葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸 |
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| 申请号 | CN201580054636.7 | 申请日 | 2015-10-23 | 公开(公告)号 | CN106795505A | 公开(公告)日 | 2017-05-31 |
| 申请人 | 诺维信公司; | 发明人 | 福山志朗; 堤纪子; 绫部圭; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及葡糖 淀粉 酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置295的位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少 |
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| 说明书全文 | 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸[0002] 本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。 [0003] 发明背景发明领域 [0004] 本发明涉及葡糖淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。还描述了本发明的葡糖淀粉酶用于淀粉转化以产生发酵产物，例如乙醇、和糖浆(例如葡萄糖)的用途。本发明还涉及一种包括本发明的葡糖淀粉酶的组合物。 [0005] 相关技术描述 [0006] 葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。葡糖淀粉酶由若干丝状真菌和酵母产生，其中来自曲霉菌属(Aspergillus)的那些在商业上最为重要。 [0007] 在商业上，葡糖淀粉酶用于将已经由α-淀粉酶部分水解的含淀粉材料转化成葡萄糖。然后可以使用一种发酵有机体将葡萄糖直接或间接地转化成发酵产物。商业发酵产物的实例包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸类(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；以及更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，盘尼西林和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；激素以及难以合成生产的其他化合物。发酵过程通常还用于可食用酒精(例如，啤酒和酒)工业、乳制品(例如，在酸乳和奶酪的生产中)工业中。 [0008] 最终产物还可以是糖浆。例如，最终产物可以是葡萄糖，但是还可以被葡萄糖异构酶转化成果糖或由几乎均等的葡萄糖与果糖组成的一种混合物。这种混合物或进一步富含果糖的一种混合物是全世界商业化的最常用的高果糖玉米糖浆(HFCS)。 [0009] 本发明的目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸，并且这些多肽和多核苷酸在发酵产物的生产过程(例如乙醇生产过程)中提供高产量。 [0010] WO 2011/068803披露了从真菌粘褶菌，特别是从篱边粘褶菌和密粘褶菌分离的葡糖淀粉酶。 [0011] WO 2014/177546披露了WO 2011/068803中披露的亲本葡糖淀粉酶的变体。 [0012] 本发明提供了与其亲本相比具有改进的特性的葡糖淀粉酶变体。 [0013] 发明概述 [0014] 本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置295的位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [0015] 本发明也涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置271、410、72、77、145、219、303、224、318的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [0016] 在一个另外的方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置271、或295、或271和295的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [0017] 本发明另外涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及生产这些变体的方法。 [0018] 在另一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物(具体是乙醇)的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化；(b)使液化的材料糖化；和(c)用发酵生物进行发酵；其中使用葡糖淀粉酶变体的至少一种变体进行步骤(b)。 [0019] 在另一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化；(b)在本发明的变体葡糖淀粉酶的存在下，使液化的材料糖化； [0020] 在再另一个方面，本发明涉及包括本发明的变体的组合物。 [0021] 在另一方面，本发明涉及该变体葡糖淀粉酶用于生产糖浆或发酵产物的用途。 [0023] 图1示出了作为通过HPLC分析的酶活性(AGU/gDS)的函数的乙醇产量。将选择的变体葡糖淀粉酶与亲本葡糖淀粉酶JGA098和来自瓣环栓菌(Tc-AMG)、篱边粘褶菌(Gs-AMG)、血红密孔菌(Ps-AMG)的野生型葡糖淀粉酶进行比较。 [0024] 定义 [0025] 葡糖淀粉酶：术语“葡糖淀粉酶”(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)被定义为催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：23.2mM麦芽糖，缓冲液：0.1M醋酸盐，反应时间：5分钟)每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量。 [0026] 在另一实施例中，本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的多肽的至少20％、优选至少40％、优选至少45％、更优选至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少 65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％以及甚至最优选至少100％的葡糖淀粉酶活性。 [0027] 等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然发生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽方面无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。 [0028] cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺少可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录物本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。 [0029] 编码序列：术语“编码序列”意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。 [0030] 控制序列：术语“控制序列”意指为编码本发明的变体的多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。 [0031] 表达：术语“表达”包括涉及变体的产生的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。 [0032] 表达载体：术语“表达载体”意指一种线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。 [0033] 片段：术语“片段”意指使一个或多个(例如，若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺少的多肽，其中该片段具有葡糖淀粉酶活性。在一方面，一个片段包含至少454个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1至454)，包括催化结构域并且具有根据本发明所述的一个或多个取代。 [0034] 高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。 [0035] 宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。 [0036] 改进的特性：术语“改进的特性”意指与相对于亲本有所改进一种变体相关的特征。这种改进的特性，包括但不限于，比活性、降低的葡萄糖抑制、降低的异麦芽糖形成活性、增加的DE11活性、和增加的热稳定性。当该变体被应用于在液化的醪液上糖化随后发酵时，进一步改进的特性是增加的EtOH产量。 [0037] 分离的：术语“分离的”意指在自然界中不存在的一种形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。 [0038] 低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。 [0039] 成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。成熟多肽在此被披露为SEQ ID NO:2。 [0040] 成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有葡糖淀粉酶活性的一种成熟多肽的一种多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸52至1728(或至1731，包括终止密码子)。SEQ ID NO:1的核苷酸1至51编码信号肽。 [0041] 中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。 [0042] 中高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。 [0043] 核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双-链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。 [0044] 可操作地连接：该术语“可操作地连接”意指如下配置，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列放置在适当位置，以使得控制序列指导编码序列的表达。 [0045] 亲本或亲本葡糖淀粉酶：术语“亲本”或“亲本葡糖淀粉酶”意指对其做出改变以产生本发明的酶变体的一种葡糖淀粉酶。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。 [0046] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。 [0047] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的尼德尔(Needle)输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的： [0048] (一致的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数) [0049] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长一致性””的尼德尔(Needle)输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且是如下计算的： [0050] (一致的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数) [0051] 子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有葡糖淀粉酶活性的一个片段。在一方面，一个子序列至少编码根据本发明所述的变体的催化结构域。例如，包含至少1362个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸52至1413)。 [0052] 变体：术语“变体”意指具有葡糖淀粉酶活性的、包含一个改变(即在一个或多个(例如，若干)位置处的一个取代、插入和/或缺失)的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸由不同的氨基酸代替；缺失意指除去占据一个位置的氨基酸；以及插入意指在占据一个位置的氨基酸的毗邻处和紧邻处添加一个氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:2的多肽的至少20％，例如至少40％、至少45％、更优选至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少 85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％、以及甚至最优选至少100％的葡糖淀粉酶活性。 [0053] 非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。 [0054] 非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。 [0055] 野生型葡糖淀粉酶：术语“野生型”葡糖淀粉酶意指由见于自然界中的一种天然存在的微生物(如一种细菌、酵母或丝状真菌)表达的一种葡糖淀粉酶。 [0056] 变体命名规则 [0057] 出于本发明的目的，在SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽用于确定另一种葡糖淀粉酶中相对应的氨基酸残基。将另一种葡糖淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定与SEQ ID NO:2中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。 [0058] 可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种葡糖淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴别，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic Acids Research)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22: 4673-4680)的EMBOSS EMMA。 [0059] 当其他酶与SEQ ID NO:2的多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25: 3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学 (Bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。 [0060] 对于已知结构的蛋白质，可获取若干工具和资源以供找回(retrieve)和生成结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(Protein Engineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。 [0061] 在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于引用方便。采用了已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。 [0062] 取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。 [0063] 缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195处的甘氨酸的缺失命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分隔，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。 [0064] 插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或者“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为“原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2”；等。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。 [0065] 在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是： [0066]亲本： 变体： 195 195 195a 195b G G-K-A [0067] 多种改变。包括多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。 [0068] 不同改变。可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体： [0069] “Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。 [0070] 发明详述 [0071] 本发明涉及葡糖淀粉酶变体，这些葡糖淀粉酶变体包括在与SEQ ID NO:2的多肽的位置295、224、410、271、72、77、145、318、60、32、83、163、169、303、219和73相对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的改变，具体地是取代，并且该变体具有葡糖淀粉酶活性。具体地，与披露为SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶相比，这些变体具有改进的特性。具体地，这些改进的特性是在SSF(同时糖化和发酵)中增加的比活性和/或降低的葡萄糖抑制、和/或增加的乙醇产量。糖化和发酵也可以在分开的步骤中进行。根据本发明所述的变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [0072] 在具体的方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置295的位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [0073] 在另一个具体的方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置271、410、72、77、145、219、303、224、318的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于 100％序列一致性。 [0074] 在另一方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置271、或295、或271和295的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [0075] 亲本葡糖淀粉酶，SEQ ID NO:2在位置95和121处具有脯氨酸。这种组合对母体葡糖淀粉酶提供改进的热稳定性。在一个具体的实施例中，在本发明的所有变体中，在位置95和121处的脯氨酸保持不变。 [0076] 变体 [0077] 本发明提供了多种葡糖淀粉酶变体，这些葡糖淀粉酶变体包括在与位置295、224、410、271、72、77、145、318、60、32、83、163、169、303、219和73相对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的改变，具体地是取代，并且该变体具有葡糖淀粉酶活性。并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [0078] 在一个实施例中，分离该变体。 [0079] 在一个实施例中，该变体与亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。 [0080] 在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [0081] 在另一方面，变体包括在对应于位置295、224、410、271、72、77、145、318、60、32、83、163、169、303、219以及73中的一个或多个(例如，若干个)位置处的改变，具体地是取代。 在另一方面，变体包括在对应于位置295、224、410、271、72、77、145、318、60、32、83、163、 169、303、219以及73中的任何一个的两个位置处的取代。在另一方面，变体包括在对应于位置295、224、410、271、72、77、145、318、60、32、83、163、169、303、219以及73中的任何一个的三个位置处的取代。在另一方面，变体包括在对应于位置295、224、410、271、72、77、145、 318、60、32、83、163、169、303、219以及73中的任何一个的四个位置处的取代。在另一方面，变体包括在对应于位置295、224、410、271、72、77、145、318、60、32、83、163、169、303、219以及73中的任何一个的五个位置处的改变。在另一方面，变体包括在对应于位置295、224、 410、271、72、77、145、318、60、32、83、163、169、303、219以及73中的任何一个的六个位置处的取代。在另一方面，变体包括在对应于位置295、224、410、271、72、77、145、318、60、32、83、 163、169、303、219以及73中的任何一个的七个位置处的取代。在另一方面，变体包括在对应于位置295、224、410、271、72、77、145、318、60、32、83、163、169、303、219以及73中的任何一个的八个位置处的取代。在另一方面，变体包括在对应于位置295、224、410、271、72、77、 145、318、60、32、83、163、169、303、219以及73中的每个位置处的取代。 [0082] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置295的位置处的取代。在另一方面，在与位置295相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、或Val取代，优选被Phe或Trp取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代Y295F或Y295W，或由其组成。 [0083] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置224的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置224的位置的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Gln或Ala或Ile或Thr取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代L224Q或L224A或L224I或L224T，或由其组成。 [0084] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置72的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置72的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Val取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代D72V，或由其组成。 [0085] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置77的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置77的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ala或Val取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代L77A或L77V，或由其组成。 [0086] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置145的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置145的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ala取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代L145A，或由其组成。 [0087] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置410的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置410的位置处的氨基酸被Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ala或Gln或His或Lys取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代R410A或R410Q或R410H或R410K，或由其组成。 [0088] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置318的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置318的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Val、或Tyr，优选被Trp或Phe或Val或Tyr取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代Q318W或Q318F或Q318V或Q318Y，或由其组成。 [0089] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置271的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置271的位置处的氨基酸被Ala、Asn、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Val、或Tyr取代，优选被Gln或Asn或Ala或Ser或Val取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代T271Q或T271N或T271A或T271S或T271V，或由其组成。 [0090] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置60的位置处的取代。在另一方面，在与位置60相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Leu取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代F60L，或由其组成。 [0091] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置73的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置73的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ala取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代S73A，或由其组成。 [0092] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置32的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置32的位置处的氨基酸被Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Val取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代A32V，或由其组成。 [0093] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置83的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置83的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Asp取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代S83D，或由其组成。 [0094] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置163的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置163的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ala取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代N163A或N163W，或由其组成。 [0095] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置169的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置169的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、或Tyr取代，优选被Ile取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代V169I，或由其组成。 [0096] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置219的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置219的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr、或Val，优选被Asp或Arg取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代T219R或T219D，或由其组成。 [0097] 在另一方面，该变体包括改变或由其组成，具体地在对应于位置303的位置处的取代。在另一方面，在对应于位置303的位置的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Glu或Asn取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的取代S303E或S303N，或由其组成。 [0098] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0099] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0100] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0101] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0102] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0103] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0104] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0105] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0106] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0107] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0108] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0109] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0110] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0111] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0112] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0113] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0114] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0115] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0116] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0117] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0118] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0119] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0120] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0121] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0122] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0123] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0124] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0125] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0126] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0127] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0128] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0129] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0130] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0131] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0132] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0133] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0134] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0135] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0136] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0137] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0138] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0139] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0140] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0141] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0142] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0143] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0144] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0145] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0146] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0147] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0148] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0149] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0150] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0151] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0152] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0153] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0154] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0155] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0156] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0157] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0158] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0159] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0160] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0161] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0162] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0163] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0164] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0165] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0166] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0167] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0168] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0169] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0170] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0171] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0172] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0173] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0174] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0175] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0176] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0177] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0178] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0179] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0180] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0181] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0182] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0183] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0184] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0185] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0186] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0187] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0188] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0189] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0190] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0191] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0192] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0193] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0194] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0195] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0196] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0197] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0198] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0199] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0200] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0201] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0202] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0203] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0204] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0205] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0206] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0207] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0208] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0209] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0210] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0211] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0212] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0213] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0214] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0215] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0216] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0217] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0218] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0219] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0220] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0221] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0222] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0223] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0224] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0225] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0226] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0227] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0228] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0229] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0230] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0231] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0232] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0233] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0234] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0235] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0236] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0237] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0238] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0239] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0240] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0241] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0242] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0243] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0244] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0245] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0246] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0247] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0248] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0249] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0250] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0251] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0252] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0253] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0254] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0255] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0256] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0257] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0258] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0259] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0260] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0261] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0262] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0263] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0264] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0265] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0266] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0267] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0268] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0269] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0270] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0271] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0272] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0273] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0274] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0275] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0276] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0277] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0278] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0279] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0280] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0281] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0282] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0283] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0284] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0285] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0286] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0287] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0288] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0289] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0290] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0291] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0292] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0293] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0294] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0295] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0296] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0297] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0298] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0299] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0300] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0301] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0302] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0303] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0304] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0305] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0306] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0307] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0308] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0309] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0310] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0311] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0312] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0313] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0314] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0315] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0316] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0317] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0318] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0319] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0320] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0321] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0322] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0323] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0324] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0325] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0326] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0327] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0328] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0329] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0330] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0331] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0332] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0333] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0334] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0335] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0336] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0337] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0338] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0339] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0340] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0341] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0342] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0343] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0344] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0345] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0346] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0347] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0348] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0349] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0350] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0351] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0352] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0353] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0354] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0355] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0356] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0357] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0358] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0359] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0360] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0361] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0362] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0363] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0364] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0365] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0366] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0367] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0368] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0369] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0370] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0371] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0372] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0373] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0374] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0375] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0376] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0377] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0378] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0379] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0380] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0381] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0382] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0383] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0384] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0385] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0386] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0387] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0388] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0389] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0390] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0391] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0392] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0393] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0394] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0395] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0396] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0397] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0398] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0399] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0400] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0401] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0402] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0403] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0404] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0405] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0406] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0407] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0408] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0409] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0410] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0411] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0412] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0413] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0414] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0415] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0416] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0417] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0418] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0419] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0420] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0421] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0422] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0423] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0424] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0425] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0426] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0427] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0428] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0429] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0430] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0431] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0432] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0433] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0434] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0435] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0436] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0437] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0438] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0439] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0440] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0441] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0442] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0443] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0444] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0445] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0446] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0447] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0448] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0449] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0450] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0451] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0452] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0453] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0454] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0455] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0456] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0457] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0458] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0459] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0460] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0461] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0462] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0463] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0464] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0465] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0466] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0467] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0468] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0469] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0470] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0471] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0472] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0473] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0474] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0475] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0476] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0477] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0478] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0479] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0480] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0481] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0482] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0483] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0484] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0485] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0486] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0487] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0488] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0489] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0490] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0491] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0492] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0493] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0494] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0495] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0496] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0497] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0498] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0499] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0500] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0501] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0502] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0503] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0504] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0505] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0506] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0507] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0508] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0509] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0510] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0511] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0512] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0513] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0514] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0515] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0516] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0517] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0518] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0519] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0520] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0521] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0522] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0523] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0524] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0525] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0526] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0527] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0528] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0529] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0530] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0531] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0532] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0533] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0534] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0535] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0536] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0537] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0538] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0539] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0540] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0541] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0542] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0543] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0544] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0545] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0546] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0547] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0548] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0549] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0550] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0551] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0552] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0553] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0554] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0555] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0556] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0557] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0558] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0559] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0560] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和145和318和60的位置处的取代或由其组成在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0561] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0562] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0563] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0564] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0565] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0566] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0567] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0568] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0569] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0570] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0571] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0572] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0573] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0574] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0575] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0576] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0577] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0578] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0579] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0580] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0581] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0582] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0583] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0584] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0585] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0586] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0587] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0588] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0589] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0590] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0591] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0592] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0593] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0594] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0595] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0596] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0597] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0598] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0599] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0600] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0601] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0602] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0603] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0604] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0605] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0606] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0607] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0608] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0609] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0610] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0611] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0612] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0613] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0614] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0615] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0616] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0617] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0618] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0619] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0620] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0621] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0622] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0623] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0624] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0625] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0626] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0627] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0628] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0629] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0630] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0631] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0632] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0633] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0634] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0635] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0636] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0637] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0638] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0639] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0640] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0641] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0642] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0643] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0644] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0645] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0646] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0647] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0648] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0649] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0650] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0651] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0652] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0653] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0654] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0655] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0656] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0657] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0658] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0659] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0660] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0661] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0662] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0663] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0664] 在另一方面，该变体改变包括在对应于位置224和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0665] 在另一方面，该变体改变包括在对应于位置224和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0666] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0667] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0668] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0669] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0670] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0671] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0672] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0673] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0674] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0675] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0676] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0677] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0678] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0679] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0680] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0681] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0682] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0683] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0684] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0685] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0686] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0687] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0688] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0689] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0690] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0691] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0692] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0693] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0694] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0695] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0696] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0697] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0698] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0699] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0700] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0701] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0702] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0703] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0704] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0705] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0706] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0707] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0708] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0709] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0710] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0711] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0712] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0713] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0714] 在另一方面，该变体改变包括在对应于位置271和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0715] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0716] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0717] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0718] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0719] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0720] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0721] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0722] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0723] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0724] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0725] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0726] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0727] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0728] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0729] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0730] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0731] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0732] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0733] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0734] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0735] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0736] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0737] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0738] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0739] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0740] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0741] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0742] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0743] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0744] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0745] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0746] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0747] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0748] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0749] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0750] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0751] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0752] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0753] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0754] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0755] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0756] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0757] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0758] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0759] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0760] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0761] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0762] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0763] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0764] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0765] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0766] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0767] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0768] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0769] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0770] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0771] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0772] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0773] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0774] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0775] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0776] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0777] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0778] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0779] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0780] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0781] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0782] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0783] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0784] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0785] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0786] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0787] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0788] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0789] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0790] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0791] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0792] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0793] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0794] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0795] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0796] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0797] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0798] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0799] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0800] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0801] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0802] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0803] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0804] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0805] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0806] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0807] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0808] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0809] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0810] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0811] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0812] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0813] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0814] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0815] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0816] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0817] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0818] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0819] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0820] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0821] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0822] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0823] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0824] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0825] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0826] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0827] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0828] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0829] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0830] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0831] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0832] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0833] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0834] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0835] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0836] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0837] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0838] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0839] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0840] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0841] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0842] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0843] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0844] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0845] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0846] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0847] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0848] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0849] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0850] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0851] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0852] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0853] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0854] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0855] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0856] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0857] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0858] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0859] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0860] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0861] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0862] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0863] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0864] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0865] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0866] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0867] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0868] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0869] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0870] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0871] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0872] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0873] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0874] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0875] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0876] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0877] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0878] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0879] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0880] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0881] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0882] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0883] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0884] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0885] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0886] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0887] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0888] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0889] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0890] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0891] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0892] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0893] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0894] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0895] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0896] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0897] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0898] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0899] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0900] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0901] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0902] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0903] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0904] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0905] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0906] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0907] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0908] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0909] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0910] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0911] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0912] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0913] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0914] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0915] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0916] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0917] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0918] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0919] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0920] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0921] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0922] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0923] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0924] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0925] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0926] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0927] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0928] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0929] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0930] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0931] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0932] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0933] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0934] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和145的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0935] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0936] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0937] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0938] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0939] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0940] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0941] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0942] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0943] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0944] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0945] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0946] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0947] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0948] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0949] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0950] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0951] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0952] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0953] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0954] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0955] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0956] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0957] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0958] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0959] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0960] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0961] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0962] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0963] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0964] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0965] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0966] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0967] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0968] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0969] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0970] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0971] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0972] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0973] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0974] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0975] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0976] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0977] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0978] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0979] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0980] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0981] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0982] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0983] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0984] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0985] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0986] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0987] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0988] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0989] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0990] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0991] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0992] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0993] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0994] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0995] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0996] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0997] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0998] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [0999] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1000] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1001] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1002] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1003] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1004] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1005] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1006] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1007] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1008] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1009] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1010] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1011] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1012] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1013] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1014] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1015] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1016] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1017] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1018] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1019] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1020] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1021] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1022] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1023] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1024] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1025] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1026] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1027] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1028] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1029] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1030] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1031] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1032] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1033] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1034] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1035] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1036] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1037] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1038] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1039] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1040] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1041] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1042] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1043] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1044] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1045] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1046] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1047] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1048] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1049] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1050] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1051] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1052] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1053] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置271和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1054] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和145和318的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1055] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和145和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1056] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和145和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1057] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1058] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1059] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1060] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1061] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1062] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1063] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1064] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1065] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1066] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1067] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1068] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1069] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1070] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1071] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1072] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1073] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1074] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1075] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1076] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1077] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1078] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1079] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1080] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1081] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1082] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1083] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1084] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1085] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1086] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1087] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1088] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1089] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和271和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1090] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1091] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1092] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1093] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1094] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1095] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1096] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1097] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和271和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1098] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置410和271和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1099] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和145和318和60的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1100] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和145和318和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1101] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和145和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1102] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1103] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1104] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1105] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1106] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和271和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1107] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和410和271和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1108] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置224和410和271和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1109] 在另一方面，这些变体改变包括在对应于位置295和224和410和271和72和77和145和318和60和73的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。 [1110] 在一方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置295的位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1111] 此外，该变体可以进一步包括至少在在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置32、83、163、169、219、224、303或410的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1112] 本文披露的这些示例性变体均基于SEQ ID NO:2的亲本葡糖淀粉酶构建。因此，包括待取代的起始氨基酸，例如Y295F，然而，由于根据本发明也可以改进其他亲本葡糖淀粉酶，在这种情况下，起始氨基酸可以不同。因此，也可以通过仅指定在发生取代后要存在于给定位置的氨基酸来描述特定取代。在下文中，仅指定了取代后存在的氨基酸。 [1113] 因此在一个实施例中，本发明所述的这些变体包括选自以下各项的取代中的至少一个或多个：295F、295W、224A、224I、224T、32V、83D、163A、163W、169I、219R、303N或410K。 [1114] 在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的以下取代中的至少一个： [1115] 295F； [1116] 295W； [1117] 224A； [1118] 224I； [1119] 224T； [1120] 271Q； [1121] 318V；或 [1122] 410K；并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1123] 在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的以下取代或取代的组合中的至少一个： [1124] 295W；或 [1125] 295W+410K；或 [1126] 224I+295F；或 [1127] 224T+295W+318V；或 [1128] 295F；或 [1129] 224A+295F；或 [1130] 295W+83D+410K；或 [1131] 163A+295W+410K；或 [1132] 163W+295W+410K；或 [1133] 303N+295W；或 [1134] 169I+295W；或 [1135] 32V+219R+295W；并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1136] 在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的以下取代或取代的组合中的至少一个： [1137] 295W；或 [1138] 295W+410K；或 [1139] 224I+295F；或 [1140] 224T+295W+318V；或 [1141] 295F；或 [1142] 224A+295F；或 [1143] 295W+83D+410K；或 [1144] 163A+295W+410K；或 [1145] 163W+295W+410K；或 [1146] 303N+295W；或 [1147] 169I+295W；或 [1148] 32V+219R+295W；并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性；并且其中与SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶相比，这些变体具有降低的葡萄糖抑制。 [1149] 在一个实施例中，这些取代选自以下各项：Y295F、Y295W、L224A、L224I、L224T、A32V、S83D、N163A、N163W、V169I、T219R、S303N、R410K、和Q318V。 [1150] 在另一方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置271、410、72、77、145、219、303、224、318的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1151] 在一个实施例中，该变体包括选自以下各项的取代中的至少一个或多个：72V、77A、145A、219D、271Q、271N、271A、271S、271V、224Q、303E、318W、318F、410A、410Q或410H。 [1152] 在实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的以下取代中的至少一个： [1153] 72V； [1154] 77A； [1155] 145A； [1156] 219D； [1157] 271Q； [1158] 271N； [1159] 271A； [1160] 271S； [1161] 271V； [1162] 224Q； [1163] 303E； [1164] 318W； [1165] 318F； [1166] 410A [1167] 410Q；或 [1168] 410H；并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1169] 在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的以下取代或取代的组合中的至少一个： [1170] 72V+145A；或 [1171] 271Q；或 [1172] 224Q+271N+410A；或 [1173] 77A；或 [1174] 77A+271A；或 [1175] 271S+318W+410Q；或 [1176] 271V+318F+410H；或 [1177] 77A+219D；或 [1178] 77A+303E； [1179] 并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1180] 在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的以下取代或取代的组合中的至少一个： [1181] 72V+145A；或 [1182] 271Q；或 [1183] 224Q+271N+410A；或 [1184] 77A；或 [1185] 77A+271A；或 [1186] 271S+318W+410Q；或 [1187] 271V+318F+410H；或 [1188] 77A+219D；或 [1189] 77A+303E； [1190] 并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性，并且其中变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶相比具有增加的比活性。 [1191] 在一个实施例中，这些取代选自以下各项：D72V、L77A、L145A、T219D、L224Q、T271Q、T271N、T271A、T271S、T271V、S303E、Q318W、Q318F、R410Q、R410H和R410A。 [1192] 具体地，与披露为SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶相比，这些变体具有改进的特性。 [1193] 具体地，改进的特性是降低的葡萄糖抑制和/或增加的比活性。 [1194] 在另一个具体的实施例中，当在糖化、并且特别是同时糖化和发酵(SSF)期间存在变体葡糖淀粉酶时，改进的特性是本发明方法中增加的乙醇产量。 [1195] 因此在另外的方面，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置271或295的一个或多个位置处或在SEQ ID NO:2的多肽的位置271和295处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1196] 在一个实施例中，该变体包括选自以下各项的取代中的至少一个或多个：271Q、271A、271V、295W、60L、73A、77A、77V、和318Y。 [1197] 在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的以下取代中的至少一个： [1198] 60L；或 [1199] 73A；或 [1200] 271Q；或 [1201] 271A；或 [1202] 271V；或 [1203] 295W；或 [1204] 77V；或 [1205] 77A；或 [1206] 318Y；并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1207] 在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的至少以下取代或取代的组合： [1208] 60L+73A+271Q； [1209] 271Q； [1210] 77V+271V+410A； [1211] 77A+271A； [1212] 271V+318Y； [1213] 295W； [1214] 271Q+295W；并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1215] 在另一个实施例中，该变体包括SEQ ID NO:2的多肽的至少以下取代或取代的组合： [1216] 60L+73A+271Q； [1217] 271Q； [1218] 77V+271V+410A； [1219] 77A+271A； [1220] 271V+318Y； [1221] 295W； [1222] 271Q+295W；并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性，并且其中与SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶相比，该变体当用于SSF时提供增加的乙醇产量。 [1223] 在一个实施例中，这些取代选自以下各项：F60L、S73A、T271A、T271V、T271Q、L77A、L77V、R410A、Y295W、和Q318Y。 [1224] 在再另一个实施例中，本发明涉及包括SEQ ID NO:2的多肽的至少以下取代或取代的组合的葡糖淀粉酶变体： [1225] F60L+S73A+T271Q； [1226] T271Q； [1227] L77V+T271V+R410A； [1228] L77A+T271A； [1229] T271V+Q318Y； [1230] Y295W； [1231] T271Q+Y295W；并且 [1232] 其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1233] 在再另一个方面，本发明涉及包括SEQ ID NO:2的多肽的至少以下取代或取代的组合的葡糖淀粉酶变体： [1234] F60L+S73A+T271Q； [1235] T271Q； [1236] L77V+T271V+R410A； [1237] L77A+T271A； [1238] T271V+Q318Y； [1239] Y295W； [1240] T271Q+Y295W；并且 [1241] 其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性，并且其中与SEQID NO:2的葡糖淀粉酶相比，该变体当用于SSF时提供增加的乙醇产量。 [1242] 这些变体可以进一步包括在一个或多个(例如若干个)其他位置的一个或多个另外的取代。 [1243] 应当指出，对于所有的披露的特定变体，这样的另一个变化可以被引入而不显著地影响这些葡糖淀粉酶变体的特性。在一方面，除了在此讨论的特定取代，在本发明的变体中的取代数目是1-20，例如1-10个和1-5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。 [1244] 因此，与SEQ ID NO:2的亲本多肽相比，变体多肽的％一致性可以是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的与SEQ ID NO:2的多肽的序列一致性。 [1245] 在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少85％、但小于100％序列一致性。 [1246] 在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少90％、但小于100％序列一致性。 [1247] 在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少91％、但小于100％序列一致性。 [1248] 在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少92％、但小于100％序列一致性。 [1249] 在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少93％、但小于100％序列一致性。 [1250] 在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少94％、但小于100％序列一致性。 [1251] 在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少95％、但小于100％序列一致性。 [1252] 在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少96％、但小于100％序列一致性。 [1253] 在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少97％、但小于100％序列一致性。 [1254] 在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少98％、但小于100％序列一致性。 [1255] 在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少99％、但小于100％序列一致性。 [1256] 除了在此描述的特定取代，可以存在的这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。 [1257] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。 [1258] 可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等。 [1259] 可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定多肽中的必需氨基酸(康宁汉(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一种技术中，在分子中的每个残基上引入单一丙氨酸突变，并且测试所得的突变型分子的葡糖淀粉酶活性以鉴别对分子的活性至关重要的氨基酸残基。还见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学 (crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。也可以从与相关多肽的比对推断必需氨基酸的身份。 [1260] 在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体葡糖淀粉酶具有改进的比活性。使用AGU测定法确定比活性. [1261] 在一个实施例中，与SEQ ID NO:2的亲本葡糖淀粉酶相比，该变体葡糖淀粉酶具有降低的葡萄糖抑制。葡萄糖抑制被确定为相对于如SEQ ID NO:2披露的野生型亲本酶，具有和不具有30％葡萄糖的葡糖淀粉酶活性的比率。 [1262] 在另一个实施例中，与SEQ ID NO:2的亲本葡糖淀粉酶相比，该变体葡糖淀粉酶具有降低的异麦芽糖形成活性。 [1263] 在另一个实施例中，与SEQ ID NO:2的亲本葡糖淀粉酶相比，该变体葡糖淀粉酶具有增加的DE11活性。 [1264] 在另一个实施例中，与SEQ ID NO:2的亲本葡糖淀粉酶相比，该变体葡糖淀粉酶具有增加的热稳定性。 [1265] 在另一个实施例中，当该变体被应用于在液化的醪液上糖化随后发酵时，与SEQ ID NO:2的亲本葡糖淀粉酶相比，该变体葡糖淀粉酶具有增加的EtOH产量。 [1266] 对于细节，参见包括在此的材料和方法部分。 [1267] 亲本葡糖淀粉酶 [1268] 该亲本葡糖淀粉酶可以是(a)与SEQ ID NO:2的多肽具有至少85％序列一致性的一种多肽；(b)由在中高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)与(i)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的一种多肽；或(c)由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％序列一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽。 [1269] 在一方面，该亲本与SEQ ID NO:2的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性，所述多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。 [1270] 在另一方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的多肽的等位基因变体。 [1271] 在另一方面，该亲本由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。 [1272] 可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针具有至少100个核苷酸长度，例如至少200个核苷酸长度、至少300个核苷酸长度、至少400个核苷酸长度、至少500个核苷酸长度、至少600个核苷酸长度、至少700个核苷酸长度、至少800个核苷酸长度、或至少900个核苷酸长度。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地这些探针被标记用于检测相应的基因(例如用32P、3H、35S、生物素或亲合素)。这类探针涵盖于本发明中。 [1273] 可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其他适合的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1杂交的克隆或DNA或其子序列，在DNA印迹中使用载体材料。 [1274] 出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严格条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。 [1275] 在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸52至1728。在另一方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽或其一个片段的多核苷酸。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。 [1276] 在另一个实施例中，该亲本是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％序列一致性。 [1277] 该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。 [1278] 该亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。 [1279] 融合多肽可以进一步包括两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在如下文献中披露的位点 ：马 丁 ( M a r t i n ) 等 人 ，2 0 0 3 ，工 业 微 生 物 学 生 物 技 术 杂 志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；Svetina等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；Collins-Racie等人， 1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能和遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；和史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。 [1280] 该亲本可以是一种真菌性葡糖淀粉酶。例如，该亲本可以是粘褶菌属或栓菌属葡糖淀粉酶。 [1281] 在另一方面，该亲本是密粘褶菌、篱边粘褶菌、或瓣环栓菌葡糖淀粉酶。 [1282] 在另一方面，该亲本是密粘褶菌葡糖淀粉酶，例如SEQ ID NO:2的葡糖淀粉酶。 [1283] 应理解的是对于前述的种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect and imperfect states)，和其他分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。 [1284] 这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。 [1285] 可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。 [1286] 变体的制备 [1287] 可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。 [1288] 定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。 [1289] 通过使用涉及包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；和巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(Nucleic Acids Res.)18:7349-4966。 [1290] 还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯托西(Storici)等人，2001，自然生物技术(Nature Biotechnol.)19:773-776；凯伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及卡里萨诺(Calissano)和曼奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学通讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15- 16。 [1292] 合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。 [1293] 可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，罗曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(德比舍尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。 [1294] 诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(奈斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。 [1295] 通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。 [1296] 多核苷酸 [1297] 本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。 [1298] 核酸构建体 [1299] 本发明还涉及包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。 [1300] 可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。 [1301] 控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。 [1302] 用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子和杂合型启动子。 [1303] 在酵母宿主中，有用的启动子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。 [1304] 控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。 [1305] 丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。 [1306] 用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。在罗马诺斯(Romanos)等人，1992，上文中描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。 [1307] 控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。 [1308] 适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。 [1309] 该控制序列也可以是前导子，所述前导子是对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。 [1310] 用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。 [1311] 适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。 [1312] 该控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。 [1313] 用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。 [1314] 对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。 [1315] 该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。该多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列5’-端可以包含对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。 [1316] 用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。 [1317] 从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得用于酵母宿主细胞的有用信号肽。其他的有用的信号肽编码序列由罗曼诺斯(Romanos)等人(1992，上文)描述。 [1318] 该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母醹-因子的基因获得前肽编码序列。 [1319] 在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。 [1320] 还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他例子是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。 [1321] 表达载体 [1322] 本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。 [1323] 重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。 [1324] 该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。 [1325] 该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。 [1326] 用于酵母宿主细胞的适合标记包括，但不限于，ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。 [1327] 载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。 [1328] 对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。在另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。 [1329] 对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。 [1330] 用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。 [1331] 在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15: 9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。 [1332] 可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。 [1333] 用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。 [1334] 宿主细胞 [1335] 本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。 [1336] 宿主细胞可以是在重组产生变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。 [1338] 该宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如霍克斯沃思(Hawksworth)等人定义，引自：安斯沃斯(Ainsworth)和比斯比(Bisby)的真菌大词典(Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际CAB，大学出版社(University Press)，剑桥(Cambridge)，英国)。 [1339] 真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母 (basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲 (Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，为了本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)，帕斯莫尔(Passmore)和达文波特(Davenport)编著，应用细菌学学会专题论文集系列9 (Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)所描述那样定义。 [1340] 酵母宿主细胞可以是假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母或耶罗维亚酵母属细胞、如乳酸克鲁维酵母细胞、卡氏酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞或解脂耶罗维亚酵母细胞。 [1341] 该真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚类的所有丝状形式(如霍克斯沃思等人，1995，上文定义)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。 [1342] 丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。 [1343] 例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。 [1344] 可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述在EP 238023；约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474；和克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及亨内恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。 [1345] 产生的方法 [1346] 本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞；并且(b)任选地回收该变体。 [1347] 这些宿主细胞使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中进行培养。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基从商业供应商可获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。 [1348] 可以使用本领域已知的对这些变体特异的方法检测这些变体。这些检测方法包括但不局限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。 [1350] 可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。 [1351] 在可替代的方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的来源。在具体的实施例中，本发明的变体葡糖淀粉酶不被回收，并且该宿主细胞是酵母宿主细胞。具体地，该酵母是假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母或耶罗维亚酵母属细胞、如乳酸克鲁维酵母细胞、卡氏酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞或解脂耶罗维亚酵母细胞。在优选的实施例中，酵母是酿酒酵母。 [1352] 组合物 [1353] 本发明还涉及包括本发明所述的多肽的组合物。优选地，该组合物还包括一种运载体和/或一种赋形剂。更优选地，这些组合物富含这样一种多肽。术语“富集”指示，该组合物的葡糖淀粉酶活性已经增加，例如富集因子为至少1.1。优选地，配制这些组合物以提供所希望的特性，例如浅颜色、低气味、以及可接受的储存稳定性。 [1354] 组合物可以包括本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包括多种酶活性，如氨肽酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、支链淀粉酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。 [1355] 在一个具体的实施例中，该组合物包括α淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。在另一个实施例中，该组合物包括异淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。在另一个实施例中，该组合物包括α淀粉酶、异淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。 [1356] 在另一方面，该组合物包括与支链淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。在另一方面，该组合物包括与支链淀粉酶、和异淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。在另一方面，该组合物包括与支链淀粉酶、和α-淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。 [1357] 在一个具体实施例中，该组合物进一步包括蛋白酶。 [1358] 可以根据本领域已知的方法来制备多肽组合物，并且这些多肽组合物可以处于液体或干燥组合物的形式。例如，多肽组合物可处于颗粒或微粒的形式。包括在该组合物中的多肽可以根据本领域中已知的方法稳定化。 [1359] 除了葡糖淀粉酶之外，该组合物可以进一步包括α-淀粉酶。具体地，该α-淀粉酶是酸性真菌α-淀粉酶。真菌酸性稳定的α-淀粉酶是在3.0至7.0的pH范围内，并且优选地在3.5至6.5的范围内具有活性的α-淀粉酶，包括在约4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0的pH下的活性。 [1360] 优选地，该酸性真菌α-淀粉酶来源于曲霉属，尤其是土曲霉、黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉或川地曲霉的菌株，或来自根毛霉属，优选微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)或来自亚灰树花菌属，优选大型亚灰树花菌的菌株。 [1361] 在优选的实施例中，该α-淀粉酶来源于根毛霉属的菌株，优选的是菌株微小根毛霉，例如示于WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3中的一种，例如具有黑曲霉连接子和淀粉结合域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，例如示于在此的SEQ ID NO:16中的一种，或其变体。 [1362] 在一个实施例中，该α-淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成： [1363] (i)一种α-淀粉酶，包括在此的SEQ ID NO:16的多肽； [1364] (ii)一种α-淀粉酶，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ ID NO:16的多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少 99％一致性。 [1365] 在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶是示于SEQ ID NO:16中的具有以下取代或取代的组合中的至少一个的α-淀粉酶的变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W； N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192RV410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:16进行编号)。 [1366] 在一个实施例中，该α-淀粉酶来源于具有黑曲霉葡糖淀粉酶连接子和淀粉结合域(SBD)的微小根毛霉，优选披露为在此的SEQ ID NO:4，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:4进行编号)，并且其中该α-淀粉酶变体与在此的SEQ ID NO:4的多肽具有至少75％一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％一致性。 [1367] 在一个优选的实施例中，在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶与α-淀粉酶之间的比率优选可以在500:1至1:1，例如从250:1至1:1、例如从100:1至1:1、例如从100:2至100:50、例如从100:3至100:70gEP/gDS的范围内。 [1368] 这些组合物可以根据本领域已知的方法制备，并可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将变体稳定化。 [1369] 这些组合物可以根据本领域已知的方法制备，并可以是液体或干燥组合物的形式。这些组合物可依照本领域中已知的方法稳定化。 [1370] 本发明的酶组合物可为任何适于使用的形式，例如像，去除或未去除细胞的粗发酵液，含或不含细胞碎片的细胞裂解物，半纯化或纯化的酶组合物，或宿主细胞，作为酶的来源。 [1371] 该酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶组合物进行稳定化。 [1372] 以下给出了本发明的多肽或多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。 [1373] 以上组合物适合在液化、糖化、和/或发酵过程中使用，优选在淀粉转化中使用，尤其是用于产生糖浆和发酵产物，例如乙醇。 [1374] 以下给出了本发明的多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。 [1375] 使用本发明所述的变体葡糖淀粉酶的方法-工业应用 [1376] 本发明所述的的变体葡糖淀粉酶具有允许各种工业应用的有价值特性。具体而言，该葡糖淀粉酶可用于啤酒制造、乙醇生产以及淀粉转化过程中。 [1377] 变体葡糖淀粉酶可用于淀粉过程，尤其是淀粉转化、特别是淀粉液化(参见例如，美国专利号3,912,590、EP 252730以及EP 063909、WO 99/19467以及WO 96/28567，这些专利全部通过引用结合在此)。还考虑了用于淀粉转化目的的组合物，除了本发明的葡糖淀粉酶以外，这些组合物还包括α-淀粉酶、普鲁兰酶和/或蛋白酶。 [1379] 在一个实施例中，本发明涉及根据本发明所述的葡糖淀粉酶用于由含淀粉材料生产糖浆和/或发酵产物的用途。在一个实施例中，该淀粉材料可以是经糊化的。在另一个实施例中，该淀粉材料是未经糊化的。 [1380] 淀粉加工 [1381] 天然淀粉由室温下不溶于水的微观颗粒组成。加热水性淀粉浆料时，颗粒膨胀并且最后破裂，将淀粉分子分散至溶液中。在高达约50℃至75℃的温度下，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度下，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。在此“糊化(gelatinization)”过程中，粘度有显著地增加。有待加工的颗粒状淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，优选地至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯，或它可以为含更粗糙的淀粉的材料，这些材料包括(例如，经碾磨的)全谷物，全谷物包含非淀粉部分，如胚芽残留物和纤维。该原材料(如全谷物)可以例如经过碾磨减少粒度，以便展开结构并且允许进一步加工。在干式碾磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。干式和湿式碾磨两者是本领域中众所周知的淀粉加工法并且可以用于本发明的方法中。用于减少该含淀粉材料的粒度的方法为本领域的普通技术人员所已知。 [1382] 由于典型工业过程中的固体水平为30％-40％，因此不得不稀释或“液化”淀粉以使其能够被适当加工。在当前商业做法中，这种粘度降低主要通过酶法降解来实现。 [1383] 在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行液化。在一个实施例中，在液化过程中还存在植酸酶。在一个实施例中，在液化期间，还存在降粘酶例如木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。 [1384] 在液化过程中，α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链以及线性的较短单元(麦芽糊精)。液化可以作为一个三步热浆料方法进行。将浆料加热至60℃-95℃之间(例如70℃-90℃，例如77℃-86℃、80℃-85℃、83℃-85℃)并且添加α-淀粉酶以开始液化(稀释)。 [1385] 在一个实施例中，可以将浆料在95℃-140℃(例如，105℃-125℃)之间喷射蒸煮约1-15分钟，例如约3-10分钟，尤其是5分钟左右。然后，将浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多的α-淀粉酶，以获得最终水解(二次液化)。在pH 4.5-6.5下，典型地在5与6之间的pH下进行喷射蒸煮过程。可以例如在喷射蒸煮之前，将α-淀粉酶以单一剂量添加。 [1386] 在70℃-95℃之间，例如80℃-90℃，例如85℃左右，将液化过程进行约10分钟至5小时，典型地是1-2小时。pH在4与7之间，例如在5.5与6.2之间。为了确保这些条件下最佳的酶稳定性，可以任选地添加钙(以提供1-60ppm游离钙离子，例如约40ppm游离钙离子)。如此处理之后，液化淀粉将典型地具有10-15的“右旋糖当量”(DE)。 [1387] 通常，液化和液化条件在本领域是熟知的。 [1388] 在下面的“α-淀粉酶”部分中披露了α-淀粉酶的实例。 [1389] 可以使用本领域熟知的条件，用产碳水化合物源的酶，具体是葡糖淀粉酶或β-淀粉酶以及任选地去分支酶(例如异淀粉酶或支链淀粉酶)进行糖化。例如，全部糖化步骤可以持续从约24至约72小时。然而，常见地在30℃-65℃之间的温度(典型地约60℃)下进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(SSF)中，在发酵期间进行完全糖化。典型地在20℃-75℃的范围内的温度(例如，25℃-65℃和40℃-70℃，典型地60℃左右)下，并且在约4与5之间的pH下，一般在约pH 4.5下进行糖化。 [1390] 糖化步骤和发酵步骤可以依序或同时进行。在一个实施例中，糖化和发酵是同时进行的(称为“SSF”)。然而，通常，在30℃至65℃、典型地约60℃的温度下执行一个预糖化步骤约30分钟至2小时(例如，30至90分钟)，随后在被称为同时糖化和发酵(SSF)的发酵期间进行一个完全糖化。pH通常在4.2-4.8之间，例如，pH 4.5。在同时糖化和发酵(SSF)过程中，没有糖化的保持阶段，而实际上是，酵母和酶一起添加。 [1391] 在典型糖化过程中，通过添加葡糖淀粉酶以及去分支酶，如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或普鲁兰酶，来将液化期间产生的麦芽糊精转化成右旋糖。添加葡糖淀粉酶以及去分支酶之前使温度降低至60℃。糖化过程进行24-72小时。在添加糖化酶之前，使pH降低至低于4.5，同时维持高温(高于95℃)，以便使液化α-淀粉酶失活。此过程减少了称为“潘糖前体”的短低聚糖的形成，这种短低聚糖不能通过去分支酶来适当水解。正常地，约 0.2％-0.5％的糖化产物是分支三糖潘糖(Glc pα1-6Glc pα1-4Glc)，它不能由普鲁兰酶降解。如果糖化过程中仍然存在得自液化步骤的活性淀粉酶(即未变性)，潘糖的量可以高至 1％-2％，这是高度不希望的，因为它显著降低了糖化产率。 [1392] 其他发酵产物可以在本领域的普通技术人员熟知的、适于所讨论的发酵生物的条件和温度下发酵。 [1393] 可以通过本领域熟知的方法(例如，通过蒸馏)回收发酵产物。在下面的“酶”部分中披露了产碳水化合物源的酶的实例。 [1394] 在具体实施例中，本发明的方法在将含淀粉材料转化为糖/糊精之前进一步包含以下步骤： [1395] (x)减少该含淀粉材料的粒度；并且 [1396] (y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。 [1397] 在一个实施例中，将该含淀粉材料碾磨，以减少粒度。在一个实施例中，该粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。 [1398] 该水性浆料可以包含含淀粉材料的从10-55wt.％干固体(DS)，优选25-45wt.％干固体(DS)，更优选30-40wt.％干固体(DS)。 [1399] 常规淀粉转化过程如液化以及糖化过程描述于例如美国专利号3,912,590、EP 252730以及EP 063909中，这些专利通过引用结合在此。 [1400] 在一个实施例中，转化方法将淀粉降解为较低分子量的碳水化合物成分，如糖或脂肪替代物，该方法包括脱支步骤。 [1401] 当将淀粉转化为糖时，淀粉被解聚。这类解聚过程由例如预处理步骤以及两个或三个连续过程步骤组成，即，液化过程、糖化过程并且取决于所需最终产物，任选的异构化过程。 [1402] 当所需的最终糖产物是例如高果糖糖浆时，右旋糖糖浆可被转化为果糖。糖化过程之后，将pH值增加至6-8范围内的值，例如pH 7.5，并且通过离子交换除去钙。然后，使用例如固定化葡萄糖异构酶将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。 [1403] 发酵产物的生产 [1404] 可发酵的糖类(例如，糊精类、单糖类，尤其是葡萄糖)由酶法糖化产生。这些可发酵的糖类可进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。另外，这些糖可在微生物发酵过程中用作发酵进料来产生最终产物，如醇(例如，乙醇以及丁醇)、有机酸(例如，丁二酸，3-HP以及乳酸)、糖醇(例如，甘油)、抗坏血酸中间物(例如，葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸)、氨基酸(例如，赖氨酸)、蛋白质(例如，抗体及其片段)。 [1405] 在一个实施例中，液化过程步骤期间获得的可发酵的糖用于产生醇，并且尤其是乙醇。在乙醇生产中，通常使用SSF过程，其中糖化酶以及发酵生物(例如，酵母)一起添加，并且然后在30℃-40℃温度下执行。 [1406] 发酵中所使用的生物取决于所需最终产物。典型地，如果乙醇是所需最终产物，则将酵母用作发酵生物。在一些优选实施例中，产乙醇微生物是酵母，并且尤其是酵母属如酿酒酵母菌株(美国专利号4,316,956)。各种酿酒酵母是可商购的并且这些包括(但不局限于)FALI(弗莱希曼酵母(Fleischmann'sYeast))、SUPERSTART(奥泰公司(Alltech))、FERMIOL(帝斯曼公司(DSMSpecialties))、REDSTAR(乐斯福公司(Lesaffre))以及Angel醇酵母(天使酵母公司(AngelYeastCompany)，中国(China))。这些方法中所使用的起始酵母的量是在合适时间内有效产生商业上有效量乙醇的量(例如，在小于72小时内从具有25％-40％之间DS的底物产生至少10％乙醇)。酵母细胞总体上以约104至约1012、并且优选地从约 107至约1010活酵母计数/mL发酵液的量来供应。在将酵母添加至醪液之后，使它典型地经受发酵约24-96小时，例如，35-60小时。温度在约26℃-34℃之间，典型地约32℃，并且pH是从pH 3-6，例如，约pH 4-5。 [1407] 除了发酵微生物(例如，酵母)以外，发酵还可包括营养物以及额外酶，这些额外酶包括植酸酶。酵母在发酵中的使用在本领域中是熟知的。 [1408] 在另外的实施例中，如本领域中已知的，适当发酵微生物的使用可产生发酵最终产物，包括例如甘油、1,3-丙二醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐、2-酮基-L-古洛糖酸、丁二酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更具体地说，当乳酸是所需最终产物时，可使用乳酸杆菌属种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是所需最终产物时，可使用大肠杆菌；并且当2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸是所需最终产物时，柠檬泛菌可用作发酵微生物。以上列举的列表只是实例并且本领域技术人员知道可用于获得所需最终产物的许多发酵微生物。 [1409] 用于由含未经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法 [1410] 本发明涉及在含淀粉材料没有糊化(即，没有蒸煮)的情况下从含淀粉材料生产发酵产物的方法(通常被称为“粗淀粉水解”方法)。可在不使包含含淀粉材料以及水的水性浆料液化的情况下生产发酵产物如乙醇。在一个实施例中，本发明的方法包括：在低于初始糊化温度下、优选地在α-淀粉酶和/或产碳水化合物源的酶的存在下将(例如碾磨的)含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)糖化，以产生可以通过适合的发酵生物发酵成发酵产物的多种糖。在此实施例中，所希望的发酵产物例如乙醇是从未经糊化的(即，未蒸煮)、优选地经碾磨的谷粒如玉米中产生的。 [1411] 因此，在一方面，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物的方法，这些方法包括：使用产碳水化合物源的酶以及发酵生物，在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度下将含淀粉材料同时糖化和发酵。糖化和发酵还可以是分开的。因而，在另一方面，本发明涉及生产发酵产物的方法，包括以下步骤： [1412] (i)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉材料糖化；并且 [1413] (ii)使用发酵生物进行发酵； [1414] 其中使用本发明所述的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(i)。 [1415] 在一个实施例中，在步骤(i)中添加α-淀粉酶。在另一个实施例中，步骤(i)和(ii)同时进行。 [1416] 在一个实施例中，还存在蛋白酶。蛋白酶可以是任何酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。发酵之后，可以任选地例如通过蒸馏来回收发酵产物(例如乙醇)。典型地，在发酵期间存在一种或多种淀粉酶如葡糖淀粉酶、和/或其他产碳水化合物源的酶、和/或一种或多种α-淀粉酶。葡糖淀粉酶以及其他产碳水化合物源的酶的实例包括使原料淀粉水解的葡糖淀粉酶。一种或多种α-淀粉酶的实例包括酸性α-淀粉酶如酸性真菌α-淀粉酶。发酵生物的实例包括酵母例如，酿酒酵母的菌株。术语“初始糊化温度”指淀粉的糊化发生的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始糊化；糊化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可根据植物种类、植物种类的具体品种、以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定的含淀粉材料的初始糊化温度是使用古林斯坦(Gorinstein)和李(Lii)，1992，淀粉(Starch/ )44(12):461-466所描述的方法，使5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。在开始该方法之前，可以制备具有10-55w/w％干固体(DS)、优选25-45w/w％干固体、更优选30-40w/w％干固体的含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)的浆料。该浆料可以包括水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水。 由于本发明的方法是在低于该初始糊化温度下进行的并且因此没有发生显著的粘度增加，所以如果希望的话，可以使用高水平的釜馏物。在一个实施例中，水性浆料包含从约1至约 70vol.％、优选地15-60vol.％、尤其是从约30至50vol.％的水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水，或其组合等。含淀粉材料可优选地通过干式或湿式碾磨来减少粒度至0.05至3.0mm，优选地0.1-0.5mm而制备。在经受本发明的方法之后，含淀粉材料中至少 85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或优选地至少99％的干固体被转化成可溶的淀粉水解产物。本发明所述的方法是在低于初始糊化温度的温度下进行的，意味着温度典型地在30℃-75℃之间、优选地在45℃-60℃之间的范围内。在优选的实施例中，该方法在从25℃至40℃，如从28℃至35℃，如从30℃至34℃，优选地约32℃的温度下进行。在一个实施例中，执行该方法以使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如低于6w/w％，如低于约3w/w％，如低于约2w/w％，如低于约1w/w％，如低于约0.5w/w％，或低于0.25w/w％，如低于约0.1w/w％。通过简单地采用调整量的酶和发酵生物就可以实现这样的低水平的糖。 本领域的普通技术人员可容易地确定有待使用的酶和发酵生物的剂量/数量。还可以选择酶和发酵生物的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，麦芽糖水平可保持低于约0.5w/w％，如低于约0.2w/w％。本发明的方法可以在从约3与7之间、优选地从pH 3.5到 6、或更优选地从pH 4到5的pH下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，尤其24至96小时。 [1417] 由含经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法 [1418] 在这一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的方法，这些方法包括：液化步骤，以及依序地或同时地进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物的方法，这些方法包括以下步骤： [1419] (a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化； [1420] (b)使用葡糖淀粉酶使在步骤(a)中获得的液化材料糖化； [1421] (c)使用发酵生物进行发酵； [1422] 其中在根据本发明所述的葡糖淀粉酶的存在下进行步骤(a)和/或步骤(b)。 [1423] 在一个实施例中，在液化之前、期间和/或之后，添加蛋白酶，如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。在一个实施例中，金属蛋白酶来自嗜热子囊菌属(Thermoascus)菌株，例如，橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670。在另一个实施例中，蛋白酶是细菌蛋白酶，特别是来源于热球菌属的菌株的蛋白酶，更特别是来自披露于US 6,358,726中的激烈热球菌。 [1424] 可以添加另外的葡糖淀粉酶。在一个实施例中，另外的葡糖淀粉酶来源于曲霉属的菌株，例如，黑曲霉或泡盛曲霉、踝节菌属的菌株，尤其是埃默森踝节菌；或阿太菌属的菌株，尤其是罗氏阿太菌；栓菌属的菌株，例如，瓣环栓菌；粘褶菌属的菌株，例如，篱边黏褶菌或密粘褶菌；或其混合物。糖化步骤(b)以及发酵步骤(c)可依序或同时执行。当该方法作为依序糖化和发酵过程来执行时，普鲁兰酶和/或金属蛋白酶可在糖化和/或发酵期间添加，并且当步骤(b)与(c)同时执行时(SSF过程)，在发酵之前或期间添加。普鲁兰酶和/或金属蛋白酶还可有利地在液化之前(预液化处理)，即在步骤(a)之前或期间，和/或在液化之后(液化后处理)，即在步骤(a)之后添加。普鲁兰酶最有利地在液化之前或期间，即在步骤(a)之前或期间添加。发酵产物，如尤其是乙醇，可以可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。发酵生物优选地是酵母，优选地是酿酒酵母菌株。在具体实施例中，本发明的方法在步骤(a)之前进一步包括以下步骤： [1425] x)优选地通过碾磨(例如，使用锤磨机)来减小含淀粉材料的粒度； [1426] y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。 [1427] 在一个实施例中，粒度是小于#7筛，例如#6筛。#7筛通常用于常规现有技术过程中。水性浆料可包含从10-55，例如25-45以及30-40的w/w％干固体(DS)的含淀粉材料。将浆料加热至高于糊化温度并且可添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在一个实施例中，在步骤(a)中经受α-淀粉酶之前可以喷射蒸煮该浆料以进一步使该浆料经糊化。在一个实施例中，液化可作为三步骤热浆料方法来执行。在pH 4-6、优选地4.5-5.5下，将浆料加热至60℃-95℃之间、优选地70℃-90℃之间、如优选地80℃-85℃之间，并且任选地连同普鲁兰酶和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶一起添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在一个实施例中，然后，可将浆料在95℃-140℃、优选地100℃-135℃、如105℃-125℃之间的温度下喷射蒸煮约1-15分钟、优选地约3-10分钟、尤其是约5分钟。浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多α-淀粉酶以及任选地普鲁兰酶和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶，以完成水解(二次液化)。通常在pH 4.0-6、特别是在从4.5至5.5之间的pH下进行液化过程。可使用本领域熟知的条件来进行糖化步骤(b)。例如，全部糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在介于30℃到65℃之间的温度下，典型地约60℃下进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(SSF过程)中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、优选地从40℃-70℃，典型地约60℃的温度下并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。 在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，在该方法中，该糖化不存在保持阶段，意味着发酵生物(如酵母)和酶可以一起添加。SSF可典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、优选地约32℃的温度下执行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，尤其24至96小时。 [1428] 含淀粉材料 [1429] 可以在本发明的方法中使用任何适合的含淀粉起始材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适于在本发明的方法中使用的含淀粉起始材料的实例包括大麦、豆类、树薯(cassava)、谷物、玉米、买罗高梁(milo)、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、木薯(tapioca)、小麦以及全谷物或其任何混合物。该含淀粉材料还可以是蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。在优选的实施例中，该含淀粉材料是玉米。在优选的实施例中，该含淀粉材料是小麦。 [1430] 发酵产物 [1431] 术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物的发酵方法或过程生产的产品。发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；以及激素。在优选的实施例中，该发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即，可饮用的酒精；或工业乙醇，或可消费醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、奶制品工业(例如，发酵的奶制品)、皮革工业及烟草工业所使用的产品。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、或清淡啤酒。在一个优选的实施例中，该发酵产物是乙醇。 [1432] 啤酒制造 [1433] 这些葡糖淀粉酶变体还可用于啤酒制造工艺以及类似发酵中。该工艺大致上类似于如上所述的碾磨、液化、糖化以及发酵工艺。 [1434] 以釜馏物加工淀粉浆料 [1435] 碾磨的含淀粉材料与水以及回收的稀釜馏物合并以产生水性浆料。浆料可包含15至55％ds w/w之间(例如20％至50％、25％至50％、25％至45％、25％至40％、20％至35％以及30％-36％ds)。在一些实施例中，回收的稀釜馏物(逆流)在约10至70％v/v(例如10％至60％、10％至50％、10％至40％、10％至30％、10％至20％、20％至60％、20％至50％、20％至 40％以及还有20％至30％范围内)。 [1436] 一旦经碾磨的含淀粉材料与水以及逆流合并，不调整浆料中的pH。此外，在将植酸酶以及任选地α-淀粉酶添加至浆料之后，不调整pH。在一个实施例中，浆料的pH是在约pH 4.5至小于约6.0范围内(例如pH 4.5至5.8、pH 4.5至5.6、pH 4.8至5.8、pH 5.0至5.8、pH 5.0至5.4、pH 5.2至5.5以及pH 5.2至5.9)。取决于添加至浆料的稀釜馏物的量以及包含稀釜馏物的材料的类型，浆料的pH可在约pH 4.5与5.2之间。例如，稀釜馏物的pH可在pH 3.8与pH 4.5之间。 [1438] 在一些实施例中，将植酸酶添加至浆料。在其他实施例中，除了植酸酶以外，将α-淀粉酶添加至浆料。在一些实施例中，将植酸酶以及α-淀粉酶依序添加至浆料。在其他实施例中，同时添加植酸酶以及α-淀粉酶。在一些实施例中，将包含植酸酶以及任选地α-淀粉酶的浆料孵育(预处理)约5分钟至约8小时(例如，5分钟至6小时、5分钟至4小时、5分钟至2小时以及15分钟至4小时)的时间。在其他实施例中，在约40℃至115℃(例如，45℃至80℃、50℃至70℃、50℃至75℃、60℃至110℃、60℃至95℃、70℃至110℃、70℃至85℃以及77℃至86℃)范围内的温度下孵育浆料。 [1439] 在其他实施例中，在比含淀粉材料的淀粉糊化温度低约0℃至约30℃(例如，0℃至25℃、0℃至20℃、0℃至15℃、0℃至10℃以及0℃至5℃)的温度下孵育浆料。在一些实施例中，温度是低于约68℃、低于约65℃、低于约62℃、低于约60℃以及低于约55℃。在一些实施例中，温度是高于约45℃、高于约50℃、高于约55℃以及高于约60℃。在一些实施例中，在低于淀粉糊化温度的温度下孵育包含植酸酶以及α-淀粉酶的浆料被称为主要(1°)液化。 [1440] 在一个实施例中，经碾磨的含淀粉材料是玉米或高粱。浆料包含25至40％DS，pH在4.8至5.2范围内，并且浆料与植酸酶以及任选地α-淀粉酶在60至75℃范围内的温度下孵育 5分钟至2小时。 [1441] 当前，据信用于液化过程的可商购的微生物α-淀粉酶总体上不能足够稳定地在高于约80℃的温度下、在小于pH 5.6的pH水平下使用全谷粒从干式碾磨过程中产生液化淀粉底物。许多可商购的α-淀粉酶的稳定性在低于约4.0的pH下降低。 [1442] 在另外的液化步骤中，在约4.0至5.5的pH下，孵育或预处理的含淀粉材料经历比含淀粉材料的淀粉糊化温度(例如，70℃至120℃、70℃至110℃以及70℃至90℃)高的温度增加，如约0℃至约45℃，持续约2分钟至约6小时的一段时间(例如，2分钟至4小时、90分钟、140分钟以及90至140分钟)，更优选地1小时与2小时之间。温度可通过常规高温喷射蒸煮系统来增加一段较短时间，例如，1至15分钟。然后，淀粉可进一步在从约75℃至95℃(例如，80℃至90℃以及80℃至85℃)范围内的温度下水解约15至150分钟(例如，30至120分钟)的时间。在一个优选的实施例中，pH在这些过程步骤期间未调整，并且液化的醪液的pH在约pH 4.0至pH 5.8(例如pH 4.5至5.8、pH 4.8至5.4以及pH 5.0至5.2)范围内。在一些实施例中，将第二剂量的热稳定的α-淀粉酶添加至二次液化步骤，但是在其他实施例中没有额外剂量的α-淀粉酶。 [1443] 可在孵育以及液化步骤之后进行本领域中熟知的糖化以及发酵步骤。 [1444] 蒸馏 [1445] 任选地，在发酵之后，可例如通过蒸馏以及任选地随后进行一个或多个过程步骤来萃取醇(例如，乙醇)。 [1446] 在一些实施例中，通过在此提供的方法来生产的乙醇的产率是至少8％、至少10％、至少12％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％以及至少18％(v/v)以及至少 23％v/v。根据在此提供的方法来获得的乙醇可用作例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的酒精，或工业乙醇。 [1447] 副产物 [1449] 关于如何完成液化、糖化、发酵、蒸馏以及回收乙醇的进一步细节是本领域技术人员熟知的。 [1450] 根据在此提供的方法，糖化以及发酵可同时或单独地执行。 [1451] 发酵生物 [1452] 术语“发酵生物”是指适于生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，例如酵母和丝状真菌。适合的发酵生物能够将可发酵糖(如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖或木糖)直接或间接地发酵(即，转化)为所希望的发酵产物。 [1453] 发酵生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母；毕赤酵母属的菌株，特别是树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS 5773或巴斯德毕赤酵母；假丝酵母属的菌株，特别是阿拉伯糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)、博伊丁假丝酵母、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、休哈塔假丝酵母、萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、假热带假丝酵母(Candida tropicalis)或产朊假丝酵母。其他发酵生物包括汉逊酵母属的菌株，特别是异常汉森酵母或多形汉逊酵母；克鲁弗酵母属的菌株，特别是脆壁克鲁弗酵母或马克斯克鲁弗酵母(Kluyveromyces marxianus)；以及裂殖酵母属的菌株，特别是粟酒裂殖酵母。 [1454] 优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属的菌株，特别是大肠杆菌；发酵单胞菌属的菌株，特别是运动发酵单胞菌；发酵杆菌属的菌株，特别是棕榈科发酵杆菌(Zymobactor palmae)；克雷伯菌属的菌株，特别是产酸克雷伯菌；明串珠菌属的菌株，特别是肠膜状明串珠菌；梭菌属的菌株，特别是丁酸梭菌；肠杆菌属的菌株，特别是产气肠杆菌；以及高温厌氧杆菌属的菌株，特别是高温厌氧杆菌BG1L1(应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotech.)77:61-86)、产乙醇高温厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)、产甲烷高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii)或热解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)。乳杆菌属的菌株也被预期，如谷氨酸棒状杆菌R、嗜热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和嗜热葡糖苷酶土芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的菌株。 [1455] 在一个实施例中，该发酵生物是C6糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。 [1456] 在一个实施例中，该发酵生物是C5糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。 [1457] 在一个实施例中，将该发酵生物添加至发酵培养基中，这样使得每mL的发酵培养基的活发酵生物(如酵母)计数在从105至1012个的范围内，优选从107至1010个，尤其是约5x107个。 [1458] 酵母是用于乙醇发酵的优选发酵生物。优选的是酵母属的菌株，尤其是酿酒酵母种的菌株，优选是对高水平的乙醇(即，直到例如约10、12、15或20vol.％或更多的乙醇)耐受的菌株。 [1459] 在一个实施例中，利用C5的酵母是披露于WO 2004/085627中的酿酒酵母菌株。 [1460] 在一个实施例中，发酵生物是WO 2010/074577(内达尔科(Nedalco))中关注的C5真核微生物细胞。 [1461] 在一个实施例中，发酵生物是披露于US 2008/0014620中的能够直接将木糖同分异构化为木糖的经转化C5真核细胞。 [1462] 在一个实施例中，发酵生物是披露于WO 2009/109633中的C5糖发酵细胞。 [1463] 可商购的酵母包括LNF SA-1、LNF BG-1、LNF PE-2和LNF CAT-1(可获得自巴西的LNF)，RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可获得自富酶泰斯/乐斯富(Fermentis/Lesaffre)，美国)，FALI(可获得自弗莱施曼酵母(Fleischmann’s Yeast)，美国)，SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可获得自乙醇技术(Ethanol Technology)，威斯康星州(WI)，美国)，BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物产品集团(NABC-North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州(GA)，美国)，GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德AB公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼食品配料部(DSM Specialties))。 [1464] 能够从可发酵糖生产所希望的发酵产物的发酵生物优选在精确条件条件下以具体生长速率生长。当将该发酵生物引入进/添加至发酵培养基中时，接种的发酵生物经过多个阶段。不出现原始生长。此时期称为“停滞期”并且可以被认为是适应时期。在称为“对数期”的接下来的阶段过程中，生长速率逐渐增加。在最大生长期间后，速率停止并且发酵生物进入“静止期”。在另外的时间段后，发酵生物进入“死亡期”，其中活细胞的数目下降。 [1465] 发酵 [1466] 基于例如植物材料的种类、可获得的可发酵糖、一种或多种发酵生物和/或所希望的发酵产物确定发酵条件。本领域的普通技术人员可以容易地确定适合的发酵条件。发酵可以在常规使用的条件下进行。优选的发酵过程是厌氧过程。 [1467] 例如，发酵可以在高达75℃，例如40℃-70℃之间，如50℃-60℃之间的温度下进行。然而，还已知的是细菌具有低至室温左右(20℃左右)的显著较低的最适温度。适合的发酵生物的实例可以发现于上面的“发酵生物”部分中。 [1468] 对于使用酵母生产乙醇，发酵可以持续24至96小时，特别是持续35至60小时。在一个实施例中，在20℃至40℃，优选26℃至34℃之间，特别是32℃左右的温度下进行发酵。在一个实施例中，pH是从pH 3至6，优选pH 4至5左右。 [1469] 其他发酵产物可以在本领域的普通技术人员已知的、适于所讨论的发酵微生物的温度下发酵。 [1470] 典型地在3与7之间的范围内的pH，优选从pH 3.5至6，如pH 5左右下进行发酵。发酵典型地持续6-96小时。 [1471] 本发明的方法可以作为分批过程或作为连续过程进行。发酵可以在超滤系统中进行，其中将渗余物在固体、水和发酵生物的存在下保持在循环之下，并且其中渗透物是包含所希望的发酵产物的液体。同样考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中执行的方法/工艺，并且其中将渗余物在固体、水和一种或多种发酵生物的存在下保持在循环之下，并且其中渗透物是包含发酵产物的液体。 [1472] 发酵后，可以将发酵生物与发酵的浆料分开并再循环。 [1473] 发酵培养基 [1474] 短语“发酵培养基(fermentation media)”或“发酵培养基(fermentation medium)”是指进行发酵的环境并且包括发酵底物，即被一种或多种发酵生物代谢的碳水化合物来源。 [1475] 发酵培养基可以包括针对一种或多种发酵生物的其他营养素和一种或多种生长刺激剂。营养素和生长刺激剂被广泛地用于发酵领域中并且包括氮源，例如氨；维生素以及矿物质或其组合。 [1476] 回收 [1477] 继发酵之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以将发酵培养基蒸馏以提取所希望的发酵产物或可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。可替代地，可以通过汽提回收发酵产物。回收方法在本领域中是熟知的。 [1478] 酶 [1479] 下面描述的一种或多种酶和多肽有待以“有效量”用于本发明的方法中。 [1480] α-淀粉酶 [1481] 可以使用任何α-淀粉酶，例如真菌、细菌或植物源的。在优选的实施例中，该α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加，在3至7、优选从3.5至6或更优选从4-5的范围内的pH下具有最适活性的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。 [1482] 细菌α-淀粉酶 [1483] 用于在本发明中使用的α-淀粉酶可以是一种细菌α-淀粉酶，例如来源于芽孢杆菌属。在优选的实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶来源于解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可以来源于其他芽孢杆菌属物种。 [1484] α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶和WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列都通过引用而结合在此)。在一个实施例中，该α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列分别具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少 99％一致性程度的酶。 [1485] 芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是变体和/或杂合体，尤其是在任何以下各项中所述的变体和/或杂合体：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355(所有文献都通过引用而结合在此)。具体的α-淀粉酶变体披露于美国专利号6,093,562、6,187,576和6,297,038中(通过引用而结合在此)并且包括具有以下改变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179至G182处的一个或两个氨基酸的缺失，优选披露于WO 96/23873中的双缺失-参见例如第20页，第1-10行(通过引用而结合在此)，优选与披露于WO 99/19467的SEQ ID NO:3阐述的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于δ(181-182)的双缺失，或使用WO 99/19467(该参考文献通过引用而结合在此)中的SEQ ID NO:3进行编号的氨基酸R179和G180的缺失。在优选的实施例中，该α-淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是在重组产生过程中天然地截短的。例如，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是截短的，因此其具有约491个氨基酸(与WO 99/ 19467中的SEQ ID NO:3相比较)。优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与披露于WO 99/19467中的SEQ ID NO:3阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于位置181和182的缺失的双缺失并且进一步包括N193F取代(也被表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体中的S239的位置处具有取代。在优选的实施例中，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组： [1486] I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E； [1487] I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S； [1488] I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及 [1489] I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3进行编号)。 [1490] 细菌杂合α-淀粉酶 [1491] 该α-淀粉酶可以是杂合α-淀粉酶，例如包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:4中)的445个C-末端氨基酸残基和来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:5中)的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶，该α-淀粉酶具有以下取代中的一个或多个(尤其是全部)： [1492] G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌进行编号)。还优选的是具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。 [1493] 真菌α-淀粉酶 [1494] 真菌α-淀粉酶包括来源于曲霉属的菌株的α-淀粉酶，例如白曲霉、黑曲霉和米曲霉α-淀粉酶。 [1495] 优选的酸性真菌α-淀粉酶是与在WO 96/23874中示为SEQ ID NO:10的氨基酸序列的成熟部分展现出高度一致性，即至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性的α-淀粉酶。 [1496] 另一种优选的酸性α-淀粉酶来源于黑曲霉的菌株。在优选的实施例中，该酸性真菌α-淀粉酶是在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主入藏号P56271下披露为“AMYA_ASPNG”并且描述于WO 89/01969(实例3-通过引用而结合)中的黑曲霉α-淀粉酶。 [1497] 其他野生型α-淀粉酶包括来源于亚灰树花菌属(Meripilus)和根毛霉属的菌株，优选大型亚灰树花菌或微小根毛霉的菌株的那些(WO 2004/055178，将其通过引用结合在此)。 [1498] 在另一个优选的实施例中，该α-淀粉酶来来源于土曲霉。 [1499] 在优选的实施例中，该α-淀粉酶来源于白曲霉(金子(Kaneko)等人，1996，发酵与生物工程杂志(J.Ferment.Bioeng.)81:292-298：“编码来自白曲霉的酸稳定的α-淀粉酶的基因的核苷酸序列的分子克隆和测定(Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii)”；并且进一步被披露为EMBL：#AB008370)。 [1500] 该真菌α-淀粉酶还可以是包含淀粉结合结构域(SBD)和α-淀粉酶催化结构域的野生型酶或其变体。 [1501] 真菌杂合α-淀粉酶 [1502] 在优选的实施例中，该真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的实例包括披露于WO 2005/003311、美国专利申请公开号2005/0054071(诺维信公司)和WO 2006/069290(诺维信公司)(通过引用而结合在此)中的α-淀粉酶。杂合α-淀粉酶可以包括α-淀粉酶催化结构域(CD)和碳水化合物结合结构域/模块(CBM)(例如淀粉结合结构域(SBD))以及任选地接头。 [1503] 杂合α-淀粉酶的实例包括披露于WO 2006/069290中的实例的表1至5中的那些，包括具有催化结构域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD的变体(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:100)、具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:101)、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(将其在美国申请号11/316,535的表5中披露为氨基酸序列SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:96的组合)或作为WO 2006/069290的表5中的V039、以及具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:102)。其他杂合α-淀粉酶列于美国申请号11/316,535和WO 2006/069290(将其通过引用而结合在此)的实例4的表3、4、5以及6中。 [1504] 在优选的实施例中，该α-淀粉酶是衍生自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉的α-淀粉酶，优选WO2013/006756中SEQ ID NO:7中所示的α-淀粉酶，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，特别是G128D+D143N。 [1505] 杂合α-淀粉酶的其他实例包括披露于美国专利申请公开号2005/0054071中的那些，包括披露于第15页上表3中的那些，例如具有白曲霉接头和淀粉结合结构域的黑曲霉α-淀粉酶。 [1506] 其他α-淀粉酶与任何上述α-淀粉酶展现出高度的序列一致性，即与上面披露的成熟酶序列展现出至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性。 [1507] 商用α-淀粉酶产品 [1508] 包括α-淀粉酶的优选的商用组合物包括MYCOLASETM(DSM)、BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM X、LIQUOZYMETM SC和SANTM SUPER、SANTM EXTRA L(诺维信公司)以及CLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETM FRED、SPEZYMETM AA、SPEZYMETM ALPHA、TM TM TMSPEZYME DELTA AA、GC358、GC980、SPEZYME CL和SPEZYME RSL(杜邦工业生物科学(DuPont Industrial Biosciences))，以及来自黑曲霉的称作SP288的酸性真菌α-淀粉酶(可获得自诺维信公司，丹麦)。 [1509] 产碳水化合物源的酶(糖化酶) [1510] 术语“产碳水化合物源的酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成器)、β-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶(两种麦芽糖生成器)并且还包括α-葡糖苷酶、异淀粉酶和普鲁兰酶。产碳水化合物源的酶能够产生可以所讨论中一种或多种发酵生物用作能源的碳水化合物，例如，当在用于生产发酵产物(例如乙醇)的本发明的方法中使用时。产生的碳水化合物可以被直接或间接地转化为所希望的发酵产物，优选乙醇。可以使用产碳水化合物源的酶的混合物。共混物包括以下混合物，这些混合物包括至少葡糖淀粉酶以及α-淀粉酶，尤其是酸性淀粉酶，甚至更优选的是酸性真菌α-淀粉酶。 [1511] 在常规的淀粉到乙醇的方法(即，包括液化步骤)中，可以如EP 140410中定义该比例，尤其是当同时进行糖化和发酵时。 [1512] 葡糖淀粉酶 [1513] 术语“葡糖淀粉酶”(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的酶。优选地,该葡糖淀粉酶是本发明所述的变体葡糖淀粉酶。 [1514] 该葡糖淀粉酶的添加量可以为0.001到10AGU/g DS，优选地从0.01到5AGU/g DS，例如为约0.1、0.3、0.5、1或2AGU/g DS，尤其是0.1至0.5AGU/g DS或0.02-20AGU/g DS，优选地0.1-10AGU/g DS。 [1515] 然而，在一个实施例中，也可以添加其他葡糖淀粉酶。此类其他葡糖淀粉酶可以来源于任何适合的来源，例如来源于微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌源的，选自下组,该组由以下各项组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(博埃尔(Boel)等人，1984，欧洲分子生物学学会杂志3(5):1097-1102)，或其变体，例如披露于WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中的那些(来自诺维信，丹麦)；披露于WO 84/02921中的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(哈塔(Hata)等人，1991，农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)55(4):941-949)，或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(陈(Chen)等人，1996，蛋白质工程(Prot.Eng.) 9:499-505)；D257E和D293E/Q(陈等人，1995，蛋白质工程8:575-582)；N182(陈等人，1994，生物化学杂志(Biochem.J.)301:275-281)；二硫键，A246C(费艾洛伯(Fierobe)等人，1996，生物化学35:8698-8704；以及在位置A435和S436中引入Pro残基(李(Li)等人，1997，蛋白质工程(Prot.Eng.)10:1199-1204)。 [1516] 其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(以前命名为罗尔伏革菌)葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和长坂(Nagasaka)等人，1998，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)50:323-330)，踝节菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于Talaromyces duponti、埃默森踝节菌(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利登记号32,153)以及嗜热踝节菌(美国专利号4,587,215)。 [1517] 在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自青霉属的菌株，尤其是草酸青霉菌菌株，特别是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶。在优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有使用成熟多肽(SEQ ID NO:2的氨基酸22-616)进行编号的K79V取代，并且描述于WO 2013/036526中。在优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是在WO 2011/127802中披露为SEQ ID NO:2的氨基酸22-616的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的变体，该变体具有K79V取代以及以下取代中的一个或多个：P2N、P4S、P11F、T65A、Q327F，尤其是在WO 2013/053801中描述的P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F。 [1518] 在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自密孔菌属(Pycnoporus)的菌株，尤其是血红密孔菌菌株，特别是在WO 2011/066576中披露为SEQ ID NO:2、4或6的血红密孔菌葡糖淀粉酶。在优选的实施例中，该酶组合物包括如WO 2011/066576中SEQ ID NO:6的氨基酸19-573所示的葡糖淀粉酶。 [1519] 在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自粘褶菌属的菌株，尤其是密粘褶菌菌株，特别是在WO 2011/068803中披露为SEQ ID NO:18的密粘褶菌葡糖淀粉酶。在尤其优选的实施例中，该酶组合物包括在WO 2011/068803中SEQ ID NO:18的氨基酸18-576所示的密粘褶菌葡糖淀粉酶，并且具有以下取代中的一个或多个：S95P、A121P，尤其是S95P+A121P，使用成熟多肽(SEQ ID NO:18的第18-576位)进行编号。 [1520] 在具体实施例中，该葡糖淀粉酶来自粘褶菌属的菌株，尤其是篱边粘褶菌的菌株，特别是在WO 2011/068803中披露为SEQ ID NO:2的氨基酸18-573的成熟的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶。 [1521] 细菌葡糖淀粉酶包括来自以下各项的葡糖淀粉酶：梭菌属(特别是嗜热解淀粉梭菌(C .thermoamylolyticum) (EP 135138)和嗜热解硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831))，瓣环栓菌(Trametes cingulata)，纸质厚孢孔菌(Pachykytospora papyracea)以及大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)，全部披露于WO 2006/069289中；或披露于PCT/US 2007/066618中的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)；或其混合物。可以在本发明中使用杂合葡糖淀粉酶。杂合葡糖淀粉酶的实例披露于WO 2005/045018中。具体实例包括披露于实例1的表1和4中的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用结合在此)。 [1522] 该葡糖淀粉酶可以与任何上述葡糖淀粉酶具有高度序列一致性，即与上述成熟酶序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％一致性。 [1523] 可商购的葡糖淀粉酶组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER，SANTM EXTRA L，SPIRIZYMETM PLUS，SPIRIZYMETM FUEL，SPIRIZYMETM B4U，SPIRIZYME ULTRATM和AMGTM E(来自诺维信公司，丹麦)；OPTIDEXTM 300，GC480TM和GC147TM(来自杜邦工业生物科学(DuPont Industrial Biosciences)，美国)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900，G-ZYMETM和G990 Zr(来自杜邦工业生物科学)。 [1524] 能以0.02-20AGU/g DS、优选0.1-10AGU/g DS、尤其是1-5AGU/g DS之间、例如0.1-2AGU/g DS、例如0.5AGU/g DS或以0.0001-20AGU/g DS的量、优选0.001-10AGU/g DS、尤其是0.01-5AGU/g DS之间、例如0.1-2AGU/g DS的量添加葡糖淀粉酶。 [1525] β-淀粉酶 [1526] β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)是传统地给予外切作用的麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1,4-α-糖苷键水解。麦芽糖单位以逐步方式依次从非还原链末端去除，直到该分子被降解，或在支链淀粉的情况下，直到到达分支点。释放的麦芽糖具有β端基异构构型，因此名称为β-淀粉酶。 [1527] β-淀粉酶已经从多种植物和微生物中分离(福格蒂(Fogarty)和凯利(Kelly)，1979，工业微生物学进展(Progress in Industrial Microbiology)15:112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有从40℃至65℃范围内的最适温度并且具有从4.5至7范围内的最适pH。来自大麦的可商购β-淀粉酶是来自丹麦的诺维信公司的NOVOZYMTM WBA和来自美国的杜邦工业生物科学的SPEZYMETM BBA 1500。 [1528] 麦芽糖淀粉酶 [1529] 淀粉酶还可以是麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，EC 3.2.1.133)，其催化α-构型的直链淀粉和支链淀粉水解为麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽糖淀粉酶可商购自诺维信公司。麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598, 048、4,604,355和6,162,628中，将其通过引用而结合在此。 [1530] 能以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加麦芽糖淀粉酶。 [1531] 植酸酶 [1532] 可以在本发明的方法中使用任何植酸酶。植酸酶是通过特异性水解肌醇与磷之间的酯键来降解植酸盐和/或植酸的酶。植酸酶活性被认为在许多成分中具有磷和离子可用性。在一些实施例中，植酸酶能够从肌醇六磷酸盐(例如，植酸)释放至少一种无机磷酸盐。可以根据其对植酸盐分子上的水解开始处的磷酸酯基团的特异性位置的偏好对植酸酶进行分组(例如，3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))。植酸酶的实例是肌醇-六磷酸(hexakiphosphate)-3-磷酸水解酶。 [1533] 植酸酶可以获得自微生物，例如真菌和细菌生物。例如，植酸酶可以获得自丝状真菌，如曲霉属(例如，无花果曲霉、烟曲霉、黑曲霉及土曲霉)，枝孢属(Cladospirum)，毛霉属(例如，梨形毛霉)，毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)，青霉属(例如，大麦青霉(P.hordei)(ATCC号22053))、桧状青霉(P.piceum)(ATCC号10519)或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC号48944)，踝节菌属(例如，嗜热踝节菌)，嗜热丝孢菌属(WO 99/49740)以及木霉属(例如，里氏木霉)。 [1534] 在一个实施例中，该植酸盐降解酶获得自酵母(例如，Arxula adeninivorans、异常毕赤酵母、许旺酵母)，革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌、克雷伯菌属、假单胞菌属)和革兰氏阳性细菌(例如，芽孢杆菌属，例如枯草芽孢杆菌)。 [1535] 该植酸酶可以获得自柠檬酸杆菌属、肠杆菌属或隔孢伏革菌属。 [1536] 在一个实施例中，该植酸酶来源于布丘菌属(Buttiauxiella spp.)，例如乡间布丘菌(B.agrestis)、布里纳氏布丘氏菌(B.brennerae)、费拉格布丘氏菌(B.ferragutiase)、伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae)、伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)、诺基亚布丘氏菌(B.noackiae)以及瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiae)。在一些实施例中，该植酸酶是披露于WO 2006/043178或美国申请号11/714,487中的植酸酶。 [1537] 在一个优选实施例中，该植酸酶与美国申请号12/263,886的SEQ ID NO:31中阐述的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％以及至少99％序列一致性。 [1538] 可商购的植酸酶是NATUPHOS(BASF)、RONOZYME P(诺维信公司)、PHYZYME(丹尼斯克公司，范恩尼姆(Verenium))以及FINASE(AB酶公司(AB Enzymes))。用于确定微生物植酸酶活性的方法和植酸酶单位的定义披露于恩格伦(Engelen)等人，1994，AOAC国际杂志(Journal of AOAC International)77:760-764中。该植酸酶可以是野生型植酸酶或其活性变体或活性片段。 [1539] 支链淀粉酶 [1540] 普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41，普鲁兰6-葡聚糖-水解酶)是去分支酶，其由它们在例如支链淀粉(amylopectin)和普鲁兰(pullulan)中水解α-1,6-糖苷键的能力表征。 [1541] 普鲁兰酶可以是细菌普鲁兰酶，优选来源于芽孢杆菌属的菌株，尤其是来源于脱支芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、淀粉脱支芽孢杆菌或嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的菌株。 [1542] 根据本发明有用的确切考虑的普鲁兰酶包括在WO 01/151620(通过引用结合在此)中披露为SEQ ID NO:4的脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶以及披露为WO 2008/024372(通过引用结合在此)的序列2、4和6的来自脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶。 [1543] 根据本发明有用的确切考虑的普鲁兰酶包括来自美国专利号4,560,651(通过引用结合在此)中披露的淀粉脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶、WO 01/151620(通过引用结合在此)中披露为SEQ ID NO:2的普鲁兰酶以及来自WO 01/151620(通过引用结合在此)中披露为SEQ ID NO:6的嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌以及还有描述于FEMS微生物学通讯(FEMS Mic.Let.)(1994)115，97-106中的普鲁兰酶。 [1544] 其他特别考虑的普鲁兰酶是WO 2015/110473中披露的那些，特别是WO 2015/110473(在此作为SEQ ID NO:5包括)中作为SEQ ID NO:21披露的变体普鲁兰酶，其中保持取代368G+393A+492S，A。因此在此实施例中，该普鲁兰酶选自SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO: 5的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性并且包括取代N368G+N393A+A492S,A的普鲁兰酶，使用SEQ ID NO:5进行编号。 [1545] 根据本发明的普鲁兰酶可以按有效量添加，该有效量包括从1-100微克/gDS之间，尤其是从10-60微克/g DS的优选范围。普鲁兰酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定法描述于下文的“材料与方法”-部分中。 [1546] 在优选的实施例中，以1-100微克酶蛋白/g DS之间，优选10-60微克酶蛋白/g DS之间的量使用普鲁兰酶。 [1547] 适合的可商购普鲁兰酶产品包括PROMOZYME D、PROMOZYMETM D2(诺维信公司，丹麦)、OPTIMAX L-1000、OPTIMAX L-300(杜邦工业生物科学)以及AMANO 8(安能满公司(Amano)，日本)。 [1548] 蛋白酶 [1549] 可以在糖化、发酵、同时糖化和发酵过程中添加蛋白酶。该蛋白酶可以是任何蛋白酶。在优选的实施例中，该蛋白酶是微生物源的，优选真菌或细菌源的酸性蛋白酶。酸性真菌蛋白酶是优选的，但是也可以使用其他蛋白酶。 [1550] 适合的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即由在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。 [1551] 在优选的实施例中，该蛋白酶来源于热球菌属的细菌菌株，例如激烈热球菌的菌株(pfu蛋白酶)。具体地，该蛋白酶是在美国专利号6,358,726-B1中示为SEQ ID NO:1的蛋白酶。在另一个实施例中，该蛋白酶是在WO 2012/088303中示为SEQ ID NO:13的蛋白酶。 [1552] 酸性真菌蛋白酶可以来源于曲霉属、假丝酵母属、革盖菌属、内座壳属(Endothia)、Enthomophtra、耙齿菌属、毛霉属、青霉属、根霉属、小核菌属以及球拟酵母菌属。具体而言，该蛋白酶可以来源于棘孢曲霉(WO 95/02044)、泡盛曲霉(林田(Hayashida)等人，1977，农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)42(5)，927-933)、黑曲霉(参见例如，快禅(Koaze)等人，1964，日本农业、生物学与化学(Agr.Biol.Chem.Japan)28:216)、斋藤曲霉(参见例如，吉田 (Yoshida) ，1954 ，日本农业、化学与社会学杂志 (J.Agr.Chem.Soc.Japan)28:66)、或米曲霉，如pepA蛋白酶；以及来自米黑毛霉或微小毛霉的酸性蛋白酶。 [1553] 该蛋白酶可以是中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属的菌株的蛋白酶。具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌并且具有作为登录号P06832可在Swissprot数据库获得的序列。这些蛋白酶与披露于Swissprot数据库中的氨基酸序列(登录号P06832)可以具有至少90％序列一致性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少 99％一致性。 [1554] 该蛋白酶与WO 2003/048353中披露为SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以具有至少90％序列一致性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或特别是至少 99％一致性。 [1555] 该蛋白酶可以是选自下组的木瓜蛋白酶样蛋白酶，该组由以下各项组成：EC 3.4.22.*内的蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)，例如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.22.7(萝蘼蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶)、EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)以及EC 3.4.22.30(木瓜蛋白酶Q(caricain))。 [1556] 在一个实施例中，该蛋白酶是来源于曲霉属的菌株(例如米曲霉)的蛋白酶制剂。在另一个实施例中，该蛋白酶来源于根毛霉属的菌株，优选是米黑根毛霉。在另一个实施例中，该蛋白酶是蛋白酶制剂，优选是来源于曲霉属的菌株(例如米曲霉)的蛋白质分解制剂和来源于根毛霉属的菌株(优选米黑根毛霉)的蛋白酶的混合物。 [1557] 天冬氨酸蛋白酶描述于例如蛋白水解酶手册(Handbook of Proteolytic Enzymes)中，由A.J.巴雷特(Barrett)、N.D.罗林斯(Rawlings)和J.F.沃森纳(Woessner)编辑，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥，1998，第270章。天冬氨酸蛋白酶的实例包括例如披露于以下各项中的那些：贝尔卡(Berka)等人，1990，基因96:313；贝尔卡等人，1993，基因125:195-198；和戈米(Gomi)等人，1993，生物科学、生物科技与生物化学 (Biosci.Biotech.Biochem.)57:1095-1100，将其通过引用而结合在此。 [1558] 该蛋白酶还可以是金属蛋白酶，将其定义为选自下组的蛋白酶，该组由以下各项组成： [1559] (a)属于EC 3.4.24的蛋白酶(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)； [1560] (b)属于以上手册的M组的金属蛋白酶； [1561] (c)尚未指定族的金属蛋白酶(指定：族MX)，或属于族MA、MB、MC、MD、ME、MF、MG、MH中的任一种的金属蛋白酶(如在以上手册的第989-991页所定义)； [1562] (d)其他家族的金属蛋白酶(如以上手册的第1448-1452页所定义)； [1563] (e)具有HEXXH基序的金属蛋白酶； [1564] (f)具有HEFTH基序的金属蛋白酶； [1565] (g)属于家族M3、M26、M27、M32、M34、M35、M36、M41、M43或M47中的任一种的金属蛋白酶(如以上手册的第1448-1452页所定义)； [1566] (h)属于M28E家族的金属蛋白酶；以及 [1567] (i)属于家族M35的金属蛋白酶(如以上手册的第1492-1495页所定义)。 [1568] 在其他具体实施例中，金属蛋白酶是其中肽键上的亲核攻击由被二价金属阳离子活化的水分子介导的水解酶。二价阳离子的实例是锌、钴或锰。可以通过氨基酸配体将金属离子保持在适当位置。配体的数目可以是五、四、三、二、一或零。在具体实施例中，数目是二或三，优选是三。 [1569] 对于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶的起源没有限制。在一个实施例中，将该金属蛋白酶分类为EC 3.4.24，优选EC 3.4.24.39。在一个实施例中，该金属蛋白酶是酸稳定的金属蛋白酶，例如真菌酸稳定的金属蛋白酶，如来源于嗜热子嚢菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶(分类为EC 3.4.24.39)。在另一个实施例中，该金属蛋白酶来源于曲霉属的菌株，优选米曲霉的菌株。 [1570] 在一个实施例中，该金属蛋白酶与WO 2010/008841的SEQ ID NO:1(橙色嗜热子囊菌金属蛋白酶)的氨基酸-178至177、-159至177或优选氨基酸1至177(成熟多肽)具有至少80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％序列一致性程度；并且该金属蛋白酶具有金属蛋白酶活性。在具体实施例中，该金属蛋白酶由与如上所述的SEQ ID NO:1具有一定一致性程度的氨基酸序列组成。 [1571] 橙色嗜热子囊菌金属蛋白酶是适于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶的优选实例。在优选的实施例中，该蛋白酶是在WO 2003/048353中披露为SEQ ID NO:2的橙色嗜热子囊菌金属蛋白酶的变体，或具有WO 2011/072191中SEQ ID NO:2的氨基酸1-177，具有以下突变： [1572] D79L+S87P+A112P+D142L； [1573] D79L+S87P+D142L；或 [1574] A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。 [1575] 另一种金属蛋白酶来源于米曲霉并且包括披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:11的序列，或其氨基酸-23-353；-23-374；-23-397；1-353；1-374；1-397；177-353；177-374；或177-397，以及披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:10。 [1576] 另一种适于在本发明的方法中使用的金属蛋白酶是包括WO 2010/008841的SEQ ID NO:5的米曲霉金属蛋白酶，或作为分离的多肽的金属蛋白酶，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少约80％、至少82％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％一致性程度；并且该多肽具有金属蛋白酶活性。在具体实施例中，该金属蛋白酶由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。 [1577] 在具体实施例中，金属蛋白酶具有这样一种氨基酸序列，该氨基酸序列与橙色嗜热子囊菌或米曲霉金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177相差四十个、三十五个、三十个、二十五个、二十个或相差十五个氨基酸。 [1578] 在另一个实施例中，金属蛋白酶具有这样一种氨基酸序列，该氨基酸序列与这些金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177相差十个、或相差九个、或相差八个、或相差七个、或相差六个、或相差五个氨基酸，例如，相差四个、相差三个、相差两个、或相差一个氨基酸。 [1579] 在具体实施例中，该金属蛋白酶a)包括以下各项或b)由以下各项组成 [1580] i)WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177的氨基酸序列； [1581] ii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353、-23-374、-23-397、1-353、1-374、1-397、177-353、177-374或177-397的氨基酸序列； [1582] iii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:5的氨基酸序列；或 [1583] i)、ii)和iii)的具有蛋白酶活性的序列等位基因变体或片段。 [1584] WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177、-159至177或+1至177或WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353、-23-374、-23-397、1-353、1-374、1-397、 177-353、177-374或177-397的片段是具有自这些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施例中，片段包含至少75个氨基酸残基、或至少100个氨基酸残基、或至少125个氨基酸残基、或至少150个氨基酸残基、或至少160个氨基酸残基、或至少165个氨基酸残基、或至少170个氨基酸残基、或至少175个氨基酸残基。 [1585] 可商购产品包括 ESPERASETM、FLAVOURZYMETM、TM NOVOZYM FM 2.0L及iZyme Ba(可获得自诺维信公司，丹麦)以及来自美国的杜邦工业生物科学的GC106TM和SPEZYMETM FAN，以及来自DSM的 [1586] 在以下编号的段落中进一步定义本发明： [1587] 段落1.一种葡糖淀粉酶变体，该变体在与SEQ ID NO:2的多肽的位置295相对应的位置处包括取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1588] 段落2.如段落1所述的变体，进一步包括至少在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置32、83、163、169、219、224、303或410的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少 90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1589] 段落3.如段落1-2中任一项所述的变体，其中取代的数目是1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个取代。 [1590] 段落4.如以上段落中任一项所述的变体，其中该变体包括选自以下各项的取代中的至少一个或多个：295F、295W、224A、224I、224T、32V、83D、163A、163W、169I、219R、303N或410K。 [1591] 段落5.如以上段落中任一项所述的变体，其中该变体包括以下取代或取代的组合中的至少一个： [1592] 295W； [1593] 295W+410K； [1594] 224I+295F； [1595] 224T+295W+318V； [1596] 295F； [1597] 224A+295F； [1598] 295W+83D+410K； [1599] 163A+295W+410K； [1600] 163W+295W+410K； [1601] 303N+295W； [1602] 169I+295W；或 [1603] 32V+219R+295W； [1604] 其中该变体具有葡糖淀粉酶活性,并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1605] 段落6.根据段落1-5中任一项所述的变体，其中该变体包括以下取代或取代的组合中的至少一个： [1606] 295W+410K；或 [1607] 163A+295W+410K； [1608] 其中该变体具有葡糖淀粉酶活性,并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1609] 段落7.根据以上段落中任一项所述的变体，其中这些取代选自以下各项：Y295F、Y295W、L224A、L224I、L224T、A32V、S83D、N163A、N163W、V169I、T219R、S303NR410K、和Q318V。 [1610] 段落8.如段落1-7中任一项所述的变体，该变体相对于亲本具有改进的特性，其中这一改进的特性是降低的葡萄糖抑制。 [1611] 段落9.一种葡糖淀粉酶变体，包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置271、410、72、77、145、219、303、224、318的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1612] 段落10.如段落8所述的变体，其中取代的数目是1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个取代。 [1613] 段落11.如段落9所述的变体，其中该变体包括选自以下各项的取代中的至少一个或多个：72V、77A、145A、219D、271Q、271N、271A、271S、271V、224Q、303E、318W、318F、410A、410Q或410H。 [1614] 段落12.根据段落9-11所述的变体，其中该变体包括以下取代或取代的组合中的至少一个： [1615] 72V+145A； [1616] 271Q； [1617] 224Q+271N+410A； [1618] 77A； [1619] 77A+271A； [1620] 271S+318W+410Q； [1621] 271V+318F+410H； [1622] 77A+219D； [1623] 77A+303E； [1624] 其中该变体具有葡糖淀粉酶活性,并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1625] 段落13.根据段落9-12所述的变体，其中这些取代选自以下各项：D72V、L77A、L145A、T219D、L224Q、T271Q、T271N、T271A、T271S、T271V、S303E、Q318W、Q318F、R410Q、R410H和R410A。 [1626] 段落14.根据段落9-13所述的变体，该变体相对于亲本具有改进的特性，其中这一改进的特性是增加的比活性。 [1627] 段落15.一种葡糖淀粉酶变体，包括在对应于SEQ ID NO:2的多肽的位置271、或295、或271和295的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1628] 段落16.如段落15所述的变体，其中取代的数目是1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个取代。 [1629] 段落17.如段落15-16所述的变体，其中该变体包括选自以下各项的取代中的至少一个或多个：271Q、271A、271V、295W、60L、73A、77A、77V、和318Y。 [1630] 段落18.根据段落15-17中任一项所述的变体，其中该变体包括以下取代或取代的组合中的至少一个： [1631] F60L+S73A+T271Q； [1632] 271Q； [1633] 77V+271V+410A； [1634] 77A+271A； [1635] 271V+318Y； [1636] 295W； [1637] 271Q+295W；并且 [1638] 其中该变体具有葡糖淀粉酶活性,并且其中该变体与SEQ ID NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。 [1639] 段落19.根据段落15-18中任一项所述的变体，该变体相对于亲本具有改进的特性，其中当用于SSF时，这一改进的特性是增加的乙醇产量。 [1640] 段落20.根据段落18-19所述的变体，其中这些取代选自以下各项：F60L、S73A、T271A、T271V、T271Q、L77A、L77V、R410A、Y295W、和Q318Y。 [1641] 段落21.根据以上段落中任一段所述的变体，其中在位置95和121的氨基酸是脯氨酸。 [1642] 段落22.一种组合物，该组合物包括如段落1-21中任一项所述的多肽。 [1643] 段落23.根据段落22所述的组合物，进一步包括一种普鲁兰酶。 [1644] 段落24.根据段落23所述的组合物，其中该普鲁兰酶选自SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列一致性并且包括取代N368G+N393A+A492S,A的普鲁兰酶，使用SEQ ID NO:5进行编号。 [1645] 段落25.根据段落22或23所述的组合物，进一步包括α-淀粉酶，特别是真菌α-淀粉酶，更特别是来源于微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)或土曲霉(Aspergillus terreus)的α-淀粉酶，甚至更特别是选自披露为SEQ ID NO:4的α-淀粉酶的α-淀粉酶，优选地具有以下取代一中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:4进行编号)，并且其中该α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少75％一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％一致性。 [1646] 段落26.如段落1-21中任一段所述的多肽用于生产糖浆和/或发酵产物的用途。 [1647] 段落27.一种由含淀粉材料生产发酵产物，特别是乙醇的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化；(b)使液化的材料糖化；和(c)用发酵生物进行发酵；其中使用如段落1-21中任一段所述的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(b)。 [1648] 段落28.根据段落27所述的方法，其中步骤(b)和步骤(c)同时进行。 [1649] 段落29.一种由含淀粉材料生产糖浆产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化；(b)在如段落1-21中任一项所述的变体葡糖淀粉酶存在下，使液化的材料糖化。 [1650] 段落30.一种分离的多核苷酸，其编码如段落1-21中任一项所述的变体。 [1651] 段落31.一种包含如段落30所述的多核苷酸的核酸构建体。 [1652] 段落32.一种包含如段落30所述的多核苷酸的表达载体。 [1653] 段落33.一种包含如段落30所述的多核苷酸的宿主细胞。 [1654] 段落34.根据段落33所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母细胞，特别是酵母属，更特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。 [1655] 段落35.根据段落1-21中任一项所述的生产葡糖淀粉酶变体的一种方法，包括：在适于该变体表达的条件下培养段落33-34所述的宿主细胞；并任选地回收该变体葡糖淀粉酶。 [1657] 通过以下实例进一步对本发明进行进一步描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。 [1658] 实例 [1659] 材料与方法 [1660] 来自WO 2006/069289中披露的瓣环栓菌(Tc-AMG)、WO 2011/068803中披露的篱边粘褶菌(Gs-AMG)、WO 2011/066576中披露的血红密孔菌(Ps-AMG)的葡萄糖淀粉酶。 [1661] 普鲁兰酶测定 [1662] 普鲁兰酶活性(NPUN)测定 [1663] 相对于诺维信支链淀粉酶标准品测量NPUN中的内切-支链淀粉酶活性。一个支链淀粉酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7％红色支链淀粉(red pullulan)(麦格酶公司(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红色普鲁兰以NPUN/ml测量该活性。 [1664] 将1mL稀释的样品或标准品在40℃下孵育2分钟。添加0.5mL 2％红色普鲁兰、0.5M KCl、50mM柠檬酸，pH 5并混合。将这些管在40℃下孵育20分钟并且通过添加2.5ml 80％乙醇终止。将这些管在室温下静置10-60分钟，随后以4000rpm离心10分钟。然后在510nm处测量上清液OD并且使用标准品曲线计算活性。 [1665] 葡糖淀粉酶活性 [1666] 可以按单位AGU来测量葡糖淀粉酶活性。 [1667] 葡糖淀粉酶活性(AGU) [1668] 葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间：6分钟，如以下葡糖淀粉酶孵育中所说明的)每分钟水解1微摩尔麦芽糖由此产生葡萄糖的酶的量。 [1669]葡糖淀粉酶孵育 底物： 麦芽糖100mM 缓冲液： 乙酸盐0.1M pH： 4.30±0.05 孵育温度： 37℃±1 反应时间： 6分钟 酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL [1670] 通过3个反应步骤描述分析原理： [1671] 步骤1是一个酶反应： [1672] 葡糖淀粉酶(AMG)EC 3.2.1.3(外-α-1,4-葡聚糖-葡糖淀粉酶)水解麦芽糖以形成α-D-葡萄糖。孵育之后，用NaOH来停止该反应。 [1673] 步骤2和步骤3引起一个终点反应。 [1674] 在由己糖激酶催化的一个反应中，葡萄糖被ATP磷酸化。形成的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸。在这个相同的反应中，等摩尔量的NAD+被还原成NADH，导致在340nm处的吸光度增加。可以使用自动分析仪系统例如Konelab 30分析仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))。 [1675] [1676] [1677] 葡糖淀粉酶活性检验(龟甲万株式会社) [1678] 产品代码：60211 [1679] 测定原理： [1680] [1681] 底物4-硝基苯基-β-麦芽糖苷(G2-β-pNP)由葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶降解成4-硝基苯基-β-葡糖苷(G1-β-pNP)。G1-β-pNP进一步由这一试剂盒中的β-葡糖苷酶降解成4-硝基苯酚(pNP)。反应是在室温下于约pH 4下进行的。通过添加碳酸钠来停止该反应，并且同时，该溶液变为碱性pH以使pNP的吸光度最大。该葡萄糖形成活性是通过在400nm下对该pNP进行定量来测量。 [1682] 1)测量的反应显示出样品中葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的G2-β-pNP降解活性。这被认为是样品中的葡萄糖形成活性。 [1683] 2)该测试可以用于未透析的米曲提取物。 [1684] 3)这一检验不受样品中的α-淀粉酶影响。 [1685] 试剂盒组分 [1686]试剂 主要组分 量 底物溶液 G2-β-pNP 60ml 酶溶液 β-葡糖苷酶 60ml 终止溶液 碳酸钠 120ml [1687] 1)以1:1混合该试剂盒的“底物溶液”和“酶溶液”。 [1688] 2)吸取10μl纯化的具有约0.1AGUg/ml活性的葡糖淀粉酶变体样品(或作为空白的水)并转移至一个微量滴定板的孔中。(一式两份) [1689] 3)将60μl的该底物-酶混合物添加到该孔中。 [1690] 4)在32℃温度孵育20分钟。 [1691] 5)将120μl的该终止溶液添加到该孔中。 [1692] 6)读取OD400nm。#Net OD400＝OD400(样品)–OD400(空白) [1693] 1.空白：通常，该空白的吸光度小于0.200。 [1694] 2.特异性：反应不受葡萄糖(高达100g/l)或α-淀粉酶(725U/ml)的影响。 [1695] 3.可再现性：当对相同样品分析10次时，吸光度的CV小于1％。 [1696] 4.线性范围：最多1.6的净OD400应当与该酶浓度成比例。 [1697] 5.颜色稳定性：该吸光度在25℃下2小时不改变。 [1698] 热稳定性 [1699] 热稳定性确定为使用0.2AGU/ml样品在65℃热处理1小时后的残留活性。将六十微升稀释的样品在65℃下在PCR板中孵育1小时。通过龟甲万(Kikkoman)测量试剂盒测量热处理样品的AMG活性，并按下式计算残留活性： [1700] 热稳定性＝Vht/Vdw [1701] Vht；热处理样品的变体的δA400，来自不具有葡萄糖的底物 [1702] Vdw；Gt-AMG的δA400，来自不具有葡萄糖的底物 [1703] 葡萄糖抑制(GI) [1704] 葡萄糖抑制被确定为在葡萄糖存在下和葡萄糖不存在下(30％)，葡糖淀粉酶(AMG)活性的比率。将龟甲万(Kikkoman)测定试剂盒用于葡糖淀粉酶活性确定。将结果确定为与SEQ ID NO:2的亲本葡糖淀粉酶相比的相对值。更高的值对应于更低抑制。 [1705] 将十微升的3倍稀释的样品添加到190微升的底物(在该试剂盒中的底物溶液:在该试剂盒中的酶溶液:40％葡萄糖或DW＝1:1:6)，并且在37℃孵育该反应混合物。反应时间取决于底物,对于无葡萄糖的底物是30min，并且对于有葡萄糖的底物是2hr。然后将80微升的反应混合物与160微升的3％Na2CO3混合以终止反应，并且测量A400。 [1706] 按以下公式计算葡萄糖抑制值； [1707] 葡萄糖抑制＝(Vg/Vdw)/(WTg/WTdw)/2*0.5*100 [1708] Vg；变体的δA400，来自具有葡萄糖的底物 [1709] Vdw；变体的δA400，来自不具有葡萄糖的底物 [1710] WTg；Gt-AMG的δA400，来自具有葡萄糖的底物 [1711] Vdw；Gt-AMG的δA400，来自不具有葡萄糖的底物 [1712] 葡糖淀粉酶比活性(SA) [1713] 通过用如上所述的Konelab仪器确定的AGU测定来确定比活性。通过A280和理论上从蛋白质序列计算的理论消光系数1mg/ml计算蛋白质浓度。 [1714] 由AGU活性和蛋白质浓度确定比活性。 [1715] 异麦芽糖形成活性测定(IF) [1716] 如下测量在pH 4.3、37℃、24小时内、来自30％w/v葡萄糖的每AGU的葡糖淀粉酶的异麦芽糖形成活性： [1717] 用包含100mM乙酸钠、0.02％TritonX-100的pH 4.3的缓冲液将葡糖淀粉酶样品稀释至0.4AGU/ml。将一百微升的样品与100μL的包含60％w/v葡萄糖、100mM NaOAc的pH 4.3的葡萄糖溶液在0.2ml PCR管中混合。将该样品在37℃下孵育24h。孵育后，取100μL，并与200μL去离子水和300μL的作为内标的1mg/ml木糖溶液混合，并且然后通过添加大约50mg离子交换基质(安伯来特(Amberlite)，俄力冈(OREGANO)，美国)进行去离子。然后将250μL的溶液转移至1.5ml微量管中，并且与500μL的乙腈混合，并且然后在HPLC分析前通过0.2μm尼龙膜过滤器过滤。通过HPLC装备SZ5532柱(Shodex公司，日本)、用线性梯度洗脱(7分钟；从 70％:30％的乙腈:水开始；以60％:40％的乙腈:水结束)将形成的异麦芽糖与其他寡糖分离并通过Corona CAD检测器(赛墨(Thermo)，美国)定量，作为相对于木糖内标的相对峰面积。作为标准样品，以相同的方式，处理浓度为0.125至1mg/ml的异麦芽糖溶液 (Hayashibara公司，日本)。每个AGU针对JGA098(SEQ ID NO:2)的相对异麦芽糖形成活性示于表1和2中。 [1718] DE11活性测定(DE11) [1719] 葡糖淀粉酶在pH 4.3、60℃下在30％DS下对麦芽糖糊精DE11的活性测量如下： [1720] 将葡糖淀粉酶样品用0.02％TritonX-100溶液稀释至0.3AGU/ml。将五十微升稀释的样品与500μL的用50mM乙酸钠缓冲的33％麦芽糖糊精溶液混合，并且在60℃下孵育20min。通过添加200μL的1M Tris-HCl(pH 9.0)来终止反应。在冷却至环境温度后，将50μL样品的等分试样用去离子水稀释5倍，并且通过GOD-POD方法(临床化学学报(Clinica Chimica Acta)，1972，Vol.37，pp.538-540)对在此期间产生的葡萄糖进行定量，例如通过使用葡萄糖C2测试试剂盒溶液(Wako公司，日本)。针对JGA098(SEQ ID NO:2)的每AGU的相对葡萄糖形成活性示于表1和2中。 [1721] DNA操纵 [1722] 在大肠杆菌Dh5α细胞中构建并且扩增所有质粒。用于DNA操纵的限制性内切核酸酶可获得自新英格兰生物试验室公司(New England Biolabs,Inc.)并且根据说明书进行使用。将In-fusion(科隆达公司(Clontech))用于DNA的连接。用凯杰公司质粒试剂盒回收扩增的质粒。聚合酶链式反应(PCR)是用Prime star MaxDNA聚合酶(宝生物公司)进行的。QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)用于纯化从琼脂糖凝胶切割的DNA片段。所有DNA操纵基本上遵循由制造商的说明书和分子克隆实验指南(Molecular cloning:a laboratory manual)(第2版)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，描述于萨姆布鲁克(Sambrook)，弗里奇(Fritsch EF)，马尼亚蒂斯(Maniatis T)(1989)中。 [1723] 实例1：根据本发明所述的变体的构建 [1724] WO 2011/068803披露了分离自粘褶菌属真菌的葡糖淀粉酶。具体地，分离自篱边粘褶菌(Gs-AMG)和密粘褶菌(Gt-AMG)。将具有取代S95P+A121P并在此披露为SEQ ID NO:2的变体葡糖淀粉酶JGA098用作亲本葡糖淀粉酶。从JGA098开始，通过本领域的标准程序引入另外的取代并且构建下表中所示的所得变体。 [1725] [1726] 实例2：具有降低的葡萄糖抑制(GI)的根据本发明所述的葡糖淀粉酶变体 [1727] 将实例1中构建和示出的特定变体如WO 2011/068803中所述进行表达。表达后，根据上述测定部分中所述的热稳定性(T)、葡萄糖抑制(GI)、异麦芽糖形成(IF)、比活性(SA)和对DE11(DE11)的活性表征纯化的样品。与SEQ ID NO:2的亲本葡糖淀粉酶相比，表1中所示的变体都显示出降低的葡萄糖抑制。 [1728] 表1 [1729] [1730] 实例3：具有增加的比活性(SA)的根据本发明所述的葡糖淀粉酶变体 [1731] 将实例1中构建和示出的特定变体如WO 2011/068803中所述进行表达。表达后，根据上述测定部分中所述的热稳定性(T)、葡萄糖抑制(GI)、异麦芽糖形成(IF)、比活性(SA)和对DE11(DE11)的活性表征纯化的样品。与SEQ ID NO:2的亲本葡糖淀粉酶相比，表2中所示的变体都显示出增加的比活性。 [1732] 表2 [1733] [1734] [1735] 实例3：Gt-AMG变体在常规SSF方法中用于乙醇生产的应用 [1736] 通过5g小测定法评估所有处理。每次处理重复三次。将使用包括α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶的实验酶组合物液化的玉米醪用于测试，其中该α淀粉酶可以选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组： [1737] I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；或 [1738] I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；或 [1739] I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；或 [1740] I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3进行编号)； [1741] 该蛋白酶可以选自WO 2012/088303中的SEQ ID NO:13中披露的蛋白酶或WO 2011/072191中披露的具有以下突变的金黄色嗜热子囊菌金属蛋白酶的蛋白酶变体： [1742] D79L+S87P+A112P+D142L； [1743] D79L+S87P+D142L；或 [1744] A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L； [1745] 并且该葡糖淀粉酶选自WO 2013/036526中所述的草酸青霉的变体。 [1746] 将3ppm青霉素和1000ppm尿素补充到醪液中。用40％H2SO4将此浆料的pH调节至5.0，并测得醪液的总固体为28.4％。将大约5g的此浆料添加至15mL聚丙烯管中。通过钻1/ 32英寸的孔制备管，并且然后称量空管，之后添加玉米浆料。在添加醪液后再次称重管以测定每个管中醪液的精确重量。基于每个管中玉米浆的精确重量，给每个试管加入实际酶剂量。每种处理的酶剂量列于表3中，并且在本研究中测试的本发明的Gt-AMG变体列于表4中，并将野生型Ps-AMG(WO 2011/066576中作为SEQ ID NO:4披露的来自血红密孔菌的葡糖淀粉酶)、Gs-AMG(来自WO 2011/068803中作为SEQ ID NO:2披露的来自篱边粘褶菌的葡糖淀粉酶)、和Tc-AMG(WO 2006/069289中作为SEQ ID NO:2披露的来自瓣环栓菌的葡糖淀粉酶)用作对照。然后，向试管添加100μl酵母繁殖至约5g玉米醪，并且然后在用于SSF(同时糖化和发酵)的32℃的湿润的空气振荡器中孵育。在53小时发酵时取样用于HPLC分析。HPLC制备由以下组成：通过添加50微升的40％H2SO4来终止反应、离心，并且通过0.45微米过滤器过滤。将样品在4℃储存直至分析。使用与RI检测器偶联的AgilentTM 1100HPLC系统确定乙醇和寡糖浓度。该分离柱是来自BioRadTM的aminex HPX-87H离子排阻柱(300mm×7.8mm)。 [1747] 表3.用于每次处理的酶剂量 [1748] 处理 AMG，μg EP/gDS 1 AMG，40μg/g 40 2 AMG，55μg/g 55 3 AMG，70μg/g 70 [1749] 表4.在常规SSF中测试的Gt-AMG变体的列表。JGA098代表本研究中使用的亲本葡糖淀粉酶。其在此披露为SEQ ID NO:2。 [1750] 酶 1 JGA098 2 JGA245 3 JGA251 4 JGA255 5 JGA283 6 JGA287 7 JGA296 8 JGA310 [1751] 结果： [1752] 来自HPLC分析的结果总结在图1中。X轴上的酶剂量是AGU/gDS(DS＝干固体)，其由表3中的酶蛋白质剂量μg/gDS和每种AMG(葡糖淀粉酶)的比活性转换。结果示出，在研究中Gt-AMG变体JGA245、JGA251、JGA255、JGA283、JGA287、JGA296和JGA310均优于野生型AMG。 [1753] 实例4：JGA287的糖化测试 [1754] 将来自玉米淀粉液化的麦芽糊精粉末溶解于水中，同时加热使浆料淀粉浆料处于35.6％干固体。使用示出1.39503的折射指数度量来测量浆料的固体含量。使用1M盐酸溶液将浆料调节至pH为4.3。将该浆料的18g等分试样添加到具有隔膜帽闭合的玻璃反应闪烁管中，并且插入加热器中来将温度加热到61℃。每个管给出基于下表的酶剂量，并且将另外的水添加到各管中以达到33％的目标干固体。使用葡糖淀粉酶和普鲁兰酶进行糖化。普鲁兰酶Promozyme D2(可获得自诺维信公司)来源于脱支芽孢杆菌，并且在此披露为SEQ ID NO: 3。在不同时间点从各管中经由针通过隔膜取1.5mL样品，并且在105℃下失活5分钟。将1mL的各失活样品用4mL去离子水进行稀释。使用HPLC方法DP1-4评估稀释的样品，用于测量右旋糖纯度(％DP1或％DX)和％DP2。 [1755] 表5示出糖化72小时后用两种不同AMG处理的浆料的％DX和％DP2。使用来自三种处理的平均值和标准差。结果示出，在测试剂量下，JGA98和JGA287两者示出出类似的％DX值，这些值没有统计学上的显着差异。然而，当使用JGA287时，％DP2结果示出统计学上显着降低了0.09％产生的DP2。 [1756] 表5 [1757] [1758] 实例5：JGA252的糖化测试 [1759] 将来自玉米淀粉液化的麦芽糊精粉末溶解于水中，同时加热使浆料淀粉浆料处于36.5％干固体。使用示出1.39690的折射指数度量来测量浆料的固体含量。使用1M盐酸溶液将浆料调节至pH为4.3。将该浆料的18g等分试样添加到具有隔膜帽闭合的玻璃反应闪烁管中，并且插入加热器中来将温度加热到61℃。每个管给出基于下表的酶剂量，并且将另外的水添加到各管中以达到33％的目标干固体。在不同时间点从各管中经由针通过隔膜取 1.5mL样品，并且在105℃下失活5分钟。将1mL的各失活样品用4mL去离子水进行稀释。使用HPLC方法DP1-4评估稀释的样品，用于测量右旋糖纯度(％DP1或％DX)和％DP2。 [1760] 表6示出糖化72小时后用两种不同AMG处理的浆料的％DX和％DP2。使用来自三种处理的平均值和标准差。结果示出，在测试剂量下，两种JGA252示出统计学上显着高于JGA98的％DX值。当使用JGA252时，％DP2结果示出统计学上显着降低了的产生的DP2。 [1761] 表6 [1762] [1763] 实例6：JGA288的糖化测试 [1764] 将来自玉米淀粉液化的麦芽糊精粉末溶解于水中，同时加热使浆料淀粉浆料处于39.7％干固体。使用示出1.4035的折射指数度量来测量浆料的固体含量。使用1M盐酸溶液将浆料调节至pH为4.3。将该浆料的18g等分试样添加到具有隔膜帽闭合的玻璃反应闪烁管中，并且插入加热器中来将温度加热到61℃。每个管给出基于下表的酶剂量，并且将另外的水添加到各管中以达到33％的目标干固体。在不同时间点从各管中经由针通过隔膜取 1.5mL样品，并且在105℃下失活5分钟。将1mL的各失活样品用4mL去离子水进行稀释。使用HPLC方法DP1-4评估稀释的样品，用于测量右旋糖纯度(％DP1或％DX)。 [1765] 表7示出糖化期间用两种不同AMG处理的浆料的％DX。从三种处理获得的平均值。结果示出，JGA288示出出比JGA98更快的反应时间，因此在更短的时间内达到用于糖化的右旋糖纯度目标。 [1766] 表7 [1767] [1768] [1769] 实例7：JGA334的糖化测试 [1770] 将来自玉米淀粉液化的麦芽糊精粉末溶解于水中，同时加热使浆料淀粉浆料处于36.5％干固体。使用示出1.39999的折射指数度量来测量浆料的固体含量。使用1M盐酸溶液将浆料调节至pH为4.3。将该浆料的50克等分试样添加到具有隔膜帽闭合的玻璃反应小瓶中，并且插入水浴中来将温度加热到61℃。每个管给出基于下表的酶剂量，并且将另外的水添加到各管中以达到33％的目标干固体。在不同时间点从各管中经由针通过隔膜取1.5mL样品，并且在105℃下失活10分钟。将1mL的各失活样品用4mL去离子水进行稀释。使用HPLC方法DP1-4评估稀释的样品，用于测量右旋糖纯度(％DP1或％DX)。 [1771] 表8示出在糖化60小时后用两种不同AMG(葡糖淀粉酶)处理的浆料的％DX。使用来自两次重复的平均值和标准差。结果示出，JGA334示出比JGA98更快的反应时间，因此以更短的时间达到用于糖化的右旋糖纯度目标。同样在测试的剂量下，JGA334示出比JGA98统计学上不同的更高的％DX值。 [1772] 表8 [1773] [1774] [1775] 在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这样的修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。 |
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