具有α-半乳糖基转移酶活性的半乳糖苷酶 |
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| 申请号 | CN200780004121.1 | 申请日 | 2007-01-23 | 公开(公告)号 | CN101379186B | 公开(公告)日 | 2013-12-04 |
| 申请人 | 科拉萨多公司; | 发明人 | G·楚特齐斯; A·K·高拉斯; T·高拉斯; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及具有半乳糖基转移活性、分离自双歧双歧杆菌的β-半乳糖苷酶。所述β-半乳糖苷酶能将乳糖转化为β-连接的寡糖的混合物，且意外地产生α-连接的 二糖 -半乳二糖。所述混合物可掺入许多食品或动物 饲料 中，通过促进肠内双歧杆菌生长并抑制致病性 微 生物 菌群生长而改善肠健康。 | ||||||
| 权利要求 | 1.编码新型β-半乳糖苷酶的DNA序列，所述DNA序列是SEQ.IDNO：1。 |
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| 说明书全文 | 具有α-半乳糖基转移酶活性的半乳糖苷酶[0001] 产品及方法 [0002] 本发明涉及具有半乳糖基转移活性的β-半乳糖苷酶，其能将乳糖转化为β-连接的寡糖的混合物，且意外地产生α-连接的二糖-α1-6半乳二糖。本发明特别涉及分离自最近发现的一株双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)菌株的β-半乳糖苷酶。 [0003] 本发明具体涉及编码所述分离的β-半乳糖苷酶的DNA序列；由这样的DNA序列编码的酶；及包含所述DNA序列或掺入所述DNA序列的重组载体的宿主细胞。本发明还涉及所述DNA序列编码的酶或所述含有DNA序列或重组载体的宿主细胞用于生产寡糖的应用。 [0004] 双歧杆菌天然定殖于肠道下段，该环境中缺少单糖和二糖，因为这类糖优先被宿主及存在于肠道上段的微生物消耗。为了在肠道下段生存，双歧杆菌产生多种表面结合和/或胞外形式的外切及内切糖苷酶，通过这些酶其可利用多样的碳水化合物。 [0006] 已知双歧杆菌的成员产生β-半乳糖苷酶，其涉及乳糖的细菌代谢。P.L.等人在Appl & Environ.Microbial.，2000，62(5)：2276-2283中描述了从一株双歧双歧杆菌中分离并表征三种β-半乳糖苷酶基因。他们发现，所有三种β-半乳糖苷酶都能通过半乳糖基转移作用催化形成β-连接的半乳寡聚糖。 [0007] Dumortier等人在Carbohydrate Research，201，(1990)，115-123中描述了用双歧双歧杆菌DSM 20456进行乳糖水解过程中通过半乳糖基转移反应形成β-连接的寡糖。他们对所产生的寡糖混合物结构的分析显示，连接是β-(1→3)、β-(1→6)及β-(1→4)-β-半乳糖基连接。Dumortier提出双歧双歧杆菌产生的化合物涉及大肠内细菌的黏附。 [0008] 已发现一株双歧双歧杆菌能产生将乳糖转化为新的半乳寡聚糖混合物的半乳糖苷酶活性，所述半乳寡聚糖混合物意外含有多至35％的二糖包括半乳二糖(Gal(α1-6)-Gal)。这种二糖是已知的(参见Paton，J C和Paton，A W(1998)，Clin.Microbiol.Revs.，11，450-479；Carlsson，K A(1989)，Ann.Reviews Biochem.，58，309-350)，是能防止毒素(如志贺菌毒素)和病原体(如大肠杆菌)黏附到肠壁的抗黏附剂。 [0010] 现已发现这株双歧双歧杆菌产生几种β-半乳糖苷酶，其中一种意外显示出α-半乳糖基转移酶活性。此酶产生多种不同的β-连接的寡糖，但也产生α-连接的二糖-半乳二糖。 [0011] 根据本发明，提供了DNA序列，其编码具有如SEQ.ID NO：2所给出的氨基酸序列的蛋白质，或在严格条件下与编码此蛋白的DNA序列杂交。所述DNA序列在SEQ.ID NO：1中给出，或可包含其片段或简并体。 [0012] 用词“简并体”应理解为是指与SEQ.ID NO：1至少50％同源，优选50-98％同源，最优选75-95％同源的DNA序列。 [0013] 这样的DNA序列可包含核苷酸置换、添加或缺失，其导致SEQ.IDNO：2所示氨基酸序列中少于60％、优选少于45％、更优选少于25％的改变。核苷酸置换可导致保守氨基酸置换。 [0014] 根据本发明第二方面，提供了由如上定义的DNA序列编码的酶。这样的酶可包含SEQ.ID NO：2所给出的氨基酸序列或其片段。 [0015] 根据本发明的第三方面，提供了重组载体，优选表达载体，其包含如上定义的DNA序列。这样的载体可被引入宿主细胞如细菌、酵母或真菌细胞中。或者，所述DNA序列可被引入这样的宿主细胞中。合适的宿主细胞可选自双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)或环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、埃希氏菌属(Escherichia)及曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillus niger)。 [0016] 使用乳糖作为底物，如上定义的DNA序列编码的酶产生二糖混合物，包含Gal(β1-3)Glc、Gal(β1-3)Gal、Gal(β1-6)Gal及Gal(α1-6)Gal。所述寡糖混合物中还存在三糖Gal(β1-6)Gal(β1-4)Glc、Gal(β1-3)Gal(β1-4)Glc，四糖Gal(β1-6)Gal(β1-6)Gal(β1-4)Glc及五糖Gal(β1-6)Gal(β1-6)Gal(β1-6)Gal(β1-4)Glc。 [0017] 如上所述的酶或宿主细胞可用于生产二糖的混合物，包括Gal(α1-6)-Gal(半乳二糖)，其可组成用于改善肠健康的产品的一部分。这样的产品可选自乳制品(例如液体奶；干奶粉如全脂奶粉、脱脂奶粉、换脂奶粉、乳清粉；婴儿奶、婴儿配方奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、经发酵乳制品)，饮料如果汁，婴儿食品，谷物类食品，面包，饼干，糖果，蛋糕，食品增补剂，膳食补充剂，益生菌可食用产品，益生元可食用产品，动物饲料，家禽饲料或实际上任何其它食品或饮料。 [0019] 根据本发明再一方面，提供了生产如上定义的酶的方法，其包括：在合适的培养基中于允许所述酶表达的条件下培养如上定义的宿主细胞，并从培养物中回收所产生的酶。 [0020] 本发明还涉及生产寡糖(包括Gal(α1-6)-Gal(半乳二糖))混合物的方法，其包括：在导致形成所述寡糖混合物的条件下，使如上定义的酶或如上定义的宿主细胞与含乳糖物质接触。 [0021] 合适的含乳糖物质可选自商品化的乳糖、全脂奶、半脱脂奶、脱脂奶、乳清及换脂奶、乳清渗透物。这样的奶制品可获自奶牛、水牛、绵羊或山羊。换脂奶定义为经脱脂除去乳脂后代之以添加植物脂肪或油的全脂奶。 [0023] 图1显示本发明的双歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶的核苷酸序列(SEQ.ID NO：1)。 [0024] 图2显示对应于图1的核苷酸序列的氨基酸序列(SEQ.ID NO：2)。 [0025] 图3为显示用β-半乳糖苷酶和40％(w/w)乳糖于0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)中作为底物进行半乳寡聚糖合成期间的时程反应的图。 [0026] 图4显示用40％(w/w)乳糖于0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)中作为底物由来自双歧双歧杆菌NCIMB 41171的β-半乳糖苷酶合成的半乳寡聚糖混合物的高效阴离子交换色谱图。(Glc＝葡萄糖，Gal＝半乳糖，Lac＝乳糖，α(1-6)半乳二糖，DP＝聚合度)。 [0027] 使用Lawson等人(1989)Fems Microbiol Letters，65，(1-2)，41-45的方法从双歧双歧杆菌菌株(NCIMB 41171)分离基因组DNA。用限制性内切酶消化所述DNA，将最大大小为15kbp的片段与经相同限制性内切酶消化的pSP72载体连接。用含有由经PstI、EcoRI、BamHI、KpnI、SmaI或HindIII消化的双歧双歧杆菌染色体DNA组成的插入物的载体转化大肠杆菌细胞。在含有对硝基苯，X-β-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的Luria Bertani琼脂平板上选择具有β-半乳糖苷酶活性的克隆。具有Bam HI染色体DNA的连接混合物产生7个β-半乳糖苷酶阳性克隆，其中之一被鉴定为pB1。 [0028] 使 用Sanger 的 双 脱 氧 链 终 止 法 (Russel P.，2002 iGenetics，Pearson Education，Inc.，San Francisco，187-189)，用BigDyeTerminator(3.0版)循环测序试剂盒(Applied Biosystems，USA)，对插入的DNA片段B1进行DNA测序。B1的DNA序列显示于图1中(SEQ.ID NO：1)。 [0029] 通过使用NCBI(国立生物技术信息中心)的ORF finder，定位可读框(ORF)。以所有6种可能的阅读框翻译图1的核苷酸序列，鉴定了编码推定的β-半乳糖苷酶的一个1052个氨基酸的可读框。翻译显示于图2中(SEQ.ID NO：2)。 [0030] 将参考下列实施例进一步描述本发明。 [0031] 实施例1 [0032] 材料与方法 [0033] 该研究全程中使用的所有化学试剂和培养基制剂均得自Sigma(Dorset，英国)、Invitrogen(Paisley，英国)、Oxoid(Basingstoke，英国)、Qiagen(West Sussex，英国)和Promega(Southampton，英国)。 [0034] 细菌菌株 [0035] 双歧双歧杆菌菌株(NCIMB 41171)保存在-70℃Microbank管中的低温珠上。菌株在Wilkinson Chalgren(WC)琼脂(Oxoid，英国)和TPY培养基(胰胨植胨酵母提取物培养基)上复苏，并于37℃厌氧培养(CO2和N2组成分别是80％和20％)48小时，以用于后续实验。通过革兰氏染色检测菌落形态及有无污染。 [0036] 大肠杆菌菌株 [0037] 本研究所用大肠杆菌菌株DH5α通常于37℃有氧条件下在LuriaBertani(LB)琼脂或培养液(Sambrook J.和Russell W.D.(2001).Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)中培养，需要时添加抗生素(100μg/ml氨苄青霉素和/或15μg/m l氯霉素)，并将40μl 2％X-β-Gal，7μl 20％(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)IPTG涂到预制的90mm琼脂平板表面上。 [0038] 大 肠 杆 菌 DH5α 菌 株 (Invitrogen，Paisley， 英 国 )( 基 因 型：- - - Fφ801acZΔMΔ(lacZYAargF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk，mk)phoA supE44 thi-1 - gyrA96 relA1λ)是α-半乳糖苷酶阳性菌株，其用于表达实验及其它遗传操作。 [0039] 从双歧双歧杆菌提取基因组DNA [0040] 使用以下方法从双歧双歧杆菌菌株(NCIMB 41171)分离基因组DNA，其中由从100ml WC厌氧菌肉汤中收获的细胞沉淀制备染色体DNA。将细胞重悬于10ml TES缓冲液(10mM Tris-HCl、10mM EDTA、10mM NaCl，pH8)，并于37℃用200μl的溶菌酶/变溶菌素混合物(4∶1，10mg/ml溶菌酶，1mg/ml变溶菌素)处理30分钟。然后将细胞用200μl蛋白酶K(20mg/ml)和200l RNA酶(均10mg/ml)处理，混合并于65℃温育1小时。最后用 2ml 10％SDS处理细胞并于65℃温育15分钟。加入12ml苯酚/氯仿，并重复抽提至水相可容易地从界面分离。用异丙醇沉淀基因组DNA，并重悬于10mM Tris-HCl-1mM EDTA(pH8)。 之后用限制性内切酶消化基因组DNA，并将其连接到经相同酶消化并用碱性磷酸酶处理的pSP72中。用EcoRI、PstI、BamHI、SmaI及KpnI进行双歧双歧杆菌基因组DNA消化。用连接混合物转化大肠杆菌DH5α，并将β-半乳糖苷酶阳性克隆鉴定为含有X-Gal的平板上的蓝色菌落。 [0041] 载体DNA制备 [0042] 在本研究中全程用于克隆和表达的载体是pSP72(Promega，英国)(Krieg，P.A.和Melton，D.A.(1987).In vitro RNA synthesiswith SP6 RNA polymerase.Methods in Enzymology.155：397-415)。 [0043] 选此载体是因为其缺乏β-半乳糖苷酶的α-片段(其不在pSP72中编码)的互补活性。此载体不携带含有调节序列和β-半乳糖苷酶前146个氨基酸编码信息的大肠杆菌DNA短片段，所述β-半乳糖苷酶前146个氨基酸编码信息与表达此β-半乳糖苷酶羧基末端部分的大肠杆菌菌株(即DH5α)组合可产生有活性的β-半乳糖苷酶(α-互补)。 [0044] 按照生产商的说明书，使用相对于DNA十倍过量的酶(酶单位：μgr DNA＝10个单位的酶/1μgr质粒DNA，或10个酶单位/0.5pmol质粒DNA)，用以下限制性内切酶消化所述载体：PstI、BamHI、HindIII、SmaI、KpnI及EcoRI。热灭活酶(65℃，20分钟)后通过水平凝胶电泳分析限制图谱。凝胶上只存在一个片段表明载体消化完全，且为单一限制酶切消化。 [0045] 还通过将未连接的分子转化到感受态大肠杆菌DH5α细胞中来检测载体是否充分消化。在添加氨苄青霉素(100μgr/ml)的LB琼脂平板上形成的菌落数指示未消化分子和在后续实验中预期的背景。 [0046] 按照生产商的说明书用牛肠碱性磷酸酶CIAP(Promega，Southampton，英国)进一步去磷酸化所述载体。在转化到DH5α细胞中后，通过自身连接(用噬菌体T4DNA连接酶，依产品说明书)检测处理效率。所形成的菌落数表示重新环化的分子(非克隆载体)数，将上述数值减去无CIAP载体处理而形成的菌落数显示非去磷酸化的载体数。 [0047] 构建基因组DNA文库 [0048] 用识别原核生物DNA中常见的六核苷酸序列的6种限制性内切酶部分消化基因组DNA。EcoRI、BamHI、PstI、KpnI、SmaI及HindIII是II型限制性内切酶，分别特异性识别序列5’G/AATTC’3、5’G/GATCC’3、5’CTGCA/G’3、5’GGTAC/C3’、5’CCC/GGG3’及5’A/AGCTT3’，在这些序列内产生双链断裂，对于EcoRI、BamHI及HindIII分别产生4个核苷酸的5’突出端AATT、GATC、AGCT，对于PstI和KpnI分别产生3’突出端ACGT、GTAC，以及对于SmaI产生平末端。 [0049] 所有这些酶只有在2价镁离子存在下有活性且能够切割DNA。这些离子是唯一需要的辅因子。 [0050] DNA的限制酶切消化 [0051] 对基因组DNA样品的所有限制酶切消化均于37℃温育2小时，并最后在65℃热灭活20分钟。之后反应冷却至室温，加入适量上样缓冲液后用密封的玻璃毛细管轻轻混匀。之后将所述溶液上样到0.8％琼脂糖凝胶的孔中(电源4-5V/cm，14-16小时)，用1kbp的DNA标准品(Promega，英国)估计消化的DNA的大小(Sambrook J.MolecularCloning：A Laboratory Manual(2002))。 [0052] 限制酶切消化后产生的片段的纯化 [0053] 用来自Qiagen的QIAEX凝胶提取试剂盒(West Sussex，英国)进行从反应混合物和琼脂糖凝胶的片段纯化。方案的详细描述见生产商的操作手册。 [0054] DNA连接和转化 [0055] DNA片段经Qiaex凝胶提取试剂盒纯化后与经CIAP处理的pSP72载体连接。如表1所示将适量DNA移入无菌的0.5ml微型离心管中以进行连接反应。 [0056] [0057] 表1：连接反应混合物。管A显示自身连接的载体DNA数，其必须从转化后的转化体总数中扣除。管B显示载体与DNA片段的连接，管C显示对照组，藉此计算转化效率。 [0058] 每次连接反应前，将DNA片段于45℃温热5分钟以解链任何在片段制备过程中重新退火的粘性末端。对于所有连接反应选用载体与插入DNA 1∶1的摩尔比，并依Promega公司的说明书进行反应装配。 [0059] 向管A和管B中加入1.0μl 10×连接缓冲液和0.5Weiss单位的T4DNA连接酶(Promega，英国)，用分子生物学级水调节连接反应体积至10μl。向管C加入1.0μl 10×连接缓冲液，并用分子生物学级水调节连接反应体积至10μl。 [0060] 向所述管中加入DNA片段连同水后温热至45℃持续5分钟以解链任何在制备过程中重新退火的粘性末端。将DNA冷却至0℃后加入剩余的连接试剂，并将反应混合物于16℃过夜温育(Sambrook和Russell，2001)。 [0061] 乙醇沉淀及纯化连接片段(以除去连接反应混合物，其可降低转化效率)后，依Hanahan流程指南进行转化。向100μl感受态大肠杆菌DH5α细胞中加入含～50ng连接DNA的5μl溶液。热处理并表达氨苄青霉素抗性基因后，将细胞铺展于含有氨苄青霉素(100μgr/ml)、X-β-Gal(40μl 2％X-β-Gal)和IPTG(7μl 20％IPTG)的LB平板表面。 [0062] 测量每个连接反应的转化体数。从管C通常得到的转化体数是2×105-1×106cfu/μg，而从管A则是500-600cfu/μg。管A中的转化体数指示对载体DNA的有效处理。管B4 中的转化体数在2-4×10cfu/μg的范围内。 [0063] 转化体数 [0064] 含PstI染色体DNA的连接反应混合物从约2500个所筛选转化体中产生13个β-半乳糖苷酶阳性克隆，而以BamHI产生7个阳性克隆(所筛选转化体约1500个)，EcoRI产生3个阳性克隆(所筛选转化体约1300个)，KpnI产生7个阳性克隆(所筛选转化体约2000个)，SmaI产生3个阳性克隆(所筛选转化体约1600个)，HindIII产生2个阳性克隆(所筛选转化体约1200个)。 [0065] 阳性克隆消化 [0066] 根据下表消化从阳性克隆分离的质粒，以鉴定不同的β-半乳糖苷酶基因。 [0067] [0068] 对消化后所产生片段的凝胶电泳分析显示质粒pB1、pP1、pP2和pP11各有一个编码不同β-半乳糖苷酶的插入片断。含有pB1的克隆用于进一步分析。 [0069] DNA测序 [0070] 用BigDye Terminator(3.0版)循环测序试剂盒(AppliedBiosystems，美国)，依Sanger的双脱氧链终止法进行DNA测序，并用ABI Prism 3100(兼并毛细管电泳的基于荧光的DNA分析系统)分析。 [0071] 用载体特异性引物对插入DNA片段的5’和3’端进行测序。用Genome Priming System(GPS-1)(New England Biolabs，英国)对插入片段进行进一步测序。GPS-1是基于TN7转座子的体外系统，其用TnsABC转座酶将转座子随机插入目标DNA中。依生产商说明书采用1∶4的供体：目标DNA质量比。向目标质粒插入Transprimer后用于测序分离的质粒数是25。该数目是依生产商说明书计算的，其假定5倍的覆盖深度。 [0072] 对于质粒pB1，在所用载体的多克隆位点下游973bp位置处插入一个约1699bp的转座子插入物完全消除了β-半乳糖苷酶活性，表明起始密码子位于载体MCS(多克隆位点)和转座子位点之间，而在MCS下游841bp位置处插入所述插入片段则导致形成有活性的β-半乳糖苷酶，表明起始密码子存在于MCS下游841bp与973bp之间。在MCS下游3565bp位置处插入所述插入片段完全消除了所述酶活性，表明终止密码子在该位置下游。 而且，在1239bp、1549bp、1683bp、1832bp、2108bp、2189bp、2270bp、2340bp、2414bp、2574bp、 2648bp、2734bp、2807bp和3410bp位置处插入也完全消除所述酶活性。 [0073] 测序反应混合物含有约400-600ng质粒DNA，3.2pmol引物溶液和4μl BigDye Terminator溶液。 [0074] 可读框确定 [0075] 用NCBI的ORF finder定位B1的可读框(ORF)。采用细菌的遗传密码，确定框长度为100bp。以所有六种可能的框翻译核苷酸序列，鉴定了一个编码推定的β-半乳糖苷酶的1052个氨基酸的可读框(所述翻译显示于图2中)。 [0076] 实施例2 [0077] 在大肠杆菌宿主(DH5α株)中用分离自双歧双歧杆菌NCIMB 41171的克隆酶-β-半乳糖苷酶进行合成 [0078] 除非另作说明，用浓度为2000ppm的甲苯处理大肠杆菌生物质(通过10000g离心收集)以通过破坏其细胞质膜增加细胞通透性并使细胞不能生活后，用全大肠杆菌DH5宿主细胞进行下述合成。如实施例1中“大肠杆菌菌株”所述制备大肠杆菌生物质。 [0079] 应用克隆酶的合成 [0080] 以40％(w/w)初始乳糖浓度的底物浓度用β-半乳糖苷酶进行合成。在pH6.8的0.1M磷酸盐缓冲液(或pH6.2的柠檬酸盐缓冲液或pH6.8的磷酸钾缓冲液)中制备合成溶液。于40℃在150rpm的摇动水浴中进行合成。基于在变化的pH值下对特定酶制剂的活性测量(使用邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷为底物)选择对特定酶的最佳pH。 [0081] 为合成半乳寡聚糖，将5ml大肠杆菌DH5α细胞悬液(活性为2.2U/ml)离心(10000g)以收集生物质，并弃去上清液。用10g 40％(w/w)的底物溶液重悬该生物质以进行合成。 [0082] 合成过程中混合物中存在的不同糖的浓度显示于图3。由克隆自双歧双歧杆菌NCIMB 41171的β-半乳糖苷酶合成的半乳寡聚糖混合物的高效阴离子交换色谱法联合脉冲电流检测(HPAEC-PAD)的色谱图显示于图4。在最佳合成时间点时半乳寡聚糖混合物中的糖浓度显示于表1。 [0083] 表1.以40％(w/w)初乳糖浓度在观察到最大寡糖浓度的时间点时半乳寡聚糖合成的碳水化合物组成。 [0084] [0085] Lac：乳糖，Glc：葡萄糖，Gal：半乳糖，DP：聚合度 |
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