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一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用
申请号	CN201611095535.7	申请日	2016-12-02	公开(公告)号	CN106434494B	公开(公告)日	2017-11-07
申请人	山东百龙创园生物科技股份有限公司;			发明人	杜倩; 窦光鹏; 干昭波; 邵先豹; 李方华;
摘要	本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY‑005，2016年10月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.13152。本发明还涉及该枯草芽孢杆菌的培养方法与应用。本发明首次获得的高产D‑阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌BLCY‑005，其发酵液中的D‑阿洛酮糖差向异构酶酶活可达到143U/ml，较传统D‑阿洛酮糖差向异构酶活提高50％以上，显著降低生产成本，最适pH值为5.5～6.5，与传统菌株产D‑阿洛酮糖差向异构酶最适pH偏中性相比，有利于生产中对污染的控制。
权利要求	1.一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BLCY-005，2016年10月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.13152，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BLCY-005的培养方法，其特征在于，步骤如下：（1）取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BLCY-005接种于固体培养基中，在30～38℃的条件下，活化培养6～12h，制得活化菌株；（2）取步骤（1）制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在30～38℃的条件下，增殖培养 6～12h，制得种子液；（3）取步骤（2）制得的种子液，按体积比1～10%的比例接种于发酵培养基中，在30～38℃，扩大培养30～48h，即得菌体发酵液。 3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中的种子培养基组分如下，均为重量百分比：蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，氯化钠1%，无水硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.02%，余量水，pH6.0～7.0； 4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中的发酵培养基组分如下，均为重量百分比：酵母浸粉3%，玉米浆粉2%，葡萄糖1%，无水硫酸镁0.01%，磷酸氢二铵0.02%，硫酸铵 0.02%，余量水，pH6.0～7.0。 5.权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BLCY-005在制备D-阿洛酮糖中的应用。 6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤如下：（a）取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BLCY-005的菌体发酵液经离心分离，洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，即为粗酶制剂；（b）将步骤（a）制得的粗酶制剂置于50～60℃水浴中热变性40～60min，再用真空冷冻干燥机，于-40～-60℃，-20～-60kpa工作压力下干燥，即制得D-阿洛酮糖差向异构酶干粉。 7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤（a）的洗涤菌体采用pH 8.0、浓度50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后经离心分离，保留沉淀，制得粗酶制剂。 8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤（a）、（b）中的离心分离均为在4℃、 10000 r/min条件下，离心10 min。
说明书全文	一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用技术领域 [0001] 本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。背景技术 [0002] 枯草芽孢杆菌，属芽孢杆菌属。革兰氏阳性菌，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色至淡黄色，需氧菌。 [0003] D-阿洛酮糖是一种重要的稀有糖，在自然界中极少量地存在于甘蔗糖蜜、水果干、糖制品、小麦和鼠刺属植物中。其名称起源于从抗菌素阿洛酮糖腺苷中也可以分离到少量的D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖在人体内是通过小肠吸收进入血液循环中，在小肠吸收后不会被代谢成能量，且对于肠道微生物具有较低的发酵利用度。D-阿洛酮糖具有多种重要的生理功能：神经保护作用，将血糖、减脂，清除活性氧簇，抗氧化，抑制癌细胞增殖，低卡路里甜味剂等。 [0004] D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，早期的D-阿洛酮糖合成方法是通过多级化学转化普通单糖或非糖的前体物质，但多次的保护和脱保护操作会导致收率偏低，且合成过程繁杂，存在很大的局限性。目前，已有以D-果糖为原料，可通过生物转化法制备D-阿洛酮糖，但是目前已报道的微生物，产生的D-阿洛酮糖差向异构酶转化能力较差，且分离纯化过程较难。 [0005] 中国专利文献CN105602879A(申请号201610051547.3)公开了一株高效分泌D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因工程菌株及其构建方法。该发明通过利用由瘤胃菌Ruminococcus sp.5_1_39B_FAA来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因rdpe构建重组表达质粒pMA5-RDPE，然后转化枯草芽孢杆菌，实现了RDPE在枯草芽孢杆菌中组成型分泌表达。通过比较三个糖诱导型启动子，得到最优诱导型启动子PxylA，并明显提高了RDPE的分泌水平。通过敲除木糖利用基因xylAB(xylA和xylB)，阻断了枯草芽孢杆菌的木糖代谢途径，进一步提高了RDPE的分泌量，并使诱导剂木糖的最优诱导浓度由4.0％降低为0.5％。最终，采用分批补料方式，在7.5L 发酵罐中对工程菌株1A751SD-XR进行评价，RDPE的分泌水平最高可以达到95U/mL和2.6g/L。但该酶的酶活仍然较低，无法满足实际生产的需要。 [0006] 因此，寻找一种高转化率的D-阿洛酮糖差向异构酶生产菌株成为解决D-阿洛酮糖大规模生产应用的关键。发明内容 [0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。该枯草芽孢杆菌具有高转化D-果糖生成D-阿洛酮糖的能力，可显著降低生产成本。 [0008] 本发明的技术方案如下： [0009] 一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，2016年10月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.13152，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 [0010] 本发明所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005的原始菌株分离于山东德州百龙创园研发中试车间附近的土壤，并经过诱变后获得。该菌株在LB培养基上形成的菌落呈污白色，半透明，菌落边缘不规整，呈波浪状，中心高凸。经显微镜观察，该菌株长约1.0～1.5微米，宽约0.6～0.9微米，无荚膜，不产鞭毛，芽孢位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后具体不膨大。该菌株可高产D-阿洛酮糖差向异构酶，产生的D-阿洛酮差向异构酶为胞内酶，经简单的离心、洗涤、灭菌、干燥即可得到干酶制剂，该酶酶活达到143U/ml，最适pH值为 5.5～6.5，较传统D-阿洛酮糖差向异构酶活提高50％以上，可以显著降低D-阿洛酮糖的生产成本。 [0011] 上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005的培养方法，步骤如下： [0012] (1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005接种于固体培养基中，在30～38℃的条件下，活化培养6～12h，制得活化菌株； [0013] (2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在30～38℃的条件下，增殖培养6～12h，制得种子液； [0014] (3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比1～10％的比例接种于发酵培养基中，在30～38℃，扩大培养30～48h，即得菌体发酵液。 [0015] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中的种子培养基组分如下，均为重量百分比： [0016] 蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，余量水，pH6.0～7.0； [0017] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中的发酵培养基组分如下，均为重量百分比： [0018] 酵母浸粉3％，玉米浆粉2％，葡萄糖1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸氢二铵0.02％，硫酸铵0.02％，余量水，pH6.0～7.0。 [0019] 所述步骤(1)中的固体培养基为本领域常规固体培养基，如LB培养基等。 [0020] 上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005在制备D-阿洛酮糖差向异构酶中的应用。 [0021] 上述应用，步骤如下： [0022] (a)取上述制备的菌体发酵液经离心分离，洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，即为粗酶制剂； [0023] (b)将步骤(a)制得的粗酶制剂置于50～60℃水浴中热变性40～60min，再用真空冷冻干燥机，于-40～-60℃，-20～-60kpa工作压力下干燥，即制得D-阿洛酮糖差向异构酶干粉。 [0024] 根据本发明优选的，所述步骤(a)的洗涤菌体采用pH 8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后经离心分离，保留沉淀，制得粗酶制剂。 [0025] 根据本发明优选的，所述步骤(a)、(b)中的离心分离均为在4℃、10000r/min条件下，离心10min。 [0026] 上述制备的D-阿洛酮糖转移酶在制备D-阿洛酮糖中的应用。 [0027] 有益效果 [0028] 1、本发明首次获得的高产D-阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌BLCY-005，其发酵液中的D-阿洛酮糖差向异构酶酶活可达到143U/ml，较传统D-阿洛酮糖差向异构酶活提高50％以上，显著降低生产成本，最适pH值为5.5～6.5，与传统菌株产D-阿洛酮糖差向异构酶最适pH偏中性相比，有利于生产中对污染的控制； [0029] 2、本发明所述的枯草芽孢杆菌BLCY-005，产生的D-阿洛酮糖差向异构酶为胞内酶，分离工艺简单，经简单的离心、洗涤、灭活、干燥即可得到干粉酶制剂，节约了生产成本，降低了动力损耗； [0030] 3、本发明摈弃了传统的发酵液直接转化D-果糖的方法，通过简便的分离步骤，就可以获得干粉酶制剂，极大地降低后续D-阿洛酮糖提纯的难度和成本，并可以显著提高D-阿洛酮糖成品的质量。具体实施方式 [0031] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。 [0032] 实施例1 [0033] 一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005，2016年10月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.13152，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 [0034] 上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))BLCY-005的筛选过程如下： [0035] 富集培养 [0036] 选取山东德州百龙创园研发中试车间附近的土壤，用小铲子除去表土，取离地面5～15cm处的土壤约10g，用无菌水稀释10倍，加入LB培养基进行富集培养，30～38℃培养24h。 [0037] 纯种分离 [0038] 采用划线分离法，取一支盛有5ml无菌水的大试管，取步骤(1)中富集培养后的菌液2ml放入其中稀释，充分振荡分散，用接种环以无菌操作挑取稀释液一环先在平板培养基一边做第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约60度角，将接种环上剩余物烧掉，待冷却后同一次划线方法做第二次划线，同法依次做第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，将培养皿倒置，28～38℃培养24h后，挑取单个菌落接种于10个斜面培养基上，分别编号01～10。 [0039] 将01～10斜面种子接种于摇瓶培养基中培养28～38℃培养24h，对01～10摇瓶发酵液进行D-阿洛酮糖对D-果糖的酶活测定，06号摇瓶酶活最高，达到75U/ml。 [0040] 所述平板培养基组分如下，均为重量百分比： [0041] 蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，余量水，pH自然； [0042] 所述斜面培养基组分如下，均为重量百分比： [0043] 蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，琼脂粉1％，余量水，pH自然； [0044] 所述摇瓶培养基组分如下，均为重量百分比： [0045] 酵母浸粉3％，玉米浆粉2％，葡萄糖1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸氢二铵0.02％，硫酸铵0.02％，余量水，pH 6.0～7.0； [0046] 诱变筛选 [0047] 对06号菌种进行紫外线诱变，紫外线诱变采用15W紫外线灯20cm照射，照射时间为120s，得到的高产菌种再进行亚硝基胍诱变处理，最终得到高转化率D-阿洛酮糖差向异构酶的产生菌株命名为BLCY-005，其产D-阿洛酮糖3-差向异构酶在最适条件下，酶活达到 143U/ml。 [0048] 酶活测定方法：1ml的反应体系中，加入800μl反应底物溶液，反应底物溶液为由50ml磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解D-果糖制得D-果糖浓度为100g/L的溶液，200μl的发酵液， 55℃保温10min，然后煮沸10min，终止酶反应。 [0049] 用HPLC检测D-阿洛酮糖的生产量，计算酶活。酶活单位(U)：每分钟催化产生1μmol D-psicose所需要的酶的量。 [0050] 实施例2 [0051] 实施例1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005的培养方法，步骤如下： [0052] (1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005接种于LB培养基中，在35℃的条件下，活化培养12h，制得活化菌株； [0053] (2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在35℃的条件下，增殖培养12h，制得种子液； [0054] 所述种子培养基组分如下，均为重量百分比： [0055] 蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，余量水，pH6.8； [0056] (3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比5％的比例接种于发酵培养基中，在35℃，扩大培养48h，即得菌体发酵液； [0057] 所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比： [0058] 酵母浸粉3％，玉米浆粉2％，葡萄糖1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸氢二铵0.02％，硫酸铵0.02％，余量水，pH6.8。 [0059] 经离心、洗涤、灭菌、干燥后制得干酶制剂，在最适pH值为5.5～6.5的条件下，测定其酶活为143U/ml，该酶活远高于原始菌株的75U/ml。 [0060] 对比例1 [0061] 实施例1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005的培养方法，步骤如下： [0062] (1)取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005接种于LB培养基中，在28℃的条件下，活化培养12h，制得活化菌株； [0063] (2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在28℃的条件下，增殖培养12h，制得种子液； [0064] 所述种子培养基组分如下，均为重量百分比： [0065] 蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，余量水，pH5.0。 [0066] (3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比5％的比例接种于发酵培养基中，在28℃，扩大培养48h，即得菌体发酵液； [0067] 所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比： [0068] 酵母浸粉3％，玉米浆粉2％，葡萄糖1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸氢二铵0.02％，硫酸铵0.02％，余量水，pH5.0。 [0069] 经离心、洗涤、灭活、干燥后制得干酶制剂在最适pH值为5.5～6.5的条件下，测定其酶活为107U/ml。 [0070] 由上述结果可以看出，培养条件不在本发明所述权利要求范围内时，D-阿洛酮糖的的转化率大幅降低。

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