现今所用洗涤剂制剂中一般含有酶，例如蛋白酶、脂酶、淀粉酶 和纤维素酶，这些酶促使污物分解。要加入酶的洗涤剂基质一般包含 已知可破坏酶的稳定性的化合物，例如碱(如碳酸钠)和阴离子表面 活性剂(如线性烷基苯磺酸盐)。例如阴离子表面活性剂，已知其会 使酶变性。因此，加入到该制剂中的酶在加入前，通常要单独粒化以 形成有被的酶颗粒。包被层一般包含聚合物，如聚乙烯醇、聚乙二醇 和/或甲基纤维素，其在凝聚过程中起保护酶的作用，使其不暴露于碱 和阴离子表面活性剂中。
酶以很高的浓度存在于这些颗粒中，因此暴露于来自颗粒的粉尘 时可对操作者造成危害。尽管减少粉尘的方法已有报导(如见N.T. Becker等人，美国专利No.5,814,501(Sep 1998)；A.G.J.Hussain， 美国专利No.3,773,671(Nov 1973)，但排除酶的单独分离和粒化就 可以排除这种危害，同时也提供了更有效的制备方法。
发明概述
本发明一方面提供了制备洗涤剂制剂的方法。按照这种方法，提 供了流体或优选膏状的含水发酵培养液提取物，其中包含(a)洗涤剂 型酶和(b)适于掺入到这种洗涤剂制剂中的表面活性剂。提取物随后 与一般也为膏状的洗涤剂基质混合物直接凝聚。
提取物可通过(a)在混合物进行分相的条件下，形成含有酶的含 水发酵培养液和洗涤剂型表面活性剂的混合物，和(b)回收含有酶和 表面活性剂的相来制备。在一个实施方案中，步骤(a)中的混合物还 包括含有金属阳离子和卤化物或极性氧化阴离子的盐。在另一个实施 方案中，诱发分相的条件包括加热混合物至高于其浊点的温度。
洗涤剂型表面活性剂优选地选自烷基聚醚醇、烷基酚聚醚醇、乙 氧基化脂肪醇、高级脂肪酸链烷醇酰胺或其烯化氧加合物，及脂肪酸 甘油单酯，更优选自聚醚醇、烷基酚聚醚醇或乙氧基化脂肪醇。
在随后的发明详述中，本发明中这些以及其它目的和特征将更明 显。
发明详述
I.定义
下面的术语除非另有说明，具有如下含意：
此处所用的“洗涤剂型酶”指可能用于清洁产品，如洗衣洗涤剂、 硬表面清洁剂、个人洗护用品、餐盘洗护用品等等的任一种酶。这些 酶包括，但不限于，蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、内切糖苷酶、脂肪 酶、过氧化物酶、乳糖酶和过氧化氢酶。特别有用的酶包括碱性蛋白 酶，如PURAFECT或PURAFECTOXP(均可从Genencor International， Inc.购买)、SAVINASETM(Novo Industries)、蛋白质工程酶如蛋白酶 899(Genencor International，Inc.)、DURAZYMTM(在+195和+222 位突变的蛋白酶，Novo Nordisk A/S)，及MAXAPEMTM(在+222位突变 的蛋白酶，Gistbrocades)；淀粉酶，如SPEZYME(Genencor International，Inc.)或蛋白质工程淀粉酶如美国专利5,824,532 (C.C.Barnett等人，Oct 1998)描述的；纤维素酶或纤维素酶组分， 如DENIMEXTM(Novo Nordisk A/S)；及内切糖苷酶，如美国专利 5,238,843(R.S.Carpenter等人，Aug 1993)和5,258,304(R.S. Carpenter等人，Nov 1993)描述的。
“洗涤剂型表面活性剂”为适于掺入到洗涤剂制剂中，且在此处 所述的酶提取中有效的表面活性剂。为了后一目的，应使用非离子型 表面活性剂。在McCutcheon’s Emulsifiers and Detergents 1999： North American Edition，Vol.1，McCutcheon Div.，MC Publishing Co.，1999，a standard catalog of commercial surfactants，和 Schick，M.J(Ed.)，Nonionic surfactants，Marcel Dekker，1987 中描述了洗涤剂型表面活性剂。适于用于本发明方法的表面活性剂包 括例如烷基聚醚醇、烷基酚聚醚醇，如TRITONX-100、X-165、X-305 或X-405(Rohm&Haas)、ARMUL930(Witcho Corp.)、ALKA SURFNP-15 (Rhone Poulenc)、CARSONONN-30(Lonza，Inc.)和CEDEPALCO-730 (Stepan Canada，Inc.)；及脂肪醇乙氧基化物，如NEODOL91-6、 91-8、23-6.5、25-12、45-13或25-20(Shell)。在此，烷基指的是 含有6～20个碳原子、优选8～16个碳原子的线状或分枝状烃链。其 它的非离子的洗涤剂型表面活性剂包括高级脂肪酸链烷醇酰胺或其烯 化氧加合物，和脂肪酸甘油单酯。
“脂肪酸”或“脂肪醇”包括具有至少8个碳原子、优选8～24 个碳原子的碳链，优选线状的碳链。
II.酶提取方法
许多酶可通过在适当条件下，在适当的营养培养基中培养某种生 物体(酵母、细菌、真菌)得以大量制备。该生物体经培养或发酵后， 产生目的酶，从发酵培养液中回收该酶。全发酵培养液含有位于胞外 或胞内的酶发酵产物，还含有细胞和/或细胞碎片(统称为“细胞碎 片”)，其无需另外步骤即可用于提取。另外，发酵培养液也可首先 通过已知的方法如超滤，去除所有或几乎所有细胞碎片而进行澄清。 使用全发酵培养液时，提取前可先将培养液进行稀释，以降低培养液 中总的固体物质的百分比、培养液的粘度和/或传导性。
已建立了多种针对生物/发酵产物的回收方法。能掺入至少一种非 离子洗涤剂型表面活性剂、使含有表面活性剂和酶的提取物能被回收 的方法中的任一种，都可用于本发明方法中。
一种称为“亲和分配”的从完整细胞和细胞碎片中回收酶的普通 方法，在普通溶剂中添加一般为亲水性的寡聚物或高聚物和/或盐(它 们在溶液中能产生不溶混的相)的材料时形成多个独立的相。为了有 效分离，要提取的产物对其中一相比另一相更具选择性的亲合力。
例如美国专利No.4,144,130(M.R.Kula等人，Mar 1979)和 NO.4,743,550(K.P.Ananthpadmanabhan等人，May 1998)，描述了 通过在含有亲水性高聚物组合物的含水系统中的分配来分离酶。适当 的组合物，包括PEG(聚乙二醇)与葡聚糖、羟丙基葡聚糖、烷氧基 PEG、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉或糖原的组合。
本发明者已经在PCT公开号WO 96/23061(相应于专利美国申请 08/379,377)中描述了提取疏水性蛋白质(其包括许多洗涤剂型蛋白 质)的方法。在该方法中，尤其适于本发明方法的，将全发酵培养液 或澄清的发酵培养液与盐和非离子的洗涤剂型表面活性剂(上文所述) 混合以形成二相系统。酶集中于富含表面活性剂的相，而不想要的副 产品，如细胞碎片、次生酶、糖类等等，集中于富含盐的相。
本方法中使用的盐，优选那些其中阳离子为单价的或二价金属离 子，如钠、钾、镁、铵、铝或钙，而其阴离子为极性氧化阴离子，如 硫酸盐、碳酸盐、磷酸盐、乙酸盐、甲酸盐、硝酸盐或柠檬酸盐，或 卤化物，如氯化物、溴化物或碘化物。也可使用盐混合物。优选的盐， 包括硫酸钠、磷酸钠、氯化钠和甲酸钠。在大约室温至大约40℃的温 度下将盐和表面活性剂加入到发酵培养液(全发酵培养液或澄清的)。 加入盐和表面活性剂的pH范围较宽(2～10)，要根据要回收酶的性 质而定。在酶不发生变性或其他降解的前提下，将系统的pH、温度和 压力保持在最适分离的水平。
加入盐和表面活性剂后，发酵培养液一般分为两相；也可能形成 第三种界面间相。通常把任何该界面间相作为包含目的蛋白质的顶层 相(富含表面活性剂相)的一部分来处理。相分离可通过简单的混合 物静置，或依照已知方法离心实现。
在另一种称为浊点萃取的分离方法中，相分离通过提高含有表面 活性剂的含水系统的温度来实现。例如在G.C.Terstappen等人，J. Biotechnology 28：263-275(1993)和Terstappen等人，Biotechn. Appl.Biochem.16(3)：228-235(1992)中描述的方法，分别使用了 聚氧乙烯叔辛基苯基醚(TRITONX-100和X-114)和聚氧乙烯正-十四 烷基醚(C14E06，Henkel KGAA)。在一般方法中，向含有蛋白质的水 性混合物中加入约1％重量/体积的表面活性剂，所得混合物在高于浊 点2℃条件下保持2小时，使其发生相分离。TRITONX-114浊点为28 ℃，为本方法优选的表面活性剂。
IV.将提取物掺入洗涤剂制剂
含有洗涤剂型表面活性剂和洗涤剂型酶的提取物，优选通过上述 方法中的一种获得的，用本领域熟练技术人员所知的方法包括如离心 进行收集或回收。然后，将表面活性剂/酶相直接掺入到目的洗涤剂基 质制剂中。为直接凝聚成固体或膏状洗涤剂制剂，优选进行酶的萃取 以产生高度粘滞的材料，这一般可通过调整混合物的浓度或加入的表 面活性剂的量来实现。下面实施例3中描述了通过减少表面活性剂的 量获得膏状提取物的典型方法。
洗涤剂或清洁产品制剂包括，但不限于任何工业或消费清洁用品， 如洗衣用品、硬表面清洁剂、洗衣预处理用品、餐盘洗护用品、个人 卫生用品等等。该制剂一般包括阴离子、阳离子和非离子表面活性剂， 也可能包括以下组分，如抗氧化剂、链烷醇胺、聚碳酸酯洗涤剂增洁 剂，抗再沉积剂、泡沫调节剂、杀菌剂、染料、香料、增白剂，等等。 本领域的技术人员熟悉可作为清洁成分的不同制剂。例如美国专利 4,404,128(Anderson，Sep 1983)、4,261,868(J.Hora等人，Apr 1981) 和4,507,219(Hughes，Mar 1985)对这些制剂进行了描述，此处引用 作为参考。
如下文所述，用枯草杆菌蛋白酶成功进行了该直接凝聚方法，而 未检测到酶的降解。该方法具有成本和操作上的优势，免除了酶的单 独粒化及粒化酶的掺和处理的必要。用于处理表面活性剂膏的商品化 凝聚剂，可容易地处理酶—表面活性剂膏(或流体)。而且，凝聚的 洗涤剂中的酶的浓度比商品化酶颗粒中的酶浓度低10-200倍，因此 降低了暴露于致敏的酶粉尘时的风险。
不希望受到机制的限制，可以假定用非离子表面活性剂来提取酶 可使其包被或防止化学攻击。考虑到这类提取物的直接凝聚在洗涤剂 制剂中的成功应用，预计类似的方法可用于其它制剂方法中，如通常 使用单独粒化与包被的蛋白质的制药工业。
实施例
以下实施例只是为了阐述的目的，而不想限制本发明的范围。
实施例1和实施例2阐述了发酵培养液中蛋白酶的盐/表面活性剂 的提取。可用如共有的PCT公开No.96/23061中所描述的类似方法进 行蛋白酶899(使用TRITONX-405)、PURAFECT(使用NEODOL91-6) 和LUMAFAST(使用TRITONX-300和X-405)的提取。
实施例1
进行在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中表达的蛋白酶2(枯草杆菌 蛋白酶，如美国专利5,185,258所述)的发酵。发酵培养液通过生物 质的絮凝作用，并经转动式真空鼓滤器(rotary vacuum drum filter， RVDF)过滤使之澄清。用甲酸将100ml滤出液样品调节至pH7，并 加入15克硫酸钠和10克氯化钠。将混合物加热至25℃，并搅拌约1 小时使盐完全溶解。然后加入TRITONX-100(辛基苯酚聚醚醇，Rohm &Hass)(10mL，或初始滤出液体积的10％)，搅拌混合物约15分钟。 通过于大约3000g离心(IEC Centra-P Centrifuge)约15分钟， 使混合物分成两相(富含表面活性剂的顶层相和富含盐的底层相)，测 定两相中的枯草杆菌蛋白酶活性。
计算如下参数：分开体积比(volume split)(顶层相体积/底层 相体积)为0.2；分配系数(顶层相中的酶浓度/底层相中的酶浓度) 为442；浓度因子(顶层相中的酶浓度/原液中的酶浓度)为4.7，产 率(顶层相中回收的总酶量/初始酶量)为93％。
实施例2
重复上面实施例1所述的提取步骤，以10mL NEODOL91-6(乙氧 化醇，C9-11；Shell)代替TRITONX-100表面活性剂，得到如下结果： 分开体积比为0.22；分配系数为57；浓度因子为4.66；产率100％。
实施例3
本实施例阐述了酶提取物直接凝聚成洗涤剂制剂。
采用实施例2中所述方法制备碱性蛋白酶表面活性剂提取物，不 同的是，采用5-10％、优选5-7.5％的NEODOL91-6表面活性剂进行提 取，这样提取物具有膏的粘稠度。然后将含4％w/w浓度的蛋白酶的膏 提取物，和含有阴离子表面活性剂(线形烷基苯磺酸酯、烷基硫酸酯、 烷基乙氧基硫酸酯)和非离子表面活性剂(烷基乙氧基化醇)的基质 洗涤膏混合物一起，加到高度剪切的凝聚剂(如Lodige或Shugi制造 的)中。加入提取物一般约为基质洗涤剂混合物重量的1％，但可加入 该水平的0.1％至10％。
凝聚后，通过以高速操作刀片0.25至10分钟，以流动的颗粒状 洗涤粉形式，移去含酶的表面活性剂凝聚物。
利用枯草杆菌蛋白酶进行了类似的方法。在高温和高湿度条件下 贮存几周后，未观察到酶活性的明显损失。
尽管本发明通过参考特定的方法和实施方案进行了描述，但应当 理解在不违背本发明的情况下可做各种修饰。