黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一类毒性很强的真菌毒素，包括致毒基团相同、结构 类似的黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)、黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)黄曲 霉毒素G1(Aflatoxin G1，AFG1)等，它可以由有毒菌株黄曲霉和寄生曲霉，以及其他一些 霉菌(如温特曲霉)等所产生。黄曲霉毒素广泛存在于谷物、饲料、食品中，对人类的主要 危害是：(1)污染了AFT的食品在食用前如果未能去除AFT，将使进食者直接受害，或者， AFT通过污染的饲料经食物链使进食禽畜肉、奶制品等的人间接受害，直接或间接地引起 急性中毒或诱发人类的癌症；(2)禽畜摄入污染的饲料，轻则中毒，直接的后果是引起动物 体重下降或引发其他疾病，间接的后果是通过食物链引起人类的慢性中毒，诱发癌症，严重 的引起死亡；(3)污染AFT的粮食谷物不能食用或者饲用，因而报废。
由于黄曲霉毒素的危害性，AFT的解毒技术长期以来受到人们的重视，人们已经知道 了一些转化AFT的方法，如：(1)氨化法。该法用于含水饲料，因处理后食品中含大量的 氨，美国FDA规定此法不能用于食品加工，也因饲料中含有大量的氨而影响了使用。(2) NaOH法(用于植物油粗炼去AFT)。因设备投资大、油耗大、成本高，现已逐渐被淘汰。 (3)白土吸附法。因操作劳动强度大及白土尘埃和油耗以及对环境污染等问题，现已基本 被淘汰。(4)混合溶剂萃取法，该方法用于如花生粉，棉籽等固态食品的AFT去除，但在 萃取、溶剂回收和处理时花费昂贵，无推广应用价值。(5)高温法。该法是通过对被处理的 样品加热到268℃以上来破坏AFT，因该法通常的加热法较难达到此温度，而过高温度会 破坏食品中的其他营养成分，故实际应用很少。(6)生物学法。利用活菌或固定化菌分解 AFT，因活菌会分解原料的营养而且对分解后的新产物不清楚，对新产物的毒性情况不了解， 此方法只用于极少数的饲料和花生油的解毒。如：1996年广东微生物所报道用Aspergillus niger菌固态发酵后制备BDA生物制剂用于解毒。(7)紫外线照射法。利用紫外线的强氧 化作用来破坏AFT，效果不稳定，且能耗大。(8)超滤-渗滤法，这种方法只能用于非均相， 对于均相、酸化牛奶无效，更因工艺要求苛刻，设备十分昂贵，至今无实际应用价值。(9) 生物酶法，有学者报道(Brown DW，etc.Proc.Natl.Acad.Sc.USA.1996)在大肠杆菌中 克隆表达肝细胞色素氧化酶P450，以期通过增强黄曲霉毒素代谢的氧化酶用于对进入体内 的被活化的AFT的转化解毒，来达到降低进入体内的AFB1的目的。
上述处理方法中，由于使用物理化学的手段转化AFT的方法通常比较强烈，经处理后 的谷物、饲料、食品等其利用价值大大降低，而且效率也相对较低，从成本方面考虑并不是 工业应用的理想方法，另外，体内提高P450氧化酶的方法虽然能增强AFB1的代谢，但也 增强了AFB1的对人的危险性。而生物酶催化方法，由于其具有专一性更强、转化效率高的 特点，人们正在进行研究开发可以直接转化AFT的生物酶。

本发明的目的是提供一种具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶及编码该酶的基因。
为了得到这种酶，发明人从筛选得到的一株产酶菌中纯化出能转化AFB1的生物酶，并 在一种转化体中借助重组DNA技术生产了具有转化AFB1活性的蛋白。由此，发明人首先 分离并纯化出了具有该活性的新型蛋白，命名为黄曲霉毒素解毒酶(Aflatoxin-detofizyme， ADTZ)。
本发明通过纯化和测序获得黄曲霉毒素解毒酶(aflatoxin-detoxifizyme，ADTZ)的基 因特异性引物，从假蜜环菌(Armillariella tabescens)的总RNA出发，克隆得到编码ADTZ 的基因，该基因是从未报道过的新基因；并利用基因工程的方法，在毕赤酵母表达系统中表 达并纯化出重组ADTZ蛋白。所选择的真菌是Armillariella tabescens，采自中国普通微生 物菌种保蒇管理中心。
ADTZ的纯化：首先通过菌体破碎，硫酸铵沉淀法进行蛋白质沉淀，沉淀样品通过快速 蛋白质液相色谱层析得到目的峰。ADTZ短肽N末端氨基酸序列的获得：将目的峰进行质 谱分析获得短肽N末端氨基酸序列。
本发明对假蜜环菌的总RNA的进行提取。根据所获得的短肽N末端氨基酸序列设计引 物进行RT-PCR和SMART RACE，得到ADTZ基因的序列长约2.3kb，经分析序列含有完 整的开放阅读框，3’端和5’端的非翻译区。编码ADTZ成熟肽的全长cDNA 2088个核苷 酸碱基，编码695个氨基酸，分子量约为73～77kDa(SDS-PAGE电泳)，等电点pI在5.3～6.8 之间(等电聚焦电泳)。氨基酸及DNA序列如序列表所示。其修饰产物，例如部分氨基酸 发生去除、取代、修饰或加成后所产生的产物，也包括在本发明所述的蛋白范围之内。
本发明的另一目的是提供包含所述基因的表达载体，以及用所述的表达载体转化宿主细 胞所得的转化体。本发明进一步提供了一种制备黄曲霉毒素解毒酶的方法，包括以下步骤： 培养所述转化体，回收所表达的黄曲霉毒素解毒酶。
本发明通过设计一对引物，将编码ADTZ成熟肽的基因从假蜜环菌的cDNA中扩增出 来，克隆到真核整合型分泌表达载体，如：pHIL-S1上，构建成表达质粒pHIL-S1-ADTZ， 并将重组表达载体转化毕赤酵母GS115。此表达载体以AOX为启动子。通过对培养时间和 诱导时间的摸索，ADTZ的表达量占培养基总蛋白的25％以上，并且处于可溶状态。
本发明所用的真核表达载体还可选用胞内型载体：PAO815、PPIC3K、PPICZ、PHWO10、 PGAPZ，或者分泌型载体：PPIC9K、PPICZα、PGAPZα，或者市面上销售的同类载体。 所用的真核表达菌株也可以选用毕赤酵母菌KM71、MC100-3、SMD1168、SMD1165、 SMD1163等作为宿主细胞。
本发明也可用原核表达体系来实现，选用表达载体：pET、pUCH33等，或者市面上销 售的同类载体；选用原核表达菌株：大肠杆菌BL21、大肠杆菌JM109等作为宿主细胞。
表达载体的复制方法：参照Sambrook等的方法(Sambrook，et al.2002，Molecular cloning.Cold Spring Harbor Laboratory Press.USA)，按CaCl2法制备并转化感受态细胞 E.Coli.DH5α，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基培养细菌，碱法提取质粒。
本发明还摸索了重组ADTZ的纯化条件，发酵液经硫酸氨沉淀后采用疏水色谱层析和 金属亲和色谱层析两步纯化法得到重组ADTZ，重组蛋白纯度达95％以上。
本发明的另一目的是提供将所述的具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶在制备饲料或食 品中黄曲霉毒素除毒产品的应用。结合目前的饲料和食品的加工工艺，可将本发明所述的具 有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶，作为脱毒剂添加到饲料中进行饲料脱毒，或者制成固定化 酶用于如花生油的脱毒。
本发明的另一目的是提供将所述的具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶在制备预防和治 疗由黄曲霉毒素诱发的肿瘤的药物的应用。结合目前的抗肿瘤药物的制备工艺，可添加本发 明所述的具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶，得到用于预防和治疗由黄曲霉毒素诱发的肿瘤 的药物。
发明人首次分离和离析出了编码该蛋白的基因。另外，发明人还将所述基因整合到一种 表达载体中以产生一种转化体，并且借助于该转化体成功地实现了ADTZ蛋白的生产。通 过活性鉴定实验，证明重组ADTZ具有与天然ADTZ相似的转化AFB1的生物活性。通过重 组ADTZ对AFB1解毒生物学活性的鉴定实验，证明重组ADTZ能降低AFB1的致畸变作用， 具有抗AFB1引起突变的生物活性作用。本发明为今后在饲料加工、食品加工以及抗肿瘤药 物开发打下了良好的基础。
附图说明
图1为纯化的ADTZ PAGE电泳结果。M：是标准分子量蛋白；1、2：是BSA(小牛 血清白蛋白)；3：是硫酸氨沉淀的粗酶组分；4：是纯化的ADTZ。
图2为纯化的ADTZ转化AFB1作用的薄层色谱检测结果。1：是AFB1标准品；2、3： 是PBS缓冲液对照组；4：是灭活ADTZ处理AFB1对照组；5：ADTZ处理AFB1组；6： 是AFB1标准品。
图3为假蜜环菌总RNA电泳结果。
图4为RT-PCR产物电泳。M：为DNA Marker；E1：为RT-PCR产物。
图5为重组载体pTE1的酶切鉴定。M：DNA Marker；1：为Pte1/HindIII+EcoRI：2： 为pTE1/EcoRI；3：为pTE1/HindIII。
图6为3’RACE产物的电泳检测。M：为DNA Marker；E2：为3’RANCE产物。
图7为重组载体pTE2的酶切鉴定。M：为DNA Marker；1：为pTE2/HindIII+EcoRI； 2：为pTE2/EcoRI；3：为pTE2/HindIII。
图8为5’RACE产物的电泳检测。M：为DNA Marker；E3：为5’RACE产物。
图9为重组载体pTE3的酶切鉴定。M：为DNA Marker；1：为pTE3/HindIII+EcoRI； 2：为pTE3/EcoRI；3：为pTE3/HindIII。
图10为End to end PCR产物电泳检测。M：为DNA Marker；ADTZ’：为PCR产物。
图11为重组载体pSA的酶切鉴定。M：为DNA Marker；1：为pSA/BamHI+EcoRI；2： 为pSA/HindIII；3：为pSA/SacI。
图12为表达产物的SDS-PAGE分析结果。1：为诱导96小时的阴性对照菌；2：为标 准分子量蛋白；3：为BSA(小牛血清白蛋白)；4：为诱导24小时的重组菌；5：为诱导 48小时的重组菌；6：为诱导72小时的重组菌；7：为诱导96小时的重组菌。
图13为重组ADTZ转化AFB1活性TLC检测。1：为AFB1标准品对照；2：为重组ADTZ 处理AFB1组样品；3：为灭活的重组ADTZ处理AFB1组照样品。4：缓冲液对照。
图14为ADTZ重组子的构建及其与毕赤酵母菌同源重组的流程图。

实施例一、ADTZ的获得与纯化
一、菌体的发酵培养
1、菌种：Armillariella tabescens。
2、将上述菌种于液体培养基(马铃薯提取液1升、葡萄糖20.0克、KH2PO4 3.0克、 MgSO4·7H2O 1.5克、维生素微量，pH6.6)中培养共25天，一级至三级分别培养6天、4 天、4天，四级培养11天，培养温度为24-28℃，收集菌体。
二、黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)的提取
新鲜菌体液氮冰冻后敲成小块，1∶1(W/V)加入磷酸盐缓冲液，冰浴中匀浆，超声破碎细胞， 11000-12000g离心去沉淀物，以20-80％饱和的硫酸铵分级沉淀，取沉淀。以pH6.0，0.02mol/L磷 酸缓冲液溶解悬浮，定蛋白(Bradford法)，用AFB1 ELISA试剂盒检测蛋白组分的酶活力，得含黄 曲霉毒素解毒酶(ADTZ)酶液。
三、ADTZ的纯化
(一)酶样品的准备
粗酶液用40倍体积的磷酸缓冲液(pH6.0，0.02mol/L)透析脱盐，聚乙二醇-20000透析浓 缩，0.45μm微膜过滤，定蛋白(Bradford法)。
(二)快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化酶
根据文献(Ion Exchange Chromatography principles and methods.Pharmacia Co.Edited， Pharmacia Co.，1984，pp.29～31；和Chromatofocusing with PolybufferTM and PBETM，6. Experimental.Pharmacia Co.Edited，Pharmacia Co.，1984，pp.11～24)报道方法选择离子交换 色谱和等电聚焦色谱柱填料及缓冲液，按操作要求离子交换色谱以及聚焦色谱均在FPLC System(Pharmacia Biotech Co.美国)上进行。具体做法如下：
1.阴离子交换色谱
(1)试剂
pH6.0，0.2mol/L磷酸盐储存缓冲液。
A液：pH6.0，0.02mol/L的磷酸缓冲液。
B液：pH6.0，0.02mol/L+1N NaCl的磷酸缓冲液。
(2)柱子的准备
DEAE-Sephadex 50ml，以2倍体积磷酸盐缓冲液充分搅拌洗涤后，静置20分钟，以 微型真空泵抽去上清，同样操作，反复洗涤，再以同样条件反复洗涤5次，以0.6ml/min的流速装柱。 柱规格：20×30cm.
以A液平衡该柱至基线稳定在零附近。酶样品20ml(含蛋白2mg/ml)，上预柱，过 DEAE-Sephadex离子交换柱。氯化钠梯度洗脱：以A液洗脱2小时，A液及0-80％的B液洗 脱5小时，100％B液洗脱2小时。流速：0.6ml/min。以分部收集器收集。紫外O.D.280nm监测。 聚乙二醇-20000透析浓缩，脱盐后，定蛋白(Bradford法)，分别测定各蛋白组分转化AFB1活性， 收取活性组分。重复以上操作，收集活性组分。
2.聚焦层析
(1)试剂
洗脱液：PolybufferTM 74(Pharmacia Co.产品)，250ml装。取100ml加纯水稀释至 1000ml，4℃保存备用。
起始缓冲液：pH7.4，0.025mol/L咪唑-HCl缓冲液。
(2)柱子
Mono-pTM PBE 94，5×20cm预装柱(Pharmacia Co.产品)。
经上述离子交换色谱纯化后的酶液6mL(含蛋白3mg/mL)，以Polybuffer 74平衡该酶液(平 衡后为6.5ml)。以起始缓冲液平衡Mono-p柱2小时，以Polybuffer 74洗脱液过柱，上2ml酶液 样品，以Polybuffer 74洗脱液洗脱10小时。流速：0.2ml/min。紫外O.D.280nm监测并记录色谱 图，以分部收集器接收，设定2ml/管，即10分钟/管。定蛋白(Bradford法)，分别测定各蛋白 组分转化AFB1活性。收集活性组分。
以0.1mol/L盐酸洗柱子至AU值回零，再以1mol/L NaCl洗柱子至AU值回零，以起始缓冲 液平衡柱子过夜。同上条件重复聚焦色谱操作，收集活性组分。
3、用ELISA法检测活性组分
将收集到的各组分分别处理AFB1，用ELISA检测处理后样品中AFB1的量，用100℃ 煮沸10分钟的相同组分作对照，能使AFB1减少的组分为活性的组分。具体做法如下：
(1)样品的制备
灭活酶液组：AFB1 200ul(浓度2.5ng/ml甲醇)+灭活酶液200ul(1.2mg/ml)
活性酶液组：AFB1 200ul(浓度2.5ng/ml甲醇)+活性酶液200ul(1.2mg/ml)
质控组：AFB1 200ul(浓度2.5ng/ml甲醇)+缓冲液200ul(1.2mg/ml)
灭活酶液的制备：组分在100℃煮沸10分钟。
混匀，30℃反应30min，100℃煮沸15min，3000g离心5min去沉淀，制备好样品后 按ELISA试剂盒(AgraQuantTM Total Aflatoxin Assay 4/40，ROMER公司产品，美国) 操作说明书操作，由标准曲线计算处理后产物中含有的AFB1。检测收集的各组分，能使样 品中AFB1减少的组分为有活性的组分。检测结果：有活性组分的活性酶液处理的样品中 AFB1为1.230±0.508ng/ml，有活性组分的灭活性酶液处理的样品中AFB1为2.436±0.326 ng/ml，质控组为2.508±0.203ng/ml。
活性峰在非还原性条件下进行电泳(PAGE)表明它为单一谱带。结果如图1。
所得蛋白经SDS-PAGE电泳分析：分子量约为73～76kDa；等电聚焦电泳分析：等电 点pl约为5.3～6.8。
实施例二：纯化的ADTZ活性鉴定
一、ADTZ转化AFB1活性的鉴定
依据中国预防医学科学院标准处(食品卫生国家标准汇编 中国预防医学科学院标准处 编，北京，中国标准出版社，1998年版，pp410～415)和翟永信(薄层色谱在食品分析中 的应用，翟永信、陆冰真编，北京大学出版社，1991年版，pp118～123)报道的方法，用 薄层色谱法对由ADTZ处理的AFB1进行检测，鉴定纯化到的ADTZ活性。具体做法如下：
1、实验组：
取1支1.5ml的离心管，加入1μL AFB1溶液(AFB1甲醇溶液：0.5μg/μL，黄曲霉 毒素B1，Alexis Biochemicals Inc.，Switzerland)，氮气挥干。分别加入ADTZ酶液(蛋 白含量：0.1mg/mL)300μL、MgSO4 0.5μL、PEG200 10μL，充分混匀。30℃水浴，反 应1小时，以后每小时向各加入0.5μL AFB1溶液，直至管内AFB1总量为2μg。加毕后， 再继续反应2小时。
2、对照组：
取1支1.5ml的离心管，标记对照组1：加入1μL AFB1溶液，氮气挥干，分别加入 300μL酶液(预先以100℃水浴5分钟灭活)、MgSO4 0.5μL、PEG200 10μL，充分混匀。 另取1支1.5ml的离心管，标记对照组2：加入1μL AFB1溶液，氮气挥干，分别加入PBS 缓冲液(0.1M pH：6.6)300μL、MgSO4 0.5μL、PEG200 10μL，充分混匀。后续操作与 实验组相同。
以上实验组和对照组用反应后，各加入2倍体积的氯仿进行萃取2次，于45℃，氮气 下挥干萃取物，加入1ml的甲醇充分溶解萃取物，得实验组样品(活性酶组)、对照组1 (灭活酶组)和对照组2(缓冲液对照组)。
3、薄层色谱(TLC)检测反应产物
取新活化(100℃ 2小时)的预制硅胶薄层板(10×10cm，60，Whatman，USA)， 在薄层板上点样：点距边缘1cm，点间距1cm。从左到右：第1点：10μL 25μg/ml的AFB1 氯仿溶液；第2、3点：各为10μL对照组2；第4点：10μL 2号对照组1；第5点：10μL 实验组；第6点：10μL 25μg/ml的AFB1氯仿溶液。
展开：在展开槽内加10ml无水乙醚展开，取出挥干。
观察：在365nm波长紫外光下观察荧光，拍照，结果如图2所示。
结果显示：AFB1标准品(1、6)以及酶的灭活对照(4)和PBS缓冲液对照(2、3)， 乙醚展开时都只发生微小的迁移，而用ADTZ处理后的AFB1产物Rf值则接近1(＝0.95)， 表明解毒处理后的AFB1其极性显著减小，与AFB1明显不同，说明纯化得到的ADTZ具有 转化AFB1的活性。
二、ADTZ对AFB1解毒生物学活性的鉴定
微生物回复突变实验(Ames实验)参照中华人民共和国卫生部药政局颁布的方法[中 华人民共和国卫生部药政局编，新药(西药)临床研究指导汇编(药学、药理学、毒理学)， 1993年7月]进行。具体做法如下：
1.测试菌株
为组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株TAg8(引自卫生部药品生物制品检定所)，-85 ℃(零下85℃)低温冰箱保存，测试前对采用的菌株进行基因型鉴定及自发回变数测定， 生物学鉴定合格，符合实验要求。
2.肝S9的制备
(1)SD大鼠诱导：SD大鼠检疫一周确定无病，用多氯联苯混悬于玉米油，腹腔注 射(500mg/kg体重)，5天后处死，处死前12小时禁食。
(2)S9组分的制备：经上述诱导的SD大鼠断头放血，无菌下取肝，称重，肝脏用 冷0.15mol/L(下同)KCl漂洗。以1g肝脏加3ml的比例在均浆器中均浆，每份组织的 均浆时间保持一致。将均浆液在0℃，经9000g离心20分钟，取上清液，经证明无菌后， 存-85℃冰箱备用。
3.S9混合液的制备
将下列A、B、C液和S9组分混合，保存4℃下4小时内使用。
A液：(0.2mol/L辅酶II，过滤灭菌)0.2ml。
B液：(0.2mol/L 6-磷酸葡萄糖过滤灭菌)0.25ml。
C液：8.55ml。
C液组成(0.4mol/L MgCl2，20ml 1.65mol/L KCl 20ml，0.2mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4)500ml，蒸馏水315ml，混和后过滤灭菌)。
S9组分：1.00ml。
4.受试样品的制备
在反应体系为30ml的系统中，ADTZ浓度为0.2mg/ml，AFB1的浓度为0.2μg/ml，pH 值6.0，于28℃下反应120min，体系放大10倍。反应后，以等体积氯仿萃取黄曲霉毒素 B1后产物及未反应的残留底物3次，合并有机相，40℃减压挥干氯仿，分别以3.75和3ml DMSO洗出提取物(活性酶处理反应组)；以预先用氯仿灭活的ADTZ代替活性ADTZ，在 同条件下处理黄曲霉毒素B1(灭活酶处理对照组)；以缓冲液代替活性ADTZ酶液，在同条 件下处理黄曲霉毒素B1(缓冲液处理对照组)。以上样品均在-15℃下保存备用。
5.回复突变实验
将受试样品的DMSO溶液与培养过夜的菌液及S9一起加入上层软琼脂培养基中，混匀， 在40℃下倒在底层Vogel选择培养基上，待凝固后于37℃温箱中培养72小时，计算每 个培养皿出现的回复突变菌落数。
每批测试时每组提取液及阴阳性对照均设3个平皿，并重复1次，各组提取液结果为2 次6组平均值。实验结果以回复菌落数、突变率(MR＝样品回变菌落数/阴性对照回变菌 落数)和抑制率(％)[＝{1-(被试物回变菌落数-阴性对照组回变菌落数)/(AFB1对 照组回变菌落数-阴性对照组回变菌落数)}×100％]表示。
6.结果评价标准
若溶剂对照组在正常范围内，受检物在3个浓度以上有阳性剂量反应，最大增加值为 溶剂对照值的两倍(即MR≥2)，可考虑为致突变阳性。
7.结果：
活性ADTZ处理反应组的细菌回复突变菌落数与阴性对照组(DMSO对照组)相近(MR 值均小于2)。缓冲液处理对照组和灭活ADTZ处理对照组的细菌回复突变菌落数明显高于 阴性对照组(MR值均大于2)，与阳性对照(黄曲霉毒素B1对照)的细菌回复突变数无显 著性差异。表明活性ADTZ处理反应组受试物无诱发基因突变作用。说明ADTZ具有抗AFB1 引起突变的生物活性作用。结果如下表。
       黄曲霉毒素B1经酶处理后的细菌突变回复试验     测试样品 回复突变数/平板   MR 抑制率(％)     PBS-对照组     378±77   13.09     ～     灭活酶处理组     359±59   12.86     ～     酶处理组     31±12   1.11     99.16     AFB1对照组     385±97   13.75     ～     DMSO对照组     28±5   ～     ～
上表说明：诱变实验以含有大鼠肝S-9混合物的Salmonella typhimuriurmn TA98为供 试菌进行。用于诱变实验的AFB1对照组的浓度为0.8μg/50μl DMSO/平板。而AFB1酶处理 后的样品每板也以相当于同样量的AFB1进行实验，并保持同样量的DMSO。平板培养28hr 后，计数，结果以四个平板的平均值±SD表示。
实施例三  ADTZ短肽氨基酸序列的获得
收集实施例一纯化所得的活性组分的峰尖，或将活性组分用PAGE电泳收集目的带， 采用Q-TOF2(电喷雾—四极杆飞行时间—串联质谱)仪(英国Micromass公司，由军事 医学科学院仪器测试分析中心提供)进行ADTZ短肽N末端的氨基酸序列检测。所测得的 氨基酸序列如下：
M1：EAWEGFTALVDK  M2：NKLLQDANGELENLYVR
本发明的ADTZ短肽氨基酸序列不限于上述所列，它还包含其他短肽氨基酸顺序片段， 只要该片段是用MALDI-MS-TOF或其他化学方法等检测ADTZ而获得。
实施例四：产酶菌总RNA的提取
将产酶菌菌体组织放入预冷过的研钵中，加入液氮研磨，至样品为粉末状，取100mg 左右样品转至1.5ml离心管中，加入1ml的Trizol，振荡混匀，室温静置5分钟，加入200μl 氯仿，振荡混匀2分钟，冰浴5分钟，2-8℃，12000×g，离心15min，转移上清至另一 1.5ml离心管。加入500μl预冷的异丙醇，冰浴静置20min，2-8℃，12000×g，离心10min， 弃上清，加入1ml预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁，2-8℃，7500×g，离心5min， 弃上清，空气干燥5-10min，加入50μl DEPC无菌水，至完全溶解，进行紫外分析及电泳 检测(1.1％Agarose/EB 100V 20min)，样品保存于-80℃。结果如图3所示，从电泳检测 结果中可看到28s rRNA和18s sRNA两条特征谱带条带清晰，亮度比接近2∶1，说明总 RNA没有降解。
实施例五、ADTZ基因特异性引物的获得：
从实施例三所得到的ADTZ短肽氨基酸序列设计2对引物(P1、P2和G1、G2)。参 照QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(QIAGEN Inc.美国)手册进行RT-PCR以获得ADTZ 基因部分序列的产物。切胶回收RT-PCR产物，并按常规方法进行TA克隆，用HindIII和 EcoRI酶切鉴定TA克隆的重组质粒，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。将重组质粒进行 测序，得到ADTZ基因的cDNA片段E1。具体做法如下：
引物对1                          引物对2
P1：5’-TGGGARGGNTTYACNGC-3’    G1：5’-CARGAYGCNAAYGGNGA-3’
P2：5’-TCNCCRTTNGCRTCYTG-3’    G2：5’-GCNGTRAANCCYTCCCA-3’
本发明扩增ADTZ基因特异性引物的引物对不限于以上的P1与P2，G1与G2，它还 包含其他的引物对，只要该引物对是由上方法获得的ADTZ短肽氨基酸序列所设计。
(一)RT-PCR的步骤
1、将模板总RNA(由实施例四获得)于75℃变性5min，迅速插入冰中冷却，
2、准备Master Mix(80μl总体系)
42μl     RNase-free Water
16μl     5×QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer
3.2μl    dNTP Mix (10mM)
3.2μl    QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix
64.4μl
抽吸混匀，短暂离心；
3、按照下表所示顺序添加各组分至0.5ml无菌离心管中(单位：μl)     组分  1(样品1)  2(-control)  3(样品2)   4(-control)     RNA     Primer P1     Primer P2     Primer G1     Primer G2     Water     Master Mix     总体积     1.3     1.3     1.3     -     -     -     16.1     20     -     1.3     1.3     -     -     1.3     16.1     20     -     -     -     1.3     1.3     -     16.1     20     -     -     -     1.3     1.3     1.3     16.1     20
4、PCR循环程序：
·Reverse transcription：          50℃  30min
·Initial PCR activation step：    50℃  15min
·3-step cycling
                    ·15 cycles：  94℃  40sec
                                   65℃  1min  (-1℃/cycle)
                                   72℃  1min
                    ·25 cycles：  94℃  40sec
                                   50℃  1min
                                   72℃  1min
·Final extension：                70℃  10min
5、循环结束后取5μl样品电泳检测。
(二)切胶回收RT-PCR产物
1.配制的TAE电泳缓冲液，并配制0.8％琼脂糖凝胶；
2.将50μl的RT-PCR产物与10×loading buffer按比例混合，上样；
3.100V，电泳20min；
4.电泳结束后，在紫外灯下观察条带位置，切下目的带，转移至一个新的灭菌的1.5ml 的离心管中；
5.加入800μlBuffer NT1；
6.漩涡振荡NucleoTrap Suspension，使小珠完全悬浮后，取10μl加入离心管中；
7.将离心管在50℃水浴6min，期间每隔2min短暂漩涡振荡；
8.室温下，10000×g，离心30s，弃上清；
9.加入500μl Buffer NT2，短暂漩涡振荡，室温下，10000×g，离心30s，弃上清。 重复此步骤一次。
10.加入500μl Buffer NT3，短暂漩涡振荡，室温下，10000×g，离心30s，弃上清。 重复此步骤一次。
11.再次10000×g，离心30s，弃上清，空气中干燥10-15min；
12.加入30μlTE Buffer(pH8.0)，重悬沉淀。回收的片段命名为“E1”。RT-PCR产物 的电泳检测。结果如图4所示，显示引物对P1和P2的反应结果中获得一个条带， 条带位置约于800bp左右，命名为E1片段。
(三)TA克隆与测序
1  连接
在1.5ml新的灭菌的离心管中加入下列成份：
1μl    pUCm-T载体
3μl    E1片断(RT-PCR回收产物)
1μl    10×buffer
1μl    T4 DNA连接酶
加4μl的无菌水补充总体积至10μl；
抽吸混匀，短暂离心，22℃水浴4h以上。
2  CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞
挑取DH5α单克隆于2mlLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。从活化的新鲜DH5 α菌液中取50μl接种于5mlLB液体培养基中，37℃振荡培养1.5-2h，冰浴30min， 将菌液转移至无菌离心管中，5000rpm，离心5min，弃上清，取1.5ml冰浴的无菌CaCl2 加入离心管，悬浮菌体，冰浴10min，5000rpm，离心5min，弃上清；加入200μl冰 浴的无菌CaCl2加入离心管，悬浮菌体，保存于4℃下备用。
3  转化DH5α感受态细胞
取感受态细胞200μl加入含10μl连接物的离心管中，混匀，冰浴30min；42℃水浴 90s；立即冰浴3-5min；加入800μl LB液体培养基，37℃温育40-60min；将一转化的 感受态细胞涂布于含有Amp及IPTG/X-gal的LB固体培养基上，每个90mm平板涂布 200μl，37℃振荡培养12-16h。
4  碱提质粒DNA
挑取转化的单菌落，接种到2ml的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃剧烈振荡 培养过夜。取1.5ml菌液于微量离心管中，12000rpm离心2min，弃上清；取400μl STE 溶液洗菌体，漩涡振荡混匀，12000rpm离心2min，弃上清；加入100μl预冷溶液I 于沉淀菌体中，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液II，立即快速颠倒混匀， 冰浴3min；加入150μl预冷溶液III，反复颠倒混匀，冰浴5min；12000rpm离心5min， 上清移至另一管中；加入等体积酚仿，颠倒混匀，12000rpm离心5min；小心吸取上清 转移至另一管中；加入两倍体积的预冷无水乙醇，颠倒混匀，室温静置40-60min； 12000rpm离心10min，弃上清；加入200μl 70％乙醇，漂洗沉淀，12000rpm离心1min， 弃上清；打开管盖空气中干燥5-10min，加入30μl无DNA酶的RNA酶的TE溶解沉 淀，37℃温育1h。贮存于-20℃。
5  酶切鉴定重组质粒pTE1
用HindIII和EcoRI酶切鉴定TA克隆的重组子，如下表：(单位：μl)     编号 Buffer M  Buffer H  HindIII   EcoRI   pTE1   H2O  1(20μl体系)  2(20μl体系)  3(20μl体系)     2     -     2     -     2     -     1     -     1     1     1     -     10     10     10     6     6     6
37℃酶切4h以上。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，结果如图5，重组载体pTE1 的酶切鉴定，HindIII+EcoRI双酶切(1号样品)和HindIII单酶切(3号样品)均切下400bp 多的条带，且前者的亮度比后者高，EcoRI单酶切将重组子切成线性(2号样品)，表明E1 片断中央位置存在一个HindIII酶切位点。
6  测序
重组质粒PEG纯化法(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)提取质粒DNA。以T7和SP6为测序引物，采用ABI377 DNA Sequencer DNA自动序列仪(由上海博雅公司提供)，正反向进行测定，得到E1片段核酸 序列。测序结果：序列包含引物P1和P2序列，在中间位置出有一个aagctt的HindIII酶切 位点。
实施例六：编码ADTZ全长cDNA序列的获得
根据实施例五已获得的ADTZ基因部分序列E1片段设计引物：
S1(5’-TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA-3’)、
S3(5’-GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT-3’)
分别作为3’RACE和5’RACE的引物，按SMARTTM RACE cDNA amplification Kit (COLONTECH Laboratories，Inc.Cat.No.K1811-2)手册进行3’RACE和5’RACE。 切胶回收RACE产物，并按常规方法进行TA克隆，用HindIII和EcoRI酶切鉴定TA克隆 的重组子，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。将重组质粒送交测序公司进行测序，得到 两个片断E2、E3，利用NCBI的VecScreen(BLASTN2.2.5)程序(http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen.html)识别去除载体序列，用DNAMAN程序(美国 Lynnon BioSoft公司的软件)将E1、E2、E3拼接，将得到的序列用NCBI的ORF Finder 程序(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)进行开放阅读框分析，得到了编码ADTZ 成熟肽的ADTZ基因的全长cDNA序列。具体如下：
引物S1：5’-TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA-3’
引物S3：5’-GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT-3’
一、3’RACE
(一)3’RACE-Ready cDNA的制备：
1.将模板总RNA于75℃变性5min，迅速插入冰中冷却；
2.在一个0.5ml灭菌离心管中加入以下试剂：
1μl    变性的模板总RNA
1μl    3’-CDS Primer A
加3μl的无RNA酶的无菌水补充体积到5μl；
3.抽吸混匀，并短暂离心使混合液位于管底；
4.70℃，温浴2min；
5.冰浴2min，稍稍离心后加入下列试剂：
2μl     5×First-Strand Buffer
1μl     DTT(20mM)
1μl     dNTP Mix(10mM)
1μl     PowerScript Reverse Transcriptase
10μl    总体积
6.轻轻抽吸混匀试剂并稍稍离心；
7.温箱中42℃温浴1.5h；
8.用100μlTricine-EDTA buffer稀释产物；
9.72℃温育7min；
10.样品存于-20℃。
(二)3’RACE的步骤
1.准备Master Mix(100μl总体系)
69μl    PCR-Grade Water
10μl    10×Advantage 2 PCR Buffer
2μl     dNTP Mix(10mM)
2μl     50×Advantage 2 Polymerase Mix
83μl
抽吸混匀，短暂离心；
2.按照下表所示顺序添加各组分至0.5ml无菌离心管中(单位：μl)     组分   1(样品)   2(-control)     3(-control)  3’-RACE-Ready cDNA  UPM(10×)  Primer S1(10μm)  H2O  Master mix  总体积     2.5     5     1     41.5     50     1.5     3     -     0.6     24.9     30     1     -     0.4     2     16.6     20
3.PCR循环程序：
·5 cycles：    94℃  5sec
                72℃  3min
·5 cycles：    94℃  5sec
                70℃  10sec
                72℃  3min
·35 cycles：   94℃  5sec
                68℃  10sec
                72℃  3min
4.循环结束后取5μl样品电泳检测，结果如图6所示，显示3’RACE获得一个一条 带的产物，产物带位于分子量约800bp处，命名为E2片段。
(三)切胶回收3’RACE产物，TA克隆，CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞，转 化DH5α感受态细胞，碱提质粒DNA(实验操作同前面实施例五的内容)。
(四)酶切鉴定重组质粒pTE2
用HindIII和EcoRI酶切鉴定TA克隆的重组子，如下表：(单位：μl)     编号 Buffer M  Buffer H   HindIII   EcoRI    pTE2   H2O  1(20μl体系)  2(20μl体系)  3(20μl体系)     2     -     2     -     2     -     1     -     1     1     1     -     10     10     10     6     6     6
37℃酶切4h以上。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，结果如图7所示，重组载体pTE2 的酶切鉴定，HindIII+EcoRI双酶切(1号样品)切下两条带分别位于600bp和300-400bp 左右，HindIII单酶切(3号样品)切下一条带约300-400bp，EcoRI单酶切将重组载体切成 线性(2号样品)，E2片断中存在一个HindIII酶切位点，位置约靠近片断的某一侧。
(五)测序：重组质粒PEG纯化法(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)提取质粒DNA。以T7和SP6为测序引物，采用ABI377 DNA Sequencer DNA自动序列仪(由上海博雅公司提供)，正反向进行测定，得到2段核 酸序列。得到的E2序列，在偏3’位置存在一个AAGCTT的HindIII酶切位点。
二、5’RACE
(一)5’RACE-Ready cDNA的制备
1.取出模板总RNA于75℃变性5min，迅速插入冰中冷却；
2.在一个0.5ml灭菌离心管中加入以下试剂：
1μl    变性的模板总RNA
1μl    5’-CDS Primer A
1μl    SMART IIA Oligonucleotide
加2μl的无RNA酶的无菌水补充体积到5μl；
2.抽吸混匀，并短暂离心使混合液位于管底；
3.70℃，、温浴2min；
4.冰浴2min，稍稍离心后加入下列试剂：
2μl    5×First-Strand Buffer
1μl    DTT(20mM)
1μl    dNTP Mix(10mM)
1μl    PowerScript Reverse Transcriptase
10μl   总体积
5.轻轻抽吸混匀试剂并稍稍离心；
6.温箱中42℃温浴1.5h；
7.用100μlTricine-EDTA buffer稀释产物；
8.72℃温育7min；
9.样品存于-20℃。
(二)5’RACE步骤
1.准备Master Mix(110μl总体系)
75.9μl    PCR-Grade Water
11μl      10×Advantage 2 PCR Buffer
2.2μl     dNTP Mix(10mM)
2.2μl     50×Advantage 2 Polymerase Mix
91.3μl
抽吸混匀，短暂离心；
2.按照下表所示顺序添加各组分至0.5ml无菌离心管中(单位：μl)     组分 1(样品)  2(+control)   3(-control)   4(-control) 5’-RACE-Ready cDNA     2.5     1     1     1
    UPM(10×)     Primer S1(10μm)     Primer S3(10μm)     H2O     Master mix     总体积     5     -     1     -     41.5     50     -     0.4     0.4     1.6     16.6     20     2     -     -     0.4     16.6     20     -     -     0.4     2     16.6     20
3.PCR循环程序：
·              94℃  1min
·5 cycles：    94℃  30sec
                72℃  4min
·5 cycles：    94℃  30sec
                70℃  4min
·25 cycles：   94℃  30sec
                68℃  4min
·              72℃  10min
4.循环结束后取5μl样品电泳检测，得到5’RACE产物E3。结果如图8所示，显示 5’RACE获得一个单条带的产物，条带位置约于1400-1800bp左右，命名为E3片段。
(三)切胶回收5’RACE产物，TA克隆，CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞， 转化DH5α感受态细胞，碱提质粒DNA(实验操作同实施例五的内容)。
(四)酶切鉴定重组质粒pTE3
用HindIII和EcoRI酶切鉴定TA克隆的重组子，如下表：(单位：μl)     编号 Buffer M  Buffer H  HindIII   EcoRI   pTE3   H2O  1(20μl体系)  2(20μl体系)  3(20μl体系)     2     -     2     -     2     -     1     -     1     1     1     -     10     10     10     6     6     6
37℃酶切4h以上。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，结果如图9所示，重组载体 pTE3的酶切鉴定，HindIII+EcoRI双酶切(1号样品)出现两条带分别位于1400-1000bp 和300-400bp左右，HindIII单酶切(3号样品)出现一条带约1400-1000bp，E3片断中能 存在一个HindIII酶切位点。
(五)测序
挑取重组质粒PEG纯化法(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)提取质粒DNA。以T7和SP6为测序引物，采用ABI377 DNA Sequencer DNA自动序列仪(由上海博雅公司提供)，正反向进行测定，得到E3片段 核酸序列。得到的E3片段，在偏向5’位置存在一个HindIII酶切位点，在3’末端存在一 个HindIII酶切位点。
三、ADTZ cDNA序列的拼接
利用NCBI的Vecscreen程序识别去除载体序列，用DNAMAN程序将E1、E2、E3 拼接，将得到的序列用NCBI的ORF Finder程序进行开放阅读框分析，得到序列长度为 2.3kb，含有完整开放阅读框，有3’末端的poly(A)尾巴，并包含5’端和3’端的非翻 译区。结果见图序列SEQ ID NO2。将ADTZ核苷酸序列和推测的氨基酸序列通过因特网 进行BLASTA序列相似性查询，程序BLAST和BLASTX(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/)，结果表明ADTZ为一全新的基因，由其推算出的编码ADTZ的成熟肽氨基酸序 列在GENEBANK中找不到相同的序列，为一全新的氨基酸序列。
编码ADTZ全长cDNA序列的获得不限于用实施例六所述的方法，用ADTZ短肽氨基 酸序列设计探针从Armillariella tabescens的cDNA文库中克隆该序列也包含在内。
实施例七：编码ADTZ成熟肽cDNA产物的获得
分析实施例六所得编码ADTZ全长cDNA序列的两端序列，设计了一对引物：
P3：5’-GTC GAATTCATGGCCACCACAACTGTC-3’
P4：3’-GTAACTCTCTGCTAACACT CCTAGGGAC-5’
以获得从起始密码子开始到终止密码子的ADTZ开放阅读框序列，并在引物上分别添加限 制酶切位点EcoRI( GAATTC)和BamHI( GGATCC)。按常规方法进行PCR扩增，切胶 回收PCR产物。具体如下：
1.准备Master Mix(100μl总体系)
69μl    PCR-Grade Water
10μl    10×Advantage 2 PCR Buffer
2μl     dNTP Mix(10mM)
2μl     50×Advantage 2 Polymerase Mix
83μl
抽吸混匀，短暂离心；
2.按照下表所示顺序添加各组分至0.5ml无菌离心管中(单位：μl)     组分   1(样品)     2(-control)     3(-control)   5’-RACE-Ready cDNA   Primer P3(10μm)   Primer P4(10μm)   H2O   Master mix   总体积     2.5     1     1     4     41.5     50     -     0.6     0.6     3.9     24.9     30     1     -     -     2.4     16.6     20
3.PCR循环程序：
·              94℃  1min
·5 cycles：    94℃  30sec
                72℃  4min
·5 cycles：    94℃  30sec
                70℃  4min
·35 cycles：   94℃  30sec
                68℃  4min
·              72℃  10min
4.循环结束后取5μl样品电泳检测，结果如图10所示，显示PCR获得一个一条带的 产物，条带位置约于1800bp左右，命名为ADTZ’片段。
5.切胶回收PCR产物
按常规的PCR产物回收方法进行。得到含编码ADTZ成熟肽的cDNA，此片断命名为 “ADTZ’”。
实施例八：重组质粒ADTZ表达质粒的构建
基因克隆按常规方法(Sambrook，et al.2001，Molecular Cloning A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)进行，将实施例七所得的ADTZ’克 隆到pHIL-S1构建成表达质粒pHIL-S1-ADTZ，克隆后的目的基因经酶切、测序鉴定。
具体做法：如图14所示，含基因ADTZ的重组质粒pHIL-S1的构建过程为： EcoRI+BamHI双酶切质粒pHIL-S1和目的片断ADTZ，酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电 泳，并切胶回收。利用T4 DNA连接酶进行质粒pHIL-S1和目的基因ADTZ的连接。CaCl2 法制备E.coli DH5α感受态细胞，转化DH5α感受态细胞，筛选转化子，碱提质粒。用 EcoRI+BamHI、HindIII、Sacl酶切鉴定重组质粒pHIL-S1-ADTZ。挑取重组质粒PEG纯 化法(Sambrook，et al.2001，Molecular Cloning A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)提取质粒DNA。以T7和SP6为测序引物，采用ABI377 DNA Sequencer DNA自动序列仪(由上海博雅公司提供)，正反向进行测定。酶切结果如 图11所示，重组载体pSA的酶切鉴定，BamHI、EcoRI双酶切(样品1)切下一条带位于 2000bp左右，HindIII单酶切(样品2)切下三条带分别约在1400bp，600bp和500bp，SacI 单酶切(样品3)将重组质粒切成线性，说明插入片段中没有SacI酶切位点。。
实施例九：重组ADTZ的表达
用Sacl酶切重组质粒pHIL-S1-ADTZ和质粒pHIL-S1，酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶 电泳，切胶回收酶切后的线性重组质粒pHIL-S1-ADTZ和质粒pHIL-S1。按Pichia Expression Kit(Invitrogen Inc.，美国)手册中的原生质法转化毕赤酵母菌GS115，筛选 Mut+转化子。利用甲醇作为唯一碳源对重组菌进行诱导表达(按Pichia Expression Kit手册 操作)中，培养液经SDS-PAGE电泳分析表明，转化子经诱导表达后，培养液上清出现明 显的目的蛋白带，而转化不含目的基因的空质粒的对照菌在相同的条件下诱导96小时，在 上清中未检测到目的蛋白条带。结果如图12所示，转化子经甲醇诱导表达后，培养液上清 出现明显的目的蛋白带；而转化不含目的基因的空质粒的阴性对照菌，在相同的条件下诱导 在上清中无目的蛋白出现。
具体做法如下：
一、重组子与毕赤酵母的同源重组
(一)线性化质粒
Sacl酶切重组质粒pSA和质粒pHIL-S1，同时线性化质粒pHIL-S1是作为下面实验的 control。
酶切pSA(120总体系)：12μl Buffer L+8μl Sacl+100μl pSA
酶切pHIL-S1(120总体系)：12μl Buffer L+8μl Sacl+100μl pHIL-S1 0.8％琼脂糖凝胶电泳酶切样品，切胶回收酶切后的线性重组质粒pSA和质粒pHIL-S1。
(二)培养用于原生质化的毕赤酵母菌GS115
1.从平板上挑取一个GS115单克隆接种于10mlYPD中，在150ml锥形瓶中，30℃， 250-300rpm振荡培养过夜；
2.从昨日培养的的10mlYPD菌液中分别取5，10，20μl接种于200mlYPD中，在 500ml的锥形瓶中，250-300rpm振荡培养过夜；
3.检测3个瓶中菌液的OD600值，取OD600＝0.2-0.3的菌液转入离心管中，室温1500 ×g离心5min，弃上清，收集的细胞用于原生质化。
(三)毕赤酵母菌GS115的原生质化
1.培养收集的细胞重悬于200ml的无菌水中，转移至两个无菌的10ml离心管中；
2.室温下，1500×g离心5min，弃上清；
3.用10ml新鲜配制的SED洗沉淀，室温下，1500×g离心5min，弃上清；
4.用10ml 1M山梨醇洗沉淀，室温下，1500×g离心5min，弃上清；
5.用10mlSCE重悬沉淀；
6.取一管Zymolyase冻融后轻弹管壁，使溶液混匀；
7.取7.5μl Zymolyase加入管中，30℃温育30min；
8.室温下750×g离心10min，收集菌体，弃上清；
9.用10ml 1M山梨醇洗原生质体，轻轻敲打管壁分散沉淀，室温下750×g离心10min， 收集菌体，弃上清；
10.用10ml CaS洗菌体，室温下750×g离心10min，收集菌体，弃上清；
11将沉淀重悬于0.6ml CaS中，此原生质体在30min内必须使用。
(四)原生质法转化毕赤酵母菌GS115
1.分别取100μl毕赤酵母原生质体加入A、B、C 3个无菌15ml离心管中；
2.A管中不加DNA作为阴性对照，B管中加入30μl线性化的原质粒pHIL-S1，C管中加 入30μl线性化的重组质粒pSA，室温下温育10min，期间准备一支3ml新鲜配制的 PEG/CaT；
3.各管中加入1ml新鲜配制的PEG/CaT，轻轻混匀，室温下温育10min；
4.室温下750×g离心10分钟，弃上清，控干；
5.将沉淀重悬于150μl SOS中，室温温育20min；
6.各管加入850μl 1M山梨醇，准备铺板；
7.涂布RD固体培养基，每板涂布200μl，28-30℃温育倒置培养，转化子约在4-6天出现。
(五)筛选Mut+转化子
1.用无菌牙签挑取His+转化子，分别在MM和MD板上一一对应点菌，同时点上 GS115/His+MutsAlbumin和GS115/His+Mut+β-gal作为对照。
2.28-30℃温育倒置培养2天；
3.两天后，观察对照MM和MD板，若在两板上均生长良好为Mut+，若在MD上生长 良好，在MM板上生长少或不生长则为Muts。
(六)重组菌的诱导表达
1.挑取一个His+Mut+转化子的单克隆，接种于25mlBMG，在250ml的锥形瓶中，28-30 ℃，250-300rpm振荡培养，直至OD600＝2-6(约16-18h)；
2.1500-3000×g离心5min收集细胞，弃上清，重悬细胞于BMM中至OD600为1.0(约 需100-200mlBMM)，在1升的锥形瓶中，28-30℃，250-300rpm继续振荡培养。
3.每24h加100％甲醇，始终浓度至0.5％，保持诱导表达；
4.诱导表达96h的时间。培养液离心2-3min，留取上清放入-80℃保存以用于纯化表达 产物。
经诱导96小时培养上清中总蛋白量达0.23mg/ml。目的蛋白的分子量与用BioEdit软 件(http：//www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)预测的理论值76.95kDa相符。
实施例十：重组ADTZ的纯化
诱导表达的发酵液经70％饱和(NH4)2SO4沉淀，收取沉淀获得粗酶样品。粗酶样品 以等体积的PBS溶解，离心后取上清上疏水色谱层析Phenyl sepharose柱，以连续梯度的 洗脱缓冲液洗脱，收集目的峰。透析脱盐，PBS溶液平衡后浓缩。浓缩酶液上金属螯合亲 和色谱层析Chelating Sepharose柱pH7.5～6.0的连续pH梯度缓冲液进行洗脱，收集目的 峰。具体如下：
1、硫酸氨沉淀收集粗酶
重组表达发酵液加入(NH4)2SO4粉末至40％饱和度，4℃，10000g离心20分钟， 上清继续再加入(NH4)2SO4粉末至70％饱和度。4℃，10000g离心20分钟。即获得粗 酶样品。
2、疏水层析：ADTZ粗酶样品以等体积的0.02M PBS(pH：6.0)液溶解，4000g 4 ℃离心10分钟，取上清，上Phenyl sepharose柱[Phenyl sepharose 6 Fast flow(high sub)， Pharmacia Biotech，Inc]，溶液液(0.02M PBS+30％饱和硫酸铵，pH：6.0)洗至基线， 然后以连续梯度的洗脱缓冲液[A液(0.02M PBS+10％饱和硫酸铵，pH：6.0)+B液(0.02M PBS，pH：6.0)]洗脱，收活性峰。透析脱盐，并以F液(0.02M PBS+0.5M NaCl，pH： 7.5)平衡，浓缩至蛋白浓度约为1mg/ml。
3、金属螯合层析：Chelating Sepharose[Chelating Sepharose Fast Flow，Pharmacia Biotech，Inc]预先以0.2M CuCl2溶液饱和，以纯水洗柱至基线，再用F液(0.02M PBS+0.5M NaCl，pH：7.5)洗至基线稳定。将经过疏水层析后的目的峰样品上样，分别以不连续pH 梯度缓冲液G液[0.02M PBS+0.5M NaCl，pH7.5～6.0的不连续pH梯度缓冲液(依次增加 0.5个pH单位)]进行洗脱，收集目的峰。目的峰用SDS-PAGE电泳鉴定。
结果：诱导表达后的1升发酵液，经以上的纯化后可获得58mg纯化的重组ADTZ。 纯度达到95％以上。
实施例十一：重组ADTZ活性的鉴定
重组ADTZ活性的鉴定按参照实施例二之一方法进行。反应体系：(1)活性酶组：1μL AFB1溶液(AFB1甲醇溶液：0.5μg/μL，氮气挥干)+重组表达ADTZ酶液(蛋白含量： 0.1mg/mL)300μL+0.5μL MgSO4+10μL PEG200；(2)灭活酶组：1μL AFB1溶液 (AFB1甲醇溶液：0.5μg/μL，氮气挥干)+灭活的重组表达ADTZ酶液(蛋白含量：0.1mg/mL， 预先以100℃水浴5分钟)300μL+0.5μL MgSO4+10μL PEG200；(3)缓冲液对照组： 1μL AFB1溶液(AFB1甲醇溶液：0.5μg/μL，氮气挥干)+PBS缓冲液(0.1M pH：6.6)300 μL+0.5μL MgSO4+10μL PEG200；反应体系充分混匀，30℃水浴，反应1小时，以后 每小时向各加入0.5μL AFB1溶液，直至管内AFB1总量为2μg。加毕后，再继续反应6小 时。反应结束后按实施例二之一方法操作点板展开检测。
结果显示：用重组ADTZ处理后的AFB1产物则Rf值接近1(＝0.93)，与天然ADTZ 的结果相似，表明重组ADTZ具有转化AFB1的活性。结果如图13所示，表明用重组ADTZ 处理后的AFB1产物则Rf值接近1(＝0.93)，与天然的ADTZ相似，表明重组的ADTZ有 转化AFB1的活性。
实施例十二  重组ADTZ对AFB1解毒生物学活性的鉴定
重组ADTZ活性的鉴定按参照实施例二之二方法进行。受试样品的制备将天然的ADTZ 替换为重组表达的ADTZ，其余的分组设计和做法同样。结果：活性重组ADTZ处理反应组 的细菌回复突变菌落数与阴性对照组(DMSO对照组)相近(MR值均小于2)。缓冲液处 理对照组和灭活重组ADTZ处理对照组的细菌回复突变菌落数明显高于阴性对照组(MR值 均大于2)，与阳性对照(黄曲霉毒素B1对照)的细菌回复突变数无显著性差异。说明重组 ADTZ具有抗AFB1引起突变的生物活性作用。结果如下表。
       黄曲霉毒素B1经重组表达酶处理后的细菌突变回复试验     测试样品  回复突变数/平板    MR   抑制率(％)     PBS-对照组     379±57   12.03     ～     灭活重组酶处理组     353±63   11.66     ～     重组酶处理组     30±01   1.01     98.06     AFB1对照组     383±65   12.35     ～     DMSO对照组     26±8   ～     ～
                            序列表
<110>暨南大学
<120>一种具有转化黄曲霉毒素活性的解毒酶及编码该酶的基因
<140>
<141>2004-08-17
<160>2
<170>Patentln version 3.2
<210>1
<211>695
<212>PRT
<213>假蜜环菌(Armillariella tabescens)
<400>1
Met Ala Thr Thr Thr Val His Arg Glu Arg Phe Leu Ala Asp Lys Ser
1               5                   10                  15
Ala Pro Leu Cys Gly Met Asp Ile Arg Lys Ser Phe Asp Gln Leu Ser
            20                  25                  30
Ser Lys Glu Lys Leu Tyr Thr His Tyr Val Thr Glu Ala Ser Trp Ala
        35                  40                  45
Gly Ala Arg Ile Ile Gln Ala Gln Trp Thr Pro Gln Ala Thr Asp Leu
    50                  55                  60
Tyr Asp Leu Leu Ile Leu Thr Phe Ser Val Asn Gly Lys Leu Ala Asp
65                  70                  75                  80
Leu Asn Ala Leu Lys Thr Ser Ser Gly Leu Ser Glu Asp Asp Trp Glu
                85                  90                  95
Ala Leu Ile Gln Tyr Thr Val Gln Val Leu Ser Asn Leu Val Asn Tyr
            100                 105                 110
Lys Thr Phe Gly Phe Thr Lys Ile Ile Pro Arg Val Asp Ala Glu Lys
        115                 120                 125
Phe Glu Ser Val Val Lys Ala Ser Ser Asn Ala Asp Gln Gly Ser Ala
    130                 135                 140
Leu Phe Thr Lys Leu Lys Gln His Ile Tyr Ala Leu Ser Pro Glu Ser
145                 150                 155                 160
Ala Leu Phe Ile Gly Lys Arg Lys Asp Gly His Val Ser Asn Tyr Tyr
                165                 170                 175
Leu Gly Glu Pro Val Gly Asp Ala Glu Val Asp Ala Ile Gln Asn Val
            180                 185                 190
Ala Glu Lys Leu Gly Val Asp Ile Leu Asn Thr Arg Val Lys Lys Asn
        195                 200                 205
Gly Ala Gly Asp Tyr Thr Leu Leu Val Ala Ser Ala Lys Thr Ser Pro
    210                 215                 220
Pro Ser Val His Asp Phe Gln Ile Asp Ser Thr Pro Ala Lys Leu Thr
225                 230                 235                 240
Ile Glu Tyr Gly Asp Tyr Ala Ser Ser Leu Thr Lys Val Val Ala Ala
                245                 250                 255
Leu Gln Glu Ala Lys Gln Tyr Thr Ala Asn Asp His Gln Ser Ala Met
            260                 265                 270
Ile Glu Gly Tyr Val Lys Ser Phe Asn Ser Gly Ser Ile Pro Glu His
        275                 280                 285
Lys Ala Ala Ser Thr Glu Trp Val Lys Asp Ile Gly Pro Val Val Glu
    290                 295                 300
Ser Tyr Ile Gly Phe Val Glu Thr Tyr Val Asp Pro Tyr Gly Gly Arg
305                 310                 315                 320
Ala Glu Trp Glu Gly Phe Thr Ala Ile Val Asp Lys Gln Leu Ser Ala
                325                 330                 335
Lys Tyr Glu Ala Leu Val Asn Gly Ala Pro Lys Leu Ile Lys Ser Leu
            340                 345                 350
Pro Trp Gly Thr Asp Phe Glu Val Asp Val Phe Arg Lys Pro Asp Phe
        355                 360                 365
Thr Ala Leu Glu Val Val Ser Phe Ala Thr Gly Gly Ile Pro Ala Gly
    370                 375                 380
Ile Asn Ile Pro Asn Tyr Tyr Glu Val Arg Glu Ser Thr Gly Phe Lys
385                 390                 395                 400
Asn Val Ser Leu Ala Asn Ile Leu Ala Ala Lys Val Pro Asn Glu Glu
                405                 410                 415
Leu Thr Phe Ile His Pro Asp Asp Val Glu Leu Tyr Asn Ala Trp Asp
            420                 425                 430
Ser Arg Ala Phe Glu Leu Gln Val Ala Asn His Glu Leu Leu Gly His
        435                 440                 445
Gly Ser Gly Lys Leu Phe Gln Glu Gly Ala Asp Gly Lys Leu Asn Phe
    450                 455                 460
Asp Pro Glu Lys Val Ile Asn Pro Leu Thr Gly Lys Pro Ile Thr Ser
465                 470                 475                 480
Trp Tyr Lys Pro Gly Gln Thr Pro Asp Ser Val Leu Gly Glu Val Ser
                485                 490                 495
Ser Ser Met Glu Glu Cys Arg Ala Glu Thr Val Ala Leu Tyr Leu Val
            500                 505                 510
Ser Asn Leu Asp Ile Leu Lys Ile Phe Asn Tyr Val Asp Lys Gln Asp
        515                 520                 525
Ile Glu Asp Ile Gln Tyr Ile Thr Phe Leu Leu Met Ala Arg Ala Gly
    530                 535                 540
Leu Arg Ala Leu Glu Phe Tyr Asp Pro Ala Thr Lys Lys His Gly Gln
545                 550                 555                 560
Ala His Met Gln Ala Arg Met Gly Ile Thr Gln Tyr Leu Ile Gln Ala
                565                 570                 575
Gly Ile Ala Arg Leu Glu Leu Ile Gln Asp Ala Asn Gly Glu Leu Glu
            580                 585                 590
Asn Leu Tyr Val Arg Val Asp Arg Glu Lys Val Leu Ser Lys Gly Lys
        595                 600                 605
Glu Val Val Gly Gln Leu Leu Ile Glu Leu Gln Val Arg Lys Ser Thr
    610                 615                 620
Ala Asp Gly Thr Gly Ser Arg Asp Phe Tyr Thr Thr Leu Thr Glu Pro
625                 630                 635                 640
Ile Ser Gly Trp Glu Gly Lys Ile Arg Asp Ile Val Leu Lys Lys Lys
                645                 650                 655
Leu Pro Arg Lys Ile Phe Val Gln Pro Asn Thr Phe Val Val Asn Gly
            660                 665                 670
Glu Val Gln Leu Lys Glu Tyr Pro Leu Thr Ala Ala Gly Val Ile Glu
        675                 680                 685
Ser Phe Ile Glu Arg Arg Leu
    690                 695
<210>2
<211>2321
<212>DNA
<213>假蜜环菌(Armillariella tabescens)
<220>
<221>CDS
<222>(92)...(2179)
<400>2
acgcggggaa tcttatcctc aatcttatcg ccagccagtc acatctcttc ctttctcgag               60
aactcgtcac ctgaatacct accgcagaga a atg gcc acc aca act gtc cac cgg gag cga      121
                                   Met Ala Thr Thr Thr Val His Arg Glu Arg
                                   1               5                   10
ttc ctg gca gat aag tct gct cct ttg tgt ggt atg gat att aga aag tca ttt gat     178
Phe Leu Ala Asp Lys Ser Ala Pro Leu Cys Gly Met Asp Ile Arg Lys Ser Phe Asp
                15                  20                  25
cag ctc agc tct aag gaa aag ctc tac acg cat tac gtg acc gaa gct tct tgg gcg ggc 238
Gln Leu Ser Ser Lys Glu Lys Leu Tyr Thr His Tyr Val Thr Glu Ala Ser Trp Ala Gly
30                  35                  40                  45
gca aga atc atc cag gct cag tgg acc ccg cag gcg aca gat cta tat gat ctg ttg atc 298
Ala Arg Ile Ile Gln Ala Gln Trp Thr Pro Gln Ala Thr Asp Leu Tyr Asp Leu Leu Ile
50                  55                  60                  65
ctt acg ttc agc gta aat gga aag ctc gcc gac ctg aat gcc ctt aag acg tcg tca ggc 358
Leu Thr Phe Ser Val Asn Gly Lys Leu Ala Asp Leu Asn Ala Leu Lys Thr Ser Ser Gly
70                  75                  80                  85
ctt tca gag gac gat tgg gag gcc ttg ata cag tac acg gtc cag gta ttg agc aat ctt 418
Leu Ser Glu Asp Asp Trp Glu Ala Leu Ile Gln Tyr Thr Val Gln Val Leu Ser Asn Leu
90                  95                  100                 105
gtc aac tac aag acg ttc gga ttt acg aag atc att ccc cgc gtc gac gca gaa aag ttt 478
Val Asn Tyr Lys Thr Phe Gly Phe Thr Lys Ile Ile Pro Arg Val Asp Ala Glu Lys Phe
110                 115                 120                 125
gag tca gtg gtc aaa gcc tct agc aac gca gac cag ggc tcg gca cta ttc acc aag ttg 538
Glu Ser Val Val Lys Ala Ser Ser Asn Ala Asp Gln Gly Ser Ala Leu Phe Thr Lys Leu
130                 135                 140                 145
aaa caa cac ata tat gcg ctt tct cct gag tca gcg cta ttc att ggc aaa agg aag gac 598
Lys Gln His Ile Tyr Ala Leu Ser Pro Glu Ser Ala Leu Phe Ile Gly Lys Arg Lys Asp
150                 155                 160                 165
ggt cac gta tca aat tac tat ctt ggt gaa cct gtt gga gat gct gag gtc gat gct atc 658
Gly His Val Ser Asn Tyr Tyr Leu Gly Glu Pro Val Gly Asp Ala Glu Val Asp Ala Ile
170                 175                 180                 185
cag aat gtc gct gag aag tta ggc gtt gat atc ctc aat act cgc gtg aag aag aat gga 718
Gln Asn Val Ala Glu Lys Leu Gly Val Asp Ile Leu Asn Thr Arg Val Lys Lys Asn Gly
190                 195                 200                 205
gcg ggt gat cac acg ctc tta gtt gcc tct gct aaa acc agt cca ccc tcc gtg cat gac 778
Ala Gly Asp Tyr Thr Leu Leu Val Ala Ser Ala Lys Thr Ser Pro Pro Ser Val His Asp
210                 215                 220                 225
ttc caa atc gac tca act ccg gct aaa ttg acg att gag tat ggc gac tac gcg tca tct 838
Phe Gln Ile Asp Ser Thr Pro Ala Lys Leu Thr Ile Glu Tyr Gly Asp Tyr Ala Ser Ser
230                 235                 240                 245
cta acg aag gtt gtc gcc gcc ctt cag gag gcc aaa cag tat acc gcg aac gat cat caa 898
Leu Thr Lys Val Val Ala Ala Leu Gln Glu Ala Lys Gln Tyr Thr Ala Asn Asp His Gln
250                 255                 260                 265
tca gcg atg atc gaa ggc tat gtc aag tcg ttc aac tca gga tca att ccg gaa cac aaa 958
Ser Ala Met Ile Glu Gly Tyr Val Lys Ser Phe Asn Ser Gly Ser Ile Pro Glu His Lys
270                 275                 280                 285
gct gcg tca aca gaa tgg gtg aaa gat att gga ccg gtt gta gag tcc tac atc ggg ttc 1018
Ala Ala Ser Thr Glu Trp Val Lys Asp Ile Gly Pro Val Val Glu Ser Tyr Ile Gly Phe
290                 295                 300                 305
gtc gaa acc tat gtc gac cca tat ggc gga cgc gcg gaa tgg gag ggt ttc act gcc atc 1078
Val Glu Thr Tyr Val Asp Pro Tyr Gly Gly Arg Ala Glu Trp Glu Gly Phe Thr Ala Ile
310                 315                 320                 325
gtc gac aag cag ctg agt gcg aag tac gaa gca ttg gtt aac ggt gct cct aag ttg atc 1138
Val Asp Lys Gln Leu Ser Ala Lys Tyr Glu Ala Leu Val Asn Gly Ala Pro Lys Leu Ile
330                 335                 340                 345
aag agt ctt ccg tgg gga acg gac ttc gag gtt gtc gtc ttc agg aag ccg gac ttt act 1198
Lys Ser Leu Pro Trp Gly Thr Asp Phe Glu Val Asp Val Phe Arg Lys Pro Asp Phe Thr
350                 355                 360                 365
gcg ttg gaa gtc gta tca ttt gca aca gga ggt att cct gcc gga atc aat ata cca aac 1258
Ala Leu Glu Val Val Ser Phe Ala Thr Gly Gly Ile Pro Ala Gly Ile Asn Ile Pro Asn
370                 375                 380                 385
tat tat gaa gtc cgg gaa agc aca ggg ttt aag aat gtt tcg cta gcg aat att ttg gcg 1318
Tyr Tyr Glu Val Arg Glu Ser Thr Gly Phe Lys Asn Val Ser Leu Ala Asn Ile Leu Ala
390                 395                 400                 405
gcc aag gca cca aac gag gag tta act ttc atc cat cct gat gac gta gaa cta tat aac 1378
Ala Lys Val Pro Asn Glu Glu Leu Thr Phe Ile His Pro Asp Asp Val Glu Leu Tyr Asn
410                 415                 420                 425
gct tgg gat agt cgc gcg ttt gaa ctt cag gtg gcc aac cac gaa ctt ttg ggt cat ggc 1438
Ala Trp Asp Ser Arg Ala Phe Glu Leu Gln Val Ala Asn His Glu Leu Leu Gly His Gly
430                 435                 440                 445
tcc ggc aag ctt ttc caa gaa ggt gct gat ggg aaa ctg aac ttc gat ccc gaa aag gtc 1498
Ser Gly Lys Leu Phe Gln Glu Gly Ala Asp Gly Lys Leu Asn Phe Asp Pro Glu Lys Val
450                 455                 460                 465
ata aac cct ctg act gga aag ccg ata act tca tgg tat aag cca ggg caa acg ccg gat 1558
Ile Asn Pro Leu Thr Gly Lys Pro Ile Thr Ser Trp Tyr Lys Pro Gly Gln Thr Pro Asp
470                 475                 480                 485
tct gtt tta ggc gaa gtg tcg tcg tca atg gaa gaa tgt cgg gcg gag acc gta gcg ctc 1618
Ser Val Leu Gly Glu Val Ser Ser Ser Met Glu Glu Cys Arg Ala Glu Thr Val Ala Leu
490                 495                 500                 505
tac ttg gtt agc aac ctc gat att ctt aaa att ttc aat tac gtc gac aag caa gac att 1678
Tyr Leu Val Ser Asn Leu Asp Ile Leu Lys Ile Phe Asn Tyr Val Asp Lys Gln Asp Ile
510                 515                 520                 525
gaa gat atc cag tac atc acg ttc ttg ctt atg gcc cgc gct ggt ctg cgg gca cta gag 1738
Glu Asp Ile Gln Tyr Ile Thr Phe Leu Leu Met Ala Arg Ala Gly Leu Arg Ala Leu Glu
530                 535                 540                 545
ttt tat gat cca gcc acc aag aag cac gga cag gca cat atg cag gcc aga atg ggc ata 1798
Phe Tyr Asp Pro Ala Thr Lys Lys His Gly Gln Ala His Met Gln Ala Arg Met Gly Ile
550                 555                 560                 565
acc cag tac ctg att caa gct ggg att gcg aga ctt gaa ttg atc cag gat gcc aac ggc 1858
Thr Gln Tyr Leu Ile Gln Ala Gly Ile Ala Arg Leu Glu Leu Ile Gln Asp Ala Asn Gly
570                 575                 580                 585
gaa ctc gaa aac tta tac gtt cgg gtt gac cgg gag aaa gtg ttg tcc aaa gga aag gag 1918
Glu Leu Glu Asn Leu Tyr Val Arg Val Asp Arg Glu Lys Val Leu Ser Lys Gly Lys Glu
590                 595                 600                 605
gtt gtt ggt caa ttg ctg atc gaa ctc caa gtc cgg aaa agt acc gca gac ggc acc ggc 1978
Val Val Gly Gln Leu Leu Ile Glu Leu Gln Val Arg Lys Ser Thr Ala Asp Gly Thr Gly
610                 615                 620                 625
tcc cga gat ttc tac aca acg ctg acc gaa cca atc tct gga tgg gag ggc aag atc cga 2038
Ser Arg Asp Phe Tyr Thr Thr Leu Thr Glu Pro Ile Ser Gly Trp Glu Gly Lys Ile Arg
630                 635                 640                 645
gac atc gtt ttg aag aag aag ctt cct cga aaa atc ttt gtc caa ccc aat aca ttt gtc 2098
Asp Ile Val Leu Lys Lys Lys Leu Pro Arg Lys Ile Phe Val Gln Pro Asn Thr Phe Val
650                 655                 660                 665
gtc aac ggc gaa gtc cag ctc aaa gag tat cct ttg acg gct gcc ggg gta att gaa agt 2158
Val Asn Gly Glu Val Gln Leu Lys Glu Tyr Pro Leu Thr Ala Ala Gly Val Ile Glu Ser
670                 675                 680                 685
ttc att gag aga cga ttg tga t gtcagagcca attgacaaac tgaattgatg aatgatgtag       2220
Phe Ile Glu Arg Arg Leu  *
690                 695
taaatgacgt gatcgtagct gataagataa gatgtattca aataacaatt ctacccaaat               2280
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