非晶形硅酸盐和硅氧烷经硅酸盐蛋白媒介的合成及其用途

1.现有技术

硅是地壳中第二大元素(地壳的80％以上由硅酸盐组成)并以不同类型的 化合物存在。硅化合物不仅是种类最丰富的矿物，而且在经济方面也是特别重 要的。它们应用于广阔领域中且以不同的形式使用。玻璃、瓷器、搪瓷、陶器、 水泥和水玻璃是工业上重要的、由硅酸盐组成的材料。一些硅酸盐的催化性能 被综合利用。当其它元素特别是铝占据一些本来由硅占领的晶格位点时还可以 扩展其多方面的应用。属于这种铝硅酸盐的，例如有长石和沸石；后者的意义 特别在于其分子筛性能和离子交换剂性能。铝或钙硅酸盐作为填料在漆、橡胶、 塑料和造纸工业中获得重要意义，镁硅酸盐(石灰)作为吸收剂和填料在化妆 品和药物中，以及碱金属-铝-硅酸盐作为磷酸盐的替代物在洗涤剂中具有意义。 同样硅酸盐在波特兰水泥的凝固中扮演着重要角色。因为某些硅酸盐在其表面 具有游离的OH-基团(类似于硅醇)，那里可以结合反应性基团；在固相技术中 可以利用此性能进行固定。

1.1.二氧化硅

二氧化硅(SiO2)是具有高熔点的固体，其不但以结晶的形式而且以非晶 形存在。在所有这些外观形状中，每个硅原子被四个氧原子以四面体状围绕着 (配位数：4)。结晶的二氧化硅具有不同的变型(石英、鳞石英、方石英等)。 晶体二氧化硅最常见的形式是石英。非晶形二氧化硅矿物包括有玛瑙、蛋白石 和燧石。通过石英熔融和该熔体缓慢冷却获得的石英玻璃不再具有晶面。其用 于例如制备石英灯(由于其对紫外线照射的通透性)和耐热装置。硅藻(硅藻 门)的外壳也由非晶形二氧化硅组成。

1.2.硅酸和硅酸盐

同样，在硅酸和硅酸盐中硅的配位数也是4。四面体结构的[SiO4]4--离子易 于通过SiO4-单元的结合进行聚合反应。在此每二个Si-原子经O-原子相互连接。

在此通过脱水(缩合)由原硅酸首先形成原二硅酸(焦硅酸；H6Si2O7)。经 焦硅酸的进一步缩合形成偏硅酸[(H2SiO3)n]。在此当SiO4-单元数目较少时(n＝3、4 或6)也可以形成环状分子。

聚硅酸具有非晶形(无序)结构。

具有Me2SiO4组成的原二硅酸的盐(原硅酸盐)包含单个的[SiO4]4--阴离子。 水溶性碱金属硅酸盐，例如其是由石英与苏打、苛性碱或碳酸钾通过熔融获得 的，除[SiO4]4-阴离子外还包含[Si2O7]6--和[Si3O10]8--阴离子(以及更大的阴离子)。 这样的“水玻璃”溶液，其溶解的颗粒可以通过膜渗析从中分离出来，用于例 如玻璃和瓷器的封接、纸的浸渍、作为木材的防火剂以及用于食品的贮藏。

这样的碱金属硅酸盐溶液酸化之后，由[SiO4]4--和[Si2O7]6--基团(以及更 大的阴离子)通过接受质子而构成的酸性分子相互缩合成多硅酸(参见上文)， 其中该溶液变成凝胶状。所获得的聚合物主要由链或网组成。在进一步缩合时 形成三维结构，其组成相当于SiO2。

有如下的分类：

1.具有离散的阴离子的硅酸盐

a)岛状-硅酸盐：是具有阴离子[SiO4]2--的原硅酸盐，实例：硅波石、橄榄 石、锆石。

b)簇状-硅酸盐：SiO4-四面体结合成短链单元。实例：具有阴离子[Si2O7]6--的二硅酸盐和三硅酸盐。

c)环状-硅酸盐：SiO4-四面体是环状布置的。实例：硅酸钡钛矿(3环)、斧 石(4环)、绿柱石(6环)。

2.链状-硅酸盐和带状-硅酸盐：链状硅酸盐由链状相互连接的SiO4-四面 体组成；它们是阴离子[SiO3]2-的聚合物。通过多个SiO4-链的结合可以形成带状 分子。实例：角闪石、石棉。

3.层状-硅酸盐(片状-硅酸盐)：层状硅酸盐包含由SiO4-四面体组成的平 面层。其由处于其间的阳离子结合在一起。它们是阴离子[Si4O10]4-的聚合物。实 例：滑石、高岭石。

4.骨架硅酸盐：在骨架硅酸盐中，四面体状的SiO4-基团键合成三维晶格。 实例：二氧化硅不同的变型例如长石。

形成聚硅酸或聚硅酸盐的缩合过程是通过由不参与缩合过程的单键有机基 团置换部分硅酸的OH-基团来控制的(各种聚硅氧烷的制备)。

合成的硅酸是非晶形的、无毒的并与晶体SiO2-变型相反不会导致Silicose 的形成。

常规文献：

Hinz，硅酸盐-专业词典(Silicat-Lexikon)(第二卷)，Berlin：Akademie Verl.1985

Liebau，硅酸盐的化学结构(Structural Chemistry of Silicates)， Berlin：Springer 1985

Petzold und Hinz，硅酸盐化学基础导论(Einfuehrung in die Grundlagen der Silicatchemie)，Stuttgart：Enke 1979

CD Roempp Chemie Lexikon-Version 1.0，Stuttgart/New York：Georg Thieme Verlag 1995

1.3.硅氧烷、聚硅氧烷

根据现有技术使用的制备硅烷醇和硅氧烷的方法在于，使水与有机硅衍生 物(例如三甲基氯化硅[(CH3)3SiCl])发生反应，其中首先形成的硅烷醇例如三 甲基硅烷醇：

[(CH3)3SiCl]+H2O→(CH3)3Si-OH+HCl

由其通过解离水形成硅氧烷例如六甲基二硅氧烷[(CH3)3Si-O-Si(CH3)3]：

2(CH3)3SiOH→(CH3)3Si-O-Si(CH3)3+H2O

进一步，通过二甲基-或一甲基氯化硅与水的反应产生具有环状或链状结构 或三维交联大分子(“聚硅氧烷”)的高分子量化合物(经中间产物二甲基硅烷 二醇或甲基硅烷三醇)：

(CH3)2SiCl2+2H2O→(CH3)2Si(OH)2+2HCl

n(CH3)2Si(OH)2→(CH3)2SiO4+nH2O

用于制备其它聚硅氧烷的起始化合物R3SiOH(硅烷醇)、R2Si(OH)2(硅烷二 醇)和RSi(OH)3(硅烷三醇)一般由相应的卤代化合物R3SiCl、R2SiCl2和RSiCl3水解产生(R＝乙基、丙基、苯基等)。

所以，硅氧烷(聚硅氧烷)可分为：

a)具有R3SiO[R2SiO]nSiR3结构的直链聚硅氧烷。

b)支化的聚硅氧烷，在其支化部位上包含三官能化或四官能化的硅氧烷单 元。

c)环状聚硅氧烷，其由二官能化的硅氧烷单元呈环状构成。

d)交联聚合物，其中链状或环状分子结合成二或三维交联网。

高分子量的、由链状大分子组成的硅氧烷(硅油)的粘度随链长的增大而 提高。硅氧烷作为工业原料具有重要意义。偶尔交联的链表现为橡胶-弹性(硅 酮橡胶；用途：密封等)，强烈交联的聚硅氧烷是类树脂的(硅酮树脂)。

基于其由有机部分决定的疏水性(水排斥的)，聚硅氧烷用于浸渍(织物、 纸等)。

1.4.硅酸盐蛋白(Silicatein)

一些上述硅化合物仅是以高成本制备的或仅少量作为矿藏存在，并因此仅 在相当可观的花费下才能够分离。该硅酸盐的化学合成方法则需要剧烈的条件 如高压和高温。

与此相反，有机体(特别是海绵和藻类)借助于特定的酶便可以在天然条 件即在低温和低压下形成硅酸盐骨架。该合成方法的优点在于：高度特异性、 协调的形态、可调节性以及合成纳米结构的可能性。

最近第一次披露了形成硅酸盐的酶的分离和纯化(硅酸盐蛋白)：Shimizu， K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：6234-6238(1998)。

然而，在此出现的问题是：该酶(硅酸盐蛋白)的分离和纯化是费时和费 力的，并因此仅达到相对低的产率。

一种可能的解决方案是借助于已知的cDNA-或基因-序列的重组蛋白质的合 成(重组硅酸盐蛋白)。其允许有效地酶促合成硅酸盐。

然而由海洋海绵体寄居蟹皮海绵和甘桔荔枝海锦制备重组硅酸盐蛋白出现的 问题是，在采用与现有技术(Shimizu，K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95： 6234-6238(1998)，Shimizu，K.等，专利申请，公开号WO0035993(1999))相符 的方法时仅获得非常低的产率，并且该重组蛋白质仅表现出低的酶活性。本发 明描述了通过有针对性地改变表达条件可以以高产率制备重组硅酸盐蛋白并使 其具有高度特异活性。此外，与天然的和使用完整c-DNA序列的重组酶相比，该 改性的重组酶具有较高的pH稳定性和温度稳定性。此外，与天然的和使用完整 c-DNA序列重组的蛋白质(其在pH值处于中性范围(pH7.0)时呈活性的)相比， 该改性的重组蛋白质在宽的pH范围(4.5-10)内具有酶活性。

通过制备特异性多克隆抗体和随后在固相上的偶合可以快速和有效地使用 亲和层析法来纯化酶。

通过使用融合蛋白质和采用不同的起始底物可以获得大量的变体可能性和 技术应用。

2.硅酸盐蛋白的制备

2.1.重组硅酸盐蛋白的制备

2.1.1.海洋海绵的cDNA的克隆

海绵的硅酸盐蛋白-蛋白质包含独特的序列-片断，其中的一些是：围绕富 丝氨酸的氨基酸-簇的部分(在寄居蟹皮海绵：氨基酸267-277)；围绕半胱氨酸 的部分，该半胱氨酸是催化性三单元组的第一个氨基酸(在寄居蟹皮海绵：氨 基酸138)，其在硅酸盐蛋白中是不存在的，而在同源酶，即组织蛋白酶中存在； 围绕前肽和加工肽之间的过渡部分(在寄居蟹皮海绵：氨基酸112/113)。

从cDNA-文库中，例如在ZapExpress和大肠肝菌XL1-Blue MRF′中可以用适 宜的简并引物(例如：与5′-载体特异性引物在一起的反向引物 5′-GAA/GCAG7CCG/GA/GAA/GTCA/GTAG/CAC-3′[氨基酸267-277区域]-或与3′- 载体特异性引物在同一蛋白片断上的正向引物)将硅酸盐蛋白的基因借助聚合 酶链式反应技术鉴别。所获得的合成产物在相关的cDNA-文库中用于筛选。然后 将经鉴定的克隆在载体(例如pGem-T)中进行亚克隆并随即测序。图1显示作 为示例的寄居蟹皮海绵的硅酸盐蛋白cDNA。

2.1.2.重组硅酸盐蛋白的表达和分离

优选在大肠杆菌XL1-Blue中进行重组硅酸盐蛋白的制备。但在酵母和哺乳 动物细胞中也是可行的并且是成功的。为此将cDNA在一相应的载体(例如 pQE-30)中克隆。还有其它的表达载体经证明是适宜的。在大肠杆菌的转化后 通过用常规的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)(Ausubel，F.M.，Brent， R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Smith，J.A.k Seidmann，J.G.& Struhl， K.(1995)Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons， New York)的诱导实现硅酸盐蛋白的表达。该硅酸盐蛋白的表达以及其重组蛋 白的提纯通过重组蛋白上存在的例如组氨酸标记，可以在相应的亲和柱例如一 种Ni-NTA-基质上得以实现(Skorokhod，A.，Schaecke，H.，Diehl-Seifert，B.， Steffen，R.，Hofmeister A.，And Mueller W.E.G.Cell.Mol.Biol. 43：509-519：1997)。

但是完整的硅酸盐蛋白序列在大肠杆菌中的表达只能获取很低的产率：如 下表达条件的变动导致出人意料的产率的巨大改善：

1.通过将编码蛋白质N-末端的序列的缩短，获得(与全部cDNA的表达相比) 超过100倍提高的表达。优选起始点在前肽的区域内。而在“成熟”蛋白质区 域内第一个潜在二硫(Disulfid)桥(通常在氨基酸135)之前的缩短也导致所 期望的强表达(图2)。

2.同样通过将编码蛋白质C-末端的cDNA缩短，与完整cDNA的表达相比获得 超过20信提高的硅酸盐蛋白表达(图2)。经证明缩短在最后的潜在二硫桥(通 常在氨基酸319)之后的序列区域中的3′-末端的基因是成功的。将一个终止密 码子插入那里。

3.在大肠杆菌中超过40倍的表达是如此实现的，即在细胞破裂时加入一种 蛋白酶-抑制剂-混合物。如下蛋白酶-抑制剂-混合物的应用被证明是有利的： 抗蛋白酶(10μg)、苯丁抑制剂(5μg/ml)、胰凝乳蛋白酶抑制剂(10μg/ml)、 亮抑蛋白酶肽(1μg/ml)、胃蛋白酶抑制剂(1μg/ml)、抑蛋白酶肽(1μg/ml)。 这一步骤之所以是如此惊人的，因为没有采用通常应用于分离重组蛋白的规则， 例如BugBuster提取-试剂盒(Novagen公司)。

4.在大肠杆菌破裂后所获得的溶液是很粘稠的。重组蛋白质的分离是通过 加入降解核酸的酶有效地实现的。核酸酶“Benzonase”在此是适宜的。

5.在硅酸盐蛋白的表达(在大肠杆菌中)中通常在“包含体(inclusion bodies)”内存在有重组蛋白。因此必须将重组蛋白转变为“天然(native)” 形式，如下方法被制备是有利的：用BugBuster提取-试剂盒的溶液溶解大肠杆 菌；在清洗后通过离心获取“包含体”。所述的“包含体”将多次用“蛋白质重 折叠试剂盒(Novagen公司)”的所谓IB清洗缓冲液清洗。应用了例如“蛋白质重折 叠试剂盒”所基于的规则，以使重组硅酸盐蛋白转变为“天然”形式。然而在 使用这种或那种可相比的方法中，重组硅酸盐蛋白被降解。令人惊讶的是，降 解过程可以通过不使用溶菌酶而被阻止。通常溶菌酶步骤是从大肠杆菌中获取 重组蛋白方案中固定的组成部分。其用于去除与重组蛋白相结合的细菌细胞膜。 重组硅酸盐蛋白的最终提纯可以通过亲和基质实现，如Ni-NTA基质。

在应用这种变更的使用方法之后，令人惊异地实现了在大肠杆菌中的高度 表达(超过100倍)；现在的产率达到约10mg重组硅酸盐蛋白每100ml细菌培养 基(图3)。

2.1.3.其它形成硅酸盐的生物体的重组硅酸盐蛋白的表达和分离

相应于如上所描述的操作方式可以分离、克隆和表达来自其它产生二氧化 硅的生物体的硅酸盐蛋白cDNA，例如来自硅藻(例如Cylindrotheca fusiformis) 的。在纯性(axenischen)培养物中获取硅藻是现有技术(Kroeger，N.， Bergsdorf，C.，and Sumper M.Europ.J.Biochem.239：259-264：1996)。

2.2.从动物和单细胞中分离和提纯硅酸盐蛋白

硅酸盐蛋白是例如在海绵体中合成非晶形硅酸盐的酶。因此硅酸盐蛋白也 可以从生物体本身中获取。在此将，例如从寄居蟹皮海绵中通过组织在无Ca++-和无Mg++-的海水(Seewasser)中分解而获取骨针(Spiculae)(由非晶形硅酸 盐组成)。所述骨针通过沉淀获取。将骨针的非晶形硅酸盐在碱性介质中(例如 稀释的苛性碱中)去除。骨针的含有硅酸盐蛋白的有机纤维通过离心(例如， 20′000×g；1小时；4℃)获取。所述蛋白将通过高盐浓度，例如1M NaCl， 但也可以通过“蛋白质重折叠-试剂盒”引入溶液中。

随即将硅酸盐蛋白用亲和基质提纯。该亲和基质通过将硅酸盐蛋白-特异性 抗体固定在一种固相上(经CNBr-活化的琼脂糖凝胶或其他适宜的载体)制备而 得，并纯化。作为抗体使用的是根据标准方法(Osterman，L.A.蛋白与核酸的 研究方法第2卷(Methods of Protein and Nucleic Acid Research Vol.2)； Springer-Verlag[Berlin]1984)制备的抗硅酸盐蛋白的单克隆或多克隆抗体。 抗体在柱基质上的连接是通过制造商(Pharmacia)的说明进行的。纯净的硅酸 盐蛋白洗脱液是借助pH-变化或离子强度的变化实现的。其它的亲和基质如聚合 硅酸盐或共聚硅酸盐/锗酸盐也能成功应用。从这种基质获取的硅酸盐蛋白洗脱 液出现在硅酸盐蛋白的等电点附近的pH处(在寄居蟹皮海绵-硅酸盐蛋白的情形 下pH约为6)。

来自其它产生二氧化硅的生物体中的相应硅酸盐蛋白的分离，如硅藻(例 如Cylindrotheca fusiformis)，成功地根据上述方法进行。

本发明的新颖之处此外还在于，硅酸盐蛋白-基因可以通过在介质中适宜的 硅酸盐浓度(通常60μM)和通过促肌缩肽(1μg/ml)诱导(图4A，B)。

3.硅酸盐蛋白活性的验证与硅-烷氧基-化合物的合成

重组硅酸盐蛋白酶活性的测量通常如下进行。将重组硅酸盐蛋白在适于反 应的缓冲液中过夜透析，如25mM Tris-HCl，pH6.8[其它在pH4.5-10.5范围 内的缓冲液也同样适合]。

通常将1-60μg重组硅酸盐蛋白溶于1ml适宜的缓冲液中(如25mM Tris-HCl，pH6.8)并配入1ml通常为1-4.5mM四乙氧基硅烷-溶液。所述酶促 反应可以在室温下-但可也在温度5℃和约65℃之间进行。平均温育时间是 60分钟。在此期间通常每100μg硅酸盐蛋白合成300nmol非晶形硅酸盐(作为 钼酸盐反应可溶性硅酸盐)。为了证明硅酸盐产物，将所述矿物在桌用离心器中 离心(12000×g；15min；+4℃)，用乙醇洗涤并空气干燥。随即将沉淀用例如 1M NaOH水解。在产生的溶液中使用一种基于钼酸盐的验证方法将硅酸盐量性测 量，如例如硅-化验(Merk)。

令人惊异地发现，硅酸盐蛋白除了底物四乙氧基硅烷还聚合其它的硅烷烷 氧化合物。

在根据本发明的方法中的新颖之处在于，如下化合物可以用于经硅酸盐蛋 白媒介的合成：四烷氧基硅烷、三烷氧基硅烷醇、二烷氧基硅烷二醇、单烷氧 基硅烷三醇、烷基-或芳基-三烷氧基硅烷、烷基-或芳基-二烷氧基硅烷醇、或 烷基-或芳基-单烷氧基硅烷二醇或其相应的(经烷基-或芳基取代的)镓(IV)、 锡(IV)或铅(IV)的烷氧基化合物。这些底物的混合物也能被酶识别并聚合。 因此也可以制备混合物。

为了提高酶的活性将底物如四乙氧基硅烷溶解于通常为500mM的二甲基亚 砜初始溶液中并随即稀释到所期望的最终浓度。

4.硅酸盐蛋白的cDNA与一种或多种其他蛋白质的cDNA(s)(开放的读框)的 连接

4.1.硅酸盐蛋白-融合蛋白的制备

具有硅酸盐蛋白的融合蛋白如下获取。使用一种适宜的表达载体(例如 pQE-30)。制备在5′-末端具有例如BamHI-限制性酶切位点和在3′-末端具有例如 SalI-限制性酶切位点的硅酸盐蛋白-cDNA。去除硅酸盐蛋白-cDNA的终止密码 子。在此使用聚合酶链式反应技术(PCR-Technik)并且使用具有相关限制性位 点的引物用于扩增。第二个蛋白质的cDNA以相应的方法获取，其中在5′-末端具 有与硅酸盐蛋白cDNA的3′-末端相同的酶切位点(例如SalI)，并在3′-末端具有 其它不同的酶切位点(例如一个HindIII-切点)。如果在相关的cDNA中存在限制 性内切酶位点，可以选择地使用限制性酶。此外还可以在两个cDNA之间使用连 接子(图5A)。

这两种cDNA通过常规的方法连接，提纯并连接入pQE-30载体中。所述连接 是紧随组氨酸标记(约6组氨酸-密码子)进行的。融合蛋白的表达和提纯可以 如上所述进行(2.1.2部分)。

4.2.经分开的表达I

可替换在4.1中所描述的方法，可以在硅酸盐蛋白的cDNA和生物活性蛋白 的cDNA之间克隆入一个蛋白酶切点(如例如一个肠肽酶-位点)。在这种情况下 可以在活性蛋白的基因编码区之前插入一个新的起始-蛋氨酸的密码子。在表达 和提纯后将该(融合)-蛋白用蛋白酶水解切开。就此分开拥有两种蛋白(图5B)。

4.3.经分开的表达II(盒式表达)

可替换地将两种蛋白质分开表达在一种结构中。对此在一种表达载体中将 硅酸盐蛋白基因后接在组氨酸-标记上。在硅酸盐蛋白-cDNA末端插入一个终止 子。在硅酸盐蛋白cDNA和生物活性蛋白cDNA之间克隆入一个具有起始-蛋氨酸密 码子的核糖体结合位点。再次将一个组氨酸-标记前接在该生物活性蛋白上。同 样该基因配有一终止子(图5C)。

当蛋白在相关的宿主细胞中用于功能分析时，可以删除组氨酸-标记。

4.4.扩展

对于如在4.1至4.3中的描述的表达，既可以使用细菌也可以使用真核细 胞。

如在4.1至4.3中的描述的表达，也可以用于3个或多个开放的读框。

5.经制备的硅酸盐蛋白和硅酸盐蛋白-融合蛋白的用途

5.1.硅酸盐蛋白用于生物材料表面修饰的用途

生物体(或生物提取物/产品)在(裸露的和/或植入的)生物材料上的生 物反应大部分通过其表面结构和表面化学决定。因此存在着对这类生物材料表 面修饰的方法的需要。在此的目的始终是获取生物分子有利的化学物理特性。 因此应该只将最外的表面修饰，因为经此影响了其生物性相互作用。

发现经表面修饰的生物材料(如例如通过含有硅和硅氧烷的嵌段共聚物， “硅烷化”)具有影响细胞粘附性和细胞生长、改变血液兼容性或控制蛋白质吸 收(降低隐形眼镜的吸收，ELISA-板的预处理)的用途。用于材料表面修饰的 硅烷化可以在此特别用于羟基化的或富胺的表面的修饰，如例如富有羟基团的 玻璃、硅、锗、铝、石英和各种金属氧化物。文献-概述见：B.D.Ratner et al. (Hrsg.)生物材料科学-医学材料介绍(Biomaterials Science-An Introduction to Materials in Medicine).Academic Press，San Diego，1996。

在此却有这样的问题，即在用于所述修饰的制备的条件下经常出现对所用 的生物材料的损坏(破坏结构的)效果。

借助于本发明的方法(经重组的/提纯的硅酸盐蛋白的应用)展现了一种相 比所述应用的物理/化学方法“温和”的方法，其是只基于生物化学反应的生物 材料修饰(含有非晶形SiO2、含有硅氧烷或含有硅氧烷-嵌段-共聚物的表面经硅 酸盐蛋白-媒介的酶促合成)。

在材料表面上经修饰的区域在多数情况下应该尽可能的薄，因为太厚的经 修饰的表面层可以改变材料的机械和功能特性。其可以通过在硅酸盐蛋白-媒介 的酶促反应时反应时间和底物浓度的变化以简单的方式实现。

借助硅酸盐蛋白-媒介的酶促反应使大量不同的生物材料得以使用，其或是 天然具有结合蛋白(硅酸盐蛋白)的表面或是通过预先修饰而使之结合蛋白质， 而且生物材料包括聚合物、金属、陶器和玻璃。

硅烷可以形成两种表面结构。即很薄的(单层)层，如果只存在微量的表 面吸附的水，或，如果存在更多的水，较厚的硅烷层，其不仅由连接在表面上 的Si-O基团，而且由形成三维聚合物网络的硅烷单元组成。这类修饰可以例如 通过用正丙基-三甲氧基硅烷处理羟基化表面来制备。

常规文献：Pleuddemann，E.P.(1980)硅烷结合剂化学(Chemistry of silane coupling agents)。硅烷化表面(In Silylated Surfaces)(D.E.Leyden， Hrsg.)Gordon & Breach，New York，pp.31-53。

借助经硅酸盐蛋白媒介的酶促反应同样使得-在温和的、保护生物材料的条 件下-在大量不同生物材料上构造不同种类的表面结构，然而其合成因为是酶促 媒介的而定向进行。

特别地，重组或从不同来源的经提纯的硅酸盐蛋白还在制备具有硅类特性 的生物材料(如硅-乳房植入物)的表面修饰以及医用植入物和Endoprothesen 中有用途，同样也用于隐形眼镜。

5.2.用硅酸盐蛋白包裹生物分子的用途

通过借助重组或或来自不同来源的经提纯的硅酸盐蛋白经控制地合成 SiO2-或硅氧烷-外壳具有用于包裹生物分子(包括蛋白质和核酸)以及生物活性 分子(包括激素、医药(Pharmaka)和细胞因子)的用途，目的是改变和改善其 生物特性(如蛋白酶抗性和核酸酶抗性、温度稳定性)或其释放性(经控制的 “药物输送”，同样也使局部“药物输送”成为可能)。

a)提高蛋白质的蛋白酶抗性(和温度稳定性)。操作方法：用硅酸盐蛋白 外衣(其合成SiO2外壳)包裹蛋白质(例如通过交联)。

b)提高核酸的核酸酶抗性(和温度稳定性)。操作方法：用硅酸盐蛋白外 衣(其合成SiO2外壳)包裹核酸(例如通过交联)。

用上述屏蔽的方式也可以制备药剂(包括肽链/蛋白质激素和细胞因子)的 储藏形式。为此将药剂(包括肽链/蛋白质激素和细胞因子)首先修饰通过

a)与硅酸盐蛋白交联或(如果涉及蛋白质)

b)制备具有硅酸盐蛋白的融合蛋白

随后进行经硅酸盐蛋白媒介的胶囊材料的合成

WO9614832A1 19960523(US9514261 19951106)公开一种用于由多磷酸 盐制备合成脂质体以提高药剂吸收(“药剂-输送”)的方法。通过借助硅酸盐蛋 白制备稳定这类脂质体的外壳使该方法的效用上升。

此外重组或来自不同来源的经提纯的硅酸盐蛋白可用于通过聚硅酸盐、硅 或混合多聚物(借助重组/经提纯的硅酸盐蛋白制备)和多磷酸盐(借助重组多 磷酸激酶制备的)的共合成，制备新型生物材料(或复合材料)如骨组织替换 材料或牙齿替换材料。

5.3.在移植过程中用硅酸盐蛋白包裹细胞/组织的用途

借助重组或来自不同来源的经提纯的硅酸盐蛋白的SiO2或硅氧烷外壳的控 制合成也可以在移植中用于包裹细胞(改善生物兼容性)。

这可以通过用硅酸盐蛋白“涂覆”细胞或经硅酸盐蛋白-融合蛋白在细胞表 面上的表达来实现。

5.4.硅酸盐蛋白用于(硅)-半导体或硅-芯片的表面-修饰(接触区域-处理) 及其用途

重组或来自不同来源的经提纯的硅酸盐蛋白也可以用于(硅或锗)-半导体 或(硅或锗)-生物传感器-芯片的表面-修饰(接触区域-处理)。经此可以建立 与细胞或其他由有机材料组成的结构之间的联系。该“基体”可以用于细胞电 特性的测量。这类经硅酸盐蛋白修饰的半导体(或硅-微芯片)可以有作为生物 传感器的用途。

5.5.用硅酸盐蛋白合成含硅宝石和半宝石(Halbedelsteine)的用途

重组或来自不同来源的经提纯的硅酸盐蛋白能够形成非晶形SiO2。算得上 是非晶形或细结晶的SiO2(蛋白石)变体有玛瑙、碧玉、缟玛瑙等。基于借助重 组或来自不同来源的经提纯的硅酸盐蛋白在控制的条件下合成非晶形SiO2的可 能性，其中可以有目的地加入杂质分子/原子，因此根据本发明的方法用于制备 上述的和其他的宝石/半宝石。

借助重组或从不同来源的经提纯的硅酸盐蛋白也有可能在控制的条件下将 薄的SiO-和SiO2层加覆到半导体基体上(用于制备集成电路)。

5.6.用硅酸盐蛋白合成硅(锗-、锡-或铅-)化合物(包括所谓的 Sila-Pharmaka)

已知硅作为微量元素明显在结缔组织和骨骼(矿化)中是必须的。硅-有机 化合物的制备作为所谓Sila-Pharmaka(Pharmaka，其中C被Si代替，具有潜在 的对有机体的作用的改变)的基础引起医学兴趣[参见：时代化学(Chem.Unserer Zeit)14，197-207(1980)，以及：生物活性-有机硅化合物(Bioactive Organo-Silicon Compounds)(当代化学主题84(Topics Curr.Chem.84))， Berlin，Springer 1979]；这类化合物的合成在温和(酶促)的条件下使借助 根据本发明的方法(重组或从不同来源提纯的硅酸盐蛋白的应用)成为可能。

其它借助本发明的方法在温和的(酶促的)条件下合成的(重组或从不同 来源提纯的硅酸盐蛋白的应用)硅-化合物在医药和化妆领域的用途是：这类经 合成的硅-化合物作为乳膏的组分或基础物质，以及作为牙膏组分的应用[用于 化妆品(zur Verwendung in der Kosmetik)，参见：Parfuem.Kosmet.67， 232-239，326-336，384-389(1986)；68，195-203(1987)]。

硅-化合物，其是借助本发明的方法在温和的(酶促的)条件下合成的(重组 或从不同来源提纯的硅酸盐蛋白的应用)，也应用于其它目的：润滑剂(塑料 加工)、润滑剂(塑料传动装置(Kunststoffgetriebe))、泡沫抑制剂、模具隔 离剂(Formtrennmittel)、(使玻璃、陶器、织物、皮革疏水)和绝缘材料(例 如用于变压器)。

借助本发明的方法合成的化合物包括在技术领域应用的硅氧烷-树脂如(或 多或少交联的)多甲基-或多甲基苯基硅氧烷。

在经硅酸盐蛋白媒介的催化反应过程中通过缩合形成的硅烷三醇RSi(OH)3导致叶形结构状(Blattstruktur-artigen)的总成分(Bruttozusammensetzung) 为R2SiO3的聚合物的合成。此聚合物的交联度和伸张度可以通过经控制的硅烷二 醇与硅烷醇的混合变化。因此产生具有典型的可调节的特性的、通过酶促按尺 寸设定(enzymatisch massgeschneiderte)的硅结构。

硅氧烷骨架可以在此用不同类型的烃基连接。借此改变其特性。

基于经硅酸盐蛋白媒介的催化反应合成的(根据经验无损健康的)硅树脂 的耐热性和疏水性，使其在化妆用皮肤保养和整形手术方面可以得到应用。

常规文献：Brinker et al.，聚二甲基硅烷在食品-和享乐品工业中 (Polydimethylsiloxane in der Lebens-und Genussmittelindustie)， Muenchen：Dow Corning 1981。

5.7.通过用含有硅酸盐蛋白基因/cDNA的质粒的转染改变细胞的特性

通过用含有硅酸盐蛋白基因/cDNA的质粒的细胞转染使其特性改变，其产生 在制备骨骼替代材料中的应用(也通过经硅酸盐蛋白合成的SiO2和多磷酸盐的 共-“聚合反应”，通过用含有多磷酸-激酶-cDNA的质粒转染制备)。

5.8.重组硅酸盐蛋白用于非晶形二氧化硅的纳米-结构的合成的应用

借助重组硅酸盐蛋白、重组硅酸盐蛋白-融合蛋白或经提纯的硅酸盐蛋白， 由非晶形二氧化硅、硅氧烷或其他硅(IV)-[或锗(IV)-、锡(IV)-或铅(IV)-]-化 合物以纳米尺寸合成特别的二维和三维的筛状、网状、笼状或其他形状的结构 是可能的，其中与这种酶联合的大分子(合成的聚合物或生物聚合物)作为“导 轨(Leitschienen)”用于合成。这类合成在应用海水养殖或水箱养殖海绵或其 他产生硅酸盐蛋白的有机体以及用基因技术改变的原本没有能力合成硅酸盐的 有机体的情形下也是可能的。所形成的结构可以应用于纳米技术(例如用于分 离过程的以纳米衡量的“微型筛”)。

图片解释：

下面详细说明所附插图。

图1：

具有推导出的寄居蟹皮海绵-硅酸盐蛋白氨基酸序列的cDNA。

图2：

寄居蟹皮海绵-硅酸盐蛋白的氨基酸序列。在蛋白质的某些部位，其在cDNA 的缩短之后导致重组蛋白表达的大幅度提高，用[—]表示。此外催化性的三单 元组(CT)的氨基酸以及导致潜在二硫桥的半胱氨酸-单元用(*)标记。

图3：

在大肠杆菌中重组硅酸盐蛋白-蛋白质制备。根据给出的方法从粗提取液 中获取纯净的硅酸盐蛋白。条带a：非诱导细胞的蛋白质提取液[-IPTG]；条带b 和条带c：经诱导细胞的蛋白质提取液[+IPTG]，在加入IPTG后2.5小时(条带b) 和8小时(条带c)。条带d：在表达8小时后溶菌液的可溶蛋白质提取物。条带e： “包含体”的蛋白质提取液。条带f：来自“包含体”的在Ni-NTA基体上提纯蛋 白质之后的提纯的硅酸盐蛋白。重组硅酸盐蛋白的分子量约33kDa。在左边给 出的是分子量标记。

图4：

(A)在寄居蟹皮海绵的Primmorphen中硅酸盐蛋白的转录浓度。 Primmorphe，经5天培养后由单细胞形成，在0(对照；Kon)至5天或在外源 性硅酸盐缺乏的情形下(-硅酸盐)或在60μM硅酸盐钠(+硅酸盐)存在下培养。 随即提取RNA并将5μg全部的-RNA根据其大小分离；在印迹转移后将用寄居蟹皮 海绵的硅酸盐蛋白-探针(SUBDOSILICA)进行杂交。(B)在Primmorphen中重组 促肌缩肽在硅酸盐蛋白表达上的效果，Primmorphe在0(对照)至5天或在缺乏 促肌缩肽(-促肌缩肽)或存在1μg/ml促肌缩肽(+促肌缩肽)的情形下培养。随 后用RNA印迹法(Northern-Blotting)以SUBDOSILICA-探针确定硅酸盐蛋白的 表达规模。

图5：

硅酸盐蛋白与编码生物活性物质的基因(示意图)的共-表达。A.融合蛋 白硅酸盐蛋白-生物活性蛋白的制备。这两种cDNA[硅酸盐蛋白和生物活性蛋白] 通过一个限制性位点(例如SalI)连接并随后克隆到pQE-30-载体的BamHI和 HindIII限制性位点上。在5′-末端存在有组氨酸-标记。B.分离的蛋白质表达。 所述的两种cDNA通过蛋白酶切位点克隆到一适宜的载体上。在表达和提纯后分 别将融合蛋白通过蛋白酶降解获取。C.分开的蛋白-表达(作为盒式表达)。将 所述两种cDNA在相同的结构上分别表达并通过组氨酸-标记提纯。