[0001] 本发明涉及以α-D-吡喃葡萄糖基-（1→3′）-腺苷及/或α-D-吡喃葡萄糖基-（1→5′）-腺苷（以下，各称为“3′-葡萄糖基腺苷”及“5′-葡萄糖基腺苷”，另外，它们有时总称为“葡萄糖基腺苷”）作为有效成分而成的持续性的抗皱纹用皮肤外用剂。 【背景技术】

[0002] 皮肤形成身体的最外层，由实现从外界保护活体的同时防体内的水分或营养分漏出到外界的作用的外侧的薄的表皮（上皮组织），和有主要成纤维细胞、胶原（胶原）纤维、弹性纤维、蛋白聚糖等复合性地以三维状扩展的结构，给皮肤带来强度、伸展性及弹力性等的有厚度的真皮（结缔组织）构成。皮肤的状态通过表皮和真皮一同维持各自的健全的组织结构及生理功能而保持。

[0003] 皮肤的表皮从真皮侧分为“基底层”、“棘层”、“颗粒层”及“角质层（角层）”，主要由被称为角化细胞（角化细胞）的细胞构成。角化细胞在最下层的基底层作为有分裂能力的未成熟的细胞形成单层，分裂增殖而叠在上层的同时在该过程分化（“角化”），最终成为作为无核的死细胞的角质细胞而形成角质层，在其表层部分成垢而脱落。在皮肤表皮，通过此角化细胞的增殖、移动、分化、然后脱落的过程以一定的周期圆滑地更新而保持其恒定性。 [0004] 但是，皮肤由年龄的增加、干燥、氧化、太阳光（紫外线）等的各种各样的要因劣化而失去水分，以皱纹的发生为始，呈松弛的发生、张力或弹力性的降低等各种各样的现象。那样的皮肤的劣化被认为是，由真皮中的成纤维细胞的胶原合成降低而真皮中的胶原量减少是1个大的原因，为了改善胶原量的减少而开发了配合胶原或胶原产生增强 剂的多种皮肤外用剂或食品等（参照例如，专利第3495217号公报及特开2007-186471号公报）。 [0005] 另一方面，在形成身体的最外层的表皮中也发生成为皱纹的发生等的要因的不期望的状态。即，构成表皮的角化细胞的增殖及分化被抑制，从下层的角质细胞的供给及上层中的角质层的形成减少，通过角质层的更新受阻滞，发生角质层的肥厚化及水分量的减少等，还有由角质层的保湿功能及屏障功能降低。另外，由低湿度环境，或过量的皮肤清洗、年龄的增加、体质等而皮肤的干燥进行，则发生易引起角质层的多重剥离，皮肤光泽降低，化妆变差等的弊害，进而，发生皱纹的发生或皮肤粗糙等的问题。为了改善此问题，进行促进角化细胞的增殖或分化的尝试，提案了配合具有角化细胞分化促进活性的物质的用于皮肤的组合物（参照例如，特表2001-510777号公报或特表平8-507289号公报）。

[0006] 如上所述，多数提案了改善以皱纹的发生为首的皮肤状态的劣化、即，真皮中的产生胶原的能力的降低及表皮中的角质层的更新的劣化的各种各样的物质及皮肤中使用的组合物。但是由于，它们均仅着眼于改善表皮或真皮的任何一方的症状，无法充分满足其抗皱纹作用，期望改善表皮和真皮的两方的症状，可总地保持皮肤的恒定性的，带来高的抗皱纹作用的皮肤外用剂的开发。作为有这样的功能的物质，在特开2009-149557号公报中公开了促乳素，但由于促乳素是肽，在制剂化之时或作为外用剂用于皮肤时的稳定性、向基底层的渗透性等的方面有问题。为了解决这些的问题，尚强烈期望作用于表皮和真皮的两方而有优良的抗皱纹作用的同时，其效果的持续性也优良的新颖的成分及使用其的皮肤外用剂。【发明内容】

[0007] 本发明鉴于如上述一样的事情，以提供有辅助表皮和真皮两方的组织结构及生理功能的改善，带来皮肤改善效果，维持皮肤的正常的状态的作用，并且，适用于皮肤也稳定且对活体不带来恶影响而安全 的，新颖的持续性的抗皱纹用的皮肤外用剂作为课题。 [0008] 本发明人为了解决上述课题着眼于核酸关联的物质，重复锐意研究，重复各种试行错误之过程中，从对活体的安全性的方面考虑，选择作为在活体内原本存在的成分的腺苷进行研究。对于腺苷自体，已知有增强真皮中的胶原产生增强作用或毛乳头细胞的角化细胞增殖的作用（例如，国际公开WO05/034902号单行本或国际公开WO05/044205号单行本）、但由本发明人的研究判明，腺苷被在活体内原本存在的酶快速代谢，有其效果难持续的情况，再者，腺苷对亲水性溶剂的溶解度低，配合于皮肤外用剂时，伴随处理困难。本发明人为了解决这样的问题，再者重复研究时发现，在腺苷的3′位或5′位（腺苷分子中的核糖的3位或5位）的羟基上α结合1分子D-葡萄糖的3′-葡萄糖基腺苷及/或5′-葡萄糖基腺苷作用于表皮角化细胞，有相比腺苷更显著地优良的角化细胞增殖及分化促进作用。

[0009] 再者，本发明人发现，上述葡萄糖基腺苷也作用于真皮的成纤维细胞，有相比腺苷更显著地优良的胶原产生增强作用。

[0010] 再者，本发明人发现，上述葡萄糖基腺苷与抗坏血酸2-葡萄糖苷等的糖苷不同，意外地难以受在活体内存在的分解酶等的作用，在活体内环境相比腺苷更稳定，其效果的持续性也优良。

[0011] 再者，本发明人发现，上述葡萄糖基腺苷相比腺苷向亲水性溶剂的溶解性更优良。 [0012] 再者，本发明人发现，上述葡萄糖基腺苷相比腺苷更难引起细胞障碍，另外，如上述一样，虽然在活体内相比腺苷更稳定，缓慢地分解，生成的腺苷快速代谢，所以是适用于人也安全的物质，确认作为有抗皱纹作用的皮肤外用剂的成分，效果的强度，持续性及安全性之任何方面相比腺苷更有用，从而完成本发明。

[0013] 即，本发明通过提供含有3′-葡萄糖基腺苷及/或5′-葡萄糖基腺苷作为有效成分的有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂解决了上述课题。

[0014] 顺便而言，虽然3′-葡萄糖基腺苷及5′-葡萄糖基腺苷本身是，例 如，公开于铃木幸雄、内田絅、“科学和工业”、65卷、6号、265～274页（1991年）或，Shuji Takahashi等、“The Journal of Antibiotics”、47卷、1号、95～100页（1994年）而公知的物质，但完全不知促进其表皮角化细胞的增殖及分化的效果，或有增强对真皮的成纤维细胞的胶原产生的效果，有抗皱纹作用，它们的效果相比糖苷化前的腺苷更增强，或相比腺苷更难以受由在活体内原本存在的酶的分解，稳定且上述效果的持续性高。

[0015] 本发明的以葡萄糖基腺苷作为有效成分的本发明的皮肤外用剂由于共具表皮角化细胞的增殖及分化促进作用和真皮的成纤维细胞的胶原产生增强作用，所以可促进由各种的要因降低的表皮的角质层的更新而改善角质层的肥厚化、水分量的减少等，改善保湿功能及屏障功能，同时增加真皮中的胶原量而提高皮肤的张力或弹力性，从而发挥优良的抗皱纹作用，另外，更有效改善皮肤粗糙，皮肤暗沉，张力或弹力性的降低、干皮症等的各种各样的皮肤症状，将皮肤维持在正常的状态。

[0016] 再者，本发明的葡萄糖基腺苷相比腺苷向亲水性溶剂的溶解性更优良，配合到皮肤外用剂时相比腺苷更容易处理。

[0017] 再者，虽然本发明的葡萄糖基腺苷相比腺苷更稳定，另外，相比抗坏血酸2-葡萄糖苷等的其他糖苷更难被酶分解，但由在活体内存在的分解酶的作用缓慢地分解为D-葡萄糖和腺苷，生成的腺苷快速代谢，所以是即使适用于人也安全的物质，因此相比腺苷在效果的持续性方面也更优良。

[0018] 另外，本发明的葡萄糖基腺苷有效果的持续性优良的抗皱纹作用，所以特别是在比较长时间适用于皮肤的皮肤外用剂中使用是适宜的，作为在那样的皮肤外用剂中使用的有防腐或静菌作用的抗菌剂，即使连续使用也对皮肤的刺激少，并且，不损害本发明的葡萄糖基腺苷的效果的是优选的，通过与它们联用可大大发挥本发明的效果。

[0019] 另外，本发明的葡萄糖基腺苷对酶等稳定，所以与在皮肤外用剂中使用的其他成分联用也难以受其影响，尤其是与植物的提取物等天 然的成分联用时，由它们中含的酶等分解的担忧少，所以可稳定发挥那些其他成分所具有的活性和葡萄糖基腺苷所具有的抗皱纹作用，可制造优良的皮肤外用剂。

[0020] 【实施方式】

[0021] 如上所述，本发明涉及含有3′-葡萄糖基腺苷及/或5′-葡萄糖基腺苷作为有效成分而成的有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂。

[0022] 本发明中所说的皮肤外用剂含有上述葡萄糖基腺苷，所以有表皮角化细胞的增殖及分化促进作用和胶原产生增强作用的两方的作用，其效果的持续性也优良，所以可在抑制以皱纹的发生为首的皮肤的劣化，皮肤粗糙，皮肤暗沉，张力或弹力性的降低、干皮症等的各种各样的皮肤症状的改善中使用。

[0023] 作为本发明的皮肤外用剂的有效成分使用的葡萄糖基腺苷是含有3′-葡萄糖基腺苷和5′-葡萄糖基腺苷的任何一方或其两方均可。再有，如后述一样，5′-葡萄糖基腺苷对在活体内存在的酶等的活体成分的稳定性优良，对水等的亲水性溶剂的溶解性高，另外，3′-葡萄糖基腺苷易以比较低浓度发挥效果，所以根据皮肤外用剂的剂形或目的将它们适宜组合使用是优选的。另外，本发明的皮肤外用剂含有在上述葡萄糖基腺苷的葡萄糖上再α-1,4、α-1,6及/或α-1,3结合1分子以上D-葡萄糖的α-糖基腺苷也可。

[0024] 本发明的皮肤外用剂中使用的葡萄糖基腺苷可由酶法制备。另外，根据必要，由发酵法或合成法制备也可。如果以经济性作为问题，使用糖转移酶的酶法是有利的。 [0025] 本发明中使用的葡萄糖基腺苷无必然高度纯化的必要，在含有如给皮肤带来恶影响的杂质的等的安全性上无问题，只要不妨碍期望的效果，对其纯度无特别限制。根据本发明的皮肤外用剂的施用形态或剂形，是含有作为制造原料使用的腺苷的酶反应后的反应液本身也可，是与其制造方法所特有的其他物质的未分离组合物的形态也可，是部分纯化的，或者，高度纯化的也可。另外，将高度纯化的3′-葡萄糖基 腺苷和5′-葡萄糖基腺苷根据目的适宜混合使用也可。

[0026] 本发明中所说的表皮角化细胞的增殖及分化促进作用是指，促进表皮的基底层中存在的角化细胞的分裂增殖、及，这样的细胞叠在上层而向形成棘层、颗粒层及角质层的细胞分化，最终至作为无核的死细胞的角质细胞的任一过程，或者，其全过程，维持健康的表皮的作用。另外，本发明中所说的胶原产生增强作用是指亢进真皮中存在的成纤维细胞的胶原产生的作用。

[0027] 本发明的皮肤外用剂的施用量，只要得到本发明的期望的效果，就无特别限制，通常、1天1次至分为多次，施用每1天的指定量即可。每1天的施用量，是通常、作为有效成分2
的葡萄糖基腺苷，每1cm 皮肤涂布0.001～100mg即可，优选0.05～10mg，更优选0.01～
2
1mg。经皮的施用量相比每1cm 皮肤0.001mg更少，则有得不到期望的效果的时候，施用超
100mg，有得不到与施用量匹配的效果的时候。

[0028] 本发明的葡萄糖基腺苷单独作为皮肤外用剂的有效成分使用也可，但只要不妨碍本发明的效果，也可随意以适宜配合其他有皮肤改善作用、胶原产生增强作用或角化细胞的增殖及分化促进作用的其他药剂、还有美白剂、抗氧化剂、抗炎症剂、保湿剂等，任意的药效成分的形态使用，与它们的作用一同，也发挥上述的葡萄糖基腺苷的效果的皮肤外用剂也可。另外，只要不妨碍本发明的效果，可根据其形态或剂形，通常添加可在化妆品、药品、准药品等中使用的适宜的载体、赋形剂、稳定剂、缓冲剂、pH调节剂、溶剂等、任意的助剂等，以粉末状、颗粒状、溶液等、任意的形态使用。

[0029] 本发明的皮肤外用剂中的葡萄糖基腺苷的配合量，根据其形态或剂形等，只要可达成其效果就无限定，通常、配合至成制剂全量中0.001～30质量%即可，0.01～10质量%是优选的，0.1～5质量%是特别优选的。本发明的葡萄糖基腺苷，在向皮肤外用剂中配合超30质量%时也有得不到与配合量匹配的效果的情况，另外，少于0.001质量%时也有得不到期望的效果的情况。

[0030] 本发明的皮肤外用剂可通过促进表皮中存在的角化细胞的增殖及 分化，提高角质细胞的供给而促进角质层的更新，改善导至功能降低的皮肤的状态，维持适当的状态。 [0031] 再者，本发明的皮肤外用剂可通过增强与由表皮角化细胞的神经酰胺合成或由真皮的成纤维细胞的胶原合成相关的基因的表达，增加表皮的神经酰胺量或真皮的胶原量而提高皮肤的弹力性、张力，屏障功能等，改善导致功能降低的皮肤的状态，维持适当的状态。 [0032] 从而，本发明的皮肤外用剂可升高皮肤的保湿功能，预防或改善皮肤粗糙，皱纹、皮肤的张力或弹力性的降低、皮肤的屏障功能的降低、皮肤的干燥、干皮症、干癣等，任意的皮肤症状。另外，葡萄糖基腺苷除了角化细胞增殖及分化促进作用、胶原产生增强作用、神经酰胺合成促进作用之外，有保湿作用，所以本发明的皮肤外用剂，不仅用于角化细胞增殖及分化促进剂、胶原产生增强剂、神经酰胺合成促进剂的制造，在保湿剂的制造中使用也可有利地实施。还有，也可随意在作为与神经酰胺合成相关的酶的β葡萄糖脑苷脂酶（GCase）或鞘磷酯酶（SMase）的基因的表达增强剂的制造中使用。

[0033] 这样的本发明的皮肤外用剂有效果的持续优良的抗皱纹作用，从比较长时间适用于皮肤的方面，配合具有防腐或除菌作用的抗菌剂是优选的。作为抗菌剂，可举出安息香酸及其盐类、水杨酸及其盐类、山梨酸及其盐类、脱氢醋酸及其盐、以对羟基安息香酸烷酯为首的对羟基安息香酸酯、依地酸、2,4,4′-三氯-2′-羟基二苯基醚、3,4,4′-三氯二苯脲、六氯酚、氯化苯扎铵、苯氧乙醇、扁柏酚、间苯二酚、乙醇、1,3-丁二醇、感光素201号、乳酸、1,2-链烷二醇、梔子提取物、苦参提取物、鼠尾草提取物、百里香提取物、艾蒿提取物、黄檗提取物、等的有抗菌作用的植物的提取物。

[0034] 尤其是，本发明的皮肤外用剂，连续使用也对皮肤的刺激少，并且，通过配合不损害本发明的葡萄糖基腺苷的效果的抗菌剂，可大大发挥本发明的效果。上述抗菌剂之中，1,2-链烷二醇或1,3-丁二醇等的非对羟基安息香酸酯系的成分在向皮肤的刺激性的低，防腐效果高及保湿性的方面是优选的。作为1,2-链烷二醇，碳原子数4～10的1,2- 链烷二醇是优选的，尤其是，选自1,2-戊烷二醇、1,2-己烷二醇、1,2-庚烷二醇或1,2-辛烷二醇的1种或2种以上的1,2-链烷二醇是特别优选的。再有，为了将本发明的葡萄糖基腺苷和这些抗菌剂在皮肤外用剂中均质地配合，只要不损害本发明的效果，也可随意使用适宜的表面活性剂。

[0035] 再者，本发明的皮肤外用剂可以与葡萄糖基腺苷一同，通常、将在化妆品、准药品或药品等中使用的其他任意的成分的1种或2种以上根据必要适宜配合的形态利用。在本发明的皮肤外用剂中，作为与葡萄糖基腺苷一同使用的其他任意的成分，可举出例如，以美白剂、抗氧化剂、抗炎症剂、保湿剂、紫外线吸收剂、乳化剂、增粘剂为首的下述成分。 [0036] 另外，本发明的葡萄糖基腺苷对酶等的活体成分比较稳定，所以即使与其他成分一同配合也难以受其影响，尤其是，在配合有如上述一样的活性的植物的提取物等天然的成分时，由其成分中含的酶等分解的担忧小，所以可作为可与由该活性成分的效果一同发挥本发明的葡萄糖基腺苷的抗皱纹作用的优良的皮肤外用剂。

[0037] 作为美白剂，可举出例如，L-抗坏血酸或其衍生物、熊果苷、曲酸、鞣花酸、胎盘提取物、氢醌糖苷、氨甲环酸或其衍生物、间苯二酚、4-n-丁基间苯二酚等的烷基间苯二酚、及这些的如盐一样的间苯二酚及其衍生物、谷胱甘肽、蓝草提取物、甘草提取物、黄芩提取物、银杏叶提取物、营实提取物、木兰提取物、芍药提取物、梔子提取物、鼠尾草提取物、当归提取物、鸢尾提取物、儿茶提取物等的植物的提取物。尤其是，L-抗坏血酸2-葡萄糖苷或氨甲环酸由于对于增强葡萄糖基腺苷所具有的生理活性的效果优良而优选。

[0038] 作为抗酸氧化剂，可举出例如，丁基羟基甲苯、生长酚、植酸钙镁、视黄醇或其衍生物等的维生素A类、维生素B6盐酸盐、维生素B6三棕榈酸盐、维生素B6二辛酸盐、维生素B2及其衍生物、维生素B12、维生素B15及其衍生物等的维生素B类、抗坏血酸或其衍生物等的维生素C类、α-生长酚、β-生长酚、δ-生长酚、维生素E乙酸盐等 的维生素E类、维生素D类、谷胱甘肽、芸香苷、橙皮苷、柚皮苷或其衍生物、贯叶连翘提取物、营实提取物、黄芩提取物、乌龙茶、红茶、绿茶等的茶提取物、松蘑提取物等的有抗氧化作用的植物的提取物。 [0039] 作为抗炎症剂，可例示尿囊素或其衍生物、甘草亭或作为其衍生物的甘草亭酸、甘草酸、甘草亭酸尿囊素、甘草亭酸甘油、甘草亭酸硬脂酯、硬脂酸甘草亭酯、3-琥珀酰氧基甘草亭酸二钠、甘草酸二钾、甘草酸单铵等，泛酸及其衍生物、维生素E及其衍生物、L-抗坏血酸、L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷、抗坏血酸-生长酚磷酸二酯、L-抗坏血酸硫酸酯、二棕榈酸抗坏血酸酯、棕榈酸抗坏血酸酯、L-抗坏血酸硬脂酯、磷酸L-抗坏血酸基、L-抗坏血酸乙酯等的L-抗坏血酸的衍生物、盐酸吡哆素、薄荷醇、生物素、樟脑、松节油、氧化锌、薁、愈创薁及其衍生物、甲芬那酸及其衍生物、苯基保泰松及其衍生物、吲哚美辛及其衍生物、布洛芬及其衍生物、酮洛芬及其衍生物、ε-氨基己酸、双氯芬酸钠、苯海拉明、氨甲环酸及其衍生物、地塞米松、可的松及其酯、氢化可的松及其酯、泼尼松、泼尼松龙等的肾上腺皮质激素、抗组胺剂、营实、小连翘、黄檗、甘草、水芹、雏菊、鼠尾草、紫草、白桦、茶、金盏花、接骨木、蒲黄、无患子、桉树提取物、绿花椰菜、当归、紫苏、母菊、艾蒿、芦荟、胡萝卜、黄檗末、杨梅皮末、儿茶、土常山、蜀癸、山金车花、狭叶紫锥花、延命草、黄芩、大麦、橙、缬草、母菊、栀子、山白竹、龙胆、老鹳草、牛蒡、花椒、紫苏、菩提树、芍药、西洋木茑、西洋杜松、西洋蓍草、川芎、獐牙菜、鼠尾草、桑白皮、大枣、百里香、冬瓜子、桃仁、蕺草、洋委陵菜、香芹、薄荷、荨麻、白檀、枇杷、假叶树、葡萄、红花、按钮、菩提树、桃、鬼灯檠、艾蒿、薰衣草、迷迭香等的植物或植物来源的成分等。

[0040] 作为保湿剂，可举出例如，聚乙二醇、丙二醇、甘油、1,3-丁二醇、己二醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、硫酸软骨素、透明质酸、粘液素硫酸、蒈酮酸、端胶原、胆甾醇基-12-羟基硬脂酸酯、乳酸钠、胆汁酸盐、dl-吡咯烷酮羧酸盐、短链可溶性胶原、二甘油（EO）PO 附加物、缫丝花提取物、西洋蓍草提取物、黄香草木犀提取物、芦荟提取物、獐牙菜提取物、苦参提取物、丝瓜提取物、七叶树提取物、虎耳草提取物、百里香提取物、当归提取物、百合提取物、栀子提取物、茴香提取物、野芝麻提取物、胡椒薄荷提取物等的植物的提取物、氨甲环酸等。

[0041] 作为紫外线吸收剂，可举出例如，对氨基安息香酸（以下，简称为“PABA”）、PABA单甘油酯、N,N-二丙氧基PABA乙基酯、N,N-二乙氧基PABA乙基酯、N,N-二甲基PABA乙基酯、N,N-二甲基PABA丁基酯、N,N-二甲基PABA甲基酯等的安息香酸系紫外线吸收剂、高薄荷基-N-乙酰邻氨基苯甲酸酯等的邻氨基苯甲酸系统紫外线吸收剂、戊基水杨酸酯、薄荷基水杨酸酯、高薄荷基水杨酸酯、辛基水杨酸酯、苯基水杨酸酯、苄基水杨酸酯、p-异丙醇苯基水杨酸酯等的水杨酸系统紫外线吸收剂、辛基肉桂酸酯、乙基-4-异丙基肉桂酸酯、甲基-2,5-二异丙基肉桂酸酯、乙基-2,4-二异丙基肉桂酸酯、甲基-2,4-二异丙基肉桂酸酯、丙基-p-甲氧基肉桂酸酯、异丙基-p-甲氧基肉桂酸酯、异戊基-p-甲氧基肉桂酸酯、辛基-p-甲氧基肉桂酸酯（2-乙基己基-p-甲氧基肉桂酸酯）、2-乙氧基乙基-p-甲氧基肉桂酸酯、环己基-p-甲氧基肉桂酸酯、乙基-α-氰基-β-苯基肉桂酸酯、2-乙基己基-α-氰基-β-苯基肉桂酸酯、甘油基单-2-乙基已酰基-二对甲氧基肉桂酸酯、三甲氧基桂皮酸甲基双（三甲基硅氧烷）甲硅烷基异戊基等的桂皮酸系统紫外线吸收剂、3-（4＆apos；-甲基苯亚甲基）-d,1-樟脑、3-苯亚甲基-d，1-樟脑、尿刊酸、尿刊酸乙酯、2-苯基-5-甲基苯并噁唑、2，2＆apos，-羟基-5-甲基苯基苯并三唑、2-（2＆apos，-羟基-5＆apos；-t-辛基苯基）苯并三唑、2-（2＆apos，-羟基-5＆apos；-甲基苯基苯并三唑、二亚苄基吖嗪、二茴香酰甲烷、4-甲氧基-4＆apos；-t-丁基二苯甲酰甲烷、5-（3,3-二甲基-2-亚降冰片基）-3-戊烷-2-酮、二吗啉代哒嗪酮等，可使用任意的1种或2种以上。

[0042] 作为紫外线散射剂，可举出氧化钛、微粒子氧化钛、氧化锌、微粒子氧化锌、氧化铁、微粒子氧化铁、氧化铈等的粉末。这些紫外线 散射剂，通常使用、针状、纺锤状、球状、粒状的粉末。另外，粒径是01μm以下的微粒子粉末是优选的。甲基氢聚硅氧烷或硅烷偶联剂等的硅酮处理；金属皂处理；由全氟烷基磷酸二乙醇胺盐或全氟烷基硅烷等的氟处理、糊精脂肪酸酯处理等，疏水化处理的紫外线散射剂也是优选的。

[0043] 作为液体油脂，可举出例如，鳄梨油、山茶油、龟油、澳洲坚果油、玉米油、貂油、橄榄油、菜种油、卵黄油、芝麻油、桃仁油、小麦胚芽油、米胚芽油、山茶花油、蓖麻子油、亚麻仁油、红花油、棉籽油、紫苏油、大豆油、落花生油、茶实油、椰子油、米糠油、泡桐油、日本桐油、霍霍巴油、三甘油等。

[0044] 作为固体油脂，可举出例如，可可脂、椰油、马脂、硬化椰油、棕榈油、牛脂、羊脂、硬化牛脂、棕榈核油、猪脂、牛骨脂、木蜡核油、硬化油、牛脚脂、木蜡、硬化蓖麻子油等。 [0045] 作为蜡类，可举出例如，密蜡、小烛树蜡、绵蜡、巴西棕榈蜡、蜡果杨梅蜡、虫白蜡、鲸蜡、褐煤蜡、糠蜡、羊毛脂、木棉花蜡、醋酸羊毛脂、液状羊毛脂、甘蔗蜡、羊毛脂脂肪酸异丙酯、月桂酸己酯、还原羊毛脂、霍霍巴蜡、硬质羊毛脂、虫胶蜡、POE羊毛脂醇醚、POE羊毛脂醇乙酸酯、POE胆甾醇醚、羊毛脂脂肪酸聚乙二醇酯、POE氢加成羊毛脂醇醚等。 [0046] 作为烃油，可举出例如，流动石蜡、地蜡、角鲨烷、姥鲛烷、石蜡、地蜡、角鲨烯、凡士林、微晶蜡、聚乙烯蜡、费希尔-托罗普希蜡等。

[0047] 作为高级脂肪酸，可举出例如，月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、油酸、十一烯酸、妥尔油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等。 [0048] 作为高级醇，可举出例如，直链醇（例如，月桂基醇、鲸蜡基醇、硬脂基醇、山萮基醇、肉豆蔻基醇、油基醇、鲸蜡硬脂基醇等）；分枝锁醇（例如，单硬脂基甘油醚（鲨肝醇）、2-癸基十四烯醇、羊毛脂醇、胆甾醇、植物甾醇、己基十二醇、辛基十二醇等）等。 [0049] 作为合成酯油，可举出肉豆蔻酸异丙酯、辛酸鲸蜡酯、肉豆蔻酸辛基十二烷酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸己酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、油酸癸酯、二甲基辛酸己基癸酯、乳酸鲸蜡酯、乳酸肉豆蔻酯、醋酸羊毛脂、硬脂酸异鲸蜡酯、异硬脂酸异鲸蜡酯、12-羟基硬脂酸胆甾醇酯、二-2-乙基己酸乙二醇酯、二季戊四醇脂肪酸酯、单异硬脂酸N-烷基二醇、二癸酸NEO戊基二醇、苹果酸二异硬脂酯、二-2-庚基十一烷酸甘油、三-2-乙基己酸三羟甲基丙烷酯、三异硬脂酸三羟甲基丙烷酯、四-2-乙基己酸五赤藓糖醇酯、三-2-乙基己酸甘油、三辛酸甘油、三异棕榈酸甘油、三异硬脂酸三羟甲基丙烷酯、鲸蜡基2-乙基己酸酯、2-乙基己基棕榈酸酯、三肉豆蔻酸甘油、三-2-庚基十一烷酸甘油酯、蓖麻子油脂肪酸甲酯、油酸油酯、乙酰甘油酯、棕榈酸2-庚基十一烷酯、己二酸二异丁酯、N-月桂酰-L-谷氨酸-2-辛基十二烷酯、己二酸二-2-庚基十一烷基、乙基月桂酸酯、癸二酸二-2-乙基己基、肉豆蔻酸2-己基癸酯、棕榈酸2-己基癸酯、己二酸2-己基癸酯、琥珀酸2-乙基己酯、柠檬酸三乙酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯随机聚合物甲基醚等。

[0050] 作为硅酮油，可举出例如，链状聚硅氧烷（例如，二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、二苯基聚硅氧烷等）；环状聚硅氧烷（例如，八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷、十二甲基环六硅氧烷等）、形成3维网目结构的硅酮树脂、硅酮橡胶、各种变性聚硅氧烷（氨基变性聚硅氧烷、聚醚变性聚硅氧烷、烷基变性聚硅氧烷、氟变性聚硅氧烷等）等。 [0051] 其他，可举出乙醇等的低级醇；酰基肌氨酸酸（例如月桂酰肌氨酸钠）、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸等的有机酸；维生素H、泛酸、泛硫乙胺等的维生素类；烟酸酰胺、烟酸苄酯、γ-谷维素、尿囊素、甘草酸（盐）、甘草亭酸及其衍生物、扁柏酚、没药醇、桉树酮、麝香草酚、肌醇、柴胡皂苷、胡萝卜皂苷、丝瓜皂苷、无患子皂苷等的皂苷类、泛酰乙基醚、乙炔基雌二醇、千金藤碱、胎盘提取物等的各种药剂、羊蹄、锦葵、云杉、问荆、百合、艾蒿、日本花柏、西洋 山楂提取物、地椒提取物、睡莲提取物、西河柳提取物、洋委陵菜提取物、胡椒薄荷提取物等的植物来源的提取物或生药、蜂王浆提取物、染料、单月桂酸山梨坦、单棕榈酸山梨坦、倍半油酸山梨坦、三油酸山梨坦、单月桂酸聚氧乙烯山梨坦、单硬脂酸聚氧乙烯山梨坦、聚乙二醇单油酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚二醇二醚、月桂酰二乙醇酰胺、脂肪酸异丙醇酰胺、麦芽糖醇羟基脂肪酸醚、烷基化多糖、烷基葡萄糖苷、糖酯等的非离子性活性剂、硬脂基三甲基铵氯化物、氯化苯扎铵、月桂基胺氧化物等的阳离子性表面活性剂、棕榈酸钠、月桂酸钠、月桂酸钠、月桂基硫酸钾、烷基硫酸三乙醇胺醚、土耳其红油、线性十二烷基苯硫酸、聚氧乙烯硬化蓖麻子油马来酸、酰基甲基牛磺酸等的阴离子性表面活性剂、两性表面活性剂、中和剂、pH调节剂、缓冲剂、δ-生长酚、丁基羟基甲苯等的氧化防止剂、苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸酯、链烷二醇类、感光素201号等的防腐剂。另外其他、也可适宜配合依地酸二钠、依地酸三钠、依地酸四钠、柠檬酸钠、聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属封闭剂、咖啡因、单宁、维拉帕米、氨甲环酸及其衍生物、芸香苷、橙皮苷、柚皮苷或其衍生物为首的聚苯酚类、甘草提取物、光甘草定、火棘的果实的热水提取物、肉毒碱、辅酶Q10、各种生药、醋酸生长酚、羟基癸烯酸、甘草酸及其衍生物或其盐等、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、α,α-海藻糖、α,α-海藻糖的糖质衍生物、环状四糖、糊精、环糊精、分岐糊精、淀粉、分岐淀粉、出芽短梗孢糖等的糖质、感光素101号、感光素301号、感光素401号等的感光素类、香料、染料等。

[0052] 本发明的皮肤外用剂包括化妆品、药品、准药品，其剂形也包括水溶液系统、可溶化系、乳化系、油液系统、凝胶系、膏系统、软膏系、气溶胶系统、水-油2层系统、水-油-粉末3层等，任意的。另外，也包括在片状基剂或粉末状基剂上荷载的。

[0053] 本发明中所说的皮肤外用剂是指，以皮肤粗糙、色斑或皱纹、炎症、老化等的预防、保湿、美容等作为目的，在脸或身体的皮肤等的表皮上直接使用，或者，在其使用时与皮肤接触，有给这些带来影响 的可能性的，化妆皂、洗染料、一般霜-乳液、化妆水、花露水、洗剂、化妆油、白粉-粉末、粉底、颊红-眉墨、眼霜-眼影-睫毛膏、香水、晒-防晒霜、晒-防晒洗剂、晒-防晒油、眼线、口红、唇膏、牙膏，浴用化妆品、各种疾病治疗剂等的护肤化妆品、化妆化妆品、身体护理化妆品、口腔护理化妆品、香味化妆品等的化妆品、准药品或药品。另外，也包括如软膏、泥敷剂、膜剂等一样，涂布或贴附到皮肤或粘膜而使用的准药品或，如口中清凉剂一样在口腔内其使用时直接接触皮肤而使用的药品或准药品。

[0054] 顺便而言，作为本发明的皮肤外用剂的有效成分的葡萄糖基腺苷是，如已所述，虽然无需限定于由特定的方法、手段制造的，但如果以经济性作为问题，则使用糖转移酶的酶法是有利的。例如，在含淀粉质和腺苷的溶液中，将环麦芽糖糊精-葡聚糖转移酶（CGT酶）、α-葡萄糖苷酶、淀粉酶、α-异麦芽糖基葡萄糖糖质生成酶（参照例如WO02/10361号单行本）、异麦芽糖基转移酶（参照例如国际公开WO01/90338号单行本）、α-葡萄糖基转移酶（国际公开WO2008/136331号单行本）、及，淀粉水解的同时催化糖基的转移，生成环糊精，可由使用作用于出芽短梗孢糖而生成潘糖的α-淀粉酶（国际公开WO2008/136331号单行本）等的有糖转移活性的酶的酶法，大量、廉价制造。尤其是，在使用在国际公开WO2008/136331号单行本中公开的α-葡萄糖基转移酶时，可高收率得到水溶性高的5′-葡萄糖基腺苷。另外，在使用CGT酶时，可高收率制造相比使用α-葡萄糖基转移酶时，3′-葡萄糖基腺苷的构成比率更高的葡萄糖基腺苷。

[0055] 通过使有糖转移活性的α-葡萄糖基转移酶或CGT酶作用于含淀粉质和腺苷的溶液，1分子或2分子以上的D-葡萄糖转移到腺苷的3′位或5′位的羟基，在生成上述在3′位或5′的羟基结合1分子的D-葡萄糖的3′-葡萄糖基腺苷及5′-葡萄糖基腺苷的同时，生成上述在3′位或5′位的羟基结合2个以上的D-葡萄糖的，例如，3′-麦芽糖基腺苷或3′-麦芽三糖基腺苷等的3′-糖基腺苷、或者，例如，5′-麦芽糖基腺苷或5′-麦芽三糖基腺苷等的5′-糖基腺苷。

[0056] 相对于溶解淀粉质和腺苷的水溶液以每1g淀粉质1～2,000单位、优选为1～1,000单位的比例添加α-葡萄糖基转移酶或CGT酶至，通常、淀粉质浓度成1～40w/v%，所述溶液保持在pH约3～10、温度30～70℃，反应6小时以上、优选为约12～96小时。 [0057] 溶液中的淀粉质和腺苷的质量比通常设定为以无水物换算1:2～20:1、优选为
1:1～10:1的范围。淀粉质的比例相比此范围更大，则虽然向腺苷的糖转移有效进行，但腺苷的生成率受由腺苷的始发浓度的制约，止于低水平。相反，腺苷的比例相比上述的范围更大，则未反应的腺苷显著量残留，对于工业生产不优选。从而，上述的比率的范围最好。 [0058] 再有，除了α-葡萄糖基转移酶或CGT酶之外，作为淀粉脱支酶联用异淀粉酶时，异淀粉酶，在含有腺苷和淀粉质的溶液中与α-葡萄糖基转移酶或CGT酶共存的状态下作用于淀粉质是优选的。其添加量，虽然也依赖于异淀粉酶的至适温度、至适pH等，但通常、以每1g淀粉质200～2,500单位，在55℃以下反应是优选的。另外，作为淀粉脱支酶使用支链淀粉酶时，也基准于异淀粉酶使用即可。

[0059] 由α-葡萄糖基转移酶及/或CGT酶和淀粉脱支酶的酶反应大致结束，则加热酶反应液而使这些酶失活而停止酶反应，接下来，使葡萄糖淀粉酶作用于此酶反应液。向其作用葡萄糖淀粉酶，则在腺苷的3′位及/或5′位的羟基结合的2分子以上的D-葡萄糖链的大部分被切断，转变为3′-葡萄糖基腺苷及/或5′-葡萄糖基腺苷，这些的化合物的生成率升高。将这样的提高3′-葡萄糖基腺苷及/或5′-葡萄糖基腺苷的含有率的反应液，由常规方法，使用活性炭等脱色过滤，再者，通过适用使用离子交换树脂、合成吸附剂树脂、多孔性树脂等的柱层析，纯化溶液中的葡萄糖基腺苷即可。再者根据需要，使用逆相层析等，使3′-葡萄糖基腺苷及/或5′-葡萄糖基腺苷的纯度变高也可，将各自的化合物单离、纯化而使用也随意。将这些含有葡萄糖基腺苷的溶液直接作为本发明的皮肤外用剂的原料使用也可，根据需要，浓缩使用也可，再者，由减压干燥或喷雾干燥等的适宜的方法干燥，根据需要粉碎而 使用也可。

[0060] 鉴于从葡萄糖基腺苷的制造成本看到的向淀粉质的成本分配等，原料使用淀粉是优选的，在此时，为了调节液化淀粉中的葡萄糖聚合度，切断分支部分，例如，异淀粉酶（EC3.2.1.68）、联用支链淀粉酶（EC3.2.1.41）等的淀粉脱支酶也可有利地实施。这些的淀粉脱支酶之中，异淀粉酶在酶活性、底物特异性等的方面易处理，所以是特别优选的。作为淀粉，可举出马铃薯淀粉、甘藷淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉等。另外，使用如糊精一样的这些淀粉的部分分解物也可，也可随意使用分子内无实质的分支结构，并且，具备葡萄糖聚合度的，例如，环麦芽糖糊精、环直链淀粉、合成直链淀粉等的淀粉质。

[0061] 结合到腺苷的3′位及/或5′位的羟基的2分子以上的D-葡萄糖链的切断中使用的葡萄糖淀粉酶，不问其给源、纯度，是市售品也可。例如，可使用作为市售的葡萄糖淀粉酶剂的，Nagase ChemteX株式会社以商品名“Glucozyme＃20000”销售的属于根霉（Rhizopus）属的微生物来源的酶剂或，天野酶株式会社以商品名“Gluczyme”销售的曲霉（Aspergillus）或根霉（Rhizopus）属的微生物来源的酶剂。

[0062] 以下，通过实验更详细地说明本申请发明。

[0063] <实验1：由α-葡萄糖基转移酶的葡萄糖基腺苷的制备>

[0064] <实验1-1：α-葡萄糖基转移酶的制备>

[0065] 由国际公开WO2008/136331号单行本的实验5的方法，向含淀粉部分分解物（商品名“Pinedex＃4”、松谷化学工业株式会社制造）1.5w/v（质量/容积）%、酵母提取物（商品名“聚胨”、日本制药株式会社制造）0.5w/v%、酵母提取物（商品名“酵母提取物S”、日本制药株式会社制造）0.1w/v%、磷酸二钾0.1w/v%、磷酸一钠·2水和物0.06w/v%、硫酸镁·7水和物0.05w/v%、硫酸锰·5水和物0.001w/v%、硫酸亚铁·7水和物0.001w/v%及水的液体培养基接种环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）PP710株（以保藏号FERM BP-10771，在2007年2月1日，在位于茨城县筑波市东1-1-1中央第6的独立行 政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心保藏），在发酵罐中培养约24小时。培养后，离心分离而回收培养液上清，添加硫酸铵至成80%饱和，通过于4℃、放置24小时而盐析。将盐析物离心分离而回收，加20mM醋酸缓冲液（pH6.0）而溶解之后，对于同缓冲液透析，通过膜浓缩制备浓缩粗酶液。本浓缩粗酶液的α-葡萄糖基转移酶活性是约1300单位/ml。另外，在本浓缩酶液也确认约140单位/ml的淀粉酶活性。

[0066] 再有，上述α-葡萄糖基转移酶的活性如以下一样测定。将麦芽糖溶解于20mM醋酸缓冲液（pH6.0）至最终浓度1w/v%而作为底物。向此底物液5ml加酶液0.5ml，于40℃反应30分钟之后，通过将其反应液0.5ml和5ml的20mM醋酸缓冲液（pH7.0）混合，在沸腾水中加热10分钟而停止反应之后，将反应液中的葡萄糖量根据常规方法由葡萄糖-氧化酶法测定，算出由反应生成的葡萄糖量。α-葡萄糖基转移酶的活性1单位定义为，在上述的条件下在1分钟生成1微摩尔的葡萄糖的酶量。另外，混在的淀粉酶的活性如以下一样测定。即，将短链直链淀粉（商品名“直链淀粉EX-I”、株式会社林原生物化学研究所销售、平均聚合度17）溶解于含1mM的氯化钙的50mM醋酸缓冲液（pH6.0）至最终浓度1w/v%而作为底物液，向其底物液2ml加酶液0.2ml，于35℃酶反应30分钟，将其反应液0.2ml混合于8ml的0.02N硫酸溶液，停止反应之后，添加0.2ml的0.1N碘溶液，于25℃保持15分钟之后，测定660nm的吸光度。对于另行反应0小时的反应液同样地测定，测定每反应时间的碘呈色的减少。淀粉酶的活性1单位定义为，在上述的条件下使20mg的短链直链淀粉的660nm处的吸光度（碘呈色）降低10%的酶量的10倍量。

[0067] <实验1-2：葡萄糖基腺苷的制备>

[0068] 用0.3N的盐酸溶解至腺苷（和光纯药株式会社销售、试剂特级）的浓度成10质量%。将此腺苷的10质量%溶液40ml和糊精（松谷化学株式会社销售、商品名“Pinedex＃1”、固体分约92.3质量%）12g加入含2mM的CaCl2的50mM醋酸缓冲液（pH6.0）336ml而搅拌混 合，加将实验1-1中制备的浓缩粗酶液用50mM醋酸缓冲液（pH6.0）稀释至α-葡萄糖基转移酶的活性成20单位/ml的酶液9ml，搅拌混合，于50℃进行24小时反应。向反应结束后的反应液加1N盐酸而调节到pH3.5后，每1g糊精的固体分加1,000单位葡萄糖淀粉酶（长濑生物化学工业公司销售、商品名“XL-4”、3,800单位/ml），于50℃反应24小时，于100℃处理10分钟，停止酶反应。通过使此停止酶反应的反应液以流速SV=3（5ml/分）通过活性炭柱 而使葡萄糖基腺苷吸附于柱之后，用脱离子水（湿润树脂容积的5倍量）及20容积%乙醇溶液（湿润树脂容积的3倍量）清洗柱，用40容积%乙醇溶液溶出。将溶出液分为各50ml，回收紫外吸收（260nm）是0.15以上的级分。将回收的级分用旋转蒸发器浓缩，供于使用ODS柱的分离用高速液体柱层析（HPLC），回收葡萄糖基腺苷的溶出级分的主峰。分2次实施由使用ODS柱的HPLC的分离，制备合计约0.8g以固体物换算含有99质量%以上的葡萄糖基腺苷的标品。再有，分离用HPLC在以下的条件下进行。

[0069] <分离HPLC条件>

[0070] 装置：SHIMADZUShodexRI-102（检测器），LC-10AD（泵），SIL-10ADvp（自动采样机）、C-R7Aplus（记录计）

[0071] 柱：ODS柱（YMC公司销售、商品名『YMC-PackR＆DODS-A』、 ）

[0072] 移动相：20mM醋酸-醋酸铵缓冲液（pH3.5）/甲醇84/16（容积/容积）

[0073] 检测：RI

[0074] 流速：3.0ml/分

[0075] 柱温度35℃

[0076] <实验2：由CGT酶的葡萄糖基腺苷的制备>

[0077] 向10mM醋酸钠溶液（pH5.5）以无水物换算添加，腺苷（东京化成工业株式会社销售、试剂特级）至其浓度成1w/v%、添加糊精（松谷化学株式会社销售、商品名“Pinedex＃1”）至其浓度成10w/v%，加温至50℃，搅拌着使完全地溶解。每1g糊精添加1,000单位特开昭50-63189号公报（特公昭53-27791号公报）中公开的嗜热脂肪土芽孢杆菌（作为Geobacillus stearothermophilus）（曾分类为嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus））Tc-91株（国际保藏号FERMBP-11273，在位于茨城县筑波市东1-1-1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心保藏；国内保藏号FERMP-2225，于2010年8月6日将其转国际保藏）来源的CGT酶（株式会社林原生物化学研究所制造），于50℃反应24小时后，于100℃加热15分钟而使CGT酶失活之后，每
1g糊精加2,600单位葡萄糖淀粉酶（Nagase ChemteX株式会社销售、商品名“Glucozyme＃20000”、20，000单位/g），于50℃反应24小时。将此反应液于100℃加热10分钟之后，离心（11，500rpm），回收上清。通过使此上清以流速SV=3（5ml/分）通过活性炭柱150ml（120mm×φ41mm）而使葡萄糖基腺苷吸附于柱之后，用脱离子水（湿润树脂容积的7倍量）及20容积%乙醇溶液（湿润树脂容积的6倍量）清洗柱，用40容积%乙醇溶液溶出（湿润树脂容积的16倍量）。将溶出液分为各50ml，回收紫外吸收（260nm）是0.15以上的级分。
将回收的级分浓缩后，供于使用ODS柱的分离用HPLC，回收含有葡萄糖基腺苷的级分的主峰。使此回收的级分吸附于活性炭柱而脱盐，由40容积%乙醇溶出，用旋转蒸发器浓缩，回收葡萄糖基腺苷的溶出级分。分离用HPLC是除了在移动相中使用20mM醋酸-醋酸铵缓冲液（pH3.5）/甲醇82/18（容积/容积），柱温度设为40℃以外，与上述实验1-2同样地在与葡萄糖基腺苷的分离相同的条件下进行，制备约1.6g以无水物换算含有99质量%以上葡萄糖基腺苷的标品。顺便而言，从使用ODS柱的分离用HPLC溶出的葡萄糖基腺苷的主峰与实验1-2中溶出的葡萄糖基腺苷的主峰以不同保留时间溶出。另外，这样的主峰中含葡萄糖基腺苷根据由常规方法的质谱（MS）分析的分子量的测定也预先确认。

[0078] 在实验1-2及实验2中，将由使用ODS柱的分离用HPLC制备的2种葡萄糖基腺苷的结构，通过由常规方法的NMR分析确定。将 基于NMR的分析的结果的，2种葡萄糖基腺苷的碳化学移位值与腺苷的碳化学移位值一并示于表1。再有，NMR分析由下述条件进行。另外，腺苷的碳化学移位值是将获自独立行政法人产业总合技术研究所公开的有机化合物的光谱数据库（SDBS；http：//riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi）的一并示于表1。

[0079]

[0080] 装置：日本电子株式会社销售、商品名“JNM-AL300”、1H：300.4MHz、13C：75.45MHz [0081] 溶剂：重水（0.6ml）

[0082] 内部标准：3-三甲基甲硅烷基-1-丙烷磺酸钠盐（TPS）

[0083] 累加次数：1H-NMR128次、13C-NMR4,000次、DEPT400次、H-HCOSY32次、H-CCOSY36次

[0084] 样品量：20mg

[0085] 【表1】

[0086]

[0087] *溶剂中使用DMSO时

[0088] 如表1所示，实验1-2中制备的葡萄糖基腺苷是核糖的5′位的碳的δc值变动，实验2中制备的化合物是核糖的3′位的碳的δc值变动，所以各鉴定为5′-葡萄糖基腺苷及3′-葡萄糖基腺苷。

[0089] <实验3：葡萄糖基腺苷的向水的溶解性>

[0090] 作为本发明的葡萄糖基腺苷的基本的性质，与腺苷比较对水的溶解性。如以下一样求出实验1-2中制备的5′-葡萄糖基腺苷及实验2中制备的3′-葡萄糖基腺苷的对水的溶解度，与腺苷的溶解度进行比较。即，向500μl的纯水各于室温（25℃）溶解100mg的5′-葡萄糖基腺苷或3′-葡萄糖基腺苷（以下，有时将两方的化合物总称为“葡萄糖基腺苷”。）。另外，向500μl的纯水于室温（25℃）溶解5mg的腺苷。在25℃的恒温室静置1天后，将由离心分离除去未溶残留的沉淀之上清超滤（日本Millipore公司销售、商品名“Ultrafree0.5Biomax-5膜”）后，用移动相稀释，再进行膜过滤（日本Millipore公司销售、商品名“Millex-LH”、孔径0.45μm）。将其供于下述条件的HPLC，从由紫外线检测器的层析谱中出现的峰的面积各自求出葡萄糖基腺苷及腺苷量，计算浓度，将其作为在室温（25℃）的最大溶解浓度。将相同的样品在4℃的冷室中静置1个月之后，再度离心分离，各自同样地测定同样地膜过滤处理的上清中的葡萄糖基腺苷及腺苷量，将其作为在4℃的最大溶解浓度。结果示于表2。

[0091]

[0092] 装置：SHIMADZUUV-VISDETECTORSPD-10AV（检测器），LC-10AT（泵），C-R8A（记录计），SIL-20AC（自动采样机）

[0093] 柱：ODS柱（YMC公司销售、商品名“YMC-PackODS-A”、 ）

[0094] 移动相：0.1容积%醋酸水溶液/甲醇=96/4（容积/容积）

[0095] 检测波长：260nm

[0096] 流速：1.0ml/分

[0097] 注入量：20μl

[0098] 柱温度：40℃

[0099] 【表2】

[0100]

[0101] 如表2所示，在室温（25℃）的水中仅溶解0.8w/v%腺苷，与此相比3′-葡萄糖基腺苷在水中溶解至2w/v%，相比腺苷向水的溶解性更升高。再者，5′-葡萄糖基腺苷于室温在水中溶解超16.1w/v%，相比腺苷向水的溶解性更显著地升高。另外，在4℃的水中腺苷仅溶解0.4w/v%，与此相比，3′-葡萄糖基腺苷溶解至2.0w/v%，相比腺苷向水的溶解性更升高。再者，5′-葡萄糖基腺苷在4℃的水中溶解超15.7w/v%，相比腺苷向水的溶解性更显著地升高。结果表明，3′-葡萄糖基腺苷及5′-葡萄糖基腺苷在使用亲水性溶剂的皮肤外用剂的制造中使用时，例如，在溶液的状态下可调合，调合时无不溶化而析出的担忧等、在制造均质的皮肤外用剂的方面的加工适性升高。

[0102] <实验4：葡萄糖基腺苷的持续性>

[0103] <实验4-1：对腺苷脱氨酶的抗性>

[0104] 已确认腺苷由活体内原本存在的腺苷脱氨酶（ADA）快速分解为肌苷、次黄嘌呤。从而，对于作为腺苷的糖苷的葡萄糖基腺苷，为了研究可持续发挥其效果的可能性，作为与腺苷代谢相关的酶的给源，使用人胎儿正常成纤维细胞的细胞裂解物（cell lysate），实施确认5′-葡萄糖基腺苷及3′-葡萄糖基腺苷是否在活体内分解的试验。将用含有10容积%牛胎儿血清（以下，简写为“FCS”）的Dulbecco的最小必需培养基（日水制药株式会社销售、商品名『Dulbecco改良的Eagle培养基“日水”』、以下，简写为DMEM）稀释的人胎儿正常成2
纤维细胞（KURABO公司销售、以下称为“NHDF细胞”）在150cm 培养瓶（康宁公司制）中，以
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1.5×10 细胞/20ml/瓶接种，培养4天。除去培养上 清后，用0.05质量%胰蛋白酶/EDTA溶液（Gibco公司销售、商品名“胰蛋白酶-EDTA”）处理，自瓶回收细胞悬浮液。将细胞悬浮液离心，除去上清后，向细胞的沉淀加溶解蛋白酶抑制剂混合物（完全，无EDTA、片、Roche
6
公司制）的10mMTris-HCl（pH7.5）缓冲液（裂解缓冲液），将NHDF细胞悬浮至成4.0×10c/ml。将悬浮液超声波处理（BRANSONSINIFIERCELLDISROPTOR185），将细胞破碎（3次、各30秒钟×2次）之后，以15,000rpm离心分离5分钟，回收上清，制备细胞裂解物。将溶解实验
1-2中制备的5′-葡萄糖基腺苷或实验2中制备的3′-葡萄糖基腺苷至成浓度5mM的磷酸缓冲生理盐水（PBS）0.1ml和上述细胞裂解物0.9ml混合、搅拌，于37℃反应。回收反应开始时（0小时）、反应开始1、7及24小时的反应液，以与实验3相同的方法处理反应液，由HPLC法定量腺苷或葡萄糖基腺苷量。将各化合物的反应开始时的浓度设为100%，计算各反应时间的化合物的反应液中的浓度的相对值，作为腺苷或葡萄糖基腺苷的残留率示于表3。 [0105] 【表3】

[0106]

[0107] 如表3所示，腺苷社8细胞裂解物中含的酶快速分解，反应7小时而完全地消失。5′-葡萄糖基腺苷在反应24小时仍90%以上残留。3′-葡萄糖基腺苷在反应7小时残留
80%以上，在24小时残留17%。结果示，腺苷在活体内在短时间内分解而易使其功能消失，与此相比3′-葡萄糖基腺苷及5′-葡萄糖基腺苷难以受到腺苷脱氨酶（ADA）或α-葡萄糖苷酶等的在活体内原本存在的酶的作用，可相比腺苷更长时间残留而发挥其功能。顺便而言，从使5′-葡萄糖基腺苷及3′-葡萄糖基 腺苷与NHDF细胞的细胞裂解物（cell lysate）反应时，均生成肌苷或次黄嘌呤，及，此反应被α-葡萄糖苷酶抑制剂抑制（数据未显示）来判断，腺苷糖苷由细胞内的α-葡萄糖苷酶分解为腺苷和葡萄糖之后，与腺苷同样被ADA分解而分解为肌苷、次黄嘌呤。

[0108] <实验4-2：在3维皮肤模型中的残留性>

[0109] 为了判断本发明的葡萄糖基腺苷的效果的持续性，也对于3维皮肤环境中的残留性进行研究。向12孔板（Becton Dickinson公司销售、商品名“12孔多孔板”）以0.33ml/孔添加EPI100测定培养基（KURABO公司销售商品名“EPI测定培养基”），将3维皮肤模型EPI200（KURABO公司销售商品名“EPI-200试剂盒”）的皮肤模型杯移到孔中。以5%CO2、于37℃培养3小时后，将皮肤模型杯移到以0.9ml/孔添加DMEM培养基（日水制药株式会社销售、商品名『Dulbecco改良的Eagle培养基“日水”』）的6孔板（Becton Dickinson公司销售、商品名“6孔多孔板”）中。将用实验1-2的方法制备的5′-葡萄糖基腺苷、用实验
2的方法制备的3′-葡萄糖基腺苷或腺苷溶解于30%乙醇至终浓度成0.1%，将得到的溶液的0.1ml添加到皮肤模型杯内。以5%CO2、于37℃培养24小时后，回收样品透过液（孔中的培养基），超滤（日本Millipore公司销售、商品名“Ultrafree0.5Biomax-5膜”）之后，用移动相稀释。将其供于下述条件的HPLC，由另行制成的标准曲线求出5′-葡萄糖基腺苷、
3′-葡萄糖基腺苷及腺苷的量。将3维皮肤中透过后的各化合物的残留量和肌苷及次黄嘌呤的生成量示于表4。

[0110]

[0111] 装置：HPLC泵Model510、泵控制器Model680、自动注射器Model712、检测器Model2487、数据处理（定量计算）Empower2软件（Millipore公司制）

[0112] 柱：ODS柱（YMC公司销售、商品名“YMC-PackODSAQ-303”、 ）

[0113] 移动相：20mM醋酸-醋酸铵缓冲液（pH3.5）/甲醇=92/8（容积/ 容积） [0114] 检测波长：260nm

[0115] 流速：0.5ml/min

[0116] 注入量：10μl

[0117] 柱温度：40℃

[0118] 【表4】

[0119]

[0120] 如表4所示，腺苷在3维皮肤透过的过程全部被代谢为肌苷及次黄嘌呤，消失。对其，5′-葡萄糖基腺苷及3′-葡萄糖基腺苷是一部分被代谢为肌苷或次黄嘌呤，即使在施用24小时后3维皮肤透过后也残留。这表明，腺苷渗透到皮肤内后，快速分解而易失效果，与此相比，葡萄糖基腺苷在渗透到皮肤后也稳定存在，达到真皮而发挥其效果。再有，3维皮肤中的稳定性是，5′-葡萄糖基腺苷相比3′-葡萄糖基腺苷更优良。

[0121] 从实验4的结果知，腺苷施用于皮肤后比较快速分解而消失，但葡萄糖基腺苷相比腺苷在皮肤中更难分解。特别是，腺苷代谢为快速肌苷或次黄嘌呤，与此相比，在葡萄糖基腺苷中检测不到腺苷，作为腺苷的代谢产物的肌苷或次黄嘌呤的生成也少表明，由α-葡萄糖苷酶的葡萄糖基腺苷的分解缓慢地进行，葡萄糖基腺苷在皮肤中长时间残留，可持续性地发挥其功能。

[0122] <实验5：葡萄糖基腺苷给角化细胞的分化带来的效果>

[0123] 关于葡萄糖基腺苷的抗皱纹作用，为了研究给皮肤的角化细胞带来的效果，使用对人的皮肤的角化细胞的分化促进剂的评价中广泛使用的正常人表皮角化细胞，如以下一样实施。即，使用正常人表皮角 化细胞（KURABO公司销售、新生儿来源、以下也称为“NHEK细胞”），角化细胞从基底层的细胞分化为颗粒层的细胞时，分化为颗粒层的细胞之时，在颗粒层的细胞中特异性地表达，作为其分化标志物的纤丝聚集蛋白原（profilaggrin：颗粒层的细胞的标志物）作为指标，通过使用对此标志物蛋白的特异性抗体的蛋白印迹法比较其表达量，评价对角化细胞的分化的葡萄糖基腺苷的效果。在本实验中，纤丝聚集蛋白原的增加表示，基底层的角化细胞的分化被促进，颗粒层的细胞增加。

[0124] <角化细胞的分化的评价方法>

[0125] 将悬浮于含有细胞增殖添加剂（EDGS：EpiLifeDefinedGrowthSupplement）的EpiLife培养基（CaskadeBiologics公司销售）（以下，将含有EDGS的EpiLife培养基简写为“EpiLife培养基”。）的NHEK细胞接种于包被胶原（新田明胶公司销售、商品名“CellmatorixTypeIV”）的6孔板（Becton Dickinson公司销售、商品名“FALCONMULTI-孔TM 56孔”）至成5×10 细胞/1.5ml/孔，用温育器，在5容积%CO2存在下、在37℃的条件下培养2天。吸除各孔的培养上清，将实验1-2中制备的5′-葡萄糖基腺苷或实验2中制备的3′-葡萄糖基腺苷各用EpiLife培养基稀释至终浓度成0.1μM、1μM或10μM，而以1.5ml/孔添加。作为对照1，将腺苷用EpiLife培养基稀释至终浓度成0.1μM、1μM或
10μM而以1.5ml/孔添加。再者，作为对照2仅以1.5ml/孔添加EpiLife培养基。往后每隔1天，用含与开始添加的相同的成分的培养基进行培养基交换着进行8天培养。吸除各孔的培养液，加PBS清洗之后，以100μl/孔加提取缓冲液（extraction buffer），使用细胞刮器将细胞自孔剥离，回收到1.5ml微管（Eppendorf公司销售、商品名“Eppendorf管”）。
将回收的细胞用涡旋混合器混合、悬浮之后，在冰上放置30分钟，离心（15,000×g、10分钟、4℃），回收上清，制备分析用样品。再有，作为提取缓冲液使用含2质量%十二烷基硫酸钠（SDS）、1mM依地酸（EDTA）、20μM苯甲基磺酰氟（PMSF）、20μM亮抑酶肽（leupeptin）、
0.1μM抑肽酶（aprotinin）的20mMTris-HCl缓冲液（pH8.0）。

[0126] <蛋白印迹分析>

[0127] 向含5容积%的二硫苏糖醇（DTT）的2.5w/v%SDS水溶液8μl加上述分析用样品12μl而混合，负荷至蛋白质量成20μg/泳道，由常规方法，SDS-聚丙烯酸类树脂酰胺凝胶电泳。电泳结束后，将凝胶中含的蛋白质由常规方法移到硝基纤维素膜，为了抑制非特异性的反应而浸渍于封闭溶液（大日本住友制药公司销售、商品名“BLOCK ACE”）。将此封闭处理的硝基纤维素膜在将抗纤丝聚集蛋白原抗体（SantaCruz公司销售、商品名“纤丝聚集蛋白（AKH1）抗体”）用含10容积%BLOCK ACE的50mMTBS（含有200mMNaCl的50mMTris-HCl（pH7.4））缓冲液（以下，称为“TBS缓冲液”）稀释100倍的溶液中于室温浸渍1小时之后，用含0.05容积%吐温20的50mMTBS缓冲液清洗而除去过量的抗体。将硝基纤维素膜在HRP标记的抗小鼠IgG兔多克隆抗体（DAKO公司销售）溶液中于室温浸渍2小时。将此膜用含0.05容积%吐温20的50mMTBS缓冲液清洗30分钟后，发色反应使用市售的蛋白印迹检测试剂盒（GE Healthcare Bioscience公司销售、商品名“ECL蛋白印迹检测反应和超膜ECL”）进行。作为对照，除了代替抗纤丝聚集蛋白原抗体，使用抗β-肌动蛋白抗体以外，进行同样地处理。将发色后的硝基纤维素膜由密度计（Amersham·Pharmacia·Biotech公司销售、商品名“ImageMaster1D”）测定各条带的浓度（强度），以β-肌动蛋白作为内部标准，用纤丝聚集蛋白原的条带强度除以β-肌动蛋白的条带强度的值而作为纤丝聚集蛋白原的表达量。将用仅EpiLife培养基培养的对照2的纤丝聚集蛋白原的表达量设为1，求出添加5′-葡萄糖基腺苷、3′-葡萄糖基腺苷或腺苷而培养之时的纤丝聚集蛋白原的表达量的相对值而示于表5。

[0128] 【表5】

[0129]* **

[0130] 相对于试验试剂未添加时的产生量，：p<0.05；：p<0.01。

[0131] 如表5所示，在培养基中添加腺苷而培养时，确认不到NHEK细胞中的纤丝聚集蛋白原蛋白的表达量的显著的增强。对此，在培养基中添加5′-葡萄糖基腺苷或3′-葡萄糖基腺苷而培养NHEK细胞时，确认作为表皮的颗粒层的细胞的标志物的纤丝聚集蛋白原蛋白的表达量的显著的增加。结果表明，5′-葡萄糖基腺苷及3′-葡萄糖基腺苷均有使表皮基底层的角化细胞分化为颗粒层的细胞的角化细胞分化促进作用，作为有抗皱纹作用的皮肤外用剂的成分适宜。再有，比较5′-葡萄糖基腺苷和3′-葡萄糖基腺苷，则添加5′-葡萄糖基腺苷时示强的纤丝聚集蛋白原蛋白的表达增强效果。

[0132] <实验6：给葡萄糖基腺苷的胶原产生带来的效果>

[0133] 对于葡萄糖基腺苷的抗皱纹作用，为了研究给真皮中的胶原产生带来的效果，使用人的皮肤的胶原产生增强剂的评价中广泛使用的人胎儿正常成纤维细胞（NHDF），如以下一样实施。即，将人胎儿正常成纤维细胞（KURABO公司销售、以下称为“NHDF细胞”）悬浮于含有10容积%牛胎儿血清（以下，简写为“FCS”）的Dulbecco的最小必需培养基（以下，5
简写为DMEM）（日水制药公司销售），以1.5×10 细胞/0.5ml/孔接种于24孔板（Becton TM
Dickinson公司销售、商品名“FALCONMULTI-孔 24孔”），用温育器，在5容积%2存在下、在37℃的条件下培养1天。将实验1-2中制备的5′-葡萄糖基腺苷、 实验2中制备的
3′-葡萄糖基腺苷或腺苷的任何用10容积%含有FCS的DMEM稀释至终浓度成表6所
示的浓度，以0.5ml/孔添加，用温育器，在5容积%CO2存在下、在37℃的条件下培养3天后，吸除培养上清，用磷酸缓冲生理盐水（PBS）清洗后，以250μl/孔添加用1M醋酸稀释至1mg/ml的胃蛋白酶（SIGMA公司销售）溶液。于室温振荡4小时之后，用细胞刮器将附着于孔的细胞自孔剥离，进行移液器吸吐，将胃蛋白酶消化后的细胞悬浮液回收到1.5ml微管（Eppendorf公司销售、商品名“Eppendorf管”）。向此管以500μl/管添加胶原定量用发色试剂（Biocolor公司销售、商品名“SicrolCollagenAssaykit”），用涡旋混合器混合后，于室温使用旋转器（TAITEC公司销售、商品名“RT-50”）正确地颠倒混和30分钟之后，于4℃离心10分钟（15，000rpm），向除去上清的沉淀以100μl/管添加1N的NaOH之后，将沉淀通过移液器吸吐溶解，将其全量移到96微孔板（Becton Dickinson公司销TM
售、商品名“FALCONMICROTEST 96”），由吸光度计（MolecularDevices公司销售、商品名“Vmaxmicroplatereader”）测定吸光度（A560-A650）。基于通过由相同的方法，使用I型胶原（KOKEN公司销售）制成的胶原定量用发色试剂的发色的标准曲线，求出各孔的胶原量，一并示于表6。

[0134] 【表6】

[0135]

[0136] 相对于各自的试验试剂未添加时的产生量，*：p<0.05；**：p<0.01。

[0137] 如表6所示，向培养基添加腺苷时，虽然5μM的添加与未添加的情况确认不到差别，但10μM的添加，则确认胶原产生的亢进。对此，添加5′-葡萄糖基腺苷或3′-葡萄糖基腺苷而培养NHDF细胞时，均依 赖于其浓度，确认显著的胶原的产生的亢进，此胶原产生增强作用的强度是，相比腺苷，5′-葡萄糖基腺苷及3′-葡萄糖基腺苷更强。这表明，5′-葡萄糖基腺苷及3′-葡萄糖基腺苷，相比腺苷，增强成纤维细胞中的胶原产生的功能更优良，作为有抗皱纹作用的皮肤外用剂的成分适宜。再有，胶原产生增强作用的强度是，
5′-葡萄糖基腺苷和3′-葡萄糖基腺苷大致同等。

[0138] 实验5和实验6的结果表明，5′-葡萄糖基腺苷及3′-葡萄糖基腺苷均共具表皮的角化细胞分化促进作用和真皮的由成纤维细胞的胶原产生增强作用，可作为有抗皱纹作用的皮肤外用剂的有效成分利用。另外判断，这样的效果是，葡萄糖基腺苷相比腺苷更强。

[0139] <实验7：给葡萄糖基腺苷的角化细胞的分化带来的效果2>

[0140] 由于在实验5中确认了葡萄糖基腺苷有对于皮肤改善有效的表皮角化细胞的分化促进作用，为了更详细地解析此作用，使用实时PCR解析法，如以下一样进行以角化细胞的分化标志物基因作为指标研究其表达量的变化的试验。再者，以研究葡萄糖基腺苷给对于人的皮肤的保湿或屏障功能有重要的作用而被认为对于皮肤改善有效的神经酰胺合成带来的影响作为目的，对于与神经酰胺的合成相关的基因的表达量也一并检查。即，作为解析对象基因，作为角化细胞的分化标志物选择纤丝聚集蛋白原（PFG：后期的标志物）或外皮蛋白（INV：初期的分化标志物），选择作为与神经酰胺的合成相关的酶的β葡萄糖脑苷脂酶（GCase）、鞘磷酯酶（SMase），作为PCR反应之时之内部标准使用亲环素B（CypB）的基因4
（参照表7）。向胶原包被的6孔板以8×10 细胞/1.5ml/孔接种NHEK细胞，使用EpiLife培养基，用温育器，在5容积%CO2存在下、在37℃的条件下培养2天，除去培养基后，以1.5ml/孔添加含有5′-葡萄糖基腺苷、3′-葡萄糖基腺苷或腺苷的新的EpiLife培养基（葡萄糖基腺苷或腺苷的终浓度是1μM）、每隔1天使用含有葡萄糖基腺苷或腺苷的相同的培养基进行培养基交换（1.5ml/孔）着培养7天。培养结束后，通过将各孔用PBS（K-）清洗2次后，以0.2ml/孔添加0.025质量%胰蛋白酶/EDTA溶液，于 室温放置5分钟而将细胞自板剥离。再者，以1ml/孔添加中和液（Chelex处理的含有0.5容积%的FCS的PBS），移液器吸吐着将细胞悬浮液回收到1.5ml微管（Eppendorf公司销售、商品名“Eppendorf管”）。
将此管以5,000rpm离心5分钟，将通过除去上清得到的细胞沉淀供于全RNA提取。作为对照，将仅添加EpiLife培养基培养的细胞同样地处理。试验是对于对照、葡萄糖基腺苷或腺苷各使用3孔。

[0141] 从这些的细胞沉淀的全RNA提取是，使用市售的RNA提取试剂盒（均Qiagen（GIAGEN）公司销售、细胞的破碎：商品名“QIAshledder”、RNA的回收：商品名“RNeasyMinikit”），操作根据其说明书。途中，加DNase（Qiagen公司销售）处理。接下来，使用市售的逆转录酶（Gibco公司销售、商品名“M-MLVRT”），根据附带的说明书如以下一样合成cDNA模板。向全RNA混合寡dT随机引物（Gibco公司销售）及dNTPs（GE HEALTHCARE公司销售、商品名“DNApolymerizationMix”）而于70℃处理5分钟后，在冰上放置1分钟以上。向其添加逆转录酶及二硫苏糖醇而于25℃温育10分钟、于42℃温育50分钟、接下来于70℃温育15分钟。

[0142] 内部标准及解析对象基因的PCR解析所必要的引物的碱基序列（正向及反向引物）是从GENBANK的mRNA序列使用“引物3软件”（免费软件）设计，或者，使用已知的碱基序列，引物依赖于合成的保藏会社（Sigma-Aldrich株式会社）制备。作为本实验的对象的解析对象基因及作为内部标准使用的基因、及，作为这些的基因的PCR反应的引物使用的碱基序列一并示于表7。使用此引物，由市售的PCR定量解析系统（Roche Diagnostics公司销售、商品名“LightCycler480”）对各解析对象基因的表达量定量。各cDNA模板的PCR反应是，使用市售的PCR试剂盒（Roche Diagnostics公司销售、商品名“SYBRGreenIMasterkit”），基于其附带的说明书，开始使反应液进行于95℃热变性5分钟之后，进行PCR反应（于95℃10秒钟、于60℃10秒钟、于72℃15秒钟作为1个循环，将其重复45个循环）。作为内部标准使用编码亲环素B的DNA，算出各解析对象 基因的相对的表达量。将对照中的各解析对象基因的表达量的3孔的平均值作为1.00，求出各解析对象基因的表达量的相对值的3孔的平均值示于表8。

[0143] 【表7】

[0144]

[0145] 【表8】

[0146]* **

[0147] 相对于试验试剂未添加时的产生量，：p<0.05；：p<0.01。

[0148] 如表8所示，NHEK细胞，在添加腺苷培养时，纤丝聚集蛋白原（PFG）、外皮蛋白（INV）、β葡萄糖脑苷脂酶（GCase）及鞘磷酯酶（SMase）基因的表达量分别成1.41、1.15、1.37、1.35，全部基因相比对照的表达量，确认不到显著的增强。对此，在添加3′-葡萄糖基腺苷培养时，纤丝聚集蛋白原（PFG）、外皮蛋白（INV）、β葡萄糖脑苷脂酶（GCase）及鞘磷酯酶（SMase）基因的表达量分别成2.03、1.52、2.08、2.03，全部的基因相比对照的表达量，显著地增强。另外，添加5′-葡萄糖基腺苷培养时，相比仅用培养基培养时，纤丝聚集蛋白原（PFG）、外皮蛋白（INV）、β葡萄糖脑苷脂酶（GCase）及鞘磷 酯酶（SMase）基因的表达量分别成2.54、1.66、2.68、2.57，全部的基因相比对照的表达量，确认显著的增强。结果表明，由3′-葡萄糖基腺苷及5′-葡萄糖基腺苷的角化细胞分化促进作用在基因的表达水平及，其增强作用在基因水平，也相比腺苷，葡萄糖基腺苷更强。另外，从葡萄糖基腺苷添加后经过24小时以上，上述基因也表达看出，葡萄糖基腺苷的效果持续至少24小时。比较
3′-葡萄糖基腺苷和5′-葡萄糖基腺苷，5′-葡萄糖基腺苷示更强。再者，此实验结果表明，葡萄糖基腺苷对于β葡萄糖脑苷脂酶或鞘磷酯酶等，对于皮肤的保湿或屏障功能发挥重要的作用的神经酰胺的合成也在基因水平发挥作用，葡萄糖基腺苷可作为β葡萄糖脑苷脂酶或鞘磷酯酶的表达增强剂、还有，也可作为神经酰胺的合成促进剂利用。 [0149] <实验8：给角化细胞生长因子带来的影响>

[0150] 在实验5及7中，由于已确认葡萄糖基腺苷的促进角化细胞的分化的作用，也研究对角化细胞的增殖的影响。比较在正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）中，对角化细胞生长因子（KGF）表达的5′-葡萄糖基腺苷和3′-葡萄糖基腺苷的影响。将NHDF悬浮于含有10%FBS（JRS公司销售、商品名“FetalBovineSerum（FBS）AustralianOrigin”）的DMEM培养基（日5
水制药株式会社销售、商品名『Dulbecco改良的Eagle培养基“日水”』），以3×10 细胞/ml/孔接种于12孔板（Becton Dickinson公司销售、商品名“12孔多孔板”），在5%CO2、于
37℃培养1天。除去培养上清后，将以实验1-2的方法得到的5′-葡萄糖基腺苷或以实验2的方法得到的3′-葡萄糖基腺苷各用含有1%的FCS的DMEM培养基稀释至终浓度成
0.15、1.5mM而添加。将添加不含葡萄糖基腺苷的含有1%FCS的DMEM培养基的作为对照。
在5%CO2、于37℃培养4小时后，吸除培养上清，用PBS（-）清洗2次之后，将细胞供于RNA提取。

[0151] 全RNA提取 使用 市售的 RNA提取 试剂盒（Qiagen公司 销售、商品 名“QIAshledder+RNeasyMinikit”）进行。操作根据试剂盒中附属的说明书实施。RT反应使用SuperScriptVILOcDNA合成试剂盒 （Invitrogen公司销售、商品名“SuperScriptVILOcDNA合成试剂盒”），将混合RNA10.5μl、5×VILOreactionmi×3μl、10×enzymemi×1.5μl的（合计15μl），在于25℃处理10分钟、于42℃处理60分钟、接下来于85℃处理5分钟的条件下进行。

[0152] 实时PCR反应使用LightCycler480SYBRGreenIMaster（RocheDiagnostics公司、商品名“LightCycler480SYBRGreenIMaster”)，混合水1.8μl、masterMi×6.0μl、引物L（10μM）0.6μl、引物R（10μM）0.6μl、template3.0μl（合计12.0μl）、在于95℃保持10秒钟、于60℃保持10秒钟、接下来于72℃保持15秒钟的条件下进行45个循环。各样品的KGF表达量由标准曲线算出，用内部标准（18srRNA）的表达量校正。求出将对照中的表达量设为1.0时的相对值，评价各样品的表达量。使用的引物使用示于表9的引物。结果示于表10。

[0153] 【表9】

[0154]

[0155] 【表10】

[0156]

[0157] 如表10所示，使用3′-葡萄糖基腺苷时，以0.15mM以上的浓度而KGF的表达量成2倍以上，使用5′-葡萄糖基腺苷时，以1.5mM以上的浓度而KGF的表达量升高。这表明，3′-葡萄糖基腺苷及5′-葡萄糖基腺苷均不仅对角化细胞的分化，对其增殖也有促进的作用，作为有抗皱纹作用的皮肤外用剂的有效成分适宜。

[0158] 实验5、7及实验8的结果表明，3′-葡萄糖基腺苷及5′-葡萄糖基腺苷均促进角化细胞的分化及增殖，从而有改善皮肤的更新的作用，抑制皱纹的发生的作用优良。另外，用实验7示本发明的葡萄糖基腺苷的效果在添加后经24小时也持续，由实验4示本发明的葡萄糖基腺苷在皮肤中长时间残留，所以表明本发明的葡萄糖基腺苷的抗皱纹作用有持续性。再有，5′-葡萄糖基腺苷对角化细胞的分化强，3′-葡萄糖基腺苷对角化细胞增殖的促进效果强，所以在皮肤外用剂中使用时，根据目的适宜组合两种葡萄糖基腺苷而利用是适宜的。

[0159] <实验9：葡萄糖基腺苷的细胞障碍>

[0160] 关于葡萄糖基腺苷，为了研究其是否作为持续性的皮肤外用剂的成分，对皮肤继续使用，研究其细胞障碍。作为对葡萄糖基腺苷及腺苷的3维皮肤的影响，将细胞受障碍之时放出的乳糖脱氢酶（LDH）作为指标，研究细胞障碍的强度。将EPI100测定培养基（KURABO公司销售商品名“EPI测定培养基”）以0.19ml/孔添加到24孔板（Becton Dickinson公司销售、商品名“24孔多孔板”），将3维皮肤模型EPI200（KURABO公司销售商品名“EPI-200试剂盒”）的皮肤模型杯移到上述孔中。以5%CO2、于37℃培养3小时后，将EPI100测定培养基以0.9ml/孔添加到新的6孔板（Becton Dickinson公司销售、商品名“6孔多孔板”），移入皮肤模型杯。将用实验1-2的方法得到的5′-葡萄糖基腺苷、用实验2的方法得到的3′-葡萄糖基腺苷、或者腺苷用30%乙醇溶解至终浓度成5%，将得到的溶液0.1ml添加到皮肤模型杯内，18小时后，回收透过液（孔内的培养基）。添加不含葡萄糖基腺苷及腺苷的30%乙醇作为对照。对于回收的透过液，将由皮肤模型放出的乳糖脱氢酶（LDH）活性使用细胞障碍检测试剂盒（Roche公司销售商品名“细胞障碍检测试剂盒（LDH）”）测定，将对照的LDH活性设为1.0求出相对LDH活性，评价各样品的细胞障碍。结果示于表11。

[0161] 【表11】

[0162]

[0163] 如表11所示，使用腺苷时，回收液中的LDH活性浓度依赖性地升高，在浓度1%确认明显的LDH的放出。另一方面，使用5′-葡萄糖基腺苷及3′-葡萄糖基腺苷时，均在浓度5%时LDH活性不升高，确认不到LDH的放出。这表明，腺苷有浓度依赖性地引起细胞障碍的担忧，但本发明的葡萄糖基腺苷相比腺苷极难引起对皮肤的障碍，作为皮肤外用剂的有效成分，尤其是，作为可长时间适用于皮肤的，有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂的有效成分有用。再有，如上所述，本发明的葡萄糖基腺苷被α-葡萄糖苷酶缓慢地分解，生成的腺苷快速代谢，所以由α-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖和腺苷，不会作为有引起细胞障碍的担忧的腺苷而蓄积。

[0164] <实验10：葡萄糖基腺苷的安全性>

[0165] 由10名的自愿者的分批测试评价葡萄糖基腺苷的安全性。

[0166] <受试者>

[0167] 将年龄22～45岁的男女合计20名（男性10名、女性10名）随机分为各10名（各组男性5名、女性5名）的2组。

[0168] <被验样品>

[0169] 由实验2的方法得到的3′-葡萄糖基腺苷或由实验1-2的方法得到的5′-葡萄糖基腺苷溶解于纯化水至成下述浓度，制备被验样品1及2。作为对照使用纯化水。 [0170] 被验样品1：含有3′-葡萄糖基腺苷2w/v%的水溶液

[0171] 被验样品2：含有5′-葡萄糖基腺苷2w/v%的水溶液

[0172] 对照：仅纯化水

[0173] <试验方法>

[0174] 对1组10名涂布被验样品1和对照（实验组1）。10名的受试者之中，在随机选择的5名的受试者中，在左上腕内侧涂布对照，在右上腕内侧涂布被验样品1，在其余的5名左上腕内侧涂布被验样品1，在右上腕内侧涂布对照。将被验样品1或对照的各15μl，使用Finn室（Epitest（EpitestLtd.）公司制芬兰国），根据常规方法实施24小时的闭塞涂布。在其余的1组10名的受试者，代替被验样品1而使用15μl被验样品2以外，在与被验样品1相同的条件下实施24小时的闭塞涂布试验（实验组2）。涂布开始24小时后，除去Finn室，由目测确认除去后1小时和24小时的涂布部位的状态。根据下述判断基准判断样品涂布部位的皮肤的状态，其受试者数示于表12。再有，在试验期间，在除去Finn室前，禁止入浴、淋浴、过激的运动，除去后24小时禁止过激的运动的同时，禁止由手帕等的摩擦等，对样品涂布部位的刺激行为。

[0175] <评价方法>

[0176] 基于日本接触皮肤炎学会的“环境皮肤科学”所示的分批测试判断基准之中的本 邦 基 准（http：//www.daiichiclinic.jp/derma/sesyoku/contents_03/patchtest_table_2.html），对于涂布部位，由目测判断。判断以无反应（-）、微少的红斑（±）、明显的红斑（+）、红斑+浮肿、丘疹（++）、红斑+浮肿-丘疹+小水疱（+++）、大水疱（++++）的6阶段进行评价。

[0177] 【表12】

[0178]

[0179] 如表12所示，在涂布被验样品1（3′-葡萄糖基腺苷）及对照的实 验组1中，在Finn室除去后1小时及24小时，均在涂布部位确认不到反应。在涂布被验样品2（5′-葡萄糖基腺苷）及对照的实验组2组中，在Finn室除去后1小时及24小时，均在涂布部位确认不到反应。结果表明，葡萄糖基腺苷是涂布到皮肤上也安全的物质。

[0180] 以下，举实施例具体说明本发明，但本发明不以任何方式限于下述的实施例。 【实施例】

[0181] 【实施例1】

[0182] <含有葡萄糖基腺苷的粉末>

[0183] 将腺苷（和光纯药工业株式会社销售、试剂特级）和糊精（松谷化学株式会社销售、商品名“Pinedex＃1”、固体分约92.3质量%）分别添加到2mM的CaCl2溶液6,600ml至浓度分别成1w/v%和10w/v%，加温至50℃，通过搅拌完全地溶解。由1N HCl将pH调节到6.0之后，加将通过培养实验1-1中制备的环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）PP710株（独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心保藏号FERM BP-10771）而制备的α-葡萄糖基转移酶的浓缩粗酶液用50mM醋酸缓冲液（pH6.0）稀释至α-葡萄糖基转移酶的活性成500单位/ml的酶液30ml（每1g糊精添加20单位α-葡萄糖基转移酶），搅拌混合，于50℃进行24小时反应。向反应结束后的反应液加1N HCl而调节为pH3.5后，每1g糊精的固体分加1,000单位葡萄糖淀粉酶（长濑生物化学工业公司销售、商品名“XL-4”、3，800单位/ml），于50℃反应24小时，于100℃处理10分钟，停止酶反应。通过使此停止酶反应的反应液以流速SV=3（5ml/分）通过活性炭柱 使葡萄糖基腺苷吸
附于柱之后，用脱离子水（湿润树脂容积的5倍量）及20容积%乙醇溶液（湿润树脂容积的
3倍量）清洗柱，用40容积%乙醇溶液溶出。将溶出液分为各50ml，回收紫外吸收（260nm）是0.15以上的级分。将回收的级分用旋转蒸发器浓缩，使以40ml/分的流速通过强酸性阳离子交换树脂（有机公司销售、商品名“XT-1030E”（Na 型）、 2条），使
用脱离子水溶出，将回收的级分由与实验3同样的条件的HPLC分析，回收计算为以无水物换算，含有95质量%以上葡萄糖基腺苷的级分。再者，通过将此回收的级分减压干燥而得到含有葡萄糖基腺苷的粉末15g。本品是，以无水物换算含有5′-葡萄糖基腺苷约85质量%、含有3′-葡萄糖基腺苷约10质量%、含有黑曲霉糖基腺苷约0.3质量%、含有腺苷约
2质量%。本品可作为用于辅助表皮及真皮的组织结构或生理功能的维持、改善的有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂的有效成分，直接以作为添加适宜的载体、赋形剂、稳定剂、缓冲剂、pH调节剂、溶剂等、任意的助剂等的制剂，或者，配合这些的药品、准药品、化妆品等的形态使用。另外，本品也可随意作为角化细胞分化及增殖促进剂、胶原产生增强剂、神经酰胺合成促进剂或保湿剂利用。

[0184] 顺便而言，上述黑曲霉糖基腺苷是，将本品供于下述条件的HPLC时，除了5′-葡萄糖基腺苷、3′-葡萄糖基腺苷、腺苷的溶出峰以外，在腺苷和3′-葡萄糖基腺苷的溶出峰之间确认小峰（保留时间是约22～23分钟）。将这样的峰级分回收，供于由常规方法的质谱（MS）分析时，算出分子量是607，所以判断为在腺苷上结合2分子葡萄糖的化合物。再者，使用回收的级分，从由下述条件的MNR分析的碳及质子的化学移位值（参照表13），鉴定为在回收的级分中含的物质是在腺苷的5′位的羟基上结合黑曲霉糖1分子的5′-黑曲霉糖基腺苷（α-D-吡喃葡萄糖基-（1→3）-α-D-吡喃葡萄糖基-（1→5′）-腺苷；5′-α-黑曲霉糖基腺苷）。再有，在5′-黑曲霉糖基腺苷在重水中以6w/v%以上溶解，所以相比3′-葡萄糖基腺苷，对水性溶剂的溶解性更高。另外，腺苷及黑曲霉糖的碳化学移位值从独立行政法人产业总合技术研究所公开的有机化合物的光谱数据库（SDBS；http：
//riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi）得到。

[0185]

[0186] 装置：SHIMADZUUV-VISDETECTORSPD-20A（检测器），LC-20AB（泵），C-R7Aplus（记录计），SIL-20AC（自动采样机）

[0187] 柱：ODS柱（YMC公司销售、商品名“YMC-PackODS-AQ303”、 ）

[0188] 移动相：20mM醋酸铵缓冲液（pH3.5）/甲醇=92/8（容积/容积）

[0189] 检测波长：260nm

[0190] 流速：0.5ml/分

[0191] 注入量：20μl

[0192] 柱温度：40℃

[0193]

[0194] 装置：日本电子株式会销售、商品名“JNM-AL300”、1H：300.4MHz、13C：75.45MHz [0195] 溶剂：重水（0.6ml）

[0196] 内部标准：3-三甲基甲硅烷基-1-丙烷磺酸钠盐（TPS）

[0197] 累加次数：1H-NMR64次、13C-NMR12,00次、DEPT100次、H-HCOSY36次、H-CCOSY72次、HMBC920次

[0198] 样品量：36.4mg

[0199] 【表13】

[0200]

[0201] *在溶剂中使用DMSO时

[0202] 【实施例2】

[0203] 向实施例1中制备的含有葡萄糖基腺苷的粉末2.5g加纯化水100ml而溶解，与实验1-2在相同的条件下供于使用ODS柱的分离用HPLC，回收含有5′-葡萄糖基腺苷的级分，通过减压干燥，制备合计约1.6g以无水物换算含有99质量%以上5′-葡萄糖基腺苷的粉末标品。本品可作为用于辅助表皮及真皮的组织结构或生理功能的维持、改善的有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂的有效成分，直接作为添加适宜的载体、赋形剂、稳定剂、缓冲剂、pH调节剂、溶剂等、任意的助剂等的制剂使用。另外，本品也可随意作为角化细胞分化及增殖促进剂、胶原产生增强剂、神经酰胺合成促进剂或保湿剂利用。

[0204] 【实施例3】

[0205] <含有葡萄糖基腺苷的粉末>

[0206] 将腺苷（东京化成工业株式会社销售、试剂特级）和糊精（松谷化学株式会社销售、商品名“Pinedex＃1”、固体分约92.3质量%）分别添加到10mM醋酸钠溶液（pH5.5）至其的浓度分别是1w/v%和10w/v%，加温至50℃，搅拌着使完全地溶解。每1g糊精添加1,000单位嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株（独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心保藏号FERM BP-11273）来源的CGT酶（株式会社林原生物化学研究所制造），于50℃反应24小时后，于100℃加热15分钟而使CGT酶失活之后，每1g糊精加2,600单位葡萄糖淀粉酶（Nagase ChemteX株式会社销售、商品名“Glucozyme＃20000”、20，000单位/g），于50℃反应24小时。将此反应液于100℃加热10分钟之后，离心（11，500rpm），回收800ml上清。通过使此上清以流速SV=3（5ml/分）通过活性炭柱150ml 而使葡萄糖基腺苷及腺苷吸附于柱之后，用脱离子水（湿润
树脂容积的7倍量）及20容积%乙醇溶液（湿润树脂容积的6倍量）清洗柱，用40容积%乙醇溶液溶出（湿润树脂容积的16倍量）。将溶出液分为各50ml，回收确认紫外吸收（260nm）的级分。将回收的级分的约半量膜过滤（孔径0.22μm）后，减压干燥，得到含有葡萄糖基腺苷的粉末约4g。本品以无水物换算，含有5′-葡萄糖基腺苷约26质量%、含有3′-葡萄糖基腺苷约52质量%、含有腺苷约21质量%。本品可作为用于辅助表皮及真皮的组织结构或生理功能的维持、改善的有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂的有效成分，可直接以作为添加适宜的载体、赋形剂、稳定剂、缓冲剂、pH调节剂、溶剂等、任意的助剂等的制剂，或者，作为配合这些的药品、准药品、化妆品等的形态使用。另外，本品也可随意作为角化细胞分化及增殖促进剂、胶原产生增强剂、神经酰胺合成促进剂或保湿剂利用。

[0207] 【实施例4】

[0208] 将实施例3中回收的活性炭柱溶出级分的其余的半量，与实验1-2在相同的条件下供于使用ODS柱的分离用HPLC，逐个回收3′-葡萄糖基腺苷级分、及，5′-葡萄糖基腺苷级分，分别与实施例3同样地，由活性炭柱层析脱盐，由40容积%乙醇溶出，回收葡萄糖基腺苷的溶出级分。将回收的级分膜过滤（孔径0.22μm）后，通过减压干燥，制备以无水物换算含有3′-葡萄糖基腺苷99质量%以上的标品约1.6g，和含有5′-葡萄糖基腺苷99质量%以上的标品约0.6g。本品均作为用于辅助表皮及真皮的组织结构或生理功能的维持、改善的有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂的有效成分，可直接以作为添加适宜的载体、赋形剂、稳定剂、缓冲剂、pH调节剂、溶剂等、任意的助剂等的制剂，或者，作为配合这些的药品、准药品、化妆品等的形态使用。另外，本品也可随意作为角化细胞分化及增殖促进剂、胶原产生增强剂、神经酰胺合成促进剂或保湿剂利用。

[0209] 【实施例5】

[0210] <含有葡萄糖基腺苷的粉末>

[0211] 将腺苷（东京化成工业株式会社销售、试剂特级）和糊精（松谷化学株式会社销售、商品名“Pinedex＃1”、固体分约92.3质量%）分别添加到10mM醋酸钠溶液（pH5.5）至其浓度分别成1w/v%和10w/v%，加温至50℃，搅拌着使完全地溶解。每1g糊精添加1,000单位嗜热脂肪土芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）Tc-91株（独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心保藏号FERMBP-11273）来源的CGT酶（株式会社林原生物化学研究所制造），于50℃反应24小时后，于100℃加热15分钟而使CGT酶失活之后，离心（11，500rpm），回收400ml上清。通过使此上清以流速SV=3（5ml/分）通过活性炭柱150ml 而使含葡萄糖基腺苷的糖基腺苷及腺苷吸附于柱之后，用脱离子水（湿润树脂容积的7倍量）及20容积%乙醇溶液（湿润树脂容积的6倍量）清洗 柱，用40容积%乙醇溶液溶出（湿润树脂容积的16倍量）。将溶出液分为各50ml，回收确认紫外吸收（260nm）的级分。将回收的级分膜过滤（孔径0.22μm）后，减压干燥，得到含有含葡萄糖基腺苷的糖基腺苷和腺苷的粉末约5g。本品以无水物换算，含有3′-葡萄糖基腺苷、3′-麦芽糖基腺苷或3′-麦芽三糖基腺苷等的3′-糖基腺苷、及，5′-葡萄糖基腺苷、5′-麦芽糖基腺苷或5′-麦芽三糖基腺苷等的5′-糖基腺苷合计约58质量%及含有腺苷约37质量%。另外，本品中的糖基腺苷的约30质量%是其5′位被糖苷化的。本品可作为用于辅助表皮及真皮的组织结构或生理功能的维持、改善的有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂的有效成分，可直接以作为添加适宜的载体、赋形剂、稳定剂、缓冲剂、pH调节剂、溶剂等、任意的助剂等的制剂，或者，作为配合这些的药品、准药品、化妆品等的形态使用。另外，本品也可随意作为角化细胞分化及增殖促进剂、胶原产生增强剂、神经酰胺合成促进剂或保湿剂利用。

[0212] 【实施例6】

[0213] <含有葡萄糖基腺苷的组合物>

[0214] 相对于由实施例1～5的方法制备的含有葡萄糖基腺苷的粉末之任一个1质量份添加α,α-海藻糖2质量份，均质地混合而制备含有葡萄糖基腺苷的组合物。本品可作为用于辅助表皮及真皮的组织结构或生理功能的维持、改善的有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂的有效成分使用。另外，本品也可随意作为角化细胞分化及增殖促进剂、胶原产生增强剂、神经酰胺合成促进剂或保湿剂利用。

[0215] 【实施例7】

[0216] <含有葡萄糖基腺苷的组合物>

[0217] 相对于由实施例1～5的方法制备的含有葡萄糖基腺苷的粉末之任一个2质量份添加将含有α,α-海藻糖的糖质衍生物的糖浆（株式会社林原生物化学研究所销售、商品名“Tornare”）喷雾干燥的粉末（株 式会社林原生物化学研究所制备）3质量份，均质地混合而制备含有葡萄糖基腺苷的组合物。本品可作为用于辅助表皮及真皮的组织结构或生理功能的维持、改善的有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂的有效成分使用。另外，本品也可随意作为角化细胞分化及增殖促进剂、胶原产生增强剂、神经酰胺合成促进剂或保湿剂利用。 [0218] 【实施例8】

[0219] <含有葡萄糖基腺苷的组合物>

[0220] 相对于由实施例1～5的方法制备的含有葡萄糖基腺苷的粉末之任一个1质量份添加抗坏血酸2-葡萄糖苷（株式会社林原生物化学研究所销售、商品名“AA2G”）5质量份、依地酸2钠0.1质量份，均质地混合而制备含有葡萄糖基腺苷的组合物。本品可作为用于辅助表皮及真皮的组织结构或生理功能的维持、改善的有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂的有效成分使用。另外，本品也可随意作为角化细胞分化及增殖促进剂、胶原产生增强剂、神经酰胺合成促进剂或保湿剂利用。

[0221] 【实施例9】

[0222] <含有葡萄糖基腺苷的组合物>

[0223] 相对于纯化水20质量份添加由实施例1～5的方法制备的含有葡萄糖基腺苷的粉末之任一个1质量份、α-葡萄糖基橙皮苷或α-葡萄糖基芸香苷2质量份、环黑曲霉糖基黑曲霉糖（环状四糖：株式会社林原生物化学研究所制造）1质量份，搅拌溶解之后，通过根据常规方法喷雾干燥而制备含有葡萄糖基腺苷的组合物。本品可作为用于辅助表皮及真皮的组织结构或生理功能的维持、改善的有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂的有效成分使用。另外，本品也可随意作为角化细胞分化及增殖促进剂、胶原产生增强剂、神经酰胺合成促进剂或保湿剂利用。

[0224] <配合例1：霜形态的皮肤外用剂>

[0225]配合成分 （质量%）
（1）丙二醇 5
（2）密蜡 5
（3）鲸蜡基醇 4
（4）还原羊毛脂 5
（5）角鲨烷 35
（6）硬脂酸甘油酯 2
（7）聚氧乙烯（20摩尔）山梨坦单月桂酸酯 2
（8）实施例4中制备的3′-葡萄糖基腺苷或，5′-葡萄糖基腺苷 1
（9）防腐剂 适量
（10）香料 适量

[0226] 加纯化水而使全量为100质量%。

[0227] <配合葡萄糖基腺苷的皮肤外用剂的抗皱纹作用>

[0228] 为了确认本发明的葡萄糖基腺苷的皮肤外用剂的有效性，使用作为有效成分配合3′-葡萄糖基腺苷或5′-葡萄糖基腺苷的上述配合例1的霜，实施由自愿者的试验。即，由问诊选择苦于慢性的皮肤粗糙的30～50岁左右的女性40名作为受试者，随机分为各
10名4组。在1组10名在皮肤粗糙部分，1天3次（朝、昼、晚）、1个月间每日涂布上述霜（3′-葡萄糖基腺苷配合：霜1）。在1组10名在皮肤粗糙部分，1天3次（朝、昼、晚）、1个月间每日涂布上述霜（5′-葡萄糖基腺苷配合：霜2）。在1组10名，除了代替上述霜的葡萄糖基腺苷而配合腺苷1质量%的以外，在皮肤粗糙部分，1天3次（朝、昼、晚）、1个月间每日涂布与上述相同的处方的霜（霜3）。在其余的1组10名，除了不含葡萄糖基腺苷或腺苷以外，在皮肤粗糙部分，1天3次（朝、昼、晚）、1个月间每日涂布与上述相同的配合的霜（霜
4）。由下述方法，测定皮肤的水分量的同时，以皱纹分值评价皱纹的状态，判断皮肤粗糙的状态。再有，由此方法，皮肤粗糙的状态相比涂布被验样品之前，涂布后的皮肤的水分量越升高，皱纹分值变得越低，越表明改善。

[0229] <肌的水分量的测定方法>

[0230] 在霜的涂前日及布结束次日测定霜涂布部位的皮肤的水分含量及皱纹分值。皮肤的水分含量使用水分含量测定装置（IBS公司销售、 商品名“SKICON-200EX”）测定，将涂布各霜的受试者10名的水分含量的平均值示于表15。

[0231] <皱纹分值的判断方法>

[0232] 皱纹分值的判断是，对于各受试者，由判断者5名的目测，基于化妆品功能评价指南（参照“日本香妆品学会志”、30卷、4号、316～332页（2006年）），以表14所示的8阶段的皱纹分值（0～7等级）进行评价。将对各受试者的判断者5名的平均值作为其受试者的皱纹分值，将涂布各霜的受试者10名的皱纹分值的平均值示于表15。

[0233] 【表14】

[0234]皱纹分值（等级） 判断的基准
0 无皱纹
1 略微确认不明显的浅的皱纹
2 略微确认明显的浅的皱纹
3 确认明显的浅的皱纹
4 明显的浅的皱纹之中，略微确认略深的皱纹
5 确认略深的皱纹
6 确认明显的深的皱纹
7 确认显著的深的皱纹

[0235] 【表15】

[0236]

[0237] 与各自的霜的涂布前比较，*：p<0.05。

[0238] 如表15所示，在涂布配合葡萄糖基腺苷的霜（霜1或2）时，与涂布前比较，涂布后的皮肤的水分量及皱纹分值显著地改善、皮肤粗 糙改善。对此，在代替葡萄糖基腺苷而配合腺苷的霜（霜3）、及，未配合葡萄糖基腺苷或腺苷的霜（霜4）中，皮肤的水分量及皱纹分值在涂布之后，也与涂布前比较确认不到显著的改善，无皮肤粗糙改善。在配合葡萄糖基腺苷的霜间比较中，涂布配合5′-葡萄糖基腺苷的霜（霜2）时，相比涂布配合3′-葡萄糖基腺苷的霜（霜1）时，皮肤的水分量及皱纹分值的改善效果示更高的倾向，所以判断为5′-葡萄糖基腺苷相比3′-葡萄糖基腺苷，皮肤粗糙改善效果更强。另外，涂布配合葡萄糖基腺苷的霜（霜1或2）的期间中及试验结束后，受试者中均未确认霜涂布所引起的异常，所以判断葡萄糖基腺苷的安全性优良。

[0239] <配合例2：溶液形态的组合物>

[0240]

[0241] 加纯化水而使全量为100质量%。

[0242] <配合例3：包装形态的皮肤外用剂>

[0243]

[0244] 加纯化水而使全量为100质量%。

[0245] <配合例4：唇膏>

[0246] 由下述的配合，根据常规方法制备唇膏。

[0247]

[0248] <配合例5：凝胶形态的皮肤外用剂>

[0249]

[0250] 加纯化水而使全量为100质量%。

[0251] <配合例6：软膏形态的皮肤外用剂>

[0252]

[0253] 这些的配合例的各种皮肤外用剂在各自的典型使用实施方式中，可持续地发挥抗皱纹作用，可改善皮肤状态。

[0254] 【工业实用性】

[0255] 如上所述，作为有效成分含有α-D-吡喃葡萄糖基-（1→3′）-腺苷及/或α-D-吡喃葡萄糖基-（1→5′）-腺苷的本发明的皮肤外用剂共具表皮角化细胞的增殖及分化促进作用和真皮成纤维细胞的胶原产生增强作用，可在皮肤中稳定发挥它们的作用，所以可在制造作为辅助表皮及真皮的组织结构或生理功能的维持、改善的优良的有持续性的抗皱纹作用的皮肤外用剂，化妆品、药品、准药品、杂货等的领域等中利用。本发明是发挥显著的作用效果的发明，是对本领域有显著大的贡献的发明。

[0256] ［基于第26条的补充24.02.2012］