保持30分钟。其后，加入200μl的停止缓冲液(含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液)使反应停止，反应液用高效液相色谱法(Prominence(岛津制作所))进行分析。检测器使用岛津PDA SPD-M10AVP检测330nm处的黄酮。色谱柱使用Shim-Pack ODS150mm*4.6mm(岛津制作所)。 洗脱使用A液(0.1％TFA水溶液)和B液(含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液)。进行由 两者的8：2的混合液到3：7的混合液的10分钟直线浓度梯度洗脱和在此之后5分钟的由 3：7的混合液的洗脱。流速为0.6ml/分钟。作为对照，使用在相同条件下使用转入不插入插入片段的pET载体的大肠杆菌的粗酶液而进行酶反应的反应液。 [0165] 其结果，关于NmGT8，可看出底物以外的峰。 [0166] 实施例6以后，对NmGT8(序列号1)加以记载。 [0167] [实施例6：具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的酶活性测定实验(纯化附加了His-Tag的蛋白质的情况)] [0168] ＜糖基转移酶在大肠杆菌中的表达和蛋白质纯化＞ [0169] 将转入实施例5中记载的pET-NmGT8的大肠杆菌株BL2使用Overnight Express Autoinduction System1(Novagen公司)，根据制造者推荐的方法进行培养。在所制备的8mL培养液中，将在37℃下培养转化大肠杆菌至OD600值为0.5(约4小时)。将该大肠杆菌液作为预培养液，加入到200ml的培养液中，25℃下主培养过夜。 [0170] 将主培养过夜的大肠杆菌液进行离心分离(1000×g、4℃、10分钟)，将集菌的菌体悬浮于20ml的提取液(组成；缓冲液(KCl：300mM、KH2PO4：50mM、咪唑：5mM)(pH8.0)、脒苯基甲磺酰氟盐酸(APMSF)：10μM)中，通过超声波处理粉碎大肠杆菌后，离心分离(1400×g、4℃、20分钟)，回收上清。将该上清通过0.45μm过滤器，使用Profinia(Bio-Rad)，根据制造者推荐的方法，进行His-Tag纯化。将所得到的纯化蛋白质溶液使用centrifugal Filters(Ultracel-10K)(Amicon Ultra公司)进行离心分离(7500×g、4℃、15分钟)，将其所浓缩的蛋白质溶液作为“NmGT8蛋白质溶液”。离心分离使用Avanti HP-26XP(转子：JA-2)(BECKMAN COULTER公司)。 [0171] ＜酶活性测定＞ [0172] 混 合 10μl 的 蛋 白 质 溶 液、2μl 的 50mM UDP- 葡 萄 糖、10μl 的 1M TrisHCl(pH7.5)、5μl的1mM芹菜素，将在冰上用水调整至100μl的反应液在30℃下保持20分钟。其后，加入100μl的停止缓冲液(含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液)使反应停止，将反应液用高效液相色谱法(Prominence(岛津制作所))进行分析。检测器使用岛津PDA SPD-M10AVP检测330nm处的黄酮。色谱柱使用Shim-Pack ODS150mm*4.6mm(岛津制作所)。洗脱使用A液(0.1％TFA水溶液)和B液(含有0.1％TFA的90％甲醇水溶液)。 进行由两者的8：2的混合液到3：7的混合液的10分钟直线浓度梯度洗脱和在此之后6分钟的由3：7的混合液的洗脱。流速为0.6mL/分钟。 [0173] 其结果，生物合成与芹菜素4’-葡萄糖苷纯品表示相同的保留时间·最大吸收的黄酮(参照图9)。将底物替换成其他的黄酮即木犀草素，在相同反应条件下进行酶反应时，生物合成了木犀草素4’-葡萄糖苷(参照图11)。另一方面，将底物替换成1mM的芹菜素7-葡萄糖苷，在相同反应条件下进行酶反应时，未生物合成芹菜素4’，7-二葡萄糖苷(参照图10)。同样，将底物替换成1mM的木犀草素7-葡萄糖苷，在相同反应条件下进行酶反应时，也未生物合成木犀草素4’，7-二葡萄糖苷(参照图11)。由此可表明，与芹菜素、木犀草素7位的糖苷化相比，NmGT8蛋白质先进行4’位的糖苷化(参照图8)。而且，在分析图 11中记载的各种类黄酮化合物及相对于苄胍的反应性时，表明NmGT8蛋白质的底物特异性高，可将如芹菜素、木犀草素的黄酮4’位选择性糖苷化(参照图11)。 [0174] 另外，还报道了来自彩虹菊的糖基转移酶基因(Dbs5GT)原本为在苄胍5位羟基上转移葡萄糖的基因，但在体外试验(in vitro)中显示出在类黄酮4’位或7位的任一个羟基上转移葡萄糖的活性。表明该来自彩虹菊的糖基转移酶在相对于类黄酮化合物、苄胍的反应性上，与本发明的NmGT8蛋白质大不相同(参照图11)。 [0175] NmGT8和NmGT3之间、及NmGT8和NmGT4之间的氨基酸序列的同一性分别为32％及32％(参照图12-1～12-3)。该分析中，使用MacVector应用程序(Version11.02、Oxford Molecular Ltd.，Oxfor，dEngland)的ClustalW程序。在已鉴定的糖基转移酶中，与NmGT8同一性最高的氨基酸序列为在月季花色素的3位和5位上附加糖的酶(GenBank accession No.Q4R1I9)，氨基酸序列的同一性为52％(参照图14)。其次，与NmGT8同一性高的氨基酸序列为在金鱼草的查耳酮4’位上附加糖的酶(如PCT/JP2004/019461中记载)，同一性为 51％(参照图13)。 [0176] 此外，图15表示以本发明的NmGT8与所述诸酶的关系为指标的系统树。 [0177] [实施例7：编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的基因在蓝猪耳中的表达] [0178] 为了确认本发明的NmGT8基因是否在植物内翻译具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质，构建用于表达NmGT8的双元载体pSPB4583，转入蓝猪耳(Summer Wave)。所转入的构建物的详细情况如以下所示(参照图16)。 [0179] ＜构建物的制备＞ [0180] pSPB4583以植物转入用双元载体pBINPLUS(vanEngel et al.，Transgenic Reserch4，p288)为基本骨架，包含在花椰菜花叶病毒35S启动子上游具有重复2次的增强子序列的El235S启动子(Mitsuhara et al.，(1996)Plant Cell PHysiol.37，p49)、全长cDNANmGT8和mas终止子。 [0181] ＜基因表达分析＞ [0182] 在含有卡那霉素的选择培养基上形成不定芽，驯化可看见发根的个体，使用各个重组蓝猪耳的萼片未开裂的花蕾的花瓣，进行基因表达分析。总RNA分离与实施例3中记载的方法同样，cDNA合成与实施例4中记载的方法同样进行。逆转录PCR反应以cDNA为模板，使用ExTaq polymarase(Takara公司)，根据制造者推荐的方法，以30μl进行(94℃下保持2分钟，进行25个94℃1分钟、55℃1分钟、72℃下保持2分钟的循环后，4℃下保持)。设计各个全长cDNA特异性扩增的引物。其结果，可确认出蓝猪耳中的NmGT8的转录。 [0183] [实施例8：编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的基因在矮牵牛中的表达] [0184] 构建用于表达NmGT8的双元载体pSPB5424、5428，转入矮牵牛(Surfinia Bouquet red)。矮牵牛因原本不生物合成黄酮，所以，将蓝猪耳黄酮合成酶(如PCT/JP2008/061600中记载，序列号5)一同转入，评价在矮牵牛中NmGT8是否具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性。所转入的构建物的详细情况如以下所示(参照图17)。 [0185] ＜构建物的制备＞ [0186] pSPB5424以pBINPLUS为基本骨架，包含3个表达盒(1.El235S启动子、全长cDNA三色堇F3’5’H(如PCT/JP2004/011958中记载，序列号3)和HSP终止子(Plant Cell Physiology(2010)51，328-332)，2.El235S启动子、全长cDNA蓝猪耳黄酮合成酶和HSP终止子，3.El235S启动子、全长cDNANmGT8和HSP终止子)。 [0187] pSPB5428以pBINPLUS为基本骨架，包含2个表达盒(1.El235S启动子、全长cDNA蓝猪耳黄酮合成酶和HSP终止子，2.El235S启动子、全长cDNANmGT8和HSP终止子)。 [0188] ＜基因表达分析＞ [0189] 在含有卡那霉素的选择培养基上形成不定芽，驯化可看见发根的个体，使用各个重组矮牵牛中完全开放的花的花瓣，与实施例7中记载的方法同样进行基因表达分析。其结果，可确认出矮牵牛中的NmGT8的转录。 [0190] ＜花瓣色素分析＞ [0191] 对于可确认出有关全长cDNA蓝猪耳黄酮合成酶与全长cDNANmGT8的转录产物的系统，进行花瓣的色素分析。将0.2g完全开放的花的花瓣冷冻干燥24小时以上，用刮板(spatula)细细敲碎，加入4mL提取缓冲液(组成；含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液)，超声波下处理20分钟。将其花瓣提取液用高效液相色谱法(Prominence(岛津制作所))进行分析。分析用与实施例5中记载的条件同样的条件进行。作为对照，对未转入基因的非重组矮牵牛与仅转入蓝猪耳黄酮合成酶而生物合成黄酮的重组矮牵牛也同样进行分析(图18)。而且，将稀释50倍的花瓣提取液用液相色谱-串联质谱(岛津制作所)进行分析。检测器使用岛津LCMS-IF-TOF，用433.1057(〔Api-Glc+H〕+)和449.1084(〔Lut-Glc+H〕+)检测。色谱柱使用Inertsil ODS-4(250*4.6mm、5μm)(岛津制作所)。洗脱使用A液(0.1％甲酸水溶液)和B液(含有0.1％甲酸的90％乙腈水溶液)。进行从两者的9：1的混合液到11：9的混合液的35分钟直线浓度梯度洗脱及从11：9的混合液到0：10的混合液的10分钟直线浓度梯度洗脱和在此之后的5分钟由0：10的混合液的洗脱。流速为0.6mL/分钟(图19)。 [0192] 其结果，检测转入黄酮合成酶和NmGT8的重组矮牵牛中的芹菜素4’-葡萄糖苷和木犀草素4’-葡萄糖苷(图18)，可知黄酮4’-葡萄糖苷占生物合成的黄酮的95.6％。还可知剩余的4.4％为由在黄酮7位转移糖的矮牵牛的内在活性而生物合成的黄酮7―葡萄糖苷(图19)。另一方面，可知在非重组矮牵牛中未检测出黄酮，在仅转入蓝猪耳黄酮合成酶的重组矮牵牛中，黄酮7-葡萄糖苷占生物合成的黄酮的82.8％。由此可表明，与具有矮牵牛内源性的在黄酮7位转移糖的活性的蛋白质相比，NmGT8为优先发挥功能的具有在黄酮4’位转移糖的活性的蛋白质。通过利用NmGT8，可在矮牵牛内高效生物合成黄酮4’-葡萄糖苷。 [0193] [实施例9：编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的基因在康乃馨中的表达] [0194] 构建用于使NmGT8表达的双元载体pSPB5433，转入到康乃馨(Cream Cinderella)中。因康乃馨原本不生物合成黄酮，所以将蓝猪耳黄酮合成酶一同转入，评价在康乃馨中NmGT8是否具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性。所转入的构建物的详细情况如以下所示(参照图20)。 [0195] pSPB5433以植物转入用双元载体pWTT2132(DNA Plant Technolo gies,USA＝DNAP)为基本骨架，包含4个表达盒(1.金鱼草查耳酮合成酶启动子(如PCT/AU94/00265中记载)、全长cDNA三色堇F3’5’H和H SP终止子，2.金鱼草查耳酮合成酶启动子、全长cDNA蓝猪耳黄酮合成酶和HSP终止子，3.康乃馨花色素苷合成酶启动子(如PCT/AU/2009/001659中记载)、全长cDNANmGT8和HSP终止子，4.康乃馨花色素苷合成酶启动子、全长cDNANmGT3(日本特愿2011-006317)和HSP终止子)。 [0196] [实施例10：编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的基因在月季中的表达] [0197] 构建用于表达NmGT8的双元载体pSPB4577、4578、5437、5440，转入到月季(Noblesse、Ritapahyumera)中。因月季原本不生物合成黄酮，所以将蓝猪耳黄酮合成酶一同转入，评价在月季中NmGT8是否具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性。所转入的构建物的详细情况如以下所示(参照图21)。 [0198] pSPB4577以pBINPLUS为基本骨架，包含3个表达盒(1.El235S启动子、全长cDNA三色堇F3’5’H和mas终止子，2.El235S启动子、全长cDNA蓝猪耳黄酮合成酶和mas终止子，3.El235S启动子、全长cDNANmGT8和mas终止子)。 [0199] pSPB4578以pBINPLUS为基本骨架，包含3个表达盒(1.紫苏花色素苷3-酰基转移酶启动子(如PCT/JP2010/053909中记载)、全长cDNA三色堇F3’5’H和mas终止子，2.El235S启动子、全长cDNA蓝猪耳黄酮合成酶和mas终止子，3.El235S启动子、全长cDNANmGT8和mas终止子)。[0085]pSPB5437以pBINPLUS为基本骨架，包含5个表达盒(1.El235S启动子、全长cDNA三色堇F3’5’H和HSP终止子，2.紫苏花色素苷3-酰基转移染色体基因(如PCT/JP2010/053886中记载，参照序列号7)，3.El235S启动子、全长cDNA蓝猪耳黄酮合成酶和HSP终止子，4.El235S启动子、全长cDNANmGT8和HSP终止子，5.El235S启动子、全长cDNANmGT3和HSP终止子)。 [0200] pSPB5440以pBINPLUS为基本骨架，包含5个表达盒(1.El235S启动子、全长cDNA三色堇F3’5’H和HSP终止子，2.El235S启动子、cDNA薰衣草花色素苷3-酰基转移酶(如PCT/JP1996/000348中记载，参照序列8)，3.El235S启动子、全长cDNA蓝猪耳黄酮合成酶和HSP终止子，4.El235S启动子、全长cDNANmGT8和HSP终止子，5.El235S启动子、全长cDNANmGT3和HSP终止子)。 [0201] ＜基因表达分析＞ [0202] 在含有卡那霉素的选择培养基上形成不定芽，驯化可看见发根的个体，使用各个重组月季的完全开放的花的花瓣，与实施例7中记载的方法同样进行基因表达分析。其结果，可确认出月季中的NmGT8的转录。 [0203] ＜花瓣色素分析＞ [0204] 对于确认出有关全长cDNA蓝猪耳黄酮合成酶和全长cDNANmGT8的转录产物的系统，进行花瓣的色素分析。将0.2g完全开放的花的花瓣冷冻干燥24小时以上，用刮板(spatula)细细敲碎，加入4mL提取缓冲液(组成；含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液)，超声波下处理20分钟。其花瓣提取液用高效液相色谱法(Prominence(岛津制作所))进行分析。分析用与实施例5中记载的条件同样的条件进行。作为对照，对未转入基因的非重组月季也同样进行分析(图22)。将稀释50倍的花瓣提取液用液相色谱-串联质谱(岛津制作所)进行分析。检测器使用岛津LCMS-IF-TOF，用433.1057(〔Api-Glc+H〕+)和449.1084(〔Lut-Glc+H〕+)检测。色谱柱使用Inertsil ODS-4(250*4.6mm、5μm)(岛津制作所)。洗脱使用A液(0.1％甲酸水溶液)和B液(含有0.1％甲酸的90％乙腈水溶液)。 进行从两者的9：1的混合液到11：9的混合液的35分钟直线浓度梯度洗脱及从11：9的混合液到0：10的混合液的10分钟直线浓度梯度洗脱和在此之后的5分钟由0：10的混合液的洗脱。流速为0.6ml/分钟(图23)。 [0205] 其结果，检测出转入了黄酮合成酶和NmGT8的重组月季中的芹菜素4’-葡萄糖苷和木犀草素4’-葡萄糖苷(图22)，可知黄酮4’-葡萄糖苷占生物合成的黄酮的97.0％。还可知剩余的3.0％为通过在黄酮7位转移糖的月季内在活性而生物合成的黄酮7―葡萄糖苷(图23)。另一方面，非重组月季中未检测出黄酮。由此可表明，与具有月季内源性的在黄酮7位转移糖的活性的蛋白质相比，NmGT8为优先发挥功能的具有在黄酮4’位转移糖的活性的蛋白质。通过利用NmGT8，可在月季内高效生物合成黄酮4’-葡萄糖苷。 [0206] 本发明中，首次鉴定了编码具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质的多核苷酸。通过使本发明的多核苷酸在适当的宿主细胞内表达，可制造具有在黄酮4’位羟基上特异性转移糖的活性的蛋白质。根据本发明，通过使具有在黄酮4’位羟基上转移糖的活性的蛋白质在植物内组成型或组织特异性表达，可用于花色的改变。此外，通过本发明，也可提供在4’位羟基上附加糖的黄酮的制法及根据该制法得到的食品、医药品、化妆品等。 |
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