为了应用于各种工业、家庭、食品/饲料、化妆品、医药等领域，工业 上不断地生产大量的多肽，包括酶和非酶蛋白质。这些蛋白质的主要来源 是已经在自然界中发现的微生物。然而，因为科学已经发明许多通过蛋白 质工程产生多肽变体的新技术，能够产生大量的蛋白质变体以筛选和选择 新特性就变得越来越重要。
发现具有新的和特殊属性的多肽的经典方法一直用于筛选存在于自然 界的野生型有机体。这曾是一种十分成功的产生将用于如以上提及的工业 等不同领域中的多肽的方法。而且有可能通过对微生物的经典突变产生蛋 白质的新变体。然而，因为这种方法是十分费时费力的，在最近二十年， 研究人员使用更特异和更快速的技术(如蛋白质和基因工程)通过创造人工 多样性，在现有的多肽基础上产生了改进方法。
通过使用重组DNA技术(定点或随机诱变)可以产生人工多样性。这种 方法产生了大量的多肽变体，这种多肽变体可以按照实验中给定有机体的 新近获得的表型进行选择。按照能够筛选的突变体的数量，这样的表型的 筛选有它的局限性。首先，人们得建立一种筛选分析方法，这种方法能够 检测多肽的新特性，并能分离出突变体。然后分离和鉴定出编码该多肽的 DNA。
已经成功地应用这些技术创造出新的重要的显示出改进特性(如更高的 特异活性、在高或低pH值下更高的稳定性、温度稳定性、氧化稳定性等) 的多肽。
然而，尽管这种方法是成功的，但是其在多肽的数量方面仍具有局限 性。通过使用这些技术可能进行筛选和检测。因此创造新的体系是有益的， 其能够把筛选和选择组合在一种方法之中。
此外，这样的方法在所给出的条件下应该仅能选出那些具有最好特性 的变体，这些变体应该从由超过108个成员组成的群体中选出。
用以制造这样的人工多样性和选择新的或改进特异性的多肽特性的一 种有前途的方法就是公知的″噬菌体显示″技术。这种技术把遗传型与表型 相结合，使一起选择这两种性状成为可能。因此排除了在上述所提到的方 法中的两个步骤。
噬菌体显示是一种相当新的技术，George P.Smith在1988年(第一次 尝试是在1985年)第一次使用和描述了这种技术。最早的专利授予了 R.C.Ladner(美国专利5,096,815和5,223,409)，这两个专利分别描述的是 “新DNA结合蛋白质和多肽的产生和选择”和“新的结合蛋白质的定向进 化”。这两个专利含有给出该技术背景的大量参考文献。
已经研究出来的噬菌体显示系统把兴趣多肽或肽与编码它的DNA联系 到一起。这种噬菌体显示系统曾用于选择用来结合到所选择的靶分子的肽 文库和用来显示具有筛选这些蛋白质所需特性的潜力的功能蛋白(参见参考 文献12至15)。
最近，显示方法的改进使得能够在噬菌体表面表达酶和抗体片段，因 此能够通过选择特异性的配位体来选择特异性的特征(参见参考文献2-6和 16-18)。
有许多参考文献描述了用于显示抗体的这种成功的方法。而对于显示 酶的描述则较少，然而却有一些这种方法的例子(参见参考文献1、8和 10)。
尤其是酶噬菌体的选择原理正在评价和研究中。已经证明给定酶的酶 促机制可以用作经使用自杀性抑制剂结合主体的手段(参见参考文献1和 9)。
发明概述
本发明涉及到选择适合于在除垢剂中使用的酶和酶变体的方法，其中 所说的将要选择的酶变体在各自显示于噬菌体微粒细胞表面上的酶变体混 合物中，这种方法包括下列步骤：
i)在将对酶活性有负面影响或使大多数所说的酶变体失活的条件下以 液体形式将所说的混合物引入到除垢剂组合物中；
ii)使所说的混合物与将特异性地结合到表现所需特性的酶变体的捕集 器分子进行反应，以在表现出所需特性的酶变体的所说的细胞或者噬菌体 和所说的捕集器之间形成复合物；
(iii)从所说的混合物的余下部分分离所说的复合物；
(iv)解离所说的复合物以便分离出显示在没有捕集器分子时所要选择的 所说的酶变体的细胞或噬菌体；
(v)把所说的噬菌体引入到它能够繁殖的宿主中；或者
(va)在有助于其繁殖的条件下培养所说的细胞；和
(vi)从所说的细胞或者噬菌体的基因组中分离编码所说的酶变体的 DNA分子。
本发明的另一个方面涉及通过使用上述方法选择的酶。
本发明另外也涉及在上述方法中使用除垢剂。
本发明也涉及一些捕集器分子，例如对本发明的第一方面的方法有用 的自杀抑制剂和过渡态类似物。
最后，本发明涉及通过本发明的方法产生的酶和含有这种酶的除垢剂 组合物。
附图和表的简单描述
参考下面的实施例和图将更加详细地描述本发明，其中图1显示了 Savinase基因3融合的结构、用于Savinase基因PCR的引物序列以及 它们和具有下划线的克隆位点的最后结构之间的关系。另外，在引物上面 有以小写形式表示的由Savinase编码的氨基酸及PCR Sav-N的有意义 链。PCR Sav-C引物本身是从3′-5′的。
发明的详细描述
如所表明的，本发明的第一个方面涉及选择适合于在除垢剂中使用的 酶和酶变体的方法，其中所说的将要选择的酶变体在各自显示于噬菌体微 粒细胞表面上的酶变体混合物中，这种方法包括下列步骤：
i)在将对酶活性有负面影响或使大多数所说的酶变体失活的条件下以 液体形式将所说的混合物引入到除垢剂组合物中；
ii)使所说的混合物与将特异性地结合到表现所需特性的酶变体的捕集 器分子进行反应，以在表现出所需特性的酶变体的所说的细胞或者噬菌体 和所说的捕集器之间形成复合物；
(iii)从所说的混合物的余下部分分离所说的复合物；
(iv)分离所说的复合物以便分离出显示在没有捕集器分子时所要选择的 所说的酶变体的细胞或噬菌体；
(v)把所说的噬菌体引入到它能够繁殖的宿主中；或者
(va)在有助于其繁殖的条件下培养所说的细胞；和
(vi)从所说的细胞或者噬菌体的基因组中分离编码所说的酶变体的 DNA分子。
完成本发明的方法之前，必需在细胞或者噬菌体表面上表达将要研究 的酶。
方便的做法是：首先通过随机诱变来诱变编码兴趣酶的DNA分子以创 造突变的DNA分子的大群体或文库，每一个DNA分子编码与亲本酶稍微 不同的酶。由此产生的不同DNA分子的数量是非常大的，甚至超过109个 突变体。因此，在本领域中这些方法是熟知的，在参考文献中，Spee等(21) 描述了这样的方法。
把代表所说的文库的每一种DNA片段插入到细胞或者噬菌体的载体中 的某一位点，在插入的位点上所说的诱变DNA与编码所说的细胞或者噬菌 体的表面蛋白的DNA邻近，并且采用的方式使得所说的诱变DNA被表达 且使相应的酶变体在转移到兴趣细胞中时显示在细胞或者噬菌体的表面 上。这就产生了DNA构建体。
这样的表面蛋白的例子是大肠杆菌细胞表面的肽葡聚糖相关性脂蛋 白、金黄色葡萄球菌的蛋白A、或者fd或者M13丝状噬菌体的glll蛋白。 这些技术也是公知的，参考文献2、3、11和22描述了这样的方法。
然后繁殖转化的细胞以产生细胞或者噬菌体的大的群体或文库，在大 的群体和文库中每一个细胞或者噬菌体显示一种酶变体，并且每个这种细 胞或者噬菌体在它的基因组中都携带编码特异性的酶变体的DNA，因此建 立了细胞或者噬菌体的表型和遗传型之间的联系。由于遗传密码的简并 性，所表达的酶变体的数量将小于DNA突变体的数量，但是产生的量仍然 很大。
按照本发明，在灭活大部分所说的酶变体的条件下，尤其是在已知对 亲本酶的活性有害的条件下将此文库放置在除垢剂中，和/或当期望选择出 在检验的参数方面显示出改进的特性的酶变体时，所说的条件对所要检验 的特性具有负面影响。
对于能灭活或者对酶的特性有负面影响的条件，所说的除垢剂可以包 含氧化剂(漂白剂)、各种表面活性剂、助洗剂等，在这些条件下期望发现对 这些试剂的影响具有更强抗性的酶变体，或者能够在高温和低温下处理所 说的混合物，或者将其保持在一定的pH值或者离子强度下，这样将会灭活 亲本酶或对其显示出负面影响；或者如果亲本酶是蛋白酶，所说的混合物 可延长保留时间以便选择出抗自体溶解的酶；或者除垢剂可以包含蛋白 酶，目的是选择出抗所说的蛋白酶的水解活性的脂酶、纤维素酶、淀粉酶 等等。
能被检验的其它参数包括疏水和亲水相互作用、溶剂化作用、用于底 物的结合口袋、辅因子和变构因子。所有在结构上有微小变化的参数都可 以提供变化。
在其它方面，在本发明的方法中所使用的除垢剂具有公知的组成，参 照美国专利4,663,071、4,652,392、4,507,219、4,405,483、4,285,841、 4,284,532、4,146,495、4,144,226、3,933,672、3,929,678、3,364,103、 3,308,067、2,477,383、2,220,099、1,739,942以及德国专利申请DOS 2,124,526，它们描述了这样的组合物和它们的成分。
此后，把此文库与只特异性结合到显示的酶变体(保持了所需特性)上的 捕集器分子进行反应，这样的捕集器分子的例子是兴趣酶活性的自杀抑制 剂或者过渡态类似物。
在本文中，″自杀抑制剂″表述的意思是不可逆转的抑制剂，其中抑制 剂在温育后共价地结合到酶上。
针对活性位点的不可逆转的抑制剂和基于机制的酶抑制剂是这种抑制 剂类型的具体例子。参考文献1和9描述了这样的抑制剂。
在本文中，″过渡态类似物″表述的是一种竞争性抑制剂，这种竞争性 抑制剂在结构上与酶促反应的不稳定的过渡态的底物部分类似。这种类型 的抑制剂对酶具有非常高的亲合性。参考文献23和24描述了这样的类似 物。
因为现在已经通过文库中细胞或者噬菌体显示的许多酶变体已经全部 或者部分地灭活，捕集器将只能和这种仍显示所需特性的显示酶变体进行 反应并且形成复合物。
必须将这些复合物从余下的细胞或者噬菌体(那些不显示所需特性，如 无活性的酶变体)、除垢剂的其它成分以及与抑制剂一起加入的试剂中分离 出来。
这些方法在本领域是公知的，如各种免疫分析方法，这些方法的参考 文献是参考文献1和7。
完成这种分离的一种方法是使复合物结合到表面，如试管的表面、滴 定板的孔或者颗粒的表面。
在一个典型的实施方案中是通过表面的吸附或者吸收进行结合。
另一种实施方案是通过共价键结合。
在这一方面，可以以各种能结合到表面的方式来改变抑制剂或者将表 面激活以便结合所说的复合物。
一种具体的方式是通过使用抗生蛋白链菌素处理表面和在使捕集器与 文库反应之前将捕集器生物素化。
如果所说的复合物已经结合到表面上，通过使用能解离连接实体的试 剂释放所说的噬菌体，或者如果吸附只是用来释放复合物，那么通过消化 或者解离除去捕集器。
一种方便的试剂是用于消化显示的酶变体的特异性蛋白酶。
为了此目的而使用的试剂不能损害所说的噬菌体，这一点是很重要 的。
在具体的实施方案中，所说的消化是用蛋白酶(如因子IX)来完成的。
接着显示酶变体的噬菌体通过感染宿主来扩增。所说的宿主是所说的 噬菌体能够在其中大量繁殖，进而提供大量的用于测序的DNA的生物体。
在本发明的一个实施方案中，所说的宿主是大肠杆菌的菌株DH12S。
如果酶变体已经显示在细胞的表面，则使细胞在有助于其增殖的条件 下生长。
因为酶变体DNA在噬菌体或细胞基因组的位置是已知的，所以很容易 分离相关的用于测序的DNA。
通过测序DNA而获得的信息使技术人员能够设计出其它的DNA构建 物，这种DNA构建物用于引入到实际生产所选择的酶变体的合适宿主中， 然后能用于除垢剂中。
合适的宿主通常是微生物，如细菌、酵母或者能产生亲本酶的同一类 型甚至同一菌株的真菌。这样的宿主、把DNA引入宿主的技术、培养和分 离酶的技术都是本领域公知的。
本发明的方法用于选择在除垢剂制剂中使用的酶变体，因此这种方法 经常用于使用选自由自杀抑制剂与过渡态类似物组成的组中的捕集器的蛋 白酶变体，如枯草杆菌蛋白酶，优选的是高碱性枯草杆菌蛋白酶的选择。
另一组兴趣酶是使用选自由自杀抑制剂与过渡态类似物组成的组中的 捕集器的脂酶，如真菌(如假单胞菌属(Pseudomonas)或者木霉属 (Trichoderma)等)的脂酶，优选的是Lipolase和其变体。
其它的兴趣酶组是蛋白酶(金属、酸性、中性或者碱性)、纤维素酶、淀 粉酶、裂合酶、木聚糖酶、果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶、氧化酶、漆酶、 氧化还原酶、谷氨酰胺转移酶、半乳糖苷酶、肌醇六磷酸酶或者过氧化物 酶。 材料和方法
大肠杆菌菌株：
    DH12S：可从生命技术公司A/S，Roskilde(丹麦)获得。
载体：
fd-tet-DOG1：在参考文献16中描述了这种载体的构建。
pSX222：在WO91/00345(NOVO NORDISK A/S)中描述了这种质粒 的构建。pSX222含有编码Savinase蛋白酶的基因。
pSX222(M222A)：具有编码氧化稳定的变体M222A的Savinase突变 基因的pSX222(在EP396 608B1中描述的)
pSX581：在WO96/17943(NOVO NORDISK A/S)中描述了这种质粒 的构建。pSX581含有编码Lipolase脂酶的基因。
pSX581(D96L)：具有编码LipolaseD96L Dobanol25-7稳定性变体的 突变基因的pSX581(在WO92/05249中描述的)
限制酶：
如果未作具体说明，所有的限制性酶均来自新英格兰生物实验室， Beverly，MA，美国。
捕集器：
使用了命名为″自杀-Sav-l″的自杀抑制剂。抑制剂的式子如下：
也使用了另一种命名为″自杀-Lip-i″的自杀抑制剂。自杀-Sav-l抑制剂 具有膦酸酯的不可逆转抑制剂类型(Bjrkling F.等“通过膦酸酯抑制脂 酶”，生物有机和药物化学：2：697-705(1994))，且有如下式子：
其中L是离去基团，如卤素(如Cl)或对-硝基苯基，R是具有1至20 个碳原子的直链或支链的烷基，如乙基或者类似二脂酰甘油酯的基团。标 记是能用于识别/鉴别和选择性固定化的基团或化合物，如生物素或地谷新 配基，其中的生物素是亲水的，而地谷新配基是疏水的标记。
寡核苷酸的合成：
所有寡核苷酸引物都是在ABI394 DNA/RNA合成仪(应用生物系统， Foster市，CA，美国)上合成的。
DNA测序：
所有DNA的测序都是在ABI373A型DNA序列分析仪上按照Tag Dye DeoxyTM终止子循环测序试剂盒的ABI 2x Taq方案来进行的。
fd-Sav噬菌体的鉴定：
ELISA：
使用标准的ELISA技术，检测酶噬菌体的结合。
简言之，用100ml捕集器溶液(PBS中的10mg/ml的抗生蛋白链菌素或 者在兔子中针对在Novo Nordisk A/S制备的Savinase产生的多克隆抗体) 在4℃下涂敷微量滴定板(Maxisorp，Nunc)的孔过夜，然后在37℃用含有2 ％的脱脂奶粉(Difco)的PBS封闭2小时。
把直接取自于噬菌体制剂(为了用于以多克隆抗体作为捕集器的 ELISA中)的噬菌体或者结合到生物素化的自杀抑制剂上并按上述方法洗 涤的噬菌体(为了用于以抗生蛋白链菌素作为捕集器的ELISA中)的封闭溶 液的系列稀释液加入到孔中，并且在室温下振荡培养1-2小时。
利用含有0.05％Tween-20的PBS在不同步骤间进行洗涤。
使用过氧化物酶缀合的兔-抗-M13多克隆抗体(Pharmacia)来测定结 合，接着按照厂商的说明使用正亚苯基二胺(DAKO)检测。
使检测反应持续10-30分钟，然后加入50ml的2M H2SO4停止反应在 微量滴定板读数器上于OD490下读取平板。
fd-Lip噬菌体的定性：
通过下面描述的ELISA分析方法表明噬菌体的脂酶活性来定性fd- Lip酶噬菌体。
ELISA微量滴定板分析：
原理：用甘油三酯和对-硝基苯基-脂肪酸(pNP-FA)的混合物覆盖 ELISA板孔的壁。这种方法是基于pNP-FA中的酯键的水解导致对-硝基苯 酚(黄色)释放到上清液中并且在ELlSA读数器上监视颜色的显现。
仪器：UV最大动力微板读数器(Molecular Device)
底物溶液：
溶解在己烷中的0.5mM油酸甘油酯(Sigma 1-7140)
溶解在己烷中的0.5mM棕榈酸对-硝基苯酯(Sigma N-2752)
溶解在96％乙醇中的0.5mM橄榄油
溶解在96％乙醇中的0.5mM辛酸对-硝基苯酯
缓冲液：
0.16M Tris，pH9
方法：
把100μl的底物混合物转移到每一个孔中，并且使有机内含物蒸发。把 125μl的缓冲液和75μl的fd-Lip噬菌体酶(按在实施例5中描述的方法制备 的)加入到孔中。把微量滴定板放置在ELISA读数器中，记录颜色的显现。
在这种ELISA脂酶微量滴定分析中，fd-Lip和fd-Lip(D96L)酶噬菌体 所显示的脂酶活性都完全高于fd噬菌体的对照水平。这表明fd-Lip噬菌 体具有脂酶活性。
实施例 实施例1
fd-Sav和fd-Sav M222A的构建：
把Pro-Mature Savinase基因克隆到载体fd-tet-DOG1中的Apa LI 和Notl位点。通过聚合酶链反应(PCR)使用图1所示的引物制备插入片 段，并且其衍生于pSX222。设计寡核苷酸引物用以产生在基因的5′末端 存在ApaLI限制性位点和在3′末端存在Notl限制位点的PCR产物。寡核 苷酸引物的序列是： PCRSaV-N： 5′-GTC ACA GAT CCT CGC GAA TGT GCA CAG GCT GAA GAA GCA AAA GAA AAA TAT TTA ATT GGC-3′ PC RSav-C： 5′-CAG ATC CTC GCG AAT TGG TGC GGC CGC ACG CCC CTC AAT CCC ACG CGT TGC CGC TTC TGC GTT AAC-3′
使用具有30个循环(由92℃1分钟、50℃2分钟和72℃3分钟构成) 的Perkin Elmer Cetus DNA热循环仪480在含有各250mM dNTP、50 mM KCl、2.5mM MgCl2、0.01％明胶、0.25单位/ml的Taq聚合酶 (Cetus/Perkin Elmer)和0.5ng/ml的pSX222模板的100ml的10mM Tris-HCL(pH8.3)中进行PCR。这样衍生的构建物称为fd-Sav。通过测序检验 fd-Sav中的插入片段。
在上述的PCR反应中除了使用pSX222(M222A)作为模板外，利用和 构建fd-Sav相同的方法完成fd-Sav M222A的构建。 实施例2
fd-Sav噬菌体酶的制备：
37℃下在含有15mg/ml四环素的2X TY中把含有fd-Sav或者fd- Sav(M222A)的大肠杆菌DH12S细胞培养16小时。基本上按照参考文献 10中所述的方法制备浓缩的噬菌体。
简言之，通过离心(10,000r.p.m.，8×50ml转头，Sorval RC-SB离心机 15-20分钟)澄清噬菌体酶培养物。通过加入1/5体积的20％聚乙二醇、 2.5M NaCl在4℃，沉淀出噬菌体放置1小时，并且离心(同上)。把噬菌体 沉淀物在10mM Tris-HCl，pH8.0中再悬浮到原来体积的1/100，在4℃ 下使用微型离心机通过两步离心(在12000r.p.m.每次5-10分钟)除去剩余的 细菌和聚集的噬菌体。 实施例3
fd-SavM222A噬菌体的选择：
为了建立反应条件，在1.5ml的50mM醋酸盐缓冲液(pH5)中再 悬浮250ml培养物中的fd-Sav噬菌体的PEG沉淀物以达到每毫升大约1011 TU，并且用Millex-GV(0.22mm)过滤。把溶于25ml DMSO中的0.3mg抑 制剂加入到500ml的这种溶液中。在整个培养中通过提取样品并且测量对 下列底物：Suc-ala-ala-pro-phe-pNA(SIGMA，St.Louis，Mo美国)的蛋白 酶活性来监视Savinase活性的丧失。
在fd-Sav噬菌体的抑制作用的基本条件建立后，将一些上述制备的噬 菌体(fd-tet-DOG1，fd-SavM222A，fd-Sav)用来制造预先确定的混合 物。
在含有漂白剂的除垢剂中培养450ml的噬菌体混合物(1011- 1012TU/ml)30分钟(含有漂白剂的除垢剂包含氧化性的化学药品，详见EP 396.608)。向噬菌体混合物中加入50ml 10％(W/V)牛血清白蛋白(BSA)溶 液，然后加入生物素化的自杀抑制剂至浓度为(0.5)mM。使反应进行30分 钟。通过加入200ml PEG-NaCl溶液和离心沉淀出噬菌体。把沉淀物再悬 浮在500ml的50mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)中，并再次经PEG沉淀。重复 上述过程，最后把沉淀物再悬浮在1.1ml含有2％(W/V)无脂肪的干燥奶粉 (MPBS)的PBS缓冲液中。
利用免疫管(immunotubes)(Nunc 3.5ml体积)或者微量滴定孔板(Nunc 140ml体积)进行使用抗生蛋白链菌素作为捕集器的实际结合选择。在选择 之前，将具有以100mg/ml的浓度存在于PBS中的抗生蛋白链菌素的管或 孔在4℃培养过夜，并且用含有2％脱脂奶粉和0.05％Tween-20(Merck)的 PBS(磷酸盐缓冲的盐水137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4x7H2O，1.4mM KH2PO4，pH7.4)封闭。
将结合的噬菌体和生物素化的抑制剂结合1-2小时，其后以10倍体积 的PBS和10倍体积的含有0.05％Tween-20的PBS彻底洗涤(至少10次)。
为了洗脱，将结合的噬菌体再悬浮在1ml 50mM Tris：HCl、100 mM NaCl、1mMCaC12缓冲液，pH8(TNCB)中。在室温和温和振荡下通 过分别用免疫管和微量滴定板孔与10mg的因子Xa3至18小时洗脱噬菌 体。
洗脱的噬菌体用于感染大肠杆菌菌株DH12S以制备用于另一轮选择的 噬菌体(50ml指数增长的噬菌体在30-37℃放置过夜以繁殖噬菌体)。
在多次选择循环之后，获得fd-SavM222A的噬菌体的有效选择是可能 的，与fd-Sav噬菌体相比，fd-SavM222A对氧化是稳定的(EP396.608 B1)。优选的fdSavM222A/fd-Sav选择比大于8；更优选的大于10；甚至 更优选的大于20。
一般地，较多次数的选择通常将给出较显著的选择结果(较高的选择数 量)。 实施例4
fd-Lip和fd-Lip(D96L)噬菌体的构建：
除了PCR引物是PCRLip-N和PCRLip-C(参见以下)，并且PCR反 应是在pSX581(为构建fd-Lip)或pSX581(D96L)(为构建fd-Lip(D96L))上进 行之外，基本上如构建fd-Sav的描述(实施例1)，把成熟的Lipolase基因 克隆到载体fd-tet-DOG1的Apa Ll和Notl位点中。 PCRLip-N： 5′-GTC ACA GAT CCT CGC GAA TGT GCA CAG GAG GTC TCG CAG GAT CTG TTT AAC CAG TTC-3′ PCRLip-C： 5′-CAG ATC CTC GCG AAT TGG TGC GGC CGC ACG CCC CTC AAT CCC AAG ACA TGT CCC AAT TAA CCC GAA GTA CC-3′ 实施例5   fd-Lip噬菌体酶的制备：
除了大肠杆菌DH12S细胞现在含有fd-iip或者fd-Lip(D96L)外， 按照如构建fd-Sav的描述(实施例2)制备fd-Lip噬菌体酶。 实施例6   fd-LipD96L噬菌体的选择：
为建立反应条件，在1.5ml的50mM醋酸盐缓冲液(pH5)中再悬 浮250ml培养物中的fd-Sav噬菌体的PEG沉淀物以达到每毫升1011TU， 并且用Millex-GV(0.22mm)过滤。把Dobanol25-7以逐渐增加的量加入到 500ml的这种溶液中(Dobanol25-7是非离子表面活性剂)。在整个培养中通 过提取样品并且测量对C-12脂肪酸月桂酸底物的蛋白酶活性来监视 Savinase活性的丧失。
在fd-Lip噬菌体抑制剂的基本条件建立后，将一些上述制备的噬菌体 (fd-tet-DOG1，fd-LipD96L，fd-Lip)用来制造预先确定的混合物。
在含有一定量(只是需要灭活fd-Lip噬菌体(参见以上))的Dobanol 25-7 的除垢剂中培养450ml的噬菌体混合物(1011-1012TU/ml)30分钟。向噬菌体 混合物中加入50ml 10％(W/V)牛血清白蛋白(BSA)溶液，然后加入生物素 化的自杀抑制剂至浓度为(0.5)mM。使反应进行30分钟。通过加入200ml PEG-NaCl溶液和离心沉淀出噬菌体。把沉淀物再悬浮在500ml的50mM 醋酸盐缓冲液(pH5.0)中，并再次经PEG沉淀。重复上述过程，最后把沉淀 物再悬浮在1.1ml含有2％(W/V)脱脂干燥奶粉(MPBS)的PBS缓冲液中。
使用免疫管(Nunc 3.5ml体积)或者微量滴定孔板(Nunc 140ml体积)进 行以抗生蛋白链菌素作为捕集器的实际结合选择。在选择之前，将具有以 100mg/ml的浓度存在于PBS中的抗生蛋白链菌素的管或孔在4℃培养过 夜，并且用含有2％脱脂奶粉和0.05％Tween-20(Merck)的PBS(磷酸盐缓 冲的盐水137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4 x7H2O，1.4mM KH2PO4，pH7.4)封闭。
将结合的噬菌体和生物素化的抑制剂结合1-2小时，其后以10体积的 PBS和10倍体积的含有0.05％Tween-20的PBS彻底洗涤(至少10次)。
为了洗脱，结合的噬菌体再悬浮在1ml 50mM Tris：HCl、100mM NaCl、1mMCaC12缓冲液，pH8(TNCB)中。在室温和温和振荡下通过分 别用免疫管和微量滴定板孔与10mg的因子Xa3至18小时洗脱噬菌体。
洗脱的噬菌体用于感染大肠杆菌菌株DH12S以制备用于另一轮选择的 噬菌体(50ml指数增长的噬菌体在30-37℃放置过夜以繁殖噬菌体)。
在多次选择循环之后，获得fd-LipD96L噬菌体的有效选择是可能的， 与fd-Lip相比，fd-LipD96L对Dobanol25-7是稳定的(WO92/05249)。 优选的fd-LipD96/fd-Lip选择比大于8；更优选的大于10；甚至更优选的 大约20。
一般地，较多次数的选择通常将给出较显著的选择结果(较高的选择数 量)。
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